Методическая статья

Инженерия индуцированных кровью микроглииподобных клеток человека для исследования обратно-трансляционного мозга

DOI:

10.3791/66819

⸱

6 сентября 2024 г.

 ,  ,  , 
1Department of Neuropsychiatry, Graduate School of Medical Sciences, Kyushu University, 2Department of Functional Anatomy and Neuroscience, Asahikawa Medical University

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этом исследовании представлен новый подход к созданию микроглииподобных (iMG) клеток человека, полученных из моноцитов, которые позволяют косвенно оценить воспаление мозга. Это представляет собой клеточную модель, которая может быть полезна для исследований, сосредоточенных на потенциальном воспалении мозга и связанных с ним нервно-психических расстройствах.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Недавние исследования с использованием животных моделей подчеркнули важность микроглии как важнейших иммунологических модуляторов при различных нейропсихиатрических и физических заболеваниях. Посмертный анализ мозга и позитронно-эмиссионная томография являются репрезентативными методами исследования, которые оценивают активацию микроглии у пациентов; Полученные данные выявили активацию микроглии в головном мозге пациентов с различными нервно-психическими расстройствами и хронической болью. Тем не менее, вышеупомянутая методика лишь облегчает оценку ограниченных аспектов активации микроглии.

Вместо биопсии головного мозга и метода индуцированных плюрипотентных стволовых клеток мы первоначально разработали метод получения непосредственно индуцированных микроглиоподобных (iMG) клеток из свежеполученных моноцитов периферической крови человека путем добавления к ним гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора и интерлейкина 34 в течение 2 недель. Эти iMG-клетки могут быть использованы для выполнения динамического морфологического и молекулярного анализа фагоцитарной способности и высвобождения цитокинов после стрессовой стимуляции на клеточном уровне. В последнее время для проверки сходства между человеческими iMG-клетками и первичной микроглией мозга был проведен комплексный транскриптомный анализ.

Полученные от пациента iMG-клетки могут служить ключевыми суррогатными маркерами для прогнозирования активации микроглии в мозге человека и помогли раскрыть ранее неизвестную динамическую патофизиологию микроглии у пациентов с болезнью Насу-Хакола, фибромиалгией, биполярным расстройством и болезнью Мойя-Мойя. Таким образом, метод, основанный на iMG, служит ценным инструментом обратной трансляции и обеспечивает новое понимание динамики молекулярной патофизиологии микроглии при различных психических и физических заболеваниях.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В последние годы было высказано предположение, что воспаление головного мозга играет ключевую роль в патофизиологии различных расстройств мозга и нервно-психических расстройств; микроглия была выделена в качестве ключевых иммуномодулирующих клеток с помощью посмертного анализа мозга человека и методов биовизуализации на основе позитронно-эмиссионной томографии (ПЭТ) 1,2,3,4. Посмертный анализ мозга и ПЭТ позволяет получить важные результаты; Тем не менее, эти подходы неэффективны с точки зрения захвата динамической молекулярной активности микроглии человека в мозге во всей ее полноте. Таким образом, необходимы новые стратегии, позволяющие всесторонне оценить функции и дисфункции микроглии человека на молекулярном и клеточном уровнях.

В 2014 году мы разработали новую технологию для получения непосредственно индуцированных микроглияподобных (iMG) клеток 5,6, до первой публикации в 2016 году микроглии, полученных из человеческих плюрипотентных стволовых клеток (iPSC). Всего за 2 недели мы успешно преобразовали моноциты периферической крови человека в клетки iMG путем оптимизации цитокинов, гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (GM-CSF) и интерлейкина 34 (IL-34). Когда мы разрабатывали эту методику, инновационный метод перепрограммирования индуцирования нейрональных клеток из iPS-клеток или фибробластов только начинал преобладать в мире 8,9,10,11. Тем не менее, в то время еще не сообщалось о методе индукции микроглиальных клеток, полученных из iPS, и было желательно создание модели микроглии, полученной из соматических клеток человека. Поскольку цитокины, такие как GM-CSF и IL-34, макрофагальный колониестимулирующий фактор, были необходимы для развития и поддержания микроглии 12,13,14,15, мы предположили, что комбинация этих цитокинов может быть применена непосредственно для создания микроглиальной клеточной модели из моноцитов крови. Наконец, нам удалось разработать модель микроглии, полученной из моноцитов путем объединения GM-CSF и IL-345. Кроме того, некоторые из этих комбинаций цитокинов также используются для индукции микроглии из iPS-клеток 7,16 и, как предполагается, являются важным фактором в приобретении характеристик микроглии.

