Методическая статья

Выделение мезенхимальных стволовых клеток, полученных из пуповины, с высоким выходом и низким уровнем повреждения

5.7K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/66835

⸱

5 июля 2024 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Beijing University of Chinese Medicine, 2Department of Central Laboratory, Shenzhen Hospital, Beijing University of Chinese Medicine, 3Obstetrical Department, Longgang District Maternity & Child Healthcare Hospital of Shenzhen City, 4Longgang Maternity and Child Institute of Shantou University, Medical College

В этой статье

Краткое содержание

В этом исследовании представлена уникальная процедура тупого препарирования для сохранения целостности желе Уортона (WJ), что приводит к меньшему повреждению WJ и большему количеству и жизнеспособности собранных мезенхимальных стволовых клеток (МСК). Метод демонстрирует превосходный выход и пролиферативную способность по сравнению с обычными методами острого рассечения.

Аннотация

Мезенхимальные стволовые клетки (МСК) представляют собой популяцию мультипотентных клеток с замечательными регенеративными и иммуномодулирующими свойствами. Желе Уортона (WJ) из пуповины (ЯК) вызывает все больший интерес в биомедицинской области как выдающийся источник МСК. Тем не менее, возникли такие проблемы, как ограниченное предложение и отсутствие стандартизации в существующих методах. В данной статье представлен новый метод повышения выхода МСК путем отсечения неповрежденного МСК от пуповины. Метод использует тупое рассечение для удаления эпителиального слоя, сохраняя целостность всего МСК и приводя к увеличению количества и жизнеспособности собранных МСК. Такой подход значительно снижает отходы WJ по сравнению с обычными методами острого рассечения. Чтобы обеспечить чистоту WJ-MSC и свести к минимуму внешнее клеточное воздействие, была проведена процедура с использованием внутреннего натяжения для отслаивания эндотелия после переворачивания ЯК. Кроме того, чашка Петри была перевернута на короткое время во время культивирования эксплантов для улучшения прикрепления и роста клеток. Сравнительный анализ продемонстрировал превосходство предложенного метода, показав более высокий выход WJ и WJ-MSC с лучшей жизнеспособностью по сравнению с традиционными методами. Сходная морфология и характер экспрессии маркеров клеточной поверхности в обоих методах подтверждают их характерность и чистоту для различных применений. Этот метод обеспечивает высокопродуктивный и высокожизнеспособный подход к выделению WJ-MSC, демонстрируя большой потенциал для клинического применения МСК.

Введение

С момента первого выделения мезенхимальных стволовых клеток (МСК) из желе Уортона (WJ) в 1991 году, эти мультипотентные стволовые клетки привлекли значительное внимание исследователей благодаря своим регенеративным свойствами способности к многолинейной дифференцировке. МСК могут быть выделены из различных источников, включая костный мозг, периферическую кровь, пульпу зубов, жировую ткань, ткани плода (аборт человека) и ткани, связанные с рождением2. Пуповина (ЯК) стала многообещающим резервуаром благодаря своей неинвазивной природе, обильному выходу клеток и способности к дифференцировке, демонстрируя высокую скорость пролиферации, потенциал дифференцировки и свойства иммунной модуляции3. МСК плода обладают сильными стволовыми и иммунными свойствами, что делает их предметом клинических испытаний и фундаментальных исследований, проводимых в течение последних двух десятилетий 2,4,5. МСК, полученные из ЯК, обладают превосходным терапевтическим потенциалом по сравнению с другими источниками МСК, такими как костный мозг или жировая ткань 6,7.

ЯК состоит из амниотического эпителия, трех сосудов (двух артерий и одной вены) и студенистого вещества, известного как WJ3. Интересно, что ЯК представляет собой простую сосудистую сеть, состоящую только из эндотелия и мезотелия, но не из adventitia оболочки; WJ не содержит лимфы или нервов8. UC имеет уникальную структуру, идеально подходящую для сегментного разделения. UC-MSC в основном расположены в WJ. МСК могут быть выделены из различных компартментов WJ, включая амнион, субамнион (амнион и субамнион также обозначаются как область выстилки пуповины) и периваскулярную область WJ8. Каждый участок WJ имеет свою структуру, иммуногистохимические характеристики и функцию 3,6.

МСК, выделенные из WJ ЯК, широко рассматриваются как обладающие более высокой клинической полезностью по сравнению с МСК из других регионов3. WJ-МСК широко изучались в доклинических и клинических условиях для лечения различных заболеваний благодаря их многолинейному дифференцировочному потенциалу, иммуномодулирующим свойствам, паракринным эффектам, противовоспалительным эффектам и иммунопривилегированнымсвойствам 2,3. Было доказано, что WJ-MSC многообещающе подходят для лечения целого ряда заболеваний, включая реакцию «трансплантат против хозяина» (РТПХ), отторжение трансплантата, болезнь Крона, аутоиммунные заболевания и сердечно-сосудистые заболевания 9,10,11,12,13,14. Поскольку клинический спрос на МСК-пуповины продолжает расти, дефицит предложения пуповины в настоящее время является препятствием для их широкого применения.

Выход WJ-МСК зависит от метода, используемого для клеточной экстракции15. В то время как WJ-МСК могут быть выделены с помощью культуры эксплантов или ферментного расщепления, последний метод имеет более длительное время распространения, что может увеличить риск повреждения клеток и снизить жизнеспособность клеток16. Тем не менее, многочисленные исследования показали, что метод культивирования эксплантов увеличивает выход и жизнеспособность клеток, и что паракринные факторы, высвобождаемые из тканей экспланта, такжеспособствуют пролиферации клеток.

В этом исследовании был применен уникальный подход к препарированию для получения целых WJ, в результате чего были получены МСК с повышенной пролиферативной способностью, жизнеспособностью и количеством, при этом минимизируя повреждение WJ. Этот инновационный метод предлагает оптимизированную стратегию изоляции WJ-MSC, удовлетворяя критические потребности в приложениях MSC.

Протокол

Образцы были получены от здоровых доноров из Шэньчжэньской районной больницы матери и ребенка Лунган, провинция Гуандун, Китай. Использование человеческих образцов для исследования было одобрено Комитетом по этике больницы Шэньчжэня Пекинского университета китайской медицины (SZLDH2020LSYM-095) и Комитетом по медицинской этике Шэньчжэньской районной больницы матери и ребенка Лунган (LGFYYXLLS-2020-005). Все эксперименты проводились в соответствии с утвержденными методическими рекомендациями. Подробная информация об используемых реагентах и оборудовании приведена в Таблице материалов.

1. Забор пуповины человека

  1. Получить образцы пуповины человека из больницы кооператива в стерильных условиях.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Выбирайте донора в возрасте до 35 лет, предпочтительно первородящего, без гепатита, заболеваний, передающихся половым путем, или генетических нарушений. Результаты обследования при поступлении на вирус гепатита В, вирус гепатита С и цитомегаловирус должны быть отрицательными. Выберите кесарево сечение в качестве способа доставки.
  2. Выберите прямой и неповрежденный кусок UC длиной примерно 10-15 см.
  3. Закройте оба конца кровоостанавливающими щипцами и перевяжите хирургическими узлами на внутреннем конце между щипцами сразу после рождения доношенного новорожденного путем кесарева сечения. (собран ЯК, как показано на рисунке 1, шаг 1).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Операция кесарева сечения обеспечивает стерильность сбора. Используйте хирургические узлы размера 0 или 2-0 швов для лучшей прочности на разрыв.
  4. Перережьте перевязанную пуповину между щипцами и узлами с помощью хирургических ножниц (рисунок 1, шаг 1).
  5. Промойте его солевым раствором, чтобы удалить любые загрязняющие сгустки крови на поверхности, и немедленно переложите в стерильную пластиковую пробирку объемом 50 мл, содержащую 20 мл стерильного фосфатно-солевого буфера (PBS).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Во время переноса антибиотик не использовался.
  6. Закройте трубку. Поместите его на лед в полистирольную коробку и храните при температуре 4 °C перед транспортировкой в лабораторию.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Рассеките шнур в течение 4 часов после сбора.

2. Выделение студня Уортона из пуповины

  1. Обработайте пуповину, выполнив следующие действия:
    1. Подготовьте стерилизованный лоток с хирургическими инструментами, асептически упакованные посуды 90 мм, пипетки объемом 1000 мкл, стерильный PBS, 75% раствор этанола и питательную среду для человека MSC, не содержащую ксено.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Зубчатые щипцы и противомоскитные зажимы позволяют эффективно обрабатывать скользкий шнур.
    2. Обеззаражьте необходимые предметы и рабочую зону перед помещением предметов в шкаф биобезопасности.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Дайте воздуху в рабочей зоне продуться в течение нескольких минут перед началом работы.
    3. Продезинфицируйте поверхность пробирки и переместите образец в чашку Петри в шкафу биобезопасности. Погрузите образец с узлами в 75% этанол на 30 с, а затем многократно промойте его стерильным PBS в новой чашке Петри.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Перед погружением в 75% этанол шнур должен быть перевязан, а время погружения должно быть ограничено от 30 с до 1 минуты для полной дезинфекции шнура без повреждений.
    4. Отрежьте узлы и хирургическими ножницами и щипцами разрежьте шнур между двумя узлами поперечно на короткие кусочки длиной около 2 см.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Концы шнура с узлами следует утилизировать. Длина UC не должна быть слишком длинной или слишком короткой; Оба условия могут увеличить сложность операции.
    5. Перфузируйте вену (более крупный сосуд) с помощью PBS с помощью пипеток объемом 1000 мкл до тех пор, пока жидкость, выходящая с другого конца каната, не станет полностью прозрачной19.
  2. Рассеките пуповину.
    1. Переложите один из уже нарезанных кусочков в новую чашку Петри.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Две артерии и одна вена должны быть видимы на поперечном сечении8 (Рисунок 2B).
    2. Добавьте соответствующее количество PBS, чтобы шнур оставался влажным на протяжении всей операции.
    3. Обхватите спинной мозг щипцами и вытяните артерии вдоль его главной оси с помощью противомоскитных зажимов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Старайтесь тянуть с другого конца спинного мозга, если артерия была оторвана, так как стенка артерии обладает большой эластичностью.
    4. Зафиксируйте пуповину горизонтально более толстой стороной вверх, вставив одно лезвие щипцов в пупочную вену, а затем плотно зажав, обеспечив зажим щипцов на более толстой стороне.
    5. Сделайте линейный разрез на слое околоплодных вод от одного конца до другого по краю другого лезвия щипцов с помощью скальпеля (рисунок 3).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Сохраняйте целостность желе Уортона, обрезая как можно меньше WJ.
    6. Начните с одного угла режущего зазора. Приподнимите угол околоплодного эпителия зубчатыми зажимами и продолжайте резать горизонтально немного дальше роговичными ножницами по внутренней поверхности эпителия.
      1. Отделите желе Уортона и амниотический эпителий с помощью зажимов и постепенно расширяйте на весь круг одного конца ЯК. Снимите эпителиальный слой вдоль (рисунок 3).
        ПРИМЕЧАНИЕ: Студень Уортона представляет собой слизистую соединительную ткань, окруженную плотным амниотическимэпителием8. Вся операция должна быть гладкой, но при возникновении трудностей во время пилинга можно использовать противомоскитные зажимы для тупого вскрытия.
    7. Вставьте оба лезвия щипцов внутрь вены, зажмите порцию WJ, а затем выверните ее наизнанку, чтобы обнажить эпителий пупочной вены (рисунок 3).
    8. Отшелушивать эпителий вены легко, так как внутреннее напряжение создает разделение между эпителием вены и периваскулярным WJ (рис. 3).
  3. Препарируйте ЯК с помощью традиционного метода сравнения20.
    1. Выберите другой уже срезанный образец почти того же веса, что и предыдущий шнур и перенесите его в новую чашку Петри.
    2. Разрежьте вдоль пупочной вены продольно ножницами и раздвиньте ЯК, чтобы обнажить сосуды и ЖК.
    3. Удалите пупочную вену и две артерии, а также отрежьте WJ от эндотелиального слоя ножницами и скальпелем.

3. Выделение и культивирование ЯК-МСК

  1. Поместите собранный WJ в заранее помеченную чашку Петри диаметром 90 мм и разрежьте ее на кусочки по 1-3 мм с помощью ножниц и щипцов.
  2. Переверните чашку с крышкой на дне и поместите ее в инкубатор с 5%CO2 при температуре 37 °C на 30 минут, чтобы укрепить крепление между частями и пластиковой поверхностью.
  3. Переверните чашку и аккуратно добавьте соответствующее количество питательной среды для МСК для дальнейшего культивирования.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте самую низкую скорость, чтобы убедиться, что детали все еще прикреплены.
  4. Меняйте питательную среду для человека каждые 3 дня. Замените две трети среды и наблюдайте за появлением вырастания фиброзных клеток каждые 2 дня в течение первых 7 дней, меняйте полную среду и наблюдайте за ней ежедневно в дальнейшем.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте перемещения чашки Петри в течение первых 7 дней. Выраженный рост фибробластоподобных клеток наблюдался примерно через 4 дня.
  5. Субкультура до слияния достигает 80%.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг занимает 7-10 дней.
    1. Предварительно нагрейте PBS, 0,25% трипсина и культуру MSC человека, не содержащую ксеносов, до 37 °C на водяной бане.
    2. После отсасывания надосадочной жидкости с помощью пипеток промойте PBS и отделите клетки предварительно нагретым 0,25% трипсином до тех пор, пока клетки не смогут быть смещены постукиванием по чашке Петри.
    3. Инактивировать трипсин путем смешивания предварительно нагретой питательной среды МСК в соотношении 4:1, собрать клеточную суспензию и центрифугировать при 300 х г в течение 5 мин при 4 °С.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эти клетки считаются проходом 0 (P0).
    4. Надосадочную жидкость отбросить пипеткой, ресуспендировать клетки в культуральную среду МСК человека и инокулировать в новые чашки Петри с плотностью затравки 1х104 клеток/см2 для размножения .
  6. С помощью гемоцитометра подсчитайте общее количество клеток двух методов после амплификации при первом, втором и третьем пассаже. Определите морфологию клетки под микроскопом в первом, третьем и пятом пассажах.
    Примечание: Морфология этих клеток должна быть схожа с клетками P0.
  7. Используйте клетки на пятом проходе для проточной цитометрии и других экспериментов.

4. Экспрессия маркеров клеточной поверхности методом проточной цитометрии

  1. Отделите 5 (P5) клеток с 0,25% трипсина, промойте клетки буфером для окрашивания клеток и центрифугируйте при 300 x g в течение 5 минут при 4 °C. Ресуспендируйте гранулы с буфером для окрашивания клеток до 100 мкл каждая.
  2. Пометьте каждую пробирку и добавьте соответствующее количество антител, которые были конъюгированы с аллофикоцианином (APC), флуоресцеином изотиоцианатом (FITC) или фикоэритрином (PE): CD44-APC, CD73-APC, CD90-FIFC, CD105-FIFC, CD11B-PE, CD19-PE, CD43-PE, HLA-DR-PE в соответствии с инструкциями производителя21. Выдерживать 15-20 мин в темноте при комнатной температуре.
  3. Центрифугируйте окрашенные клетки при 300 x g в течение 5 минут при 4 °C, отасканируйте надосадочную жидкость с помощью пипетки и промойте один раз буфером для окрашивания клеток.
  4. Повторите центрифугирование и ресуспендирование клеток с 300 мкл буфера для окрашивания клеток.
  5. Пропустите клетки через проточный цитометр и проанализируйте окрашенные антителами клетки в соответствии с инструкциями производителя.

5. Определение кривой роста клеток методом подсчета клеток

  1. Получить одноклеточную суспензию клеток Р5 двумя способами путем их разведения в культуральной среде МСК человека.
  2. Засейте 8 000 клеток в лунку в 24-луночной пластине, всего засеивается 21 лунка каждого метода.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Перед посевом аккуратно перемешайте ячейки, обдувая и отсасывая пипетками.
  3. Соберите ячеек из трех лунок через 24 ч посева. Проведите подсчет клеток с помощью гемоцитометра, чтобы вычислить среднее значение.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Встряхните планшет перед подсчетом клеток. Продолжительность встряхивания может быть увеличена, чтобы предотвратить образование клеточных агрегатов.
  4. Повторяйте подсчет клеток каждые 24 часа в общей сложности в течение 7 дней. Постройте кривую роста с использованием времени (d) по оси X и количества клеток (x104/мл) по оси Y.

Результаты

Процедуры сбора и культивирования UC-MSC, а также их последующий анализ обобщены на рисунке 1. UC был аккуратно разделен на несколько секций с помощью уникального метода; конкретная схема работы основных процедур проиллюстрирована на рисунке 2. Рост клеток из культур эксплантов регулярно контролировался и регистрировался. Адгезивные веретенообразные клетки наблюдались примерно через 4 дня после культивирования эксплантов и все чаще приобретали вихревую форму. Эти клетки также были идентифицированы как P0 и продолжали пролиферировать для последующего пассации, сохраняя при этом однородный размер и морфологию во время пролиферации и пассирования. Традиционные и современные методы показали незначительные различия с точки зрения размера и морфологии клеток (рис. 3).

Традиционный метод диссекции включает в себя соскабливание WJ из кровеносных сосудов и внутреннего эпителия ЯК. Выход WJ представлял собой значительную разницу между двумя методами путем корректировки по весу. Выход WJ можно рассчитать, измерив процент веса WJ в 2 см шнура (2,4 г ± 0,2 г). Сравнение соотношения урожайности WJ между текущим и традиционным методами показало значительное увеличение урожайности WJ при использовании нового подхода (рис. 4A). Дальнейший анализ путем подсчета общего количества WJ-МСК, собранных обоими методами из эквивалентного веса UC одновременно, показал выраженный разрыв в количестве клеток с увеличением числа пассажей (рис. 4B). Кривая роста показала, что скорость пролиферации МСК в новом методе была значительно выше, чем в обычном методе, при той же плотности инокуляции через 2 дня (рис. 4C). Эти эксперименты демонстрируют преимущества современного метода, который позволяет эффективным способом увеличить эффективную подачу того же материала.

В соответствии с минимальными критериями определения МСК Международного общества клеточной и генной терапии (ISCT), иммунофенотип МСК демонстрирует положительную экспрессию CD105, CD44, CD90, CD73 (более 95%), при этом отсутствует CD45, CD19, CD34, CD11b и HLA-DR (менее 2%)22. МСК, полученные из WJ, были исследованы с помощью количественной проточной цитометрии (рис. 5); клетки, выделенные обоими методами, были высоко положительны к поверхностным антигенам CD105, CD44, CD90 и CD73 (все выше 99%), при этом экспрессия поверхностных молекул CD45, CD19, CD34, CD11b и HLA-DR была выражена ниже определяемых уровней (данные не показаны). На основании результатов маркеров клеточной поверхности адгезивные клетки могут быть точно расценены как МСК, и может быть обеспечена их идентификация и чистота.

figure-results-1
Рисунок 1: Схематическое изображение рассечения и изоляции WJ-MSC от пуповины. Шаг 1: Образец пуповины человека берут у новорожденного и промывают солевым раствором с последующей перфузией вены. Затем шнур разрезают на кусочки по 2 см. Шаг 2: Чистое желе Уортона (WJ) получают с помощью современного метода, включающего разделение артерий, амниотического эпителия и венозного эпителия. Для сравнения также используется традиционный метод. Соответственно рассекается пуповина. Шаг 3: Препарированный WJ разрезают на кусочки 1-3 мм, и чашку помещают вверх дном в инкубатор на 30 минут для укрепления крепления между частями и пластиковой поверхностью. Затем кусочки WJ культивируют и пропускают при плотности посева 1 x 104 клеток/см2 до достижения 80% конфлюенции. Шаг 4: Проточная цитометрия используется для характеристики клеток Р5 путем анализа маркеров поверхности мезенхимальных стволовых клеток (МСК). Шаг 5: Пролиферативная способность клеток определяется путем построения кривой роста клеток с использованием метода подсчета клеток. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-2
Рисунок 2: Анатомия пуповины и схематическая демонстрация диссекции. (A) Поперечное сечение ЯК, выделение артерий (А), вены (V), желе Уортона (WJ) и последующее рассечение разделяют ЯК на различные отделы. (Б) Схематическая демонстрация удаления амниотического эпителиального слоя. Разрез делается по пунктирной линии на амниотическом эпителии, отделяя эпителий, начиная с бокового угла спинного мозга. (В) Схематическая демонстрация удаления эпителиального отверстия вены. Переворачивание шнура наизнанку (направление стрелки указывает на направление силы) обнажает эпителий вены для удаления. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-3
Рисунок 3: Морфологические особенности первичных культивируемых и пассажированных WJ-МСК. Различимый рост фибробластоидных клеток из эксплантов можно наблюдать примерно на 4-й день (обозначен стрелками) и все чаще демонстрирует вихревой характер роста. Экспланты были удалены и субкультивированы; Выделенные клетки были однородны по визуализируемым размерам и морфологии. Наблюдалась незначительная разница в размерах и морфологии клеток между двумя методами. Масштабная линейка: 200 μм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-4
Рисунок 4: Графический сравнительный анализ урожайности WJ и характеристик роста культивируемых МСК. (A) Сравнение выхода WJ с использованием 2 см UC с начальной массой 2,4 г ± 0,2 г обоими методами. Выход WJ = (вес WJ) / (начальный вес необработанного шнура. Отношение выхода WJ (%) = (выход WJ) / (средний выход WJ по текущему методу) × 100. (В) Сравнение подсчета клеток после культивирования и пассажа в одних и тех же условиях обоими методами. (C) Кривые роста Р5-клеток в обоих методах. Все эксперименты включали три биологические реплики, а статистические различия анализировали методом двустороннего ANOVA (***p < 0,001). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-5
Рисунок 5: Экспрессия МСК на клеточной поверхности проанализирована с помощью проточной цитометрии. Р5-клетки, собранные как традиционными, так и современными методами, подвергаются анализу проточной цитометрии. Поверхностные антигены CD44, CD105, CD90 и CD73 были высоко положительными (все выше 99%), в то время как экспрессия поверхностных молекул CD45, CD19, CD34, CD11b и HLA-DR была ниже предела обнаружения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Обсуждение

МСК представляют собой динамичную область исследований с глубокими последствиями для регенеративной медицины22. Их уникальные свойства делают их центром научных исследований и обладают потенциалом для революции в лечении широкого спектра заболеваний и травм7. WJ-МСК представляют собой отдельную подгруппу МСК, которые могут быть получены из студенистой соединительной ткани в пределах ЯК, расположенной между межсосудистым и амниотическим эпителием23. Клиническое применение МСК заключается в достижении достаточного количества клеток24. Однако по мере увеличения числа пассажей клетки начали проявлять определенную степень феномена старения, и пролиферативная способность МСК постепенно снижалась после P524. Поэтому крайне важно оптимизировать методы для повышения выхода MSC.

Наиболее эффективным способом выделения WJ-MSC является препарирование всего WJ с сохранением его целостности6. Исследования показывают, что эти пограничные клетки из пограничных областей пуповины имеют более высокую миграционную характеристику и более высокую скорость пролиферации, чем межсосудистые WJ-MSCs23. Тем не менее, регионы и методы препарирования WJ не были стандартизированы, и остается неясным, обладают ли популяции стволовых клеток в WJ-MSC одними и теми же качествами из-за отсутствия четких гистологических границ междуразделами.

Предыдущие исследования показали значительные различия в свойствах WJ-МСК, полученных из различных отделов пуповины, при этом клетки, расположенные близко к амниотической поверхности, проявляют повышенную пролиферативную способность3. В настоящее время уникальный метод препарирования UC и выделения WJ-MSC направлен на снижение как потери выстилающей оболочки WJ, так и повреждения клеток, что повышает выход и жизнеспособность клеток. Этот протокол демонстрирует метод, который облегчил обработку UC в почти неповрежденный WJ. Первый этап протокола включает в себя удаление эпителиального слоя с помощью пилинга и тупого рассечения. Инновационным шагом является отшелушивание эпителиального слоя вдоль с помощью противомоскитных зажимов. Этот подход эффективен для уменьшения повреждения соседних клеток, вызванного обычным острым рассечением ножницами25.

Эндотелий вены хрупкий, и от него трудно избавиться. После удаления амниотического эпителия из пупочной вены пуповина переворачивается через вену, чтобы обнажить эндотелий. Внутреннее напряжение, создаваемое WJ, затем используется для отслаивания эндотелия вены, тем самым сводя к минимуму интерференцию эндотелиальных клеток пупочной вены человека (HUVECs) во время последующих процессов культивирования клеток.

Метод культивирования эксплантов принят, поскольку он имеет более высокую урожайность по сравнению с другими доступными методами18. Неприкрепленные клетки будут постепенно удаляться путем обмена питательной средой МСК человека, что приведет к потере клеток26. Экспланты, которые не прилипают к пластику, могут препятствовать росту клеток в предыдущем опыте. Необходимо учитывать воздействие водяного пара, выделяемого тканью из-за изменений между внутренней и внешней температурой инкубатора. Для поддержания сухого состояния чашки Петри был реализован инновационный шаг по переворачиванию чашки вверх дном на 30 минут во время инкубации с крышкой на дне. Такая инверсия чашки позволила избежать конденсации водяного пара на контакте между тканью и поверхностью чашки Петри, что, в свою очередь, позволяет лучше прикреплять экзосомы к пластиковой поверхности для улучшения роста клеток.

Проводимый метод сравнивают с обычным методом препарирования путем измерения массового процента полученного WJ и количества культивируемых и пассажированных МСК; Новый метод показал значительно более высокую урожайность WJ и большее количество собранных МСК. Несмотря на то, что любой протокол выделения популяций стволовых клеток из каждого из этих компартментов сопряжен с риском контаминации клеток из других компартментов, результаты продемонстрировали чистоту выделенных МСК, характеризующуюся высокой экспрессией мезенхимальных маркеров (все выше 99%) и минимальным обнаружением гемопоэтических и эндотелиальных маркеров (данные не показаны). Результаты доказали, что WJ-MSC являются чистыми и подходят для различных применений, в соответствии с рекомендациями ISCT21. Культивируемые МСК в течение короткого периода времени демонстрировали фибробластоподобные клетки, и клетки все чаще формировались в вихревые клетки, демонстрируя большой пролиферативный потенциал и миграционные свойства.

Протокол, изложенный в этом исследовании, имеет ряд недостатков. Во-первых, требуется высокая квалификация оператора, о чем свидетельствует отделение амниотического эпителия. Это может помешать его широкому внедрению в исследованиях или клиническом применении. Во-вторых, протокол в значительной степени опирается на ручные манипуляции во время вскрытия, что может привести к несогласованности между экспериментами или операторами. Стандартизация процесса вскрытия повысила бы надежность и воспроизводимость протокола25. Кроме того, отсутствие других сравнений с традиционным методом оставляет вопросы без ответа.

В заключение следует отметить, что данный метод обеспечивает эффективный способ отделения интактного желе Уортона от амниотического эпителия и сосудов, что приводит к получению экстракта, включающего периваскулярное и субамниотическое желе Уортона. Введение инвертированной ступени инкубации еще больше способствует улучшению прикрепления MSC. Сравнительный анализ с традиционными методами демонстрирует существенные преимущества предложенного протокола с точки зрения получения более высокого выхода WJ и сбора большего количества МСК с лучшей пролиферативной способностью. Полученные данные также подчеркивают чистоту выделенных МСК, на что указывает отчетливая картина экспрессии маркеров клеточной поверхности. Этот метод может повысить выход МСК и пролиферативную способность, предлагая экономически эффективный метод увеличения производства МСК.

Раскрытие информации

Авторы не сообщают о конфликте интересов.

Благодарности

Работа выполнена при финансовой поддержке Национального фонда естественных наук Китая (82172107), Фонда естественных наук провинции Гуандун, Китай (2021A1515011927, 2021A1515010918, 2020A1515110347), Шэньчжэньского фонда медицинских исследований (SMRF. D2301015), Шэньчжэньский муниципальный комитет по науке и технологическим инновациям (JCYJ20210324135014040, JCYJ20220530172807016, JCYJ20230807150908018, JCYJ20230807150915031) и Специальный фонд экономического и технологического развития района Лунган (LGKCYLWS2022007).

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Антитела к CD44 APC против человека Биолегенда 
24-луночные клеточные культуральные планшетыThermo Scientific142475
APC античеловеческое антитело CD73 (Ecto-5'-нуклеотидаза)Биолегенда 
мыши APC IgG1, κ Изотип Ctrl (FC) АнтителоBiolegend 
АвтоклавHIRAYAMAHVE-50
Автоматический счетчик клетокCountstarFL-CD
BAMBANKER Решение для криоконсервацииWako302-14681
Буфер для окрашивания клетокBiolegend 
Центробежная машинаEppendorf5424R
Clean BenchShanghai ZhiChengC1112B
CO2 ИнкубаторThermo ScientificHERAcell 150i
D-PBSSolarbioD1040
Электротермостатическая дутьевая печьShanghai JingHongDHG-9423A
FITC античеловеческое антитело к CD105 Биолегенда 
FITC античеловеческое антитело к CD90 (Thy1) Биолегенда 
мыши FITC IgG1, κ Изотип Ctrl (FC) АнтителоBiolegend 400110
Проточная цитометрияBeckmanCytoFLEX
гемоцитометрSuperior Marienfeld640410
Внутриклеточное окрашивание Пермеабилизация Промывочный буфер (10&раз;) Биолегенда 
Инвертированный биологический микроскопZEISSAxio Vert. A1
Резервуар для хранения жидкого азотаThermo ScientificCY50935-70
Нормальный физиологический раствор (NS)MeilunbioMA0083
PBSSolarbioP1032
PE антитела к человеку CD11b Biolegend 
ПЭ антитела к человеческому CD19 Биолегенда 
ПЭ античеловеческое антитело к CD34Biolegend 
ПЭ античеловеческое антитело к CD45Biolegend 368510
PE антитела к HLA-DR к человеку Биолегенда 
PE Mouse IgG1, κ Изотип Ctrl (FC) АнтителоBiolegend 
ПЭ мыши IgG2a, κ Изотип Ctrl (FC) АнтителоBiolegend 
Прецизионные электронные весыSatoriusPRACTUM313-1CN
Машина для льда со снежинкамиZIEGRAZBE 30-10
стерилизованная 50 мл пластиковая тубаGreniner227270
Термостатическая водяная баняShanghai YiHengHWS12
Trypsin 1:250SolarbioT8150
UltraGRO-AdvancedHelios 
Система очистки сверхчистой и чистой водыMilli-Q Milli-QReference
Xeno-Free Human MSC Culture MediumFUKOKU 
338806344006400122420201323204328108421002393112392506343606307606400114400214HPCFDCGL50T2011301

Ссылки

  1. Abbaszadeh, H., et al. Regenerative potential of Wharton's jelly-derived mesenchymal stem cells: A new horizon of stem cell therapy. J Cell Physiol. 235 (12), 9230-9240 (2020).
  2. Liau, L. L., Ruszymah, B. H. I., Ng, M. H., Law, J. X. Characteristics and clinical applications of Wharton's jelly-derived mesenchymal stromal cells. Curr Res Transl Med. 68 (1), 5-16 (2020).
  3. Kim, D. -W., et al. Wharton's jelly-derived mesenchymal stem cells: Phenotypic characterization and optimizing their therapeutic potential for clinical applications. Int J Mol Sci. 14 (6), 11692-11712 (2013).
  4. Drobiova, H., et al. Wharton's jelly mesenchymal stem cells: A concise review of their secretome and prospective clinical applications. Front Cell Dev Biol. 11, 1211217(2023).
  5. Joerger-Messerli, M. S., et al. Mesenchymal stem cells from Wharton's jelly and amniotic fluid. Best Pract Res Cl Ob. 31, 30-44 (2016).
  6. Pera, M., Subramanian, A., Fong, C. -Y., Biswas, A., Bongso, A. Comparative characterization of cells from the various compartments of the human umbilical cord shows that the Wharton's jelly compartment provides the best source of clinically utilizable mesenchymal stem cells. Plos One. 10 (6), 0127992(2015).
  7. Petrenko, Y., et al. A comparative analysis of multipotent mesenchymal stromal cells derived from different sources, with a focus on neuroregenerative potential. Sci Rep. 10 (1), 4290(2020).
  8. Davies, J. E., Walker, J. T., Keating, A. Concise review: Wharton's jelly: The rich, but enigmatic, source of mesenchymal stromal cells. Stem Cells Transl Med. 6 (7), 1620-1630 (2017).
  9. Pan, Y., Wu, W., Jiang, X., Liu, Y. Mesenchymal stem cell-derived exosomes in cardiovascular and cerebrovascular diseases: From mechanisms to therapy. Biomed Pharmacother. 163, 114817(2023).
  10. Elshaer, S. L., Bahram, S. H., Rajashekar, P., Gangaraju, R., El-Remessy, A. B. Modulation of mesenchymal stem cells for enhanced therapeutic utility in ischemic vascular diseases. Int J Mol Sci. 23 (1), 249(2021).
  11. Wang, R., et al. Stem cell therapy for Crohn's disease: Systematic review and meta-analysis of preclinical and clinical studies. Stem Cell Res Ther. 12 (1), 463(2021).
  12. Shi, Y., et al. Immunoregulatory mechanisms of mesenchymal stem and stromal cells in inflammatory diseases. Nat Rev Nephrol. 14 (8), 493-507 (2018).
  13. Kassem, D. H., Kamal, M. M. Wharton's jelly MSCs: Potential weapon to sharpen for our battle against DM. Trends Endocrinol Metab. 31 (4), 271-273 (2020).
  14. Saleh, M., Fotook Kiaei, S. Z., Kavianpour, M. Application of Wharton jelly-derived mesenchymal stem cells in patients with pulmonary fibrosis. Stem Cell Res Ther. 13 (1), 71(2022).
  15. Varaa, N., Azandeh, S., Khodabandeh, Z., Gharravi, A. M. Wharton's jelly mesenchymal stem cell: Various protocols for isolation and differentiation of hepatocyte-like cells; narrative review. Iran J Med Sci. 44 (6), 437-448 (2019).
  16. Hassan, G., Kasem, I., Soukkarieh, C., Aljamali, M. A simple method to isolate and expand human umbilical cord derived mesenchymal stem cells: Using explant method and umbilical cord blood serum. Int J Stem Cells. 10 (2), 184-192 (2017).
  17. Naeem, A., et al. A comparison of isolation and culture protocols for human amniotic mesenchymal stem cells. Cell Cycle. 21 (15), 1543-1556 (2022).
  18. Yoon, J. H., et al. Comparison of explant-derived and enzymatic digestion-derived MSCs and the growth factors from Wharton's jelly. Biomed Res Int. 2013, 428726(2013).
  19. Reinisch, A., Strunk, D. Isolation and animal serum free expansion of human umbilical cord derived mesenchymal stromal cells (MSCs) and endothelial colony forming progenitor cells (CFCs). J Vis Exp. (32), e1525(2009).
  20. Beeravolu, N., et al. Isolation and characterization of mesenchymal stromal cells from human umbilical cord and fetal placenta. J Vis Exp. (122), e55224(2017).
  21. Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
  22. Samsonraj, R. M., et al. Concise review: Multifaceted characterization of human mesenchymal stem cells for use in regenerative medicine. Stem Cells Transl Med. 6 (12), 2173-2185 (2017).
  23. Sypecka, M., Bzinkowska, A., Sulejczak, D., Dabrowski, F., Sarnowska, A. Evaluation of the optimal manufacturing protocols and therapeutic properties of mesenchymal stem/stromal cells derived from Wharton's jelly. Int J Mol Sci. 24 (1), 652(2022).
  24. Binato, R., et al. Stability of human mesenchymal stem cells during in vitro culture: Considerations for cell therapy. Cell Prolif. 46 (1), 10-22 (2012).
  25. Mushahary, D., Spittler, A., Kasper, C., Weber, V., Charwat, V. Isolation, cultivation, and characterization of human mesenchymal stem cells. Cytometry A. 93 (1), 19-31 (2018).
  26. Hendijani, F. Explant culture: An advantageous method for isolation of mesenchymal stem cells from human tissues. Cell Prolif. 50 (2), 12334(2017).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи