Методическая статья

Подготовка мышей к модели тяжелого острого панкреатита с помощью комбинации церулеина и липополисахарида внутрибрюшинной инъекции

DOI:

10.3791/66780

⸱

10 мая 2024 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1The First Affiliated Hospital of Anhui University of Science & Technology, 2Medical College of Anhui University of Science & Technology, 3Endocrinology Department, The First Affiliated Hospital of Anhui University of Science & Technology, 4Department of Hepatobiliary Surgery, The First Affiliated Hospital of Anhui University of Science & Technology

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Внутрибрюшинное введение препарата является безопасным и эффективным неинвазивным подходом для индуцирования повреждения поджелудочной железы. В этом исследовании сравнивались пять различных протоколов внутрибрюшинных инъекций на мышах для индуцирования различной степени повреждения поджелудочной железы и была создана модель тяжелого повреждения поджелудочной железы для изучения патологических изменений и стратегий лечения тяжелого острого панкреатита (САП).

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Лечение тяжелого острого панкреатита (САП) с высокими показателями смертности представляет собой значительную клиническую проблему. Изучение патологических изменений, связанных с САП, с использованием животных моделей может помочь в определении потенциальных терапевтических мишеней и изучении новых подходов к лечению. Предыдущие исследования в первую очередь индуцировали повреждение поджелудочной железы путем инъекции тавиаурохолата натрия в ретроградный желчный проток, но влияние хирургического повреждения на качество животной модели остается неясным. В этом исследовании мы использовали различную частоту внутрибрюшинных инъекций церулеина в сочетании с различными дозами ЛПС для индуцирования повреждения поджелудочной железы у мышей C57BL/6J и сравнили степень повреждения по пяти протоколам внутрибрюшинных инъекций. Что касается индуцирования острого панкреатита у мышей, предлагается протокол внутрибрюшинной инъекции, который приводит к смертности до 80% в течение 5 дней. В частности, мыши получали десять ежедневных внутрибрюшинных инъекций церулеина (50 мкг/кг), за которыми следовала инъекция ЛПС (15 мг/кг) через час после последнего введения церулина. Регулируя частоту и дозировку вводимых лекарств, можно эффективно манипулировать тяжестью повреждения поджелудочной железы. Эта модель демонстрирует высокую управляемость и имеет короткий цикл репликации, что делает ее возможной для выполнения одним исследователем без необходимости использования дорогостоящего оборудования. Он удобно и точно моделирует ключевые характеристики заболевания, наблюдаемые в SAP человека, демонстрируя при этом высокую степень воспроизводимости.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Тяжелый острый панкреатит характеризуется быстрым началом, быстрым прогрессированием и высокими показателями смертности в области заболевания пищеварительной системы1. Высокий уровень смертности всегда был в центре внимания клинических исследований. Из-за непредсказуемых изменений клинических условий, гетерогенности проявлений болезни и ограниченной доступности образцов для человека, создание животных моделей становится все более важным для исследований болезней.

Ретроградная инъекция таурохолата натрия в общий желчный проток обычно используется для создания модели SAP2 на крысе. Моделируя обструкцию поджелудочной железы и индуцируя рефлюкс желчи и жидкости поджелудочной железы, этот метод моделирования демонстрирует высокий процент успеха при воспроизведении животных моделей SAP. Тем не менее, следует отметить, что инвазивная хирургия оказывает влияние на саму животную модель. Кроме того, этот метод ограничен более крупными животными, такими как крысы и собаки, которые в основном используются в качестве подопытных. В целях моделирования часто используются альтернативные методы, включая дуоденальную интубацию3, прямую пункцию двенадцатиперстной кишки4 и прямую пункцию желчного протока-протока поджелудочной железы5.

Внутрибрюшинные инъекции и методы диетического моделирования дают неинвазивные преимущества, которые могут быть применены к животным любого размера. Мышиная модель САП, индуцированная кормлением холин-дефицитным этионином (CDE)6, имеет определенные осложнения, такие как плохо контролируемая гипергликемия и гипокальциемия, что делает ее непригодной для оценки новых диагностических и терапевтических подходов. С другой стороны, внутрибрюшинное введение церулеина в сочетании с L-аргинином7 представляет собой наиболее часто используемый метод индуцирования острого панкреатита у мышей. В частности, повторное внутрибрюшинное введение Caerulein — аналога холецистокинина — обеспечивает весьма подходящий подход к исследованию различных аспектов, связанных с этим деструктивным заболеванием, включая патогенез, воспаление и процессы регенерации. Благодаря своему структурному сходству с холецистокинином (ЦКК), церулин эффективно стимулирует сокращение желчного пузыря и секрецию ферментов поджелудочной железы, что приводит к дисбалансу секреции ферментов с последующим саморазрушением8. Липополисахарид (ЛПС), будучи повсеместно распространенным и широко изученным как молекула молекулы, ассоциированной с патогенами, может быть объединен с церулеином путем внутрибрюшинной инъекции для создания эффективной модели САП у мышей. Эта комбинация быстро запускает и высвобождает значительное количество воспалительных цитокинов, что приводит к чрезмерному местному и системному воспалению. В нескольких исследованиях сообщалось об индукции моделей SAP у мышей путем внутрибрюшинного введения церулеина в сочетании с ЛПС. Это может быть связано с тем, что внутрибрюшинное введение церулеина может вызвать отек поджелудочной железы и кровоизлияние у мышей, в то время как добавление ЛПС может немедленно вызвать панкреонекроз и усугубить системную воспалительную реакцию, сепсис и даже органную недостаточность. В настоящее время существуют различия в дозировке и частоте внутрибрюшинных инъекций церулеина, а также непоследовательность в дополнительной дозировке ЛПС. Достижение согласованности в моделях SAP мыши является сложной задачей 9,10,11,12; Поэтому необходимо установить стандартизированный протокол для получения идеальной модели. В данной статье мы опишем протокол внутрибрюшинного введения мышам и исследуем оптимальную частоту инъекций и дополнительную дозировку ЛПС.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол был рассмотрен и одобрен Комитетом по этике Первой аффилированной больницы Аньхойского университета науки и технологии (Хуайнань, Китай) (Этический кодекс: 2023-KY-905-001). Исследование проводилось в соответствии с рекомендациями Национального института здравоохранения по уходу и использованию исследовательских грызунов во всех процедурах на животных. В настоящем исследовании использовались взрослые мыши C57BL/6J с массой тела 20-30 г. Мышей содержали в лаборатории на животных в течение одной недели в контролируемых условиях (около 21 °C с 12-часовым чередованием цикла дня и ночи). Мыши имели свободный доступ к пище и воде на протяжении всего времени. Подробная информация о реактивах и оборудовании, использованных в исследовании, приведена в Таблице материалов.

1. Подготовка животных

  1. Распределите 84 здоровых мышей C57BL/6J на шесть групп, включая контрольную группу с травмой поджелудочной железы (PI) I, PI II, PI III, PI IV и PI V.
  2. Прежде чем начать процедуру моделирования, пометьте каждую группу мышей ушными насечками и дайте им поститься в течение 12 часов.

