Методическая статья

Выделение на основе проточной цитометрии и терапевтическая оценка инфильтрирующих опухоль лимфоцитов на мышиной модели рака поджелудочной железы

DOI:

10.3791/67413

⸱

17 января 2025 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pancreatic Cancer, National Clinical Research Center for Cancer, Tianjin's Clinical Research Center for Cancer, Tianjin Key Laboratory of Digestive Cancer, Key Laboratory of Cancer Prevention and Therapy, Tianjin Medical University Cancer Institute and Hospital, 2Department of Immunology and Biotherapy, National Clinical Research Center for Cancer, Tianjin's Clinical Research Center for Cancer, Key Laboratory of Cancer Immunology and Biotherapy, Key Laboratory of Cancer Prevention and Therapy, Tianjin Medical University Cancer Institute and Hospital, 3Research Core Facility, School of Basic Medical Sciences, Tianjin Medical University, 4Department of Public Laboratory, National Clinical Research Center for Cancer, Key Laboratory of Cancer Prevention and Therapy of Tianjin, Tianjin's Clinical Research Center for Cancer, Tianjin Medical University Cancer Institute and Hospital

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы описываем метод использования инфильтрирующих опухоль лимфоцитов (TILs) от мышей с помощью проточной цитометрии для адоптивного переноса клеток. Этот протокол направлен на проверку специфической цитотоксичности TILs против опухолей в модели сингенного рака поджелудочной железы у мышей, что дает представление о разработке адоптивной клеточной терапии рака поджелудочной железы.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Рак поджелудочной железы является агрессивным злокачественным новообразованием с мрачным прогнозом и ограниченными терапевтическими возможностями. Адоптивная клеточная терапия, которая включает в себя изоляцию и активацию собственных иммунных клеток пациента, таких как инфильтрирующие опухоль лимфоциты (TILs), перед их повторной инфузией, представляет собой многообещающий экспериментальный подход. Тем не менее, методы адоптивного переноса клеток в доклинических моделях рака поджелудочной железы недостаточно хорошо изучены. Здесь мы опишем подробный протокол адоптивной клеточной терапии с использованием TILs из модели сингенного рака поджелудочной железы у мыши. Процедура включает в себя имплантацию живых или облученных клеток рака поджелудочной железы мыши мышам-репортерам с флуоресцентной меткой для инициирования притока иммунных клеток, затем выделение лимфоцитов из первичных опухолей с помощью сортировки проточной цитометрии и/или активацию и расширение опухолеактивных Т-клеток ex vivo, а также адоптивный перенос этих активированных Т-клеток внутрибрюшинно мышам-носителям с опухолями с последующим введением интерлейкина-2. Биолюминесцентная визуализация опухолей позволяет проводить лонгитюдный мониторинг роста ортотопической опухоли и ответа на терапию, особенно оценивая опухолеспецифические цитотоксические эффекты. Этот подход обобщает логистику, связанную с разработкой адоптивной терапии переноса клеток для пациентов с раком поджелудочной железы. Результаты демонстрируют повышенную противоопухолевую эффективность адопуально перенесенных опухолевых Т-клеток по сравнению с нерелевантными лимфоцитами контрольной группы. Эта универсальная методология позволяет in vivo изучать адоптивную иммунотерапию при раке поджелудочной железы, а также оптимизировать параметры клеточного процессинга и комбинированные схемы лечения.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Иммунотерапия рака поджелудочной железы находится на начальной стадии, с продолжающимися доклиническими исследованиями и валидацией, в первую очередь на мышиных моделях1. Современные методы лечения рака поджелудочной железы включают хирургическое вмешательство, химиотерапию, лучевую терапию и таргетную терапию. К сожалению, эти методы часто не позволяют полностью искоренить опухолевые образования, что приводит к рецидивам и прогрессированию. Традиционные методы лечения сосредоточены на опухолевых клетках, но часто упускают из виду опухолевое микроокружение (TME), которое включает в себя как опухолевые клетки, так и связанную с ними строму, состоящую из инфильтрирующих опухоль лимфоцитов (TILs), фибробластов и внеклеточного матрикса2. TILs — это иммунные клетки в пределах TME, включая цитотоксические Т-клетки, хелперные Т-клетки, регуляторные Т-клетки, В-клетки, NK-клетки, макрофаги и миелоидные супрессорные клетки. Эти клетки участвуют в иммунных реакциях, которые влияют на рост опухоли и результаты лечения4.