В отличие от методов iPSC, клетки iMG не требуют какой-либо генетической модификации и могут быть получены за очень короткое время путем простой химической индукции, что приводит к снижению временных и финансовых затрат. Кроме того, клетки iMG не требуют генетического перепрограммирования, поэтому мы считаем, что клетки iMG являются мощными суррогатными клетками для оценки не только признаков, но и состояний микроглии человека. В первоначальной статье по технике iMG в 2014 году мы подтвердили, что клетки iMG демонстрируют фенотип микроглии человека, который может отличаться от моноцитов и макрофагов. Например, клетки iMG демонстрировали коэффициент сверхэкспрессии хемокинового рецептора CX3C 1 (CX3CR1) и хемокинового рецептора C-C типа 2 (CCR2), чем моноциты и типичные маркеры микроглии, включая трансмембранный белок 119 (TMEM 119) и пуринергический рецептор P2RY12 5,17. Недавно мы подтвердили, что клетки iMG, полученные из периферической крови, напоминают микроглию мозга по профилю экспрессии генов хорошо известных маркеров микроглии у того же пациента, перенесшегооперации на головном мозге. Клетки iMG могут быть проанализированы на предмет динамических функций на молекулярном уровне, таких как фагоцитоз и продукция цитокинов, и, как ожидается, компенсируют недостатки посмертных исследований мозга и исследований ПЭТ.

Мы обнаружили ранее неизвестные динамические патофизиологические механизмы микроглии у пациентов с диагнозом болезнь Насу-Хакола5, фибромиалгия19, биполярное расстройство20,21 или болезнь Мойя-Мойя22. Кроме того, основываясь на нашей оригинальной методологии, различные лаборатории использовали ячейки iMG (некоторые лаборатории назначили альтернативные названия этим элементам) в качестве важнейшего инструмента исследования обратной трансляции 23,24,25,26,27. Sellgren et al. успешно сгенерировали iMG-клетки в соответствии с нашими рекомендациями и провели анализ микрочипов, который показал, что эти клетки очень похожи на микроглию23 мозга человека. Недавно мы подтвердили сходство между человеческими iMG-клетками и первичной микроглией мозга с помощью секвенирования РНК18.

Это исследование было направлено на документирование методологии получения iMG-клеток из периферической крови человека для содействия реверсивно-трансляционным исследованиям, ориентированным на нейропсихиатрические заболевания. Этот метод представляет собой разумный аналитический инструмент, который может легко создавать микроглиальные клеточные модели за короткий промежуток времени, даже в плохо оборудованных лабораториях, где нет аппаратуры для переноса генов или квалифицированного персонала.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Протокол исследования был одобрен Этическим комитетом Университета Кюсю и соответствовал всем положениям Хельсинкской декларации. Было получено письменное информированное согласие от всех участников, включая здоровых добровольцев и пациентов, на анализ их крови и публикацию данных. Материалы и оборудование указаны в Таблице материалов, а составы растворов подробно описаны в Таблице 1.

1. Подготовка сред и буферов для экспериментов

  1. Изоляционную среду готовят путем добавления RPMI-1640 10% инактивированной при нагревании фетальной бычьей сыворотки (56 °C, 30 мин) и 1 % пенициллин-стрептомицина.
  2. Приготовьте изоляционный буфер, добавив в основной буферный раствор 0,5% исходный раствор бычьего сывороточного альбумина (БСА) и стерилизуйте его с помощью фильтрации (0,22 мкм).