2. Приготовление индуцированного разбавителя лекарственного средства

  1. Растворите церулен (1 мг) в 1 мл PBS и поставьте в холодильник при температуре -20 °C.
  2. Измерьте и запишите массу подопытных мышей за 1 ч до внутрибрюшинного введения препарата.
  3. Извлеките требуемую общую массу церулеина в соотношении 50 мкг/кг, исходя из общего веса всех мышей.
  4. Полученный препарат Церулеина снова разведите с PBS.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Общий объем разведения PBS должен быть эквивалентен 5-кратному общему весу всех мышей. Тот же метод разбавления использовали для получения разбавителя ЛПС.

3. Внутрибрюшинное введение

Примечание: Внутрибрюшинные инъекции вводились каждой группе мышей в соответствии с протоколом, описанным в Дополнительной таблице 1 , для индукции модели. Еще 10 мышей были сгруппированы и обработаны в соответствии с 7-дневной выживаемостью.

  1. Возьмите и удерживайте мышей таким образом, чтобы брюхо мышей было обращено вверх, а голова располагалась ниже хвоста, чтобы предотвратить повреждение органов при введении шприца.
  2. Продезинфицируйте брюшную полость мышей с помощью ватных шариков с 75% спиртом.
  3. Держите шприц в правой руке (с помощью иглы размером ≤0,5/≥0,3) и введите иглу в подкожную кожу с левой стороны от белой линии живота.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Перейдите на правую сторону для следующей инъекции.
  4. Как только игла достигнет подкожного слоя, переместите ее вперед примерно на 3-5 мм, а затем введите иглу шприца в брюшную полость под углом 45°. В этот момент следует почувствовать некоторое сопротивление.
  5. Держите иглу неподвижно и вводите вещество медленно.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не превышайте в 5 раз значение веса мышей в качестве объема одной внутрибрюшинной инъекции.
  6. После инъекции вытащите иглу и аккуратно помассируйте и прижмите место инъекции стерильным ватным тампоном, чтобы полностью диффундировать препарат в брюшную полость мышей.
  7. С помощью нового шприца повторите то же самое со следующими экспериментальными мышами.

4. Тестирование поведенческих способностей на открытом воздухе

Примечание: Через 12 часов после последней внутрибрюшинной инъекции было проведено тестирование поведенческих способностей в открытом поле для оценки общей дистанции активности и времени неподвижности мышей.

  1. Поместите четыре одинаковые белые коробки прямо под камеру.
  2. Подключите камеру к компьютеру с помощью видеокабеля.
  3. Перед началом эксперимента убедитесь, что экспериментальная коробка чистая и не имеет каких-либо запахов.
  4. Расположите животное в центре сетки, лицом от экспериментатора, и дайте ему адаптироваться к окружающей среде в течение 10 минут.
  5. Запустите программу для отслеживания видео и нажмите на меню «Файл », чтобы создать новый эксперимент.
  6. Настройте мониторинг для четырех одновременных полей зрения.
  7. Отметьте длину и ширину экспериментального объекта, который может перемещаться в пределах коробки на экране мониторинга в режиме реального времени (30 см × 30 см).
  8. Как только настройка будет завершена, приступайте к видеонаблюдению и записи.
  9. Запишите активность мышей в течение 15 минут.
  10. После тестирования снимите животное с сетки и верните его в клетку. Тщательно очистите сетку с помощью стерилизатора, содержащего диоксид хлора.

5. Сбор и исследование периферической крови мышей

  1. Усыпьте мышей (в соответствии с протоколом, утвержденным учреждением).
    1. Провести эвтаназию подопытным мышам через 36 ч после внутрибрюшинной инъекции. Измерьте и запишите массу тела мышей до эвтаназии.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Вводите 0,18 мл 10% хлоралгидрата внутрибрюшинно, не допуская реакции на стимуляцию пальца ноги или хвоста.
    2. Левой рукой закрепите мышей, а правой рукой держите ножницы, чтобы подстричь усы с одной стороны мышей.
    3. Аккуратно надавите на кожу вокруг глаза, чтобы вызвать заложенность и выпячивание глазного яблока.
    4. С помощью изогнутых щипцов захватите глазное яблоко и быстро удалите его, собрав периферическую кровь в микроцентрифужную пробирку.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Использовались два различных типа микроцентрифужных пробирок, один из которых содержал антикоагулянт, а другой без.
    5. Одновременно слегка надавите на область сердца мыши средним пальцем левой руки, чтобы увеличить скорость перекачивания сердца.
  2. Оставьте периферическую кровь без антикоагулянта при комнатной температуре на 30 минут.
  3. Измерьте концентрации амилазы сыворотки крови (Amy) и липазы (Lip) с помощью автоматизированного биохимического анализатора методом ферментной скорости и методом циркуляции ферментов (следуя инструкциям производителя).
  4. Определить уровни воспалительных индикаторов, таких как прокальцитонин (ПКТ) в плазме с помощью хемилюминесцентного метода с использованием коммерческого хемилюминесцентного тепловизора (следуя инструкциям производителя).
  5. Используйте наборы для ИФА для измерения уровней HMGB-1, IL-6 и TNF-α в сыворотке крови мышей (следуя инструкциям производителя).
  6. Проанализируйте периферическую кровь, обработанную антикоагулянтом, с помощью полностью автоматического анализатора клеток крови для оценки соответствующих параметров.

6. Забор ткани поджелудочной железы и подготовка парафинового среза

  1. Поместите мышей в лежачее положение и закрепите их на пластине из пенопласта.
  2. Выбрейте и продезинфицируйте эту область, затем сделайте срединный разрез брюшной полости и переверните тонкую кишечную трубку вправо, чтобы полностью обнажить поджелудочную железу.
  3. Отсоедините двенадцатиперстную кишку и пилорический проток и найдите тонкую кишку под поджелудочной железой. Полностью освободить ткань поджелудочной железы по ходу кишечного протока.
  4. С помощью беззубых щипцов зажмите селезенку и аккуратно потяните вверх.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не прикасайтесь непосредственно к ткани поджелудочной железы и избегайте применения чрезмерной силы в течение всего процесса диссоциации.
  5. Резко рассекают заднюю ткань связок поджелудочной железы вплоть до головки поджелудочной железы и разъединяют желчный проток и кровеносные сосуды.
  6. Удалите ткани поджелудочной железы, промокните поверхность влагой впитывающей бумагой, взвесьте и запишите.
  7. Зафиксируйте половину ткани поджелудочной железы с помощью 4% параформальдегида и храните другую половину в холодильнике при температуре -80 °C.
  8. Приготовьте срезы парафина для поджелудочной железы, следуя приведенным ниже инструкциям.
    1. Очистите неподвижную ткань поджелудочной железы 75% спиртом и обрежьте ее до размера примерно 0,5 см × 0,5 см.
    2. Погрузите салфетку в 70% этанол на 20 минут, 80% этанол еще на 20 минут и 90% этанол на 15 минут.
    3. Дважды обработайте ткань 95% этанолом в течение 15 минут каждый раз, а затем дважды 100% этанолом в течение 5 минут каждый раз.
    4. Подвергните ткань двум раундам по 12 минут и 5 минут обработки раствором ксилола для обеспечения прозрачности.
    5. Замочите прозрачную ткань в восковом баке при температуре 65 °C на 1 час.
    6. Погрузите ткань в расплавленный парафин и дайте ей остыть. Получите срезы парафина поджелудочной железы с помощью слайсера (толщина: 5 мкм).
    7. Полученные ломтики парафина расплющить в воде при температуре 45 °C, смонтировать и высушить (условия выпекания: 40 °C в течение 14-16 часов).