Адоптивная клеточная терапия (ACT) включает в себя сбор иммунных клеток пациента, их модификацию и расширение in vitro, а затем повторное введение для нацеливания и уничтожения опухолевых клеток. TIL-терапия, разновидность АКТ, исследуется для лечения различных видов рака, включая меланому, рак легких и рак шейки матки. Этот процесс включает в себя выделение лимфоцитов из опухоли, культивирование их с помощью IL-2 in vitro и повторное вливание их пациенту, часто после лимфодеплеции с помощьюхимиотерапии или лучевой терапии.

С тех пор, как исследование Розенберга 1986 года продемонстрировало эффективность TILs у мышей6, иммунотерапия с переносом адоптивных клеток стала горячей точкой исследований и показала многообещающие результатыв лечении рака. Мы стремимся извлечь TILs у мышей, отсортировать их на наличие специфических Т-клеток с помощью проточной цитометрии и подтвердить их эффекты для уничтожения опухолей с помощью адоптивного переноса.

В этом протоколе мы описываем метод использования TILs от мышей с помощью проточной цитометрии для переноса адоптивных клеток. Цель состоит в том, чтобы проверить специфическую цитотоксичность TILs против опухолей на мышиной модели сингенного рака поджелудочной железы, что дает представление о разработке адоптивной клеточной терапии рака поджелудочной железы. Этот метод включает в себя имплантацию живых или облученных раковых клеток поджелудочной железы мышей с флуоресцентной меткой для инициирования притока иммунных клеток, выделение лимфоцитов из первичных опухолей с помощью сортировки проточной цитометрии или активацию и расширение опухолеактивных Т-клеток ex vivo, а также адоптивный перенос этих активированных Т-клеток мышам-носителям опухолей. Последующее введение интерлейкина-2 и биолюминесцентная визуализация опухоли позволяют проводить продольный мониторинг роста ортотопической опухоли и ответа на терапию, в частности, оценивать опухолеспецифичные цитотоксические эффекты. Этот подход обобщает логистику, связанную с разработкой адоптивной терапии переноса клеток для пациентов с раком поджелудочной железы. Результаты демонстрируют повышенную противоопухолевую эффективность адопуально перенесенных опухолевых Т-клеток по сравнению с нерелевантными лимфоцитами контрольной группы. Эта универсальная методология позволяет in vivo изучать адоптивную иммунотерапию при раке поджелудочной железы, а также оптимизировать параметры клеточного процессинга и комбинированные схемы лечения.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мышиная колония содержится в учреждении, аккредитованном AAALAC International, в соответствии со всеми соответствующими правилами и стандартами USDA, HHS и NIH. Институт рака Тяньцзиньского медицинского университета и Комитет по уходу за животными и их использованию в больницах рассмотрели и одобрили все процедуры на животных, включая обоснование выбора штамма, распределение экспериментальных групп и статистическое обоснование численности животных и рандомизации.

1. Индукция опухоли

  1. Используйте клеточную линию11 KPC-Luc для индуцирования ортотопических опухолей поджелудочной железы у мышей.
  2. Приготовьте клеточную суспензию путем трипсинизации клеток KPC-Luc, дважды промыв их PBS и ресуспендируя их в концентрации 1 x 106 клеток/мл в PBS с 30% матрицей базальной мембраны (BMM).
  3. Обезболите мышь изофлураном в индукционной дозе 4%, а затем переключитесь на поддерживающую дозу 2%. Обеспечьте тепловую поддержку с помощью грелки и контролируйте по мере необходимости. Нанесите офтальмологическую мазь на оба глаза, чтобы предотвратить сухость.
  4. Продезинфицируйте операционную область несколько раз круговыми движениями с помощью скраба на основе йода и спирта. Перед операцией введите подкожную инъекцию карпрофена в дозе 5 мг/кг в качестве анальгезии. С помощью стерильного лезвия скальпеля выполните небольшой разрез левой брюшной полости (0,5-1 см) под левым ребром мыши, чтобы обнажить поджелудочную железу.
  5. Используйте щипцы для удержания селезенки мыши и обнажения поджелудочной железы мыши, смешайте клетки и введите их в поджелудочную железу мыши из расчета 50 000 клеток на мышь. Введите 50 мкл клеточной суспензии непосредственно в поджелудочную железу с помощью иглы 29 G.
  6. Верните поджелудочную железу мыши и последовательно зашите брюшину и кожу нитями.
  7. Дайте мыши восстановиться на теплом коврике до полного пробуждения. Вводите 5 мг/кг карпрофена подкожно в качестве обезболивания после операции ежедневно в течение 3 дней.
  8. Проведите визуализацию в реальном времени через 7 дней после инъекции для мониторинга роста опухоли.
    ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе можно проводить лечение.
    1. Внутрибрюшинно введите мышке калийную соль D-люциферина (150 мкг/мл в PBS, 60 мкл на мышь).
    2. После анестезии изофлураном поместите мышь в систему визуализации in vivo для обнаружения биолюминесценции. После визуализации извлеките мышь из системы и дайте ей восстановиться после анестезии естественным путем.