2. Выделение мононуклеарных клеток из цельной крови

  1. Перенесите 15 мл среды с градиентом плотности в центрифужную пробирку с градиентом плотности 50 мл и центрифугируйте при давлении 1000 × г в течение 1 мин при 20 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Выделите 15 мл крови на 50 мл пробирки для центрифугирования с градиентом плотности. Увеличивайте количество пробирок при большом объеме крови.
  2. Кровь, собранную в гепариновые пробирки, гомогенизировать методом инверсии и снять крышку с пробирки для сбора крови с помощью пинцета, стерилизованного огнем.
  3. Дозируйте равный объем (10-15 мл) крови в среду с градиентом плотности в пробирке центрифугирования с градиентом плотности.
  4. Установите уровень замедления центрифуги на 1 из 4 уровней и центрифугируйте при давлении 1 000 × г в течение 10 минут при комнатной температуре (RT).
    ПРИМЕЧАНИЕ: При такой скорости замедления скорость вращения 180 × g (1 000 об/мин) останавливается за 3 минуты.
  5. Приготовьте такое же количество пробирок для центрифуги объемом 50 мл, как и пробирки для центрифугирования с градиентом плотности 50 мл, и заполните каждую пробирку 10 мл PBS (-).
  6. После центрифугирования удалите верхний слой плазмы на расстоянии примерно до 1 см над охристым слоем.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Вставьте аспирационную пипетку вертикально в трубку и осторожно отсасывайте от центра поверхности жидкости. Не переусердствуйте, чтобы не потревожить охристую шерсть.
  7. Сцедите всю оставшуюся надосадочную жидкость из центрифужной пробирки с градиентом плотности 50 мл в центрифужную пробирку, содержащую 10 мл PBS (-).
  8. Сбросьте уровень замедления центрифуги на 3 из 4 уровней и центрифугируйте при 250 × г в течение 10 мин при RT. На этом этапе подготовьте одну центрифужную пробирку объемом 50 мл и две пробирки 15 мл и сетчатый фильтр для клеток объемом 100 мкм.
  9. После центрифугирования установите температуру центрифуги на уровне 4 °С. Найдите белую гранулу с красной периферией на дне пробирки центрифуги. Удалите надосадочную жидкость с помощью аспирации и осторожно ослабьте гранулу постукиванием.
  10. Поместите клеточный фильтр 100 μм на коническую трубку объемом 50 мл с помощью пинцета, стерилизованного огнем.
  11. Добавьте 13 мл изоляционной среды в одну из центрифужных пробирок и промойте внутреннюю стенку, чтобы правильно собрать клетки. Возьмите клеточную суспензию и последовательно промойте оставшиеся центрифужные пробирки. После сбора клеток из всех пробирок отфильтруйте клеточную суспензию через сетчатое фильтр в коническую пробирку объемом 50 мл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Изоляционная среда должна быть охлаждена на протяжении всего процесса изоляции (шаги 2.11-2.16).
  12. Еще раз промойте каждую пробирку 13 мл изоляционной среды, как описано в шаге 2.11. Соберите в общей сложности 26 мл клеточной суспензии.
  13. Распределите равное количество в две конические пробирки объемом 15 мл, перечислите ячейки и рассчитайте подходящую концентрацию изоляционного буфера (60 мкл буфера на 107 клеток) для шага 2.16.
    ПРИМЕЧАНИЕ: С конической трубкой объемом 15 мл лучше работать, потому что объем жидкости небольшой, и жидкость легко пузырится при пипетировании на шаге 2.16.
  14. Центрифугировать при 250 × г в течение 10 мин при 4 °C.
  15. Во время центрифугирования тщательно продезинфицируйте магнитный стенд (особенно часть, контактирующую с колонной) 70% этанолом и поместите его на стенд для сушки на воздухе. Держите изоляционный буфер на льду.
  16. Удалите надосадочную жидкость путем аспирации (на этом этапе ищите красные гранулы толщиной ~1 мм из-за наличия эритроцитов), добавьте соответствующее количество изоляционного буфера и осторожно ослабьте гранулу пипетированием ~20x.