7. Окрашивание гематоксилином и эозином (H&E)

  1. Срезы парафина поджелудочной железы поместить в ксилол I и II на 30 мин, затем в безводный, 95%, 85% и 75% спирт на 5 мин и сверхчистую воду на 5 мин.
  2. Окрашивать ядро клетки гематоксилином в течение 160 с, затем медленно промыть проточной водой.
  3. Нанести раствор для дифференцировки спирта соляной кислоты на 5-10 с, затем быстро смыть проточной водой.
  4. Срезы обработать безводным спиртом в течение 5 минут.
  5. Инкубируйте цитоплазму с эозином в течение 30 с, затем промойте проточной водой.
  6. Погрузите срезы в 75%, 85%, 95% и 100% этанол на 10 с каждая, затем обработайте ксилолом в течение 5 минут для обезвоживания.
  7. Наконец, запечатайте срезы нейтральной смолой и понаблюдайте под микроскопом.
  8. Выполнение патологической оценки и нормативов13.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Определяйте тяжесть панкреатита на основании таких показателей, как отек, ацинарный некроз, кровотечение, кровотечение и жировой некроз, а также воспалительное и периваскулярное воспаление. Используйте ранее опубликованные рекомендации по внедрению для начисления баллов13.

8. Иммуногистохимическое окрашивание

  1. Депарафинизируйте залитые парафином участки ткани поджелудочной железы в ксилоле и затем регидратируйте их в градиенте растворов этанола.
  2. Проведите эндогенную ферментную блокаду с использованием 3%H2O2 в течение 20 мин после 30-минутного разрыва мембраны.
  3. Блокируйте антитела 5% бычьей сывороткой при комнатной температуре в течение 30 минут, затем инкубируйте в течение ночи при 4 °C с разведением кролика анти-HMGB1 в соотношении 1:1500.
  4. Промойте срезы PBS, затем инкубируйте их в соответствующих вторичных антителах в течение 30 мин при 37 °C. После этого проведите проявку цвета DAB, противоокрашивание гематоксилином, запечатайте нейтральной резинкой.

9. Метод TUNEL для выявления апоптоза в срезах поджелудочной железы

  1. Очистите парафин от парафина поджелудочной железы в ксилоле в течение 5 минут, повторите дважды и промойте градиентным этанолом (100% в течение 5 минут, 90% в течение 2 минут, 70% в течение 2 минут и дистиллированной водой в течение 2 минут).
  2. Смойте лишнюю жидкость вокруг парафиновых срезов с помощью PBS. Обработайте каждый образец 100 мкл протеиназы К, обеспечивая полное покрытие ткани. Инкубируйте образцы при 37 °C в течение 20 минут. Впоследствии замочите образцы в PBS 3 раза, каждый раз на 5 минут.
    Примечание: Раствор протеиназы К получали путем разбавления исходного раствора протеиназы К (200 мкг/мл) PBS в соотношении 1:9 (объем), в результате чего конечная концентрация составила 20 мкг/мл, исключая ДНКазу. Тщательная промывка протеиназы К необходима для того, чтобы избежать вмешательства в последующие реакции мечения.
  3. Добавьте подходящее количество 3% H2O2 (разбавленного PBS) в ткань, чтобы полностью проникнуть в нее, и инкубируйте в течение 20 минут. Промойте салфетку PBS 3 раза по 5 мин каждый.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Парафиновые срезы следует поддерживать во влажном состоянии. Для инактивации эндогенных пероксидаз в тканях время инкубации не должно быть слишком большим, чтобы предотвратить ложноположительные результаты из-за разрыва ДНК, вызванного 3% H2O2.
  4. Покройте всю площадь тестируемого образца 50 μл уравновешивающего буфера и инкубируйте в течение 10 минут.
  5. Удалите как можно больше буфера Equilibration. Затем добавьте 56 мкл инкубационного буфера TdT в каждый образец ткани и инкубируйте в течение 1 ч (при комнатной температуре).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Нельзя давать предметному стеклу высыхать, а также следует избегать воздействия света. Инкубационный буфер TdT готовили в соответствии с инструкцией производителя (Фермент TdT рекомбинантный: Biotin-dUTP Labeling Mix: Equilibration Buffer = 1 μL: 5 μL: 50 μL).
  6. Немедленно промойте образцы тканей с помощью PBS. Промойте их 4 раза по 5 минут. Аккуратно удалите излишки раствора PBS вокруг образцов с помощью фильтровальной бумаги.
  7. Добавьте 100 мкл предварительно разведенного реакционного раствора стрептавидин-HRP (Streptavidin-HRP: TBST = 1:300) в каждый образец ткани для реакции стрептавидин-HRP. Выдерживать в течение 30 минут. Затем промойте образцы PBS и промойте их 3 раза по 5 минут каждый.
  8. Выполните окрашивание DAB, добавив 50 μL DAB в каждую парафиновую срезку. Наблюдайте за окрашиванием под микроскопом в режиме реального времени. После появления положительного окрашивания сразу же поместите предметные стекла во влажный бокс. Остановите реакцию, промыв его чистой водой.
  9. Погрузите предметные стекла в раствор для окрашивания гематоксилина на 3-5 минут, затем промойте чистой водой.
  10. Дифференцировать в растворе дифференцировки гематоксилина в течение примерно 2 с с последующим немедленным промыванием чистой водой.
  11. Добейтесь синего цвета с помощью раствора для повторного воронения гематоксилина в течение нескольких секунд и промойте предметные стекла чистой водой.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Проведите микроскопическое исследование после ядерного окрашивания. Если окрашивание получилось слишком темным, верните предметные стекла в раствор для дифференцировки. Если окрашивание слишком светлое, возобновите процесс окрашивания с этапа ядерного окрашивания.
  12. Обезвожьте образцы 4 порциями свежего безводного этанола в течение 5 минут каждая. Затем замочите их в бутаноле на 5 минут и в ксилоле на 5 минут. Наконец, используйте свежий ксилол еще 5 минут.
  13. Закрепите предметные стекла с помощью нейтральной резинки. Дайте им высохнуть на воздухе естественным образом или высушите в духовке при температуре 60 °C.
  14. Провести гистологическое исследование с помощью микроскопа белого света. Ядра апоптоза будут иметь коричневый цвет.
  15. Рассчитайте соответствующий индекс апоптоза (AI).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Наблюдайте за предметными стеклами двойным слепым способом. На предметных стеклах TUNEL случайным образом выберите 5 положительных областей при большом увеличении (400x) и подсчитайте не менее 100 ацинарных клеток в каждой области, чтобы определить процент положительных клеток. AI = (общее количество апоптотических клеток/общее количество клеток) × 100%.

