Инкапсулированная агрегация клеток матрицы базальной мембраны для исследования формирования ткани селезенки мышей

Summary

В данной статье описывается протокол агрегации и инкапсуляции клеток селезенки в полутвердой мембранной матрице. Матричные конструкции базальной мембраны могут быть использованы в трехмерной культуре для изучения развития органоидов или для трансплантации in vivo и исследований регенерации тканей.

Abstract

Селезенка является иммунным органом, который играет ключевую роль в иммунных реакциях, передающихся через кровь. Анатомическая или функциональная потеря этой ткани повышает восприимчивость к тяжелым инфекциям крови и сепсису. Аутотрансплантация срезов селезенки используется клинически для замещения утраченной ткани и восстановления иммунной функции. Однако механизм, приводящий к устойчивой и иммунологически функциональной регенерации тканей селезенки, до конца не выяснен. Здесь мы стремимся разработать метод агрегации и инкапсуляции клеток селезенки в полутвердом матриксе, чтобы исследовать клеточные потребности для формирования ткани селезенки. Инкапсулированные клеточные конструкции базальной мембранной матрицы поддаются как культивированию трехмерных органоидов in vitro, так и трансплантации под капсулу почки для непосредственной оценки образования ткани in vivo. Манипулируя входными клетками для агрегации и инкапсуляции, мы демонстрируем, что полученные из трансплантата PDGFRβ⁺MAdCAM-1-неонатальные стромальные клетки необходимы для регенерации ткани селезенки в моделях трансплантации животных.

Introduction

Травматический разрыв селезенки и появление множественных селезеночных узелков в организме был одним из первых признаков того, что ткань селезенки обладает регенеративной способностью ^1,2. Позже в клинику была внедрена аутотрансплантация селезенки для сохранения ткани селезенки у пациентов, нуждающихся в экстренной спленэктомии³. Тем не менее, несмотря на то, что селезенка является частью клинической практики на протяжении десятилетий, очень мало известно о том, как селезенка регенерирует. Модели трансплантации животных позволили получить представление о многих параметрах регенерации селезенки и иммунной функции ^4,5. В частности, экспериментальные модификации метода препарирования трансплантата позволили более детально изучить регенерацию тканей на клеточном и молекулярном уровне.

Трансплантация с использованием целых срезов селезенки проходит фазу массового некроза, прежде чем будет восстановлена новая структура селезенки⁶. Начальная фаза некроза трансплантата говорит о том, что основная масса трансплантированной ткани в значительной степени состоит из эритроцитов и лейкоцитов и не нужна для регенерации селезенки. Это было исследовано экспериментально путем исключения гемопоэтических клеток из трансплантатов селезенки перед трансплантацией под капсулу почки мыши. Здесь было показано, что нелейкоцитарная/неэритроцитарная фракция селезенки, которая включает стромальные и эндотелиальные клетки, достаточна для индуцирования образования de novo ткани⁷. Стромальная ткань селезенки может быть дополнительно переработана в одноклеточную суспензию, что позволяет использовать технологии сортировки клеток для манипулирования составом клеточного трансплантата. Путем селективного удаления типов клеток-кандидатов были идентифицированы две популяции CD45-TER-119-стромальных клеток, которые были необходимы для развития трансплантата: эндотелиоподобная популяция клеток CD31⁺CD105⁺MAdCAM-1⁺ и более широко определенная популяция мезенхимальных клеток PDGFRβ^{+ 8}.

Конструкция трансплантатов из клеток селезенки различается с точки зрения вспомогательных материалов и процессов загрузки клеток. Тканеинженерные селезенки ранее были получены путем загрузки селезеночных единиц на полимерный каркас из полигликолевой кислоты/поли-L молочной кислоты ^5,9. Интересно, что стромальные клетки селезенки, абсорбированные в коллагеновую губку, не приживались, в то время как стромальные клетки, агрегированные и нагруженные на коллагеновый лист,^{способствовали регенерации} селезенки8. Также было продемонстрировано, что ресуспензия стромальных клеток селезенки внутри матрикса Matrigel индуцирует агрегацию клеток в трехмерных условиях культивирования¹⁰. Однако этот метод не был протестирован для использования в трансплантационных моделях. Общая цель текущего протокола заключается в принудительной агрегации и инкапсуляции стромальных клеток селезенки непосредственно внутри матрицы базальной мембраны, которые впоследствии могут быть перенесены в трехмерную систему культивирования тканей in vitro или использованы в качестве средства для трансплантации модельных животных (дополнительный рисунок 1).

Protocol

Все процедуры на животных проводились в соответствии с экспериментальными протоколами, утвержденными Комитетом по этике животных Университета Квинсленда (UQBR/079/19).

1. Забор тканей и подготовка стромальных клеток

1. Усыпляют 0,5-1,5-дневных самцов и/или самок неонатальных мышей-доноров BALB/c путем индукции гипотермии, заворачивая животных в папиросную бумагу и помещая их под колотым льдом на >10 минут.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол может быть адаптирован к различным линиям мышей, возрасту и количеству животных.
2. Подготовьте стерильные хирургические инструменты.
3. Положите мышь в правое боковое положение. Промокните кожу 80% этиловым спиртом и сделайте разрез диаметром 1 см хирургическими ножницами Iris, чтобы обнажить стенку брюшины.
4. Сделайте второй разрез 0,5 см над селезенкой и с помощью тонких щипцов осторожно приподнимите ткань вверх. Используйте хирургические ножницы, чтобы перерезать кровеносные сосуды и иссечь ткань. Перенесите ткань в чашку Петри, содержащую ледяной фосфатный буферный раствор (PBS). Удалите всю оставшуюся соединительную ткань, прикрепленную к селезенке.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Стереомикроскоп может помочь мелкой моторике, необходимой для работы с хирургическими инструментами.
5. Чтобы диссоциировать целые ткани, перенесите селезенку новорожденных (пулы из 10 или менее) во внутренний край перевернутой конической крышки пробирки объемом 14 мл. Механически разрушайте ткани надавливающим движением с помощью пластикового заднего конца поршня шприца объемом 1 мл.
6. Наденьте и плотно закрепите колпачок на конической пробирке объемом 14 мл, содержащей 10 мл холодного PBS. Переверните тюбик 5 раз, чтобы смыть всю поврежденную ткань с колпачка в тюбик.
7. Повторите шаг 1.6 для оставшихся тканей.
8. Оставьте пробирку на льду на 1 минуту, чтобы ткань осядла на дно пробирки.
9. Осторожно выбросьте надосадочную жидкость (содержащую гемопоэтические клетки), пропустив раствор через реверсивное ситечко с 70 мкм.
10. Восстановите нерастворимую стромальную фракцию, перевернув ситечко и промыв стромальную ткань обратно в коническую пробирку объемом 14 мл, используя свежеприготовленные 2 мл модифицированной орлиной среды (sDMEM) Dulbecco, содержащей 1 мг/мл коллагеназы IV, 40 мкг/мл ДНКазы I и 2% фетальной бычьей сыворотки (FBS).
    ВНИМАНИЕ: Коллагеназа IV и коллагеназа D являются опасными веществами и должны обрабатываться в шкафу биобезопасности с соответствующими средствами индивидуальной защиты.
11. Для приготовления одноклеточной суспензии ферментативно расщепляют объединенную ткань (до 20) в течение 10 мин при 37 °C при постоянном вращении.
12. Добавьте 4 мл свежеприготовленного sDMEM, содержащего 1 мг/мл коллагеназы D, 40 мкг/мл ДНКазы I и 2% FBS, непосредственно в пробирку, содержащую стромальную ткань. Инкубируйте еще 10 минут при температуре 37 °C при постоянном вращении.
13. Остановите пищеварение, добавив 8 мл ледяного PBS. Собирают клетки центрифугированием при 200 x g в течение 5 мин при 4 °C.
14. Выбросьте надосадочную жидкость и промойте клетки дважды, повторно суспендировав в 1 мл холодного PBS и центрифугируя при 200 x g в течение 5 мин при 4 °C. Держите клетки на льду.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки могут быть подсчитаны и доведены до желаемой концентрации. Это может потребовать оптимизации для разных клеточных популяций. При использовании этого протокола обычно извлекают стромальные клетки на селезенку размером 0,5 x 10⁶ 6, в зависимости от возраста мышей-доноров. На этом этапе клетки могут быть окрашены и отсортированы методом FACS для определения клеточного состава.

2. Матричная инкапсуляция клеточных агрегатов

1. Предварительно охладите стерильные наконечники дозаторов P200 в морозильной камере с температурой -20 °C.
2. Разрежьте гибкую лабораторную пленку (например, Parafilm) на куски размером 1 см x 2 см и простерилизуйте, погрузив в 80% этиловый спирт на 10 минут, а затем PBS на 10 минут. Лабораторную пленку можно подготовить заранее и хранить стерильно.
3. Приготовьте 0,5 x 10 6-2,5 x 10⁶ клеток центрифугированием при 200 x g в течение 5 мин при 4 °C. Осторожно аспирируйте надосадочную жидкость, оставляя примерно 20 мкл оставшегося объема PBS. Держите клеточную гранулу на льду.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Оставшийся PBS можно осторожно отсосать, не повредив гранулу ячейки, чтобы подтвердить объем.
4. Аспирируйте 2 мкл ледяной мембранной матрицы основания в предварительно охлажденный наконечник дозатора P200 с помощью пипеттора P20.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Высококонцентрированная матрица базальной мембраны (например, матрица Corning Matrigel высокой концентрации) способствует образованию прочной затвердевшей пробки.
5. Осторожно поверните, чтобы извлечь наконечник пипетки. Натяните предварительно стерилизованную полоску лабораторной пленки и поместите ее на конец наконечника пипетки, стараясь не проткнуть пленку. Продолжайте заворачивать наконечник в пленку, чтобы запечатать наконечник пипетки. Осторожно положите запечатанный наконечник прямо на лед, стараясь не порвать пленку.
6. Ресуспендируйте клеточную гранулу в оставшейся PBS и аккуратно нанесите раствор на матрицу базальной мембраны. Держите конструкцию на льду.
7. Подготовьте центрифугированную пробирку, поместив кластерную пробирку объемом 1,2 мл внутрь конической пробирки объемом 14 мл.
8. Поместите наконечник пипетки внутрь вложенной пробирки и центрифугируйте при температуре 400 x g и 4 °C в течение 5 минут.
9. Установите коническую пробирку объемом 14 мл в вертикальном положении и инкубируйте при температуре 37 °C в течение 15 минут, чтобы матрица базальной мембраны затвердела внутри наконечника пипетки.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Коническую пробирку объемом 14 мл можно помещать на лед до тех пор, пока это не потребуется для последующего применения.

3. Трехмерная органоидная культура

1. Осторожно снимите лабораторную пленку с наконечника пипетки.
2. Вставьте тонкий проволочный поршень из нержавеющей стали в большее отверстие наконечника пипетки.
3. Выталкивайте матричную пробку до тех пор, пока она не выйдет через наконечник, в одну лунку необработанной 6-луночной тканевой культуральной пластины, содержащей 2 мл sDMEM с добавлением 10% FBS, 1x Glutamax, 1x заменимых аминокислот (NEAA), 10 мкМ ингибитора горных пород, 10 U/мл пенициллина/стрептомицина и 50 мкМ β-меркаптоэтанола.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Емкость для культуры тканей и соответствующий объем среды могут быть отрегулированы по мере необходимости.
   ВНИМАНИЕ: NEAA, пенициллин/стрептомицин и β-меркаптоэтанол являются опасными веществами и должны обрабатываться в шкафу биобезопасности с соответствующими средствами индивидуальной защиты.
4. Культивирование органоидов при 37 °C, 5% CO₂ и влажности 95% в течение 4-12 недель.
5. Заменяйте половину носителя каждые 5 дней.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если органоиды начинают прикрепляться к планшету для культуры тканей, перенесите их в свежую лунку.

4. Пересадка капсулы почки

1. Подготовьте стерильные хирургические инструменты.
2. Выполнить субкапсулярную трансплантацию почки пробки матрикса базальной мембраны:
   1. Обезболивайте 8-недельную самку мыши-реципиента BALB/c изофлураном в соответствии с рекомендациями по этике для животных.
      ВНИМАНИЕ: Изофлуран является опасным веществом. Отработанные газы необходимо удалять, чтобы предотвратить попадание в рабочую среду.
   2. Положите мышь в правое боковое положение.
   3. Сбрейте волосы в месте операции и продезинфицируйте кожу в соответствии с рекомендациями учреждения.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется дезинфицировать место операции три раза круговыми движениями с чередованием скраба на основе йода или хлоргексидина и спирта.
   4. Сделайте разрез на коже диаметром 2 см перпендикулярно позвоночнику, чтобы обнажить стенку брюшины.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для разреза кожи можно использовать тонкие хирургические ножницы или лезвие скальпеля. Пользователи должны следовать Руководству по этике животных или Стандартным операционным процедурам.
   5. Сделайте разрез меньшего размера 0,5 см в стенке брюшины над почкой.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Разрез должен приблизительно соответствовать ширине почки, чтобы гарантировать, что почка останется экстериоризированной во время трансплантации.
   6. Экстериоризируйте почку через отверстие брюшины, надавливая вниз большим и указательным пальцами. Кольцевой пинцет может быть использован для помощи экстериоризации. Следите за тем, чтобы почка была влажной на протяжении всей процедуры, регулярно нанося стерильный PBS с помощью ватного тампона.
   7. Под стереомикроскопом зажмите околопочечный жир капсулы почки парой изогнутых ультратонких щипцов на одном полюсе почки. Используйте вторую пару изогнутых ультратонких щипцов, чтобы осторожно разорвать мембрану капсулы почки вверх в противоположном направлении, создавая небольшое отверстие.
   8. Осторожно введите зубец одного щипца под мембрану капсулы. Медленными размашистыми движениями отделите мембрану капсулы от паренхимы почки.
   9. Подготовьте матричную пробку базальной мембраны к трансплантации, сняв лабораторную пленку с наконечника пипетки.
   10. Приподнимите капсулу почки с помощью одного зубца щипцов и введите кончик пипетки через отверстие, проталкивая его к противоположному полюсу почки.
   11. Вставьте проволочный поршень в наконечник пипетки и выньте матричную пробку, одновременно извлекая наконечник пипетки из почки.
   12. Смочите почку PBS и повторно усвоите.
   13. Закройте стенку брюшины одним швом 5-0 Vicryl и закройте кожу двумя автоклипсами.
   14. Назначают обезболивающее средство (бупренорфин в дозе 0,05-0,1 мг/кг подкожно или в соответствии с рекомендациями по этике животных).
       ВНИМАНИЕ: Бупренорфин является опасным веществом, и с ним необходимо обращаться с соответствующими средствами индивидуальной защиты.
3. Выключите поток изофлурана, но оставьте поток кислорода включенным, чтобы мышь могла дышать чистым кислородом до тех пор, пока она не начнет приходить в сознание.
4. Верните мышь в клетку. Держите животное в тепле во время выздоровления, частично поместив клетку на грелку или под тепловую лампу, и наблюдайте до тех пор, пока мышь полностью не оправится от анестезии.
5. Наблюдайте за послеоперационным восстановлением в течение первых двух недель или в соответствии с требованиями институциональных рекомендаций.

Results

Клеточная агрегация важна для развития межклеточного контакта и передачи сигналов. Помещение клеточных агрегатов внутрь матрицы базальной мембраны поддерживало как 3-мерные культуры для формирования тканевых органоидов in vitro, так и облегчало механическую доставку клеток в капсулу почки для трансплантации трансплантата. Чтобы установить эти конструкции, матрица базальной мембраны сначала поддерживалась в жидком состоянии в условиях ледяного холода. Агрегация клеток впоследствии была достигнута путем наслоения концентрированной клеточной суспензии сверху и использования центробежной силы для проталкивания клеток через матрицу высокой плотности. Для достижения позиционирования ячеек среднего слоя (рис. 1A) требовалась оптимизация скорости центрифугирования (200-2000 x g), которая также зависела от количества клеток. Более высокие центробежные силы (>500 x g) подталкивают клетки к самому кончику пипетки (рис. 1B), и необходимо соблюдать осторожность при меньшем количестве клеток (т. е. <5 x 10⁵), которые могут быть потеряны при снятии гибкого покрытия из лабораторной пленки. И наоборот, клетки могут не перемещаться адекватно через матрицу базальной мембраны, если перегрузки слишком малы (≤200 x g) (рис. 1C). Скорость центрифугирования для ячеек с номерами <1 x 10⁵ или >2,5 x 10⁶ может нуждаться в дальнейшей оптимизации. После центрифугирования клетки помещали внутрь матрицы базальной мембраны путем нагревания конструкции при 37 °C в течение 15 мин. Этот процесс затвердевания позволил полностью вытолкнуть матричную «пробку» (рис. 1D) с помощью плунжера из тонкой проволоки.

Образование органоидов селезенки in vitro
Пробки матрицы базальной мембраны, выброшенные в соответствующий сосуд для культуры тканей, воспроизводимо формировали 3-мерные органоидоподобные структуры, которые можно было поддерживать в соответствии со стандартными методами и условиями культивирования тканей (37 °C, 5% CO₂, влажность 95 %)¹¹. В культуре матриксный субстрат опорной базальной мембраны постепенно рассеивался между 0 и 14 днями (рис. 2A, i-iii) и к 21-му дню больше не наблюдался, оставляя неповрежденную органоидоподобную сферическую клеточную массу (рис. 2A, vi) размером около 545 мкм (s.d. = 120 мкм, n = 6)¹¹ в диаметре. Эти органоидные структуры поддерживались в культуре более 30 дней, но не увеличивались в размерах с течением времени (рис. 2B). Органоиды селезенки состояли из CD45-TER-119-стромальных, CD45-TER-119⁺ эритроцитов и CD45⁺TER-119-лимфоидных клеток (рис. 2C), однако частота каждой популяции варьировала в зависимости от отдельных органоидов (n = 4; Таблица 1). Для оценки общей структуры органоидов селезенки были подготовлены и визуализированы тканевые криосрезы толщиной 50 мкм. Органоиды состояли из неполой структуры, с клетками, присутствующими по всему диаметру ткани (рис. 2D). Оценка срезов органоидов при толщине слоя одиночных клеток 7 мкм показала, что клетки расположены в шнуровидных структурах без четкой пространственной ориентации (рис. 2D), с участками, лишенными ядер между цепочками клеток. Окрашивание антител к CD45 подтвердило наличие ядросодержащих гемопоэтических клеток, плотно окружающих периферические участки органоида (рис. 2E). Кроме того, CD45⁺ клетки отчетливой веретенообразной морфологии наблюдались в более центральных органоидных областях. Общее отсутствие окраски антителами к CD90.2 (Т-клеткам) и CD19 (В-клеткам), но положительное окрашивание CD11b продемонстрировало специфическое присутствие миелоидных клеток (рис. 2F). Негемопоэтические эндотелиальные клетки CD105⁺ и CD31⁺ также были обнаружены в нескольких органоидах¹¹.

Трансплантация селезенки in vivo
Инкапсуляция агрегированных стромальных клеток селезенки в полутвердую матрицу облегчает исследования по трансплантации животных. Этот метод был использован для встраивания нефракционированных или CD45-TER-119-FACS-сортированных препаратов стромальных клеток селезенки новорожденных в матричную пробку базальной мембраны, служащую транспортным средством для трансплантации под капсулу почки мыши. В соответствии с аналогичными протоколами агрегации клеток⁸, инкапсулированные клеточные конструкции с матрицей базальной мембраны (MECC) успешно регенерировали ткань селезенки в 4/5 независимых трансплантациях животных, тем самым подтверждая жизнеспособность этого метода конструирования трансплантата. Чтобы проверить полезность MECC в определении типов клеток, необходимых для регенерации селезенки, трансплантаты MECC были построены из клеток селезенки новорожденных, которые были специфически истощены PDGFRβ⁺MAdCAM-1⁺ или PDGFRβ⁺MAdCAM-1^- стромальными (CD45^-) клетками¹¹. Трансплантаты, лишенные клеток PDGFRβ⁺MAdCAM-1⁺, сохраняли способность к грубой регенерации тканей (4/4 графта; Рисунок 3А) ¹¹. Три из четырех регенерированных тканей показали нормальный состав и структуру клеток селезенки, демонстрируя центральные артериолы, фолликулы белой пульпы, сегрегированные Т- и В-клеточные компартменты, фолликулярные дендритные клетки, ретикулярные клетки маргинальной зоны и маргинальные металлофильные макрофаги, синусоиды красной пульпы, миелоидные клетки и макрофаги (рис. 3Б)¹¹. Напротив, трансплантаты, в которых отсутствовали клетки PDGFRβ⁺MAdCAM-1^-, в основном не регенерировали ткань селезенки (1/4 трансплантатов)¹¹. Эти данные подтверждают важность PDGFRβ⁺ клеток, полученных из трансплантата, в регенерации ткани селезенки⁸ и указывают на конкретную потребность ^{в стромальных} клетках PDGFRβ⁺MAdCAM-1-.

Рисунок 1. Инкапсуляция матрикса базальной мембраны агрегированных стромальных клеток селезенки. Наконечник пипетки на 200 мкл используется для облегчения агрегации клеток внутри матрицы базальной мембраны. Слой жидкостной матрицы сначала создается путем аспирации 2 мкл ледяной мембранной матрицы основания в предварительно охлажденный наконечник пипетки. Клеточная суспензия осаждается над матриксным слоем, и центробежная сила прикладывается для мобилизации и агрегации клеток в матрице базальной мембраны. (A) Настройки скорости центрифуги оптимизированы для позиционирования клеточных агрегатов посередине матричного слоя. (B) Чрезмерная центробежная скорость приводит к образованию клеток, которые агрегируются на конце пипетки. (C) Недостаточная скорость препятствует перемещению клетки через матрицу. (D) После инкубации при температуре 37 °C в течение 15 минут из наконечника пипетки извлекается полутвердая матричная пробка. Стрелки указывают на размещение агрегатов ячеек в матрице. Масштабная линейка, 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2. Культивирование in vitro базальных мембранных матрикс-инкапсулированных агрегатов селезенки и формирование 3-мерных органоидных структур. (А) Развитие органоидов селезенки в течение 35 дней. Панели (i-vi) соответствуют дням 0, 7, 14, 21, 28 и 35 в культуре. Изображения были получены с помощью инвертированного фазово-контрастного микроскопа Nikon TS2. Масштабная линейка, 500 мкм. (B) Диаметр органоида селезенки в течение длительных периодов культивирования. Каждая линия представляет собой отдельный органоид. (C) Характеристика популяций стромальных (CD45-TER-119^-), лимфоидных (CD45⁺TER-119^-) и эритроидных (CD45-TER-119⁺) клеток методом проточной цитометрии после 53 дней культивирования. Верхняя панель: Контрольная ткань, полученная из стромы селезенки новорожденного. Нижняя панель: Органоид селезенки, день 52. (D) Валовая морфология органоидной ткани при толщине срезов 50 мкм (верхние панели) и 7 мкм (нижние панели) после 22 дней культивирования. (E) Локализация и морфология CD45⁺ гемопоэтических клеток после 34 дней культивирования. Увеличенная область показана на правой панели. Срезы 7 мкм. (F) Оценка миелоидных (CD11b), Т-клеток (CD90.2) и В-клеток (CD19) после 34 дней культивирования. Увеличенная область показана на врезке. Сечение 7 мкм. Изображения были получены с помощью микроскопа живых клеток Nikon Eclipse Ti2-E. Масштабные линейки (D, E, F), 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3. Анализ матриксной ткани базальной мембраны. Трансплантаты были построены из стромы селезенки новорожденного, обедненной клетками PDGFRβ⁺MAdCAM-1⁺ (n = 4). Дополнительные данные доступны в режиме онлайн¹¹. (А) Макроскопический вид регенерированного селезеночного трансплантата через 4 недели после трансплантации под капсулу почки. Желтая область в виде прямоугольника указывает на регенерированную ткань селезенки. Изображение было получено с помощью стереомикроскопа Leica M60, оснащенного зум-адаптером Snap, и Apple iPhone 6S. Масштабная линейка, 1000 мкм. (B) Композитные многоцветные иммунофлуоресцентные изображения тканей трансплантата толщиной 30 мкм, криосекированных в корональной плоскости. Окрашивание антителами проводили с помощью указанных маркеров для визуализации микроархитектуры ткани селезенки. Изображения были получены с помощью микроскопа живых клеток Nikon Eclipse Ti2-E. Области, выделенные рамкой, показывают области с большим увеличением. Масштабная линейка, 1000 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Органоид No.	Стромальные клетки	Эритроцитов	Лимфоцитов
1	62	7.7	31
2	22	24	55
3	3.6	0.1	96
4	10	76	12

Таблица 1. Процентное соотношение популяций стромальных, эритроидных и лимфоидных клеток среди отдельных органоидов селезенки.

Дополнительный рисунок 1. Схематический обзор протокола, освещающий основные этапы создания матричных встроенных клеточных конструкций для исследований in vitro и in vivo . Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Discussion

Агрегация клеток селезенки новорожденных в полутвердой среде представляет собой жизнеспособный метод создания селезеночных конструкций. Аналогичные протоколы на основе базальной мембраны были использованы для инициирования трехмерных культур селезенки¹⁰. Здесь мы демонстрируем, что конструкции селезенки одинаково поддаются системам органоидных культур in vitro , а также моделям трансплантации in vivo . Следует отметить, что трансплантация культивируемых in vitro органоидов селезенки еще не тестировалась, но было бы интересно определить способность к полной или частичной регенерации ткани селезенки. Этот протокол также наследует методы агрегации клеток, описанные в предыдущих исследованиях трансплантации селезенки⁸. Эти исследования включали нагрузку клеточных агрегатов на коллагеновый лист с последующей трансплантацией под капсулу почки. Оболочка клеточных агрегатов внутри матрицы базальной мембраны дает явное преимущество с точки зрения ориентации трансплантата, где исключаются вариации, связанные с трансплантацией коллагена листовой стороной вниз по сравнению с трансплантацией клеточного агрегата вниз.

Методология подготовки матричных конструкций базальной мембраны относительно проста. Использование базальной мембранной матрицы с высокой концентрацией гарантирует, что клетки первоначально поддерживаются в агрегированном состоянии, прежде чем матрикс рассеется в течение нескольких дней. По нашему опыту, после тщательного наслоения (этап 2.6) и центрифугирования (шаг 2.8) клеточного раствора, взвешенного PBS, происходит минимальное перемешивание и разбавление матрицы базальной мембраны. Большинство оптимизаций сосредоточено вокруг позиционирования гранулы ячейки внутри матричной пробки (рис. 1). Эту проблему можно решить, проверив несколько переменных, таких как скорость центрифугирования, время, объемный состав матрицы базальной мембраны, объем взвешенного раствора ячейки PBS и размер наконечника пипетки. Количество клеток и их характеристики (размер, плотность) также могут влиять на настройки, и каждая подготовка клеток должна быть оптимизирована индивидуально.

Важно выделить несколько ограничений. Матрица базальной мембраны может быть чувствительным к температуре продуктом, поэтому следует позаботиться о том, чтобы реагенты работали быстро, чтобы они оставались холодными. Это предотвращает преждевременное затвердевание матрикса и обеспечивает надлежащую инкапсуляцию клеток. В то время как все соответствующие материалы хранятся, подготавливаются или обслуживаются в холодной среде, ручные операции (например, выталкивание наконечника пипетки, запечатывание гибкой лабораторной пленкой [Шаг 2.5]) могут по-разному приводить к внешнему нагреву пользователя, изменяя вязкость матрицы и влияя на характеристики миграции клеток во время центрифугирования. Таким образом, воспроизводимость внутри экспериментов и между ними может быть трудно достичь последовательно.

Вторым ограничением является требование к пользовательскому опыту и профессионализму. Для эффективного и успешного выполнения некоторых мануальных техник может потребоваться длительное обучение. Например, запечатывание наконечника пипетки лабораторной пленкой (шаг 2.5) может поначалу привести к низким показателям успеха, но с практикой это неизбежно улучшится. Компетентность в микрохирургических техниках на животных также приобретается путем повторения. При трансплантации необходимо соблюдать осторожность, особенно при введении наконечника пипетки под капсулу почки (шаг 4.2.10), вставке проволочного поршня для извлечения пробки (шаг 4.2.11) и извлечении наконечника из почки. Важно, чтобы пробка извлекалась осторожно и равномерно, одновременно извлекая наконечник пипетки. Избыточное движение может привести к перфорации капсулы почки или повреждению паренхимы, что приведет к чрезмерному кровотечению.

Таким образом, процесс инкапсуляции клеток в полутвердой матрице был описан здесь с акцентом на понимание формирования ткани селезенки. Эта система может быть в равной степени применена к широкому спектру типов клеток с потенциалом многократного последующего применения in vitro или in vivo .

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
96 Well Polypropylene 1,2 мл кластерные пробирки	Corning	CLS4401	Для помещения внутрь конической пробирки 14 мл
B-меркаптоэтанол	Gibco	21985023	Stock 55 мМ, используйте на 50 мкМ
коллагеназы D	Roche	11088858001
коллагеназы IV	Sigma-Aldrich	C5138	из Clostridium histolyticum
дезоксирибонуклеаза I (ДНКаза I)	Sigma-Aldrich	D4513	Дезоксирибонуклеаза I из поджелудочной железы крупного рогатого скота, тип II-S, лиофилизированный порошок, белок ≥ 80 %, ≥ 2 000 ЕД/мг белка
Дульбекко s Модифицированный Eagle' s Среда (DMEM)	Sigma-Aldrich	D5796	4500 мг/л глюкозы, L-глутамина и бикарбоната натрия, без пирувата натрия, жидкость. Стерильный процеженный.
Фосфатно-солевой буфер Дульбекко (PBS)	Sigma-Aldrich	D8537	Без хлорида кальция и хлорида магния, стерильно отфильтрованный
Eclipse 200 μ l Наконечники для пипеток	Labcon	1030-260-000	Bevel Point
Фетальная бычья сыворотка (FBS)	Gibco	26140-079	Лот # 1382243
GlutaMAX	Gibco	35050061	Stock 100X, используйте в 1X
Matrigel	Corning	354263	Matrigel matrix базальная мембрана высокой концентрации, лот # 7330186
MEM Заменимые аминокислоты	Gibco	11140076	Сток 100X, использование в 1X
Пенициллин/Стрептомицин	Gibco	15140122	Склад 10 000 единиц/мл Пенициллин, 10 000 мкг/мл Реверсивный клеточный фильтр стрептомицина
	STEMCELL Technologies	27216	70 μ m
Кольцевой пинцет	NAPOX	A-26	Размер кольца: 3 мм
Ингибитор горных пород (Y-27632)	MedChemExpres	HY-10071
Thermofisher Heraeus Megafuge 40R Центрифуга	Thermofisher		Скорость ускорения и замедления была установлена на 8
Ультратонкий пинцет	EMS	78340-51S	Модель 51S. Антимагнитные/антикислотные пинцеты из низкоуглеродистой аустенитной стали SA устойчивы к коррозии. Антибликовое сатинированное покрытие.
Vicryl 5/0 Шовный материал Лигапак Катушка	Ethicon	J283G
Wiretrol II Длинный проволочный плунжер	Drummond	5-000-2002-L	Поршень из нержавеющей стали, 25 & 50 & L/WRTL II, Long
Аппликатор для ран	MikRon	427630
Зажимы для ран	MikRon	427631	9 мм