3. Выделение моноцитов с помощью микрогранул CD11b

  1. Вихревой реагент для блокировки FcR человека в течение 10 с до нанесения. Введите необходимое количество реагента (20 мкл блокирующего реагента FcR на10-7 клеток) и инкубируйте в камере при 4 °C в течение 5 минут.
  2. Сделайте вихревое воздействие на микрогранулы CD11b в течение 10 с перед нанесением. Введите необходимое количество реагента (20 мкл микрогранул CD11b на 10-7 клеток) и инкубируйте в камере при температуре 4 °C в течение 20 минут, перемешивая вручную каждые 5 минут.
  3. После инкубации добавьте 10 мл изоляционного буфера, суспензируйте с помощью щадящего пипетирования и центрифугируйте при 300 × г в течение 10 минут при 4 °C.
  4. Во время центрифугирования поместите магнитный столбик на магнитную подставку и промойте его 3 мл изоляционного буфера.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Воздержитесь от прикосновения к магнитной части колонки и расположите колонку правильно. Если пузырьки попали в колонку, удалите их с помощью пипетки. Изолирующий буфер должен охлаждаться на протяжении всего процесса изоляции (шаги 3.4-3.9).
  5. Удалите надосадочную жидкость после центрифугирования с помощью аспирации, добавьте 1 мл изоляционного буфера, аккуратно перемешайте пипетированием и нанесите суспензию на колонку.
  6. Промойте колонку 3 раза, добавляя 3 мл изоляционного буфера каждый раз, когда резервуар колонки опустошается.
  7. Поместите колонку в коническую трубку объемом 15 мл, не касаясь магнитной части; Добавьте 5 мл изоляционного буфера в колонку и выдавите жидкость через колонку с помощью поршня, вставленного в трубку.
  8. Центрифугируйте собранную в пробирку клеточную суспензию при 300 × г в течение 10 мин при 4 °С.
  9. Аспирируйте надосадочную жидкость и ресуспендируйте клетки в изолированной среде. Поскольку будет восстановлено ~5-10% от количества клеток, подсчитанных на шаге 2.13, отрегулируйте объем суспензии в соответствии с количеством клеток.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Изоляционную среду следует использовать при температурной плотности, а не нагревать, чтобы избежать резкого изменения температуры от 4 °C.
  10. Перечислить клетки и ввести по 500 мкл клеточной суспензии в каждую лунку 24-луночных планшетов в концентрации 40 ×10 4 клеток/мл и инкубировать в течение ночи.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Клеточные суспензии следует дозировать соответствующим образом в соответствии с отрегулированным объемом посева, необходимым для различных планшетов. Например, 1 мл на одну лунку в 12-луночном планшете и 250 мкл на одну лунку в 8-луночном камерном слайде.
  11. Наконец, утилизируйте или продезинфицируйте загрязненное оборудование в соответствии с политикой обращения с инфекционными отходами, установленной на предприятии.

4. Индукция iMG-клеток из моноцитов

  1. Приготовьте индукционную среду, добавив базальную индукционную среду 1% раствором антибиотик-антимикотика, 10 нг/мл рекомбинантного GM-CSF человека и 100 нг/мл рекомбинантного человеческого IL-34.
  2. Замените изоляционную среду от предыдущего посева на индукционную. Наклоните планшет вперед и быстро отсасывайте обедненную среду от переднего края дна лунки с помощью пастеровской пипетки. Заменяйте среду из расчета не более 1 планшета (= 24 лунки) за раз и немедленно аккуратно внесите 500 μл индукционной среды.
    ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе следует выбирать адгезивные моноциты.
  3. Инкубируйте клетки в течение 14 дней, чтобы завершить индукцию.
  4. Через 14 дней снова замените среду на 500 мкл индукционной среды. Впоследствии, для постиндукционного обслуживания ячеек, заменяйте индукционную среду на 500 мкл свежей индукционной среды каждую неделю.