10. Проточная цитометрия

  1. Получить свежие ткани поджелудочной железы и тщательно промыть их после перфузии PBS.
  2. Приготовьте 0,5% раствор коллагеназы для внутривенного пищеварения и используйте ножницы для стерильных тканей для адекватного переваривания тканей поджелудочной железы.
  3. Добавьте 5% раствор для прекращения сбраживания БСА в зависимости от состояния фрагментов поджелудочной железы и помутнения жидкости и центрифугируйте смесь при низкой температуре в течение 5 мин (~300 x g, 4 °C).
  4. Выбросьте надосадочную жидкость, чтобы прекратить пищеварение.
  5. Готовят питательную среду для клеточных культур, содержащую фенилметансульфонилфторид (PMSF) и 2,5% суспензию фетальных бычьих клеток сыворотки для ресуспендирования клеток поджелудочной железы.
  6. Фильтруйте суспензии ацинарных клеток поджелудочной железы через нейлоновую сетку толщиной 200 меш, чтобы получить клеточные суспензии путем клеточной фильтрации.
  7. Центрифугируйте суспензию ацинарных клеток поджелудочной железы при низкой температуре (соблюдайте условия, указанные в шаге 10.3).
  8. Выбросьте надосадочную жидкость.
  9. Промойте клетки с помощью предварительно охлажденного PBS.
  10. Аккуратно ресуспендируйте клетки в предварительно охлажденном связывающем буфере 1x с помощью центробежной ресуспензии.
  11. Пометьте ацинарные клетки поджелудочной железы Аннексином V-FITC/PI в соответствии с инструкциями производителя после корректировки концентрации клеток.
  12. Используйте проточную цитометрию в течение 1 ч для обнаружения апоптоза в ацинарных клетках поджелудочной железы.

11. Вестерн-блоттинг каспазы-3 и HMGB-1

  1. Извлеките белок поджелудочной железы.
    1. Извлеките 50 мг ткани поджелудочной железы и разрежьте ее на мелкие фрагменты.
    2. Добавьте 1 мл буфера для лизиса RIPA (содержащего PMSF и ингибитор фосфорилированной протеазы).
    3. Гомогенизируйте ткань поджелудочной железы на льду в течение 5 минут с помощью электрической кофемолки.
    4. Гомогенизированную ткань инкубировать на льду с легким встряхиванием в течение 2 ч.
    5. Центрифугируйте гомогенат при 4 °C в течение 10 мин при концентрации 4 500 x g.
    6. Соберите надосадочный раствор и храните его при температуре -80 °С.
  2. Выполните количественное определение белка.
    1. Разбавьте определенный объем стандартного образца БСА (25 мг/мл) до концентрации 0,5 мг/мл.
    2. Приготовьте определенное количество рабочего раствора ВСА, смешав 50 объемов раствора ВСА А с 1 объемом раствора ВСА В, обеспечивая тщательное и равномерное перемешивание.
    3. Поместите стандартный образец BSA в стандартные отверстия для образцов на 96-луночном планшете в порядке 0, 1, 2, 4, 8, 12, 16 и 20 μл. Сбалансируйте объем каждого отверстия дистиллированной водой, в результате чего общий объем составит 20 μл.
    4. Добавьте 2 мкл проб в отверстия для проб, затем последовательно добавьте 18 мкл дистиллированной воды для разбавления (1:9).
    5. Заполните каждую лунку 200 μL рабочего раствора BCA и дайте ему постоять при температуре 37 °C в течение примерно 20-30 минут.
    6. Измерьте поглощение на длине волны 562 нм. Рассчитайте концентрацию белка в образцах на основе стандартной кривой.
    7. Добавьте определенный объем раствора крекинга RIPA и разбавляющий буфер для разбавления образцов до тех пор, пока концентрация не достигнет 5-10 мкг/мкл, что считается целесообразным.
    8. Хранить образцы при температуре -20 °C после денатурации белка (100 °C; 10 мин).
  3. Выполните вестерн-промокание.
    1. Подготовьтесь к SDS-PAGE.
      1. Установите формы для производства клея и проверьте их герметичность.
      2. Добавьте TEMED в 10% разделительный клей и равномерно перемешайте.
      3. Впрыскивайте смесь в форму, составляя примерно две трети объема, при этом не допуская образования пузырей.
      4. Добавьте изопропанол в форму и прижмите клей около 40 минут.
      5. Используйте эту же программу для настройки 5% концентрированного клея.
      6. Вылейте изопропанол и сразу же добавьте клей.
      7. Расческу расположить вертикально до тех пор, пока клей полностью не полимеризуется.
    2. Выполните операцию электрофореза.
      1. Добавьте образец, подлежащий испытанию, в ожидаемом порядке экспериментального контроля, в обратном порядке, в отверстия для отбора проб клея SDS-PAGE.
      2. Одновременно добавьте белковую метку, чтобы определить местоположение целевого белка и внутреннего эталонного белка.
      3. Поместите образец в резервуар для электрофореза после завершения добавления образца.
      4. Первоначально запустите при напряжении 80 В в течение 30 минут, а затем запустите гель для отделения белка при 100 В в течение 60 минут.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Следует обратить внимание на положение бромфенольного синего во избежание чрезмерного электрофореза.
    3. Выполните перенос белка.
      1. Разрежьте пленку PVDF в правом верхнем углу, чтобы она служила отметкой.
      2. Поместите пленку PVDF в раствор метанола на 5-10 секунд для активации.
      3. Замочите пленку PVDF в буфере для электрофореза примерно на 15 минут.
      4. Осторожно удалите гель после электрофореза и обрежьте излишки геля, следя за тем, чтобы гель оставался влажным на протяжении всего процесса.
      5. Соберите шину в следующем порядке: отрицательная пластина → губка → три слоя фильтровальной бумаги → геля → пленки ПВДФ → три слоя фильтровальной бумаги → губка → положительная пластина.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что между гелем и пленкой PVDF нет пузырей.
      6. Поместите собранный зажим во влажную вращающуюся канавку (от черного до черного) с кубиками льда, расположенными вокруг него.
      7. Включите питание и начните перенос пленки при 400 мА в течение 100 минут.
    4. Выполняйте герметизацию пленки PVDF и инкубацию первичных и вторичных антител.
      1. Аккуратно снимите пленку PVDF после переноса и промойте TBST в течение 10 минут, повторяя процесс 3-5 раз.
      2. Запечатайте пленку ПВДФ в 5% обезжиренном молоке на 2 часа.
      3. Снимите пленку PVDF и промойте TBST в течение 10 минут, повторив процесс 4 раза.
      4. Поместите пленку PVDF и разведенное первичное антитело вместе в холодильник при температуре 4 °C с легким встряхиванием и инкубируйте в течение ночи.
      5. На следующий день снимите пленку ПВДФ и смойте TBST в течение 10 минут, повторив процесс 4 раза.
      6. Инкубируйте пленку PVDF в меченном HRP разбавителе вторичных антител в течение приблизительно 2 ч.
      7. Промойте пленку ПВДФ с TBST в течение 10 минут, повторив процесс 4 раза.
    5. Экспонируйте пленку и анализируйте ее.
      1. Нанесите приготовленный раствор ECL на пленку равномерно.
      2. Экспонируйте пленку в темной комнате с экспонометром примерно на 2-3 минуты, а затем храните ее.
      3. Проведите анализ с помощью программного обеспечения image J.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Процесс экспериментального моделирования мышей проиллюстрирован на рисунке 1. Через 12 ч после завершения инъекции с помощью видеорегистратора открытого поля контролировали расстояние движения и продолжительность неподвижности различных экспериментальных групп мышей в течение 5 циклов (рис. 2А). В течение 5 циклов мыши в группе PI V сохраняли низкий уровень дистанции движения в течение 3 минут, в то время как коэффициент неподвижности в течение 3 минут увеличивался с каждым последующим циклом (рис. 2B, C). Кроме того, был проведен статистический анализ общего расстояния передвижения мышей из разных экспериментальных групп в течение 5 циклов. Группа PI V показала наименьшее общее расстояние движения по сравнению с другими экспериментальными группами, и разница была статистически значимой (p < 0,001) (рис. 2D, E). За исключением контрольной группы и группы PI I, мыши в других экспериментальных группах показали отрицательный рост веса D-значения. Среди них группа PI V показала наибольшее изменение веса, а разница в изменении веса по сравнению с другими экспериментальными группами была статистически значимой (рисунок 2F). После оценки выживаемости еще 10 мышей в каждой опытной группе, результаты показали, что смертность мышей в группе PI V достигла 80% на5-й день. Тем не менее, не было статистически значимой разницы в уровне смертности между другими четырьмя экспериментальными группами и мышами контрольной группы (рисунок 2G).

При использовании мощного микроскопа в группах мышей с PI IV и PI V наблюдался значительный клеточный отек, некроз и воспалительная инфильтрация клеток (рис. 3A, B). Используя критерии ранжирования, представленные в Дополнительной таблице 2, оценивали патологию поджелудочной железы различных экспериментальных групп мышей, и наблюдали значимые различия в оценке патологии поджелудочной железы по сравнению с мышами контрольной группы (p < 0,001) (Рисунок 3C; Дополнительный рисунок 1). Кроме того, по сравнению с контрольной группой, уровни сывороточной амилазы и липазы у измеряемых мышей были достоверно выше в экспериментальных группах PI II - PI V, и различия были статистически значимыми. Интересно, что статистически значимой разницы у мышей группы PI I не было (рисунок 3D, E). Методом ИФА оценивали уровни маркеров воспаления14, включая TNF-α и IL-6, в сыворотке крови мышей. Результаты показали, что уровни TNF-α и IL-6 у мышей группы PI V были значительно выше, чем в других экспериментальных группах, и различия были статистически значимыми (рис. 3F, G). По сравнению с контрольной группой, уровни ПКТ повысились во всех четырех экспериментальных группах, но статистически значимой была только разница в группе PI V (p < 0,05) (рисунок 3H).

Апоптотический статус тканей поджелудочной железы в разных экспериментальных группах мышей
При проведении окрашивания TUNEL на тканях поджелудочной железы каждой группы мышей наблюдался статус клеточного некроза в тканях поджелудочной железы разных экспериментальных групп (рис. 4А). Значения оттенков серого (OD) на единицу площади участков ткани поджелудочной железы и положительная скорость клеточного некроза были полуколичественно проанализированы с помощью программного обеспечения Image J. Результаты показали, что по сравнению с другими экспериментальными группами уровень некроза клеток в тканях поджелудочной железы у мышей группы PI V был достоверно повышен, и разница была статистически значимой (p < 0,001) (рис. 4B,C). Эксперименты с белковым иммуноблоттингом были проведены для оценки уровней экспрессии цистеиниласпартатспецифической протеиназы-3 (Каспазы-3), маркера клеточного некроза, в тканях поджелудочной железы мышей из разных экспериментальных групп (рис. 4D). Количественная оценка экспрессии каспазы-3 показала, что уровень экспрессии белка каспазы-3 в тканях поджелудочной железы группы PI V был достоверно повышен, и разница была статистически значимой (p < 0,001). Уровни экспрессии белка количественно оценивали и нормализовали по внутреннему контролю GapDH (рис. 4E). Кроме того, свежие суспензии ацинарных клеток поджелудочной железы были помечены аннексином V-FITC/PI и проанализированы с помощью проточной цитометрии. Было обнаружено, что по сравнению с другими экспериментальными группами мышей, группа PI V имела значительно более высокую положительную частоту гибели клеток, что было статистически значимым (p < 0,001) (рис. 4F, G).

Содержание HMGB-1 в периферической сыворотке крови и уровень экспрессии HMGB-1 в ткани поджелудочной железы
С целью изучения взаимосвязи между белком HMGB-1 и повреждением поджелудочной железы было проведено иммуногистохимическое окрашивание и количественное определение тканей поджелудочной железы мышей в каждой экспериментальной группе. Выявлена статистически значимая разница между экспериментальной и контрольной группами (p < 0,001) (рис. 5A, B). С помощью ИФА измеряли уровни HMGB-1 в сыворотке крови мышей из разных экспериментальных групп. Результаты показали, что по сравнению с контрольной группой, сывороточные уровни HMGB-1 были достоверно выше во всех экспериментальных группах, при этом самый высокий уровень наблюдался в группе PI V, а разница была статистически значимой (p < 0,001) (рисунок 5C). Кроме того, вестерн-блоттинг выявил повышенную экспрессию белка HMGB-1 в тканях поджелудочной железы мышей во всех экспериментальных группах, со статистически значимыми различиями по сравнению с контрольной группой (p < 0,001) (рис. 5D, E).

figure-results-1
Рисунок 1: Экспериментальная блок-схема. День 2 и день 3: Внутрибрюшинная инъекция. День 4: Эксперимент в открытом поле был начат через 12 ч после последней внутрибрюшинной инъекции. День 5: Усыплен через 36 ч после внутрибрюшинной инъекции. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-2
Рисунок 2: Макроскопические изменения в модели мышей PI. (A) Изображен график траектории движения мышей в реальном времени. (В) Общее расстояние перемещения в течение каждого периода мониторинга для различных экспериментальных групп мышей. (В) Процент времени неподвижности в течение каждого периода мониторинга для различных экспериментальных групп мышей. (Д,Э) Общий процент расстояния движения и времени неподвижности в течение 15 мин были проанализированы у мышей разных экспериментальных групп. (F) Показано D-значение, представляющее вес мышей до и после процесса моделирования. (G) Выживаемость 10 мышей в каждой группе наблюдалась в течение 7 дней после внутрибрюшинной инъекции. Данные выражаются как средние ± SEM, n = 4. "ns" обозначает не значимый, *P < 0,05, ****P < 0,001. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-3
Рисунок 3: Патологические изменения у мышей с панкреатитом в различных экспериментальных группах. (A) Гистологические срезы панкреатической ткани мышей с H&E в различных экспериментальных группах (залитые парафином срезы панкреатической ткани, окрашенные гематоксилином и эозином, увеличение в 100 раз и масштабные линейки 200 мкм, и 400-кратное и масштабные полосы 50 мкм, соответственно. Желтыми длинными стрелками обозначены островки; красные длинные стрелки указывают на ацинарные клетки; коричневые длинные стрелки указывают на кровеносные сосуды; синими длинными стрелками обозначены протоки). (B) Расчет отношения массы поджелудочной железы к массе тела у мышей. (В) Патологическая оценка поджелудочной железы мышей. (Д,Э) Определение уровня амилазы и липазы в сыворотке крови у мышей. (Ф-Г) Измерение с помощью ИФА уровней ФНО-α и ИЛ-6 в сыворотке крови у мышей. (H) Оценка уровня РСТ. Данные выражаются как средние ± SEM, n = 4. "ns" обозначает не значимый, *P < 0,05, ****P < 0,001. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-4
Рисунок 4: Апоптоз ткани поджелудочной железы у мышей. (A) Репрезентативные изображения окрашивания TUNEL были получены из парафиновых срезов поджелудочной железы мышей и изображений увеличенной площади. (400x, масштабная линейка 50 мкм, коричневато-желтые - положительные клетки). (В,В) Количественный анализ значения оттенков серого на единицу площади окрашенных методом TUNEL срезов поджелудочной железы мышей и процентного соотношения положительно окрашенных мертвых клеток. (D) Уровень экспрессии каспазы-3 в ткани поджелудочной железы был определен с помощью вестерн-блоттинга. (E) Количественная оценка экспрессии каспазы-3 в ткани поджелудочной железы. (F) Проточная цитометрия была использована для оценки степени гибели клеток в ацинарных клетках поджелудочной железы мышей. (G) Перечисление мертвых клеток поздней стадии в ацинарных клетках поджелудочной железы мыши. Данные выражаются как средние ± SEM, n = 4. "ns" обозначает не значимый, *P < 0,05, ****P < 0,001. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-5
Рисунок 5: Экспрессия HMGB-1 в ткани поджелудочной железы мышей. (A) Репрезентативные изображения и увеличенные изображения (x400, масштабная линейка 50 мкм) иммуногистохимического окрашивания HMGB-1 на срезах поджелудочной железы. Коричневато-желтый цвет указывает на положительные клетки (n = 4). (B) Процент HMGB-1-положительных клеток в срезах ткани поджелудочной железы (n = 24). (C) Уровень HMGB-1 в сыворотке крови мышей (n = 4). (Д,Э) Вестерн-блоттинг проводили для определения уровня экспрессии HMGB-1 в ткани поджелудочной железы и получения результатов количественной оценки (n = 4). Данные выражаются в виде средних значений ± SEM, "ns" обозначает не значимые, *P < 0,05, ****P < 0,001. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Дополнительный рисунок 1: Повреждение полиорганов на мышах группы PI V. (A) Репрезентативные изображения гистологических изменений в тканях поджелудочной железы, легких, печени и почек, собранные у мышей группы CON и PI V, были проанализированы с помощью окрашивания H&E (200-кратное увеличение, масштабная линейка 50 мкм). Патологические изменения, связанные с некрозом ацинарных клеток, обозначены черными стрелками. Желтые стрелки указывают на патологические изменения, характеризующиеся интерстициальным кровоизлиянием и отеком в альвеолах. Отек и некроз гепатоцитов обозначаются зелеными стрелками. Патологические изменения, связанные с гломерулярным кровоизлиянием, отмечены красными стрелками. (B) Расчет гистологических баллов проводили на тканях поджелудочной железы, легких, печени и почек, полученных от мышей группы CON и PI V группы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительная таблица 1: Протокол внутрибрюшинного введения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительная таблица 2: Критерии патологической оценки тяжести панкреатита. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В настоящее время не хватает эффективных средств для снижения высокой смертности у пациентов с тяжелым острым панкреатитом. Крайне важно исследовать эффективность лекарственных препаратов в усилении механизмов иммунной стабильности. Существует острая потребность в идеальной животной модели для тяжелого острого панкреатита. Мыши с генетическим фоном C57BL/6J широко используются в биомедицинских исследованиях, в том числе в исследованиях по патофизиологии SAP. Более 70 лет генетической дифференциации у мышей B6J привели к спонтанной делеции нескольких экзонов15, что привело к снижению чувствительности к Caerulein-индуцированному повреждению поджелудочной железы16. Кроме того, существующие животные модели острого панкреатита имеют ограничения, такие как хирургическая травма или применимость только к более крупным животным, что препятствует научным исследованиям с использованием этих моделей. Поэтому очень важно создать стабильную, эффективную и удобную животную модель с использованием этого конкретного генного штамма.

Церулин является аналогом холецистокинина, который вызывает повреждение тканей поджелудочной железы, вызывая относительную обструкцию пищеварительной жидкости поджелудочной железы и секреции ферментов посредством высокочастотных инъекций в течение короткого периода времени, когда мыши натощались и накопили достаточное количество пищеварительнойжидкости. ЛПС является основным компонентом, содержащимся в клеточных стенках бактерий, и может вызывать MODS и SIRS у мышей18. Предыдущее исследование показало, что сочетание инъекций церулеина с разной частотой с различными дозами ЛПС, вводимыми через внутрибрюшинную инъекцию, вызывает аналогичные патологические изменения, наблюдаемые у человека SAP19,20. В этом исследовании использовался неинвазивный подход для индуцирования различной степени повреждения поджелудочной железы путем комбинации различных частот инъекций церулеина с различными дозами ЛПС, вводимыми внутрибрюшинно мышам. Обеспечение равномерной абсорбции брюшиной имело решающее значение при разработке протокола. Чтобы выполнить это требование, крайне важно строго придерживаться этапов внутрибрюшинного введения, чтобы обеспечить точный контроль за введением каждого препарата. Кроме того, осторожное растирание и соответствующее давление на место инъекции стерильным ватным тампоном после каждой инъекции лекарства необходимы для равномерного распределения лекарства по всей брюшной полости. Кроме того, первостепенное значение имеет точное и аккуратное размещение булавочной головки в брюшной полости, когда игла направлена в центральную область верхней части живота. Необходимо провести предварительную подготовку, чтобы операторы могли точно воспринимать любое отсутствие сопротивления при введении иглы в брюшную полость. Использование микроколичественного инфузионного насоса вместо ручного управления потенциально может повысить качество инъекций лекарственных средств; К сожалению, в данном исследовании это не было реализовано. Тем не менее, используя различные схемы инъекций, мы индуцировали различную степень повреждения поджелудочной железы и эффективно наблюдали различия в повреждении поджелудочной железы, вызванном различными частотами и дозами при идентичных технических условиях, индуцированных церулином в сочетании с инъекциями ЛПС. Это дает ценную информацию для будущего использования Церулеина в неинвазивных животных моделях для индукции тяжелого острого панкреатита.