2. Забор опухолей

  1. Усыпьте мышей-доноров с помощью камеры CO2 . Простерилизуйте все тело с помощью 75% этанола.
  2. Поместите мышь в стерильный капюшон. Используйте стерильные ножницы и щипцы для вскрытия брюшной полости.
  3. Удалите опухоли и поместите их в PBS на лед. Измерьте размер опухоли с помощью штангенциркуля и рассчитайте объем опухоли по формуле (π x длина × ширина × ширина)/6.

3. Опухолевое пищеварение

  1. Приготовьте раствор для разложения, сделав 0,125 мг/мл коллагеназы, 0,125 мг/мл Dispase II и 10 мкг/мл ДНКазы I в RPMI 1640 в концентрации 1x. Добавьте 1-2 мл раствора для варки на лунку в 12-луночный планшет.
  2. Измельчите опухоли на мелкие кусочки с помощью стерильных ножниц. Расщепляйте кусочки опухоли при температуре 37°C с встряхиванием при 70 об/мин в течение 30 минут.

4. Сбор клеток

  1. Прекратите пищеварение, добавив 2-4 мл 10% фетальной бычьей сыворотки. Переложите все клетки в пробирку для сбора.
  2. Дважды промойте лунки PBS, чтобы собрать оставшиеся клетки. Отфильтруйте клеточную суспензию через сетчатый фильтр 40 μм или 70 μм.
  3. Соберите клетки центрифугированием при 400 x g в течение 5 мин при 4 °C. Ресуспендируйте клетки в 5% BSA для окрашивания проточной цитометрией.

5. Подготовка к проточной цитометрии

  1. Подготовьте мононуклеарные клетки селезенки или периферической крови (PBMC) от мышей без опухоли в качестве контроля.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Необязательно: PBMC от мышей с опухолями также могут быть использованы в качестве контроля.
  2. Окрашивание клеток блокаторами Fc (<1 мкг на миллион клеток) и проточными антителами (CD3-APC, CD45-APC/Fire750 в разведении 1:100).
  3. Выдерживать на льду в темноте в течение 30 минут. Дважды промойте холодной PBS и повторно суспендируйте клетки в 1% BSA в PBS.

6. Сортировка клеток

  1. Отсортируйте клетки CD45+CD3+ с помощью проточного цитометра. Вентильные живые клетки на основе FSC-A и SSC-A (P1). Затем гейтируют одиночные ячейки из P1 на основе FSC-A и FSC-H (P2).
  2. Наконец, отсортируйте CD45+CD3+ из P2 с помощью CD45 и CD3-гейтинга и соберите их в сборные пробирки. Обеспечить надлежащую ресуспендию и поддержание жизнеспособности клеток во время сортировки.

7. Подготовка клеток к переносу

  1. Центрифуга отсортировала ячейки при 400 x g в течение 5 мин при 4 °C. Ресуспендирование клеток в сыворотке крови мышей в конечной концентрации 1 x 106 клеток/мл. Держите клетки на льду.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Может быть выполнено культивирование ex vivo или активация отсортированных клеток.

8. Усыновляющий трансфер

  1. Выполните индукцию опухоли мыши-реципиенту за 7 дней до дня переноса.
  2. Введите 2 x 105 клеток на мышь внутрибрюшинно мышам-реципиентам с помощью инсулинового шприца 29 г x 1/2". Вводите IL-2 (50 МЕ на мышь) внутрибрюшинно в течение трех дней подряд.

9. Мониторинг опухолей

  1. Выполняйте визуализацию в реальном времени на 4-й и 7-й день после переноса для оценки роста опухоли, с дополнительной визуализацией в реальном времени еженедельно с той же процедурой, описанной в шаге 1.8.
  2. Следите за выживаемостью мышей-реципиентов. В конце эксперимента усыпьте мышь, как описано выше. Используйте офтальмологические ножницы и щипцы для удаления опухолей, а затем поместите их в PBS на лед для быстрого измерения размера опухоли и, возможно, продолжите последующие эксперименты по мере необходимости.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мыши-реципиенты разделены на семь групп для тщательной оценки эффективности переноса TIL: (a) Физиологический контроль (холостой контроль): мыши получают инъекции физиологического раствора в качестве исходного уровня. (b) Только IL-2 (холостой контроль): Мыши получают инъекции IL-2 для объяснения любых эффектов только цитокина. (c) Такое же однократное лечение, как и у обработанных донорских мышей (положительный контроль): мыши получают такое же лечение, как и донорские мыши, для сравнени...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Потенциальная иммунотерапия рака поджелудочной железы может усилить иммунную систему для нацеливания и уничтожения опухолевых клеток, включая адоптивную иммунотерапию, ингибиторы иммунных контрольных точек и противоопухолевыевакцины. Терапия TIL извлекает и расширяет лимфоциты из опухолей, которые затем повторно вводятся пациентам. По сравнению с другими адоптивными клеточными терапиями, терапия TIL обладает разнообразной клональностью TCR, превосходной способност...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявили, что у них нет конфликта интересов. Используя ChatGPT и Claude-3 для редактирования языка, авторы тщательно проверили и проверили слова и предложения, сгенерированные ChatGPT или Claude-3, прежде чем включить их в статью.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Это исследование было профинансировано грантами Национального фонда естественных наук Китая (NSFC), грантом No 82272767 и 82072691 Y.M. Авторы благодарят членов своей команды за обсуждение и сотрудничество.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Биолюминесцентная система визуализацииPerkinElmerIVIS SpectrumДля мониторинга роста
опухолей Сыворотка крупного рогатого скота Альбумин VSolarbioA8020Для ресуспензии клеток
Клеточный фильтр (40 μ м или 70 μ m)JetCSS013040Для фильтрации клеточных суспензий
ЦентрифугаEppendorf5810RДля сбора и подготовки клеток
CO2-камераTianjin LiliangN/AДля усыпления мышей
КоллагеназаSigma-AldrichC5138Для разложения раствора
антитела CD3-APCBiolegend100236Для проточной цитометрии окрашивание
антитела CD45-APC/Fire750Biolegend100154Для окрашивания проточной цитометрией
мышей-альбиносов C57BL/6Jackson Laboratory58Мыши-доноры и реципиенты
Dispase IIGibco17105-041Для пищеварения раствор
DNase ISparkJadeAC1711Для пищеварения раствор
D-люциферин калийная сольBeyotimeST198-10gДля визуализации в реальном времени
Этанол (75%)N/AДля стерилизации
Блокаторы FcBD Biosciences553142Для окрашивания проточной цитометрией
Сыворотка плода крупного рогатого скотаGibcoA5669701Для клеточных культур
Проточный цитометрBD BiosciencesFACSAria IIIДля сортировки клеток
IL-2 (Интерлейкин-2)PeproTech200-02Для введения после переноса
ИзофлуранШаньдун АнтеН/ДДля наркотизма
Клеточная линия KPC-LucPI лабораторно сгенерированаН/ДДля индуцирования ортотопических опухолей поджелудочной железы
Matrigel MatrixCorning356234Для ортотопической имплантации
PBS (фосфатно-солевой буфер)ServicebioG4207-500MLДля промывки и ресуспензии клеток
RPMI 1640 mediumGibco11875093Для приготовления раствора для разложения
Стерильный капюшонESCON/AДля стерильной экстракции и обработки опухолей
Стерильные ножницы и щипцыN/AДля экстракции опухоли
Шовный материал (4-0, PGA рассасывающийся шов)Jinhuan MedicalR413Для закрытия раны
ШприцJiangxi Fenglin1 мл 0,45 × 16RWLBДля инъекций
Планшет для культуры тканей 12 лунокJetTCP001012Для пищеварения опухолей

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ma, Y., et al. Combination of PD-1 inhibitor and OX40 agonist induces tumor rejection and immune memory in mouse models of pancreatic cancer. Gastroenterology. 159 (1), 306-319.e12 (2020).
  2. Pitt, J. M., et al. Targeting the tumor microenvironment: Removing obstruction to anticancer immune responses and immunotherapy. Ann Oncol. 27 (8), 1482-1492 (2016).
  3. Zhang, Y., Zhang, Z. The history and advances in cancer immunotherapy: Understanding the characteristics of tumor-infiltrating immune cells and their therapeutic implications. Cell Mol Immunol. 17 (8), 807-821 (2020).
  4. Tay, C., Tanaka, A., Sakaguchi, S. Tumor-infiltrating regulatory t cells as targets of cancer immunotherapy. Cancer Cell. 41 (3), 450-465 (2023).
  5. Betof Warner, A., et al. Expert consensus guidelines on management and best practices for tumor-infiltrating lymphocyte cell therapy. J Immunother Cancer. 2 (2), e008735(2024).
  6. Rosenberg, S. A., Spiess, P., Lafreniere, R. A new approach to the adoptive immunotherapy of cancer with tumor-infiltrating lymphocytes. Science. 233 (4770), 1318-1321 (1986).
  7. Leidner, R., et al. Neoantigen t-cell receptor gene therapy in pancreatic cancer. N Engl J Med. 386 (22), 2112-2119 (2022).
  8. Lowery, F. J., et al. Molecular signatures of antitumor neoantigen-reactive t cells from metastatic human cancers. Science (New York, N.Y.). 375 (6583), 877-884 (2022).
  9. Rosenberg, S. A., Parkhurst, M. R., Robbins, P. F. Adoptive cell transfer immunotherapy for patients with solid epithelial cancers. Cancer Cell. 41 (4), 646-648 (2023).
  10. Yossef, R., et al. Phenotypic signatures of circulating neoantigen-reactive cd8+ t cells in patients with metastatic cancers. Cancer Cell. 41 (12), 2154-2165.e5 (2023).
  11. Ma, Y., Hwang, R. F., Logsdon, C. D., Ullrich, S. E. Dynamic mast cell-stromal cell interactions promote growth of pancreatic cancer. Cancer Res. 73 (13), 3927-3937 (2013).
  12. Mahadevan, K. K., et al. Type I conventional dendritic cells facilitate immunotherapy in pancreatic cancer. Science. 384 (6703), eadh4567(2024).
  13. Mullard, A. FDA approves first tumour-infiltrating lymphocyte (til) therapy, bolstering hopes for cell therapies in solid cancers. Nat Rev Drug Discov. 23 (4), 238(2024).
  14. Morotti, M., et al. PGE2 inhibits til expansion by disrupting IL-2 signalling and mitochondrial function. Nature. 629 (8011), 426-434 (2024).
  15. Chupp, D. P., et al. A humanized mouse that mounts mature class-switched, hypermutated and neutralizing antibody responses. Nat Immunol. 25 (8), 1489-1506 (2024).
  16. Stress response in tumor-infiltrating T cells is linked to immunotherapy resistance. Nat Med. 29 (6), 1336-1337 (2023).
  17. Wang, A. Z., et al. Glioblastoma-infiltrating CD8+ T cells are predominantly a clonally expanded GZMK+ effector population. Cancer Discov. 14 (6), 1106-1131 (2024).
  18. Chen, Y., et al. A transformable supramolecular bispecific cell engager for augmenting natural killer and t cell-based cancer immunotherapy. Adv Mater. 36 (3), e2306736(2024).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Adoptive Cell TherapyPancreatic Cancer ModelTIL IsolationTumor Reactive T CellsBioluminescent ImagingCell SortingInterleukin 2 AdministrationOrthotopic Tumor

Похожие статьи