5. Иммуноцитохимия

  1. Извлеките среду из 8-луночной камеры, засеянной ячейками на шаге 3.10, путем аспирации и промойте PBS (-).
  2. Зафиксируйте клетки на 20 мин в режиме RT с помощью 4% параформальдегида.
  3. Снимите фиксирующий реагент и промойте клетки в течение 3 x 5 минут PBS (-).
  4. Пермеабилизируйте клетки PBS (-), содержащим 0,1% Triton X-100 при ОТ.
  5. Инкубируйте пермеабилизированные клетки с блокирующим раствором (3% BSA/PBS (-)) в течение 1 ч в режиме ЛТ.
  6. Инкубируйте клетки в течение ночи с первичными антителами (Таблица материалов) при температуре 4 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Все антитела разводят в блокирующем растворе.
  7. Промойте ячейки в течение 3 x 5 минут с PBS (-) в течение 5 минут каждая.
  8. Инкубируйте промытые клетки с соответствующими флуоресцентно меченными вторичными антителами в течение 1 ч в режиме ОТ (Таблица материалов).
  9. Промойте клетки в течение 3 x 5 минут PBS (-) для удаления вторичных антител.
  10. Инкубируйте клетки с раствором DAPI (1:10 000), разведенным PBS (-), в течение 5 мин при RT.
  11. Промойте ячейки в течение 3 x 5 минут с помощью PBS (−).
  12. Смонтируйте лунку с помощью монтажной среды и визуализируйте клетки под флуоресцентным микроскопом.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Важно отметить, что существует большая степень гетерогенности на уровне человека и времени в характерах клеток iMG, включая морфологию и экспрессию генов. Клетки iMG у одних особей имеют многочисленный ветвящийся вид (рис. 1А), в то время как у других они остаются сферическими (рис. 1В). Характеристики iMG могут отличаться даже в пределах одного человека, что делает клетки iMG ключевым инструментом для обнаружения биомаркеров состояния заболевания. И наоборот, изучение таких межиндивидуальных различий гарантирует уменьшение технических ошибок. Клетки iMG определяются как моноциты, индуцированные GM-CSF и IL-34 в течение минимум 14 дней. Чтобы свести к минимуму технические ошибки, рекомендуется стандартизировать время индукции, использовать те же количества реагентов и воздержаться от использования реагентов с истекшим сроком годности.

Валидация иммуноокрашивания также подтверждает, что клетки iMG экспрессируют маркеры микроглии, включая P2RY12 и TMEM119 (рис. 2). Предыдущие исследования показали, что морфологические характеристики и характеристики экспрессии генов клеток iMG связаны с патофизиологией биполярного расстройства20,21. Самые ранние разветвленные клетки наблюдались на 3-й день после лечения GM-CSF и IL-34, а клетки iMG в оптимальном состоянии могут выживать более 1 месяца при смене среды один раз в неделю. Клетки iMG могут быть использованы для анализа экспрессии генов. Например, при стимуляции интерфероном гамма или IL-4 клетки iMG изменяли паттерн экспрессии генов, что может быть использовано для функциональной оценки поляризованной микроглии M1 и M2 5,22. Кроме того, гранулы FITC вызывают амебоидные морфологические модификации и повышают экспрессию TNFα и других генов5. Кроме того, фагоцитоз можно оценить путем измерения интенсивности флуоресценции гранул 5,22. Более того, поскольку клетки iMG являются жизнеспособными клетками, их фактическое движение и морфологические изменения можно наблюдать с помощью снимков клеток (рис. 3) или с помощью покадровой съемки (видео 1).

figure-results-1
Рисунок 1: Морфология клеток iMG. (A) Типичные разветвленные iMG демонстрировали мельчайшие тела сомы и многочисленные разветвленные коллатерали. (B) Некоторые образцы различались по внешнему виду, например, амебоидный тип. Масштабная линейка, 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-2
Рисунок 2: Иммуноцитоокрашивание клеток iMG. Клетки iMG экспрессируют типичные маркеры микроглии: (A) TMEM 119, (B) P2RY12. Ядра окрашивали DAPI (синим). Масштабная линейка = 10 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-3
Рисунок 3: Морфологические изменения в клетках iMG. iMG изменяют свою морфологию в процессе индукции. Выпячивания клеток появляются (А) примерно на 3-й день и удлиняются на 7-й день и (С) 14 по мере индукции. Масштабная линейка = 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Видео 1: Покадровая фотосъемка элементов iMG. Разветвленная ячейка iMG в центре, по-видимому, устанавливала контакт с окружающими клетками, удлиняя и сокращая их отростки. Кроме того, в клетке проводился фагоцитоз поврежденных клеток. Интервалы съемки составляли 46 секунд, а время съемки — около 14 часов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить это видео.

Таблица 1: Состав решений Нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Аналитические методы с использованием iMG-клеток могут служить мощными инструментами обратнотрансляционных исследований 5,6. Чтобы получить достаточное количество человеческих iMG-клеток, экспериментаторы должны планировать свои исследования с учетом определенных вопросов. Образцы крови, полученные от человека, чрезвычайно чувствительны; Следовательно, полученные образцы требуют быстрой обработки и тщательного обращения во избежание загрязнения. В частности, образцы крови следует отделять сразу после забора и не оставлять без присмотра в течение длительного времени. Эксперименты обычно начинают в течение 3 ч после забора крови для подтверждения их достоверности; тем не менее, можно хранить образцы крови при температуре 4°C в течение более 3 часов и довести их до комнатной температуры до начала протоколов разделения.