Комбинация церулеина и ЛПС приводила к значительному повышению уровня амилазы и липазы в сыворотке крови, увеличению массы поджелудочной железы и гистологическим изменениям, включая обширную инфильтрацию воспалительных клеток, отек ацинарных клеток поджелудочной железы, некроз и кровоизлияние, о чем свидетельствует окрашивание гематоксилином и эозином (ПЭ). Более того, с увеличением дозы ЛПС патологические изменения в поджелудочной железе становились более выраженными. Тем не менее, следует отметить, что не было заметных различий в показателях патологии поджелудочной железы между группами PI IV и PI V, в то время как степень некроза клеток ткани поджелудочной железы была более выраженной в группе PI III по сравнению с группой PI IV. Это наблюдение позволяет предположить, что частота приема церулеина может служить основным фактором, способствующим повреждению поджелудочной железы, в то время как ЛПС усугубляет его прогрессирование, приводя к системному воспалительному повреждению18,21. HMGB-1 — это белок, который функционирует в зависимости от своего местоположения22. Внеклеточный HMGB-1 действует как белок, участвующий в предупреждающих сигналах воспаления и тесно связан с тяжестью острого панкреатита 23,24,25. В этом исследовании уровни HMGB-1 в сыворотке крови у мышей из всех экспериментальных групп были значительно выше по сравнению с контрольной группой, при этом группа PI V показала наиболее значительное увеличение. Эксперименты по иммуногистохимическому и белковому электрофорезу также подтвердили высокую экспрессию HMGB-1 в ткани поджелудочной железы. Этот важный белок может служить терапевтической мишенью для подавления воспалительного шторма при тяжелом остром панкреатите.

Подводя итог, можно сказать, что крайне важно разработать неинвазивную, простую и удобную в исполнении модель SAP на мышах. В этом экспериментальном протоколе индукция повреждения поджелудочной железы с использованием церулеина в сочетании с ЛПС является надежной и эффективной. Путем введения церулеина внутрибрюшинно в течение десяти последовательных дней в дозе 50 мкг/кг с последующим однократным внутрибрюшинным введением 15 мг/кг ЛПС можно создать стабильную, надежную, экономически эффективную и эффективную модель САП на животных.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

У авторов нет конфликта интересов, который можно было бы раскрыть.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Это исследование было поддержано Исследовательскими проектами в области здравоохранения и медицинских наук в городе Хуайнань (No. HNWJ2023005); Муниципальная программа руководства научно-техническим планом в городе Хуайнань (No 2023151); Программа обучения инновациям и предпринимательству студентов колледжа провинции Аньхой (No S202310361254); Девятая партия программы «50· Звезды науки и техники» в городе Хуайнань и проекте строительства ключевых клинических специальностей провинции Аньхой. Выражаем благодарность лабораторному отделению Первого филиала больницы Аньхойского университета науки и технологий за предоставление соответствующих данных испытаний.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
в 20 раз; Раствор для восстановления антигена лимонной кислоты (pH 6,0)Wuhan servicebio Technology Co., Ltd, КитайG1202-250 мл
амилазыMindray, Китай
Аннексин V-FITC/PIWuhan servicebio Technology Co., Ltd, Китай&nbsp; G1511  разбавлен в 1:20
Anti-HMGB1 Rabbit pABWuhan servicebio Technology Co., Ltd, КитайGB11103  разведен в 1:1800
BCA набор для количественного обнаружения белкаWuhan servicebio Technology Co., Ltd, КитайG2026-200T
BD FACSКанто II Проточный цитометрBD Life Sciences, Сан-Хосе, Калифорния, 95131, СШАBD FACSCanto II
BSAWuhan servicebio Technology Co., Ltd, КитайGC305010-100g
C57BL/6JCavion Experimental Animal Co., Чанчжоу, Китайномер лицензии SCXY (Su) 2011; 0003
Церулитид  MCE, Нью-Джерси, США17650-98-5 50 & микро; г/кг
Хемилюминесцентный тепловизорCytiva CO.,LTD.;
Раствор для восстановления антигена лимонной кислоты (сухой порошок pH 6,0)Wuhan servicebio Technology Co., Ltd, КитайG1201-5 L
Collagenase IVWuhan servicebio Technology Co., Ltd, Китай  GC3050140,5 мг/мл
DAB (SA-HRP) Набор для обнаружения апоптоза туннельных клетокWuhan servicebio Technology Co., Ltd, КитайG1507-100 T
Dimension EXL с интегрированной химической системой LMSiemens Healthcare Diagnostics Inc.Brookfield,СШАYZB/США 8311-2014
разработчик ECLWuhan servicebio Technology Co., Ltd, Китай
Краситель эозин (спирторастворимый)Wuhan servicebio Technology Co., Ltd, КитайG1001-100 мл
EthoVision XT  Нолдус, Нидерланды
Маркированный FITC козий антикролиацкий IgGWuhan servicebio Technology Co., Ltd, КитайGB22303  разбавлен в 1:50
Полностью автоматический анализатор клеток кровиZybio Inc. Китай  Zybio-Z3 CRP
GapDHWuhan servicebio Technology Co., Ltd, КитайGB11103  разведенный в 1:1500
Гематоксилин синий обратный растворWuhan servicebio Technology Co., Ltd, КитайG1040-500 мл
раствор для дифференциации гематоксилинаWuhan servicebio Technology Co., Ltd, КитайG1039-500 мл
гематоксилин красительWuhan servicebio Technology Co., Ltd, КитайG1004-100 мл
HMGB-1 ELISA наборыnjjcbio Co., Ltd, Китай
ГОМОГЕНИЗАТОРWuhan servicebio Technology Co., Ltd, КитайKZ-III-F;
Козий анти-кролик с маркировкой HRPIgG Wuhan servicebio Technology Co., Ltd, КитайGB23303  разведенный в 1:1500
IL-6 ELISA наборыWuhan servicebio Technology Co., Ltd, КитайGEM0001
Lipase Mindray, Китайский
липополисахарид Wuhan servicebio Technology Co., Ltd, КитайGC20500915 мг/кг
Низкотемпературная высокоскоростная центрифугаChangsha Pingfan Apparatus& Instrument Co., Ltd., КитайTGL-20M
Жидкость для разрушения мембраныWuhan servicebio Technology Co., Ltd, КитайG1204
микротомJinhua Craftek Instrument Co., Ltd.; КитайCR-601ST
Нейлоновая сеткаWuhan servicebio Technology Co., Ltd, Китай200-мешочный
набор для обнаружения апоптоза клеток TUNEL (метод окрашивания DAB)Wuhan servicebio Technology Co., Ltd, КитайG1507-100T Машина
для встраивания парафиновой тканиPRECISION MEDICAL INSTRUMENTS CO., LTD; Чанчжоу, КитайPBM-A
патологических тканейPRECISION MEDICAL INSTRUMENTS CO., LTD; Чанчжоу, КитайPHY-III
Фосфатно-солевой буферныйWuhan servicebio Technology Co., Ltd, КитайG4202-100ML
PMSFWuhan servicebio Technology Co., Ltd, КитайG2008-1 мл
Положительный флуоресцентный микроскопOlympus Corporation, Токио, ЯпонияBX53
Pro КальцитонинMindray, Китай
ПВДФ мембранаMillipore, США0.22 & микро; m
RIPAWuhan servicebio Technology Co., Ltd, КитайG2002-100 ml
SDS-PAGEBeyotime Biotechnology, КитайP0012A
TNF-α Наборы ИФАWuhan servicebio Technology Co., Ltd, КитайGEM0004
Ультразвуковая водяная баняDONGGUAN KQAO ULTRASONIC EQUIPMENT CO., LTD.; КитайKQ-200KDE
Western BlotBio-Rad Laboratories, Inc., США
Western blot imaging SystemLife Sciences IP Holdco LLC, ЯПОНИЯAmersham ImageQuant 800 
Вихревой смесительSCILOGEX; США
СШАIC111150 100222 Аппарат для сушки Global

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gliem, N., Ammer-Herrmenau, C., Ellenrieder, V., Neesse, A. Management of severe acute pancreatitis: An update. Digestion. 102 (4), 503-507 (2021).
  2. Duan, F., et al. GDF11 ameliorates severe acute pancreatitis through modulating macrophage M1 and M2 polarization by targeting the TGFbetaR1/SMAD-2 pathway. Int Immunopharmacol. 108, 108777(2022).
  3. Zhang, X. P., et al. Preparation method of an ideal model of multiple organ injury of rat with severe acute pancreatitis. World J Gastroenterol. 13 (34), 4566-4573 (2007).
  4. Bluth, M. H., Patel, S. A., Dieckgraefe, B. K., Okamoto, H., Zenilman, M. E. Pancreatic regenerating protein (reg I) and reg I receptor mRNA are upregulated in rat pancreas after induction of acute pancreatitis. World J Gastroenterol. 12 (28), 4511-4516 (2006).
  5. Qiu, F., Lu, X. S., Huang, Y. K. Effect of low molecular weight heparin on pancreatic micro-circulation in severe acute pancreatitis in a rodent model. Chin Med J (Engl). 120 (24), 2260-2263 (2007).
  6. Lombardi, B., Estes, L. W., Longnecker, D. S. Acute hemorrhagic pancreatitis (massive necrosis) with fat necrosis induced in mice by DL-ethionine fed with a choline-deficient diet. Am J Pathol. 79 (3), 465-480 (1975).
  7. Liu, Y., et al. Deletion of XIAP reduces the severity of acute pancreatitis via regulation of cell death and nuclear factor-kappaB activity. Cell Death Dis. 8 (3), e2685(2017).
  8. Niederau, C., Ferrell, L. D., Grendell, J. H. Caerulein-induced acute necrotizing pancreatitis in mice: Protective effects of proglumide, benzotript, and secretin. Gastroenterology. 88, 5 Pt 1 1192-1204 (1985).
  9. Zhou, X., et al. DPP4 inhibitor attenuates severe acute pancreatitis-associated intestinal inflammation via Nrf2 signaling. Oxid Med Cell Longev. 2019, 6181754(2019).
  10. Yang, J., et al. Heparin protects severe acute pancreatitis by inhibiting HMGB-1 active secretion from macrophages. Polymers (Basel). 14 (12), 2470(2022).
  11. Kong, L., et al. Sitagliptin activates the p62-Keap1-Nrf2 signalling pathway to alleviate oxidative stress and excessive autophagy in severe acute pancreatitis-related acute lung injury. Cell Death Dis. 12 (10), 928(2021).
  12. Tan, J. H., et al. ATF6 aggravates acinar cell apoptosis and injury by regulating p53/AIFM2 transcription in severe acute pancreatitis. Theranostics. 10 (18), 8298-8314 (2020).
  13. Schmidt, J., et al. A better model of acute pancreatitis for evaluating therapy. Ann Surg. 215 (1), 44-56 (1992).
  14. Luo, C., et al. Abdominal paracentesis drainage attenuates severe acute pancreatitis by enhancing cell apoptosis via PI3K/AKT signaling pathway. Apoptosis. 25 (3-4), 290-303 (2020).
  15. Fontaine, D. A., Davis, D. B. Attention to background strain is essential for metabolic research: C57BL/6 and the international knockout mouse consortium. Diabetes. 65 (1), 25-33 (2016).
  16. Wan, J., et al. Pancreas-specific CHRM3 activation causes pancreatitis in mice. JCI Insight. 6 (17), e132585(2021).
  17. Sah, R. P., et al. Cerulein-induced chronic pancreatitis does not require intra-acinar activation of trypsinogen in mice. Gastroenterology. 144 (5), 1076-1085 (2013).
  18. Wang, K., et al. Activation of AMPK ameliorates acute severe pancreatitis by suppressing pancreatic acinar cell necroptosis in obese mice models. Cell Death Discov. 9 (1), 363(2023).
  19. Jin, C., Li, J. C. Establishment of a severe acute pancreatitis model in mice induced by combined Rain Frog Peptide and lipopolysaccharide and exploration of its mechanism. Acta Exp Bio Sinica. 36 (2), 91-96 (2003).
  20. Tan, J. H., et al. ATF6 aggravates acinar cell apoptosis and injury by regulating p53/AIFM2 transcription in severe acute pancreatitis. Theranostics. 10 (18), 8298-8314 (2020).
  21. Roy, R. V., et al. Pancreatic Ubap2 deletion regulates glucose tolerance, inflammation, and protection from Caerulein-induced pancreatitis. Cancer Lett. 578, 216455(2023).
  22. Chen, R., Kang, R., Tang, D. The mechanism of HMGB1 secretion and release. Exp Mol Med. 54 (2), 91-102 (2022).
  23. Murao, A., Aziz, M., Wang, H., Brenner, M., Wang, P. Release mechanisms of major DAMPs. Apoptosis. 26 (3-4), 152-162 (2021).
  24. Liu, T., et al. Accuracy of circulating histones in predicting persistent organ failure and mortality in patients with acute pancreatitis. Br J Surg. 104 (9), 1215-1225 (2017).
  25. Li, N., Wang, B. M., Cai, S., Liu, P. L. The role of serum high mobility Group Box 1 and Interleukin-6 levels in acute pancreatitis: A meta-analysis. J Cell Biochem. 119 (1), 616-624 (2018).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

TUNEL3

Похожие статьи