В данной работе мы показываем, что мощные лазеры с длиной волны 375 нм и 405 нм могут эффективно возбуждать Hoechst 33342 и служить жизнеспособной альтернативой лазеру с длиной волны 355 нм для обнаружения клеток боковой популяции (SP), тем самым расширяя диапазон доступных лазеров в приложениях проточной цитометрии.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Эффективное обнаружение популяционных клеток боковой стороны Хёхста с помощью проточной цитометрии
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Клетки боковой популяции (SP) идентифицируют с помощью окрашивания по методу Hoechst 33342 и анализируют с помощью проточной цитометрии (FCM). Метод Hoechst SP используется для выделения стволовых клеток на основе свойств оттока красителя транспортеров АТФ-связывающей кассеты (ABC). Первоначально этот метод использовался для идентификации и выделения гемопоэтических стволовых клеток (ГСК), но в настоящее время он эволюционировал и в первую очередь сосредоточился на идентификации и выделении раковых стволовых клеток (ОСК). Традиционный метод обнаружения FCM использует лазер с длиной волны 355 нм для возбуждения красителя для обнаружения SP-клеток. В ходе этого исследования мы успешно определили альтернативные подходы к возбуждению красителем, которые могут эффективно заменить обнаружение SP-клеток с помощью лазера с длиной волны 355 нм. Это достигается за счет использования мощных лазеров с длиной волны волны 375 нм или 405 нм. Это позволяет нам проявлять повышенную селективность при обнаружении SP-клеток, а не ограничиваться только лазерной проточной цитометрией с длиной волны 355 нм.
Введение
Клетки боковой популяции (SP) идентифицируют с помощью окрашивания по методу Hoechst 33342 и анализируют с помощью проточной цитометрии (FCM). SP-клетки характеризуются выкачиванием флуоресцентного красителя ДНК из клеток через их транспортер АТФ-связывающей кассеты (ABC) 1,2. Первоначально метод был разработан для выделения гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) костного мозга мышей1. SP-клетки костного мозга были обогащены популяцией ГСК, характеризующихся низкой экспрессией CD117+Sca-1+Lin-Thy1 3,4.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
В экспериментах в этом исследовании приняли участие в общей сложности 10 мышей C57BL/6 в возрасте от 8 до 12 недель. Экспериментальные операции проводились в соответствии с протоколом, который был одобрен Комитетом по институциональному уходу за животными и их использованию Сычуаньского университета (#201609309). Экспериментальные материалы и параметры проточной цитометрии, использованные в данной статье, приведены в Таблице материалов.
1. Выделение и забор клеток костного мозга мыши
- Усыпляйте мышей в строгом соответствии с рекомендациями учреждения. Чтобы вызвать потерю сознания у мышей, вводят и....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
На рисунке 2 контрольную группу лечили верапамилом, который блокирует транспортеры ABC в стволовых клетках для предотвращения элиминации Hoechst 33342. Таким образом, стволовые клетки в группе неверапамила вытесняют Hoechst 33342 и образуют отрицательную клеточную популяцию, известную как SP-клетки. Лазер с длиной волны 355 нм эффективно возбуждает краситель Hoechst 33342, что приводит к четкому наблюдению SP-клеток костного мозга (рис. 2A). SP-ячейки одних и те.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Мы использовали описанный протокол для проведения трех экспериментов, в каждом из которых участвовало 3-4 мыши, в результате чего было получено в общей сложности 10 мышей. Доля SP-элементов колебалась от 0,05% до 0,76%. Важно отметить, что среди мышей наблюдались индивидуальные вариации. Мы использовали четыре проточных цитометра для анализа образцов Хёхста. Было замечено, что возбуждение красителя Hoechst лазером мощностью 20 мВт и длиной волны 355 нм на новой версии проточной цитометрии эквивалентно возбуждению лазера .......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Конфликт интересов не декларируется.
Благодарности
Эта работа была поддержана грантами J.H. от Национального фонда естественных наук Китая (No 81800207). Мы высоко ценим помощь компании Beckman Coulter, Inc. в обеспечении поддержки проточной цитометрии и калибровки параметров. Мы благодарим Цзяо Чэня из Государственной ключевой лаборатории болезней полости рта Западно-Китайской стоматологической больницы Сычуаньского университета и Юй Ци из Исследовательского центра регенеративной медицины Западно-Китайской больницы Сычуаньского университета за их помощь в сборе данных проточной цитометрии.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Автоматический счетчик ячеек | Countstar | 1M1200 | |
| Cell Filter (100 & микро; m) | BIOFIL | CSS-013-100 | |
| Ежедневный контроль качества флюоросфер | Beckman Coulter | B5230 | |
| Модификация Dulbecco's Eagle's Medium с глюкозой 4,5 г/л (среда DMEM) | CORNING | 10-013-CVRC | |
| Фетальная бычья сыворотка | CORNING | 35-081-CV | |
| HBSS | Hyclone | SH30030.02 | |
| Hoechst 33342 | Sigma-Aldrich | B2261 | |
| Пропидиум йодид (PI) | Sigma-Aldrich | P4170 | |
| Буфер для лизиса эритроцитов | Beyotime | C3702 | |
| Verapamil | Sigma-Aldrich | V4629 |
Ссылки
- Goodell, M. A., Brose, K., Paradis, G., Conner, A. S., Mulligan, R. C. Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo. J Exp Med. 183 (4), 1797-1806 (1996).
- Zhou, S., et al.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