Для обеспечения стабильных результатов рекомендуется использовать реагенты, такие как питательные среды, в течение месяца после вскрытия и выбрасывать по истечении срока годности. При разделении мононуклеарных клеток периферической крови с помощью центрифугирования с градиентом плотности в некоторых образцах может наблюдаться агрегация клеток. В таких случаях образец цельной крови должен быть разбавлен PBS (-) для предотвращения агрегации. Во время индукции дифференцировки в микроглию культуральную среду не заменяют в течение 14 дней, чтобы избежать ненужной стимуляции клеток. После завершения индукции дифференцировки замена среды на свежую среду может восстановить ослабленные клетки и сохранить жизнеспособность в течение некоторого времени.

Метод iMG, установленный в этом исследовании, имеет ограничение; Экспериментально индуцированные «микроглиевые клетки» сопоставимы, но не полностью идентичны реальным микроглиальным клеткам в человеческом мозге. Кроме того, в предыдущих исследованиях была задокументирована методология индукции микроглииподобных клеток человека, полученных из моноцитов, и различные исследовательские группы предложили свои собственные протоколы и названия, зависящие от оригинальныхметодов iMG. Например, в некоторых протоколах используются M-CSF 29,30,31,32 или TGF-β 33, которые, как сообщается, способствуют микроглиеподобному фенотипу в культурах микроглии, полученных из iPSC, или на покрытиях, таких как Geltrex24,34; Эти факторы могут оказаться эффективными для индукции микроглииподобных клеток.

Оригинальная технология iMG выгодна благодаря простому и легко воспроизводимому протоколу с двумя цитокинами и без покрытий, что позволяет проводить различные эксперименты с обратной трансляцией с использованием человеческой крови. С другой стороны, достижения в области технологий облегчили разработку многих продуктов. Методы магнитной сепарации включают в себя положительную селекцию на основе колонок, аналогичную нашему протоколу, а также отрицательную селекцию и методы без колонок. Кроме того, вместо магнитной сепарации может быть рассмотрен альтернативный метод сепарации с использованием пластической адгезии. Положительная селекция на основе столбцов обеспечивает чистоту, но методика требует много времени, а стимуляция магнитными шариками существенно влияет на клетки35. Напротив, отрицательный отбор и пластическая адгезия могут быть менее вредными для клеток; Тем не менее, эти подходы могут быть менее чистыми 35,36. В будущем может потребоваться дальнейшая модификация на основе других протоколов.

Вышеуказанные результаты свидетельствуют о том, что преобладающим преимуществом данной технологии iMG является ее короткая продолжительность, экономически эффективная методология и возможность обработки большого количества образцов для высокопроизводительных исследований. Таким образом, эта технология может быть использована для получения знаний из человеческих образцов, а затем для проведения дальнейших проверочных исследований с использованием различных животных моделей. Кроме того, могут быть полезны результаты, полученные в результате исследований, проведенных на клеточных и животных моделях с применением метода iMG. Таким образом, наша методика iMG может быть применена к двунаправленным трансляционным исследованиям методом «от кровати к скамье» и «от скамьи к кровати».

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была частично поддержана следующими грантами на научные исследования: (1) Японское общество содействия науке (KAKENHI; JP18H04042, JP19K21591, JP20H01773 и JP22H00494 в TAK, JP22H03000 в M.O.); (2) Японское агентство медицинских исследований и разработок (AMED; JP21wm0425010 в TAK, JP22dk0207065 в M.O.) и (3) Японское агентство по науке и технике CREST (JPMJCR22N5 к TAK). Финансирующие органы не принимали на себя никакой роли в разработке исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи. Мы хотели бы поблагодарить Editage (www.editage.jp) за редактирование на английском языке.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
0,1% Triton X-100Sigma-Aldrich30-5140-5
4% параформальдегидNacalai Tesque09154-14
Антибиотик-антимикотик (100x)gibco15240-062описан как "антибиотик-антимикотический раствор"
autoMACS Раствор для полосканияMiltenyi Biotec130-091-222описан как "базовый буферный раствор" и используется для "изоляционного буфера"
CD11b MicroBeadsMiltenyi Biotec130– 049-601
DAPI растворDOJINDO28718-90-3
Фосфат Дульбекко буферизованный физиологический растворNacalai Tesque14249-24описан как "PBS (−)«
Фетальная бычья сывороткаbiowestS1760-500
Реагент для блокировки FcR человекаMiltenyi Biotec130– 059-901
LeucosepGreiner Bio-One227290описан как "центрифужная трубка с градиентом плотности"
MACS LS колонкиMiltenyi Biotec130-042-401описан как "магнитная колонка"
MACS BSA Stock SolutionMiltenyi Biotec130-091-376описан как "стоковый раствор бычьего сывороточного альбумина (БСА)MACS
MultiStandMiltenyi Biotec130-042-303описан как "магнитная подставка"
Пенициллин-стрептомицинNacalai Tesque26253– 84
ProLong Gold Antifade MountantInvitrogenP10144описан как «монтажная среда»
рекомбинантный человеческий GM-CSFR& D Systems215-GM
рекомбинантный человеческий ИЛ-34R& D Systems5265-IL
RPMI 1640 Medium + GlutaMAX Supplement (предварительно дополненная среда)Thermo Fisher Scientific61870036описана как "базальная индукционная среда"
RPMI-1640Nacalai Tesque30264-56
Antibodies
anti-P2RY12 антителаSigma-AldrichHPA014518Первичное антитело, кролик, 1:100
антитело против TMEM119Sigma-AldrichHPA051870первичное антитело, кролик, 1:100
Козье антитело против кролика IgG (H+L) Перекрестная адсорбция вторичного антитела, Alexa Fluor 568invitrogenA-11011вторичное антитело, кролик, 1:1000

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Steiner, J., et al. Immunological aspects in the neurobiology of suicide: elevated microglial density in schizophrenia and depression is associated with suicide. J Psychiatr Res. 42 (2), 151-157 (2008).
  2. Setiawan, E., et al. Association of translocator protein total distribution volume with duration of untreated major depressive disorder: a cross-sectional study. Lancet Psychiatry. 5 (4), 339-347 (2018).
  3. Holmes, S. E., et al. Elevated translocator protein in anterior cingulate in major depression and a role for inflammation in suicidal thinking: a positron emission tomography study. Biol Psychiatry. 83 (1), 61-69 (2018).
  4. Meyer, J. H., et al. Neuroinflammation in psychiatric disorders: PET imaging and promising new targets. Lancet Psychiatry. 7 (12), 1064-1074 (2020).
  5. Ohgidani, M., et al. Direct induction of ramified microglia-like cells from human monocytes: dynamic microglial dysfunction in Nasu-Hakola disease. Sci Rep. 4, 4957(2014).
  6. Method of producing microglial cells. France patent EP. , 3 092 305 B1 (2023).
  7. Muffat, J., et al. Efficient derivation of microglia-like cells from human pluripotent stem cells. Nat Med. 22 (11), 1358-1367 (2016).
  8. Mattis, V. B., Svendsen, C. N. Induced pluripotent stem cells: a new revolution for clinical neurology. Lancet Neurol. 10 (4), 383-394 (2011).
  9. Dimos, J. T., et al. Induced pluripotent stem cells generated from patients with ALS can be differentiated into motor neurons. Science. 321 (5893), 1218-1221 (2008).
  10. Pfisterer, U., et al. Direct conversion of human fibroblasts to dopaminergic neurons. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (25), 10343-10348 (2011).
  11. Pang, Z. P., et al. Induction of human neuronal cells by defined transcription factors. Nature. 476 (7359), 220-223 (2011).
  12. Wang, Y., et al. IL-34 is a tissue-restricted ligand of CSF1R required for the development of Langerhans cells and microglia. Nat Immunol. 13 (8), 753-760 (2012).
  13. Aloisi, F., De Simone, R., Columba-Cabezas, S., Penna, G., Adorini, L. Functional maturation of adult mouse resting microglia into an APC is promoted by granulocyte-macrophage colony-stimulating factor and interaction with Th1 cells. J Immunol. 164 (4), 1705-1712 (2000).
  14. Erblich, B., Zhu, L., Etgen, A. M., Dobrenis, K., Pollard, J. W. Absence of colony stimulation factor-1 receptor results in loss of microglia, disrupted brain development and olfactory deficits. PLoS One. 6 (10), e26317(2011).
  15. Nandi, S., et al. The CSF-1 receptor ligands IL-34 and CSF-1 exhibit distinct developmental brain expression patterns and regulate neural progenitor cell maintenance and maturation. Dev Biol. 367 (2), 100-113 (2012).
  16. Douvaras, P., et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells to microglia. Stem Cell Rep. 8 (6), 1516-1524 (2017).
  17. Yonemoto, K., et al. Heterogeneity and mitochondrial vulnerability configurate the divergent immunoreactivity of human induced microglia-like cells. Clin Immunol. 255, 109756(2023).
  18. Tanaka, S., et al. CD206 expression in induced microglia-like cells from peripheral blood as a surrogate biomarker for the specific immune microenvironment of neurosurgical diseases including glioma. Front Immunol. 12, 2424-2424 (2021).
  19. Ohgidani, M., et al. Fibromyalgia and microglial TNF-alpha: Translational research using human blood induced microglia-like cells. Sci Rep. 7 (1), 11882(2017).
  20. Ohgidani, M., et al. Microglial CD206 gene has potential as a state marker of bipolar disorder. Front Immunol. 7, 676(2016).
  21. Ohgidani, M., et al. A case of bipolar disorder with AIF1 (coding gene of Iba-1) deletion: A pilot in vitro analysis using blood-derived microglia-like cells. Psychiatry Clin Neurosci. 77 (2), 128-130 (2023).
  22. Shirozu, N., et al. Angiogenic and inflammatory responses in human induced microglia-like (iMG) cells from patients with Moyamoya disease. Sci Rep. 13 (1), 14842(2023).
  23. Sellgren, C. M., et al. Patient-specific models of microglia-mediated engulfment of synapses and neural progenitors. Mol Psychiatry. 22 (2), 170-177 (2017).
  24. Sellgren, C. M., et al. Increased synapse elimination by microglia in schizophrenia patient-derived models of synaptic pruning. Nat Neurosci. 22 (3), 374-385 (2019).
  25. Banerjee, A., et al. Validation of induced microglia-like cells (iMG Cells) for future studies of brain diseases. Front Cell Neurosci. 15, 629279(2021).
  26. You, M. J., et al. A molecular characterization and clinical relevance of microglia-like cells derived from patients with panic disorder. Transl Psychiatry. 13 (1), 48(2023).
  27. Rocha, N. P., et al. Microglia activation in basal ganglia is a late event in Huntington disease pathophysiology. Neurol Neuroimmunol Neuroinflamm. 8 (3), e984(2021).
  28. Sargeant, T. J., Fourrier, C. Human monocyte-derived microglia-like cell models: A review of the benefits, limitations and recommendations. Brain Behav Immun. 107, 98-109 (2023).
  29. Lannes, N., et al. Interactions of human microglia cells with Japanese encephalitis virus. Virol J. 14 (1), 8(2017).
  30. Ryan, K. J., et al. A human microglia-like cellular model for assessing the effects of neurodegenerative disease gene variants. Sci Transl Med. 9 (421), 7635(2017).
  31. Etemad, S., Zamin, R. M., Ruitenberg, M. J., Filgueira, L. A novel in vitro human microglia model: characterization of human monocyte-derived microglia. J Neurosci Methods. 209 (1), 79-89 (2012).
  32. Bortolotti, D., Gentili, V., Rotola, A., Caselli, E., Rizzo, R. HHV-6A infection induces amyloid-beta expression and activation of microglial cells. Alzheimers Res Ther. 11 (1), 104(2019).
  33. Ormel, P. R., et al. A characterization of the molecular phenotype and inflammatory response of schizophrenia patient-derived microglia-like cells. Brain Behav Immun. 90, 196-207 (2020).
  34. Akiyama, H., et al. Expression of HIV-1 intron-containing RNA in microglia induces inflammatory responses. J Virol. 95 (5), e01386-e01420 (2021).
  35. Nielsen, M. C., Andersen, M. N., Moller, H. J. Monocyte isolation techniques significantly impact the phenotype of both isolated monocytes and derived macrophages in vitro. Immunology. 159 (1), 63-74 (2020).
  36. Kelly, A., Grabiec, A. M., Travis, M. A. Culture of human monocyte-derived macrophages. Methods Mol Biol. 1784, 1-11 (2018).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи