Методическая статья

Респирометрия высокого разрешения в камере малого объема

DOI:

10.3791/67442

⸱

25 июля 2025 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Oroboros Instruments, 2Department of Pediatrics and Inherited Metabolic Disorders, First Faculty of Medicine, Charles University and General Hospital in Prague, 3Institute of Pathophysiology, Medical University of Innsbruck, 4Mitochondrial Medicine, Department of Clinical Sciences, Lund University, 5Abliva AB

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы показываем, что камера объемом 0,5 мл для респирометрии с высоким разрешением показывает результаты, которые согласуются с камерой объемом 2,0 мл, если применяется соответствующая инструментальная коррекция фонаО2. Для этого требуется меньше образца, что выгодно для исследований с ограниченной доступностью или низкой дыхательной способностью.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Исследование дыхательных потоков имеет решающее значение для понимания сложного взаимодействия между метаболическими процессами. Исследования клеток и тканей с ограниченной доступностью образцов и низкой частотой дыхания могут выиграть от небольших экспериментальных объемов. Мы изучили, дает ли камера объемом 0,5 мл результаты, соответствующие камере объемом 2,0 мл при идентичных концентрациях образцов, используемых при респирометрии высокого разрешения с Oroboros. Фоновый потокO2 был в 4 раза выше в камерах 0,5 мл, чем 2,0 мл при насыщении воздухом, но был воспроизводимым, что позволяло проводить точную коррекцию фона. Оптимальная скорость перемешивания составляла от 550 оборотов в минуту (об/мин) до 750 об/мин в камере объемом 0,5 мл. Дыхательные потоки в живых клетках, проникнутых клетках и изолированных митохондриях измеряли параллельно в камерах объемом 0,5 мл и 2,0 мл с использованием протоколов титрования «субстрат-развязка-ингибитор» с 14–20 титрованиями. ПотокиО2 в различных типах камер были идентичны в пределах детектирования. Камера объемом 0,5 мл, требующая почти в четыре раза меньше образца, чем камера объемом 2,0 мл, дает значительное преимущество при исследованиях с ограниченным количеством образца или низкой дыхательной способностью.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Исследование митохондриальных дыхательных путей является ключом к тому, чтобы пролить свет на метаболические механизмы, лежащие в основе различных заболеваний, старения или реакции на стресс, тем самым обеспечивая потенциальные мишени для терапевтических вмешательств и улучшая диагностические возможности 1,2,3. Респирометрия высокого разрешения (HRR) позволяет провести подробный анализ митохондриального пути и контроля связи при окислительном фосфорилировании (OXPHOS) на различных типах образцов и препаратов4. Объем экспериментальной камеры является основополагающей конструктивной особенностью респирометрических приборов. Ранее установленный объем камеры составляет 2,0 мл в Oroboros. Этот объем был оптимизирован для обеспечения низкого инструментального фонового потокаO2 и обеспечения однородности перемешиваемой среды. Они являются одними из ключевых критериев качества для точного измерения дыхания в условиях низкого содержания кислорода и гипероксии, необходимых для кинетики митохондриального кислорода и проникающих мышечных волокон, соответственно 5,6,7,8,9. Кроме того, для нескольких мультисенсорных вставок10 требуется пространство камеры объемом 2,0 мл (таблица 1).

В настоящем исследовании мы рассмотрели целесообразность уменьшения объема камеры для HRR с 2,0 мл до 0,5 мл. Можно ли применять более низкое количество клеток или количество ткани в респирометрических анализах в меньшей камере без ущерба для точности? Прояснение этого вопроса важно для исследования тканей человека и жидких биопсий, первичных клеток и медленно растущих клеточных культур1. Аналогичным образом, уменьшение объема камеры потенциально выгодно при изучении образцов с низкой дыхательной активностью в дефектных митохондриях11 и митохондриальных путях с изначально низкой емкостью, такими как окисление жирных кислот в мозге12. Тем не менее, разрешение может быть снижено при малом размере камеры из-за непропорционально возрастающих артефактов обратной диффузииO2 и неточной калибровки объема13,14. Поэтому мы проанализировали инструментальные характеристики Oroboros с камерой малого объема (sV), откалиброванной при минимальном экспериментальном объеме 0,5 мл, по сравнению с камерой классического объема (cV), откалиброванной при 2,0 мл. В частности, был проанализирован инструментальный фон потокаО2 и оптимальная скорость перемешивания.

Протоколы титрования субстрата-развязки-ингибитора (SUIT) используются для оценки частоты и состояния дыхания в анализе OXPHOS. Протоколы SUIT включали от 14 до 20 титрований на респирометрический анализ и включали в себя дыхательные потокиO2 в диапазоне от нескольких пмоль-1∙мл-1 до сотен пмоль-1∙мл-1. Состояния сцепления-контроля включают скорость утечки L, т.е. диссипативный компонент дыхания, который недоступен фосфорилированию аденозин-5'-дифосфата (АДФ) в аденозин-5'-трифосфат (АТФ) и является результатом утечки протонов, проскальзывания протонов, цикличности катионов и утечки электронов. Емкость OXPHOS P отвечает за дыхание митохондрий, когда перенос электронов, измеряемый как потреблениеO2 (окисление), связан с синтезом АТФ (фосфорилированием) в присутствии АДФ. Способность к переносу электронов E в развязанном состоянии количественно определяется титрованием протонофора в присутствии митохондриальных субстратов15. Расход остаточного кислорода rox определяют после добавления ингибиторов комплекса I и III ротенона и антимицина А.

Измеряли дыхание клеток и митохондриальные препараты в камерах sV и cV. Тромбоциты представляют собой ядерные цитоплазматические фрагменты мегакариоцитов и представляют собой легкодоступный источник митохондрий человека. Поэтому тромбоциты были применены в качестве модели для живых клеток (или клеточных частиц) с интактными плазматическими мембранами. Дыхание клеток крови служит биомаркером системных митохондриальных заболеваний и коррелирует с биоэнергетической приспособленностью метаболически активных органов 16,17,18,19, хотя эти данные не могут быть обобщены 20,21,22. Фибробласты человека были выбраны для их применения в качестве клеточной модели митохондриальной дисфункции 1,23,24,25. Интактность плазматических мембран необходима для жизнеспособности клетки, но ее селективная пермеабилизация позволяет осуществлять обмен молекулами между цитозолем и окружающей средой. Следовательно, фибробласты с химически проникнутыми плазматическими мембранами были изучены в качестве примера пермеабилизированных клеток по сравнению с изолированными митохондриями, используемыми для оценки митохондриальной функции и необходимыми для разделения митохондриальных субпопуляций26,27.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Для исследования тромбоцитов человека восемь добровольцев предоставили письменное информированное согласие на участие в исследовании, которое было одобрено Шведским органом по этическому обзору (No 2013/181). Две клеточные линии фибробластов кожи человека от новорожденных мужского пола были приобретены у ATCC и использованы в соответствии с этическим одобрением Министерства здравоохранения Чешской Республики (проект: AZV MZ CR NU22-07-00474). Процедуры с участием мышей проводились в соответствии с Австрийским законом об экспериментах на животных и в соответствии с Европейской конвенцией о защите позвоночных животных, используемых в экспериментальных и других научных целях (Tierversuchsgesetz 2012; Директива 2010/63/ЕС; BMWFM-66.011/0128-WF/V/3b/2016). Принцип 3R был применен для минимизации количества подопытных животных.

1. Объемная калибровка

  1. Установите камеры малого объема (sV) или камеры классического объема (cV) на ороборос (рис. 1A, B; Таблица 1).
  2. Включите Oroboros и подключитесь к DatLab.
  3. Просушите камеры.
  4. Пипетка вводит 0,54 мл H2O в sV (0,50 мл эффективного экспериментального объема плюс 0,04 мл капиллярного мертвого объема) или 2,07 мл H2O в cV (2,00 мл эффективного объема плюс 0,07 мл капиллярного мертвого объема).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы избежать потери жидкости между верхней частью стеклянного цилиндра и держателем камеры из полиоксиметилена (POM), вставьте наконечник пипетки достаточно глубоко, чтобы он касался стенки стеклянной камеры.
  5. Включите мешалки.
  6. Перед закрытием камеры увлажните уплотнительные кольца стопоров, сохраняя их капилляры сухими. Ослабьте кольца для калибровки объема и вставьте пробки вниз до тех пор, пока жидкость не заполнит капилляр пробки и в емкости на верхнем конце капилляра не появится небольшая капля (Таблица 1).
  7. Затяните кольца для калибровки объема, чтобы зафиксировать их положение таким образом, чтобы откалиброванный объем был получен при последовательных вставлениях стопоров.

2. Общий сеттинг Оробороса

  1. Запустите программу DatLab .
  2. Установите экспериментальную температуру (37 °C) и скорость вращения перемешивания на уровне 550 об/мин (9,2 Гц или оборотов в секунду) в камереs V или 750 об/мин (12,5 Гц) в камере cV. Установите интервал выборки данных в 2 с со сглаживанием в течение 80 с (40 точек данных) в инструментальных фоновых тестах O2 или 40 с (20 точек данных) для респирометрии.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Магнитные мешалки (AlNiCo, покрытые поливинилидендифторидом [PVDF]; Таблица 1) возбуждаются импульсным вращающимся магнитным полем с напряженностью поля 3,5 мТл на уровне мешалки в камере.
  3. Проводят калибровку воздуха28 в MiR05 или в той же инкубационной среде, которая использовалась в последующих экспериментах.
  4. Выполняйте калибровку нулевого содержания кислорода время от времени, но никогда непосредственно перед началом экспериментов.
    1. Приготовьте свежий исходный раствор Na-дитионита путем растворения порошка O2-Zero в 50 мМ фосфатном буфере (pH 8,0) до концентрации 2,5 мМ или 10 мМ для камер sV или cV соответственно.
    2. Титруйте Na-дитионит в избытке для получения исходного сигнала R0 или нулевого тока [μA] при концентрации O2 0 μM14,28.

3. Инструментальный фоновый тест O2

  1. КамераV
    1. После калибровки воздухом закройте камеру. Контролируйте сигнал кислорода в течение примерно 60 минут,пока концентрация О2 не снизится от насыщения воздуха примерно до 150 мкМ. Установите четыре отметки от J°1 до J°4 на графике «Отрицательный наклонО2».
      ПРИМЕЧАНИЕ: Выполняйте этот инструментальный фоновый тест O2 каждый день перед началом эксперимента.
    2. ДОПОЛНИТЕЛЬНО: С помощью шприца Hamilton титруйте Na-дитионит, приготовленный в соответствии с этапом 2.4.1, до достижения концентрацииО2 100 мкМ (рис. 1C).
      ПРИМЕЧАНИЕ: В другом протоколе Na-дитионит титруется в камеру с помощью микронасоса для титрования-впрыска (TIP2k; Дополнительный рисунок 1 и дополнительный рисунок 2) для сравнения со стандартным методом определения инструментального фона потокаО2 28.
  2. Камера cV
    1. После калибровки воздухом закройте камеру, дождитесьстабилизации наклона О2 и установите отметку J°1 на графике «Наклон О2 отрицательный».28. С помощью шприца Гамильтона титруют Na-дитионит, приготовленный в соответствии с пунктом 2.4.1. с шагом 0,7 мкл для согласования кислородного режима камеры sV и снижения концентрацииО2 до 150 мкМ.
    2. Добавьте еще одну стадию титрования Na-дитионита (около 7 μL), чтобы снизить концентрациюO2 до 100 μМ (рис. 1D).
  3. Инструментальный анализ фоновых данныхО2
    1. Рассчитайте инструментальный наклон фона O2 в DatLab28. Выберите Flux/Slope в верхнем меню.
    2. Откройте окно коррекции фона O2. Выберите Active File в качестве источника фона O2 и выберите метки J°, которые будут использоваться для расчета линейной регрессии. Примените коррекцию фона O2.

figure-protocol-1
Рисунок 1: Камеры малого объема (sV) и классического объема (cV) и инструментальный фоновый тест на O2. (A) Chamber sv. (B) Камера cV. (C) Репрезентативные следы отрицательного уклона и отметок J°1, sV (0,5 мл; зеленый) и cV (2,0 мл; синий). (D) Соответствующая концентрация кислорода и маркировка R1. Три ручных титрования Na-дитионита (ок. 0,7 мкл, 10 мМ сток; cV) и окончательное 7,0 мкл титрования 2,5 мМ и 10 мМ в камерах sV и cV соответственно. Шипы, вызванные титрованием, были устранены. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

4. Добавление образца в камеры Ороборос

Примечание: Образец может быть добавлен в камеру двумя методами: частичное замещение объема (тромбоциты и фибробласты в настоящем исследовании) или полное замещение объема (изолированные митохондрии в настоящем исследовании).

  1. Частичная замена объема
    1. Снимите полностью вставленную пробку. Пипетка и сбросить том Vиз MiR05. Vout составляет 60-70 мкл для тромбоцитов и 80-150 мкл для фибробластов, рассчитанных в соответствии с концентрациями клеток в суспензии исходных клеток.
    2. Эквивалентно Vна выходе, пипеткой нанесите в камеру тот же объем VJ.i суспензии исходных клеток (с известной концентрацией клеток) (рис. 2).
    3. Рассчитайте концентрацию экспериментальной клетки в фактическом объеме V' (0,54 мл и 2,07 мл), большем, чем эффективный экспериментальный объем V (0,5 мл и 2,0 мл).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрации суспензии stock cell и концентрации экспериментальных клеток должны быть спланированы таким образом, чтобы получить объемы VJ.i = Vout, совместимые с небольшой погрешностью титрования. В экспериментах с тромбоцитами был использован прототип пробки для камерыV с капиллярным мертвым объемом 0,05 мл.
  2. Полная замена тома
    1. Откачайте всю среду из камеры и замените ее не менее чем 0,54 мл или 2,07 мл выделенного стокового раствора митохондрий в концентрации экспериментального образца в камерах sV или cV соответственно.
    2. Закройте камеру и откачайте излишки митохондриального исходного раствора из стопорного сосуда.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Полное замещение объема исключает любую изменчивость концентрации митохондрий, которая может быть вызвана титрованием в закрытую камеру через капилляр пробки с помощью шприца Гамильтона. Последний способ применим к образцам малого диаметра, приготовленным в концентрированных исходных суспензиях (например, изолированные митохондрии); однако он подвергает хрупкие клетки потенциальному повреждению плазматических мембран под действием поперечных сил, действующих в игле длиной 51 мм шприца Гамильтона (внутренний диаметр 0,41 мм). Этого можно избежать путем снятия пробки и дозирования образца в камеру путем частичной или полной замены объема. Были изучены три типа митохондриальных препаратов. Образцы препаратов описаны в Дополнительном файле 1 1,26,29,30.
  3. Живые клетки: тромбоциты человека
    1. Поместите криопрепараты, содержащие тромбоциты, в водяную баню при температуре 37 °C и разморозьте содержимое до тех пор, пока не останется немного льда.
    2. Откройте криовиалы и медленно добавьте 1 мл предварительно подогретой среды (DPBS + 10 mM EGTA, 37 °C) в каплях.
    3. Аккуратно перемешайте тромбоциты и переложите их в центрифужную пробирку объемом 50 мл с общим объемом 10 мл предварительно подогретой среды (DPBS + 10 mM EGTA, 37 °C). Центрифуга при 1000 g в течение 10 мин при комнатной температуре (RT) с помощью поворотно-поворотного ротора (ускорение 6, тормоз 2).
    4. Ресуспендируйте тромбоциты в 0,25 мл DPBS + 10 мМ EGTA (RT) и добавьте их в камеры путем частичного замещения объема до исходной концентрации экспериментальной клетки в диапазоне от 157 · 106 до 210 · 106 x·mL-1 в камере 0,5 мл и от 164 · 106 до 220 · 106 x·mL-1 в камере объемом 2,0 мл (подробнее об элементарной единице x см.в пункте 31).
      Примечание: Один Oroboros был оборудован камерами sV и cV в положениях A и B соответственно, используемыми параллельно с другими Oroboros, оснащенными камерами sV и cV в позициях B и A соответственно.
  4. Пермеабилизированные клетки: фибробласты человека
    1. Добавьте клетки в камеры Oroboros путем частичного замещения объема до номинальной концентрации ячеек 0,75 · 106 x·мл-1 в обоих типах камер и рассчитать фактическую концентрацию (шаг 4.1.3).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Различные инструменты Oroboros использовались параллельно, каждый из которых был оснащенлибо V-образными, либоcV-камерами .
  5. Изолированные митохондрии: сердце мыши
    1. Добавьте 15 мкл митохондриальной суспензии к 5985 мкл среды для митохондриального дыхания (MiR05), в результате чего концентрация митохондриального белка будет находиться в диапазоне от 0,013 до 0,026 мг-мл-1.
    2. Добавьте митохондриальную суспензию в камеры Oroboros путем полного восполнения объема.
      Примечание: Один Oroboros был оснащен камерами sV и cV в положениях A и B соответственно, используемыми параллельно с другими Oroboros, оснащенными камерами sV и cV в позициях B и A соответственно.

figure-protocol-2
Рисунок 2: Добавление суспензии клеток путем частичного замещения объема. (А) Присоединение в 0,5-мл камере sV и (В) 2,0-мл камере cV. (1) Закрытая камера с объемами дыхательной среды V и заполненным капилляром пробки Vstc, для измерения инструментального фона O2 потока JO2°. (2) Пробка снята, Vstc сливается в камеру, в результате чего получается общий объем V'= V+Vstc. (3) Частичное удаление среды Vout = -V J.i. Объем V''= V'+Vна выходе остается в камере. (4) Пипетирование подобразца с объемом V J.i респирометрической суспензии биржевых клеток в камеру, в результате чего общий объем V# = V+Vstc разбавленной клеточной суспензии. (5) Закрытая камера с заполненным капилляром пробки (мертвый объем Vstc) для измерения объемного потока O2 JV,O 2 в экспериментальном объеме V. Этот рисунок был изменен по сравнению с рисунком 2A в разделе Количество клеток и нормализация в HRR41. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

5. Протоколы SUIT

  1. Титровать исходные растворы химических веществ, перечисленных в дополнительной таблице 1 , в камеры с помощью микрошприцев Гамильтона, регулируя объемы титрования для получения одинаковых экспериментальных концентраций в камерах sV и cV (см. пояснения к рисункам на рисунках 6, 8, 10).
  2. Выберите протокол SUIT-003_D018 32,33 (для тромбоцитов в настоящем исследовании).
  3. Выберите протоколы SUIT-001_D004 4,15,34,35 и SUIT-002_D007 4,15,35,36 (для фибробластов в настоящем исследовании).
  4. Выберите протокол SUIT-002_D005 4,15,35,37 (для изолированных митохондрий в настоящем исследовании).

6. Анализ данных SUIT

  1. В DatLab установите метки для определения сечений выбранных графиков.
  2. Выберите Flux/Slope в верхнем меню. Откройте окно Flux/Slope (Flux/Slope). Применяйте коррекцию объема титрования для разбавления взвешенных образцов при каждом титровании в протоколе SUIT.
  3. Выберите «Метки » в верхнем меню. Откройте функцию Отметить статистику , чтобы отобразить медиану отмеченных точек данных, скорректированную на исходный уровень путем вычитания остаточного потребления кислорода (rox).
  4. Рассчитать пересечение и наклон между парными результатами, полученными в камерах sV и cV, методом обратного регрессионного анализа25,28 с использованием электронной таблицы.
  5. Сравните частоту дыхания в rox состоянии (минимальные потоки O2) в камерах sV и cV по парному t-критерию Стьюдента с использованием программного обеспечения jamovi 2.3.1338.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку две камеры в приборе Oroboros функционально независимы (за исключением интервалов измерения температуры и записи DatLab), измерения в каждой камере можно рассматривать отдельно, аналогично использованию других приборов. Окончательные результаты могут быть представлены в виде медиан или средних значений нескольких камер с информацией об их вариабельности.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Предполагается, что исходные сигналы R1 [μA] датчиков кислорода (POS) не зависят от объема водной фазы, находящейся в равновесии с газовой фазой воздуха в «открытой» камере, что подтверждено в Дополнительная таблица 2. В закрытой камере, однако, инструментальный фон О2Флюс вблизи насыщения воздухом J°1[pmol∙s-1∙мл-1] зависит от объема V (Дополнительная таблица 2). Буква «О»2Расход датчика [пмоль∙с-1] можно предсказать по потоку электронов, измеренному как скорректированный на ноль исходный сигнал R1-R0 [μA], зарядовое число 4 e-/О2и постоянная Фарадея F = 96 485,33 К∙моль-1. 1 мкА эквивалентен потоку электронов (e-) от 10.36 пмоль∙с-1. Деление на номер заряда дает O2течь15,39 из 2.591 пмоль-1·μА-1. Зарегистрированная медиана R1-R0 составила 2,09 мкА и 1,98 мкА в 0,5-мл и 2,0-мл камерах соответственно (Дополнительная таблица 2; R0 = 0,006 ± 0,007 мкА в sV и R0 = 0,004 ± 0,003 мкА в cV камеры), теоретически соответствующие O2нормы расхода 5,41 пмоль-с-1и 5.13 пмоль∙с-1. Буква «О»2Расход датчика преобразуется в ожидаемый объемный поток при насыщении воздуха (J°R1) как 5,41 пмоль∙с-1/0,5 мл = 10,82 пмоль∙с-1∙мл-1и 5.13 пмоль∙с-1/2,0 мл = 2,56 пмоль∙с-1∙мл-1В 1990-х годахV и сV камера, соответственно. У однотипных полярографических датчиков кислорода в камерах объемом 2,0 мл и 0,5 мл объемный фон O2flux - рассчитывается от текущего R1-R0 (J°R1) - увеличивается теоретически в 4 раза обратно пропорционально объему камеры. J°воздух (при насыщении воздухом, где обратная диффузия равна нулю; сравните Стол 2 и Дополнительная таблица 3) был рассчитан для О2концентрация при насыщении воздухом по результатам линейной регрессии экспериментального фонового испытания (Рисунок 3). J°воздух приблизились к теоретически ожидаемым значениям J°R1 для обеих камер (Стол 2). Тем J°воздух / J°R1Коэффициент составил 0,85 ± 0,04 и 0,92 ± 0,12 в 1990 годуV и сV камере, соответственно, в соответствии с независимой серией из 52 измерений в камере объемом 2,0 мл, в которой это соотношение составляло 0,95 ± 0,12 (Дополнительная таблица 4). J°воздух был в 3,9 раза выше в 0,5-мл, чем в 2,0-мл камере. Сетка O2обратная диффузия J°50, рассчитанный на 50 мкМ О2по результатам линейной регрессии экспериментального фонового теста, был всего в три раза выше в 0,5-мл камере (Стол 2). Вариабельность инструментального фона О2флюсов было почти идентичным в двух разных объемах камер, со стандартным отклонением (SD) 0,5 и 0,3 пмоль∙с-1∙мл-1для J°воздух и 0,9 и 0,8 пмоль-с-1∙мл-1 для J°50В 1990-х годахV и сV камера, соответственно (Стол 2). Несмотря на более высокий инструментальный фон O2наклоны в 0,5-мл камере, зависимость фона O2флюсы на cO2обладал высокой воспроизводимостью в обоих типах камер (Рисунок 3D). Это приводит к низким значениям остатков <±1 pmol∙s-1∙мл-1для обеих камер (Дополнительная таблица 5), в соответствии с пределом обнаружения Ороборос28.

Мы количественно оценили влияние скорости перемешивания на калибровочный исходный сигнал R1 POS-терминала в диапазоне от 350 об/мин (5,8 Гц) до 950 об/мин (15,8 Гц) с шагом 100 об/мин (1,7 Гц) с камерой в «открытой» конфигурации. В этойконфигурации растворенный в среде О2 находится в равновесии с газовой фазой; Таким образом, изменения исходного сигнала (микроампер [μA]) в зависимости от скорости перемешивания не отражают истинных различий в cO2. Датчики кислорода реагировали на изменение скорости перемешивания с небольшим отклонением от R1 при стандартной скорости 750 об/мин, независимо от объема камеры (рис. 4). В «открытой» конфигурации шум наклона O2, определяемый как SD для каждого шага после стабилизации сигнала, был самым низким при 850 об/мин в обоих типах камер и увеличивался, когда скорость перемешивания отклонялась от этого значения в любом направлении (рис. 5A). Ниже 550 об/мин шум наклона О2 превышал пороговое значение ±4 пмоль-1∙мл-1, определяя минимальную практическую скорость перемешивания. Из-за технических ограничений верхняя граница не была достигнута, что дало 950 об/мин в качестве максимальной практической скорости перемешивания (Рисунок 5A). В пределах этого диапазона отклонение сигнала O2 от R1 составило <2,5 %. Закрытие камер не изменило соотношение между шумом и скоростью перемешивания (Рисунок 5B). Экспоненциальная постоянная времени τ составила 2,53 ± 0,05 с при 550 об/мин и 2,50 ± 0,05 с при 750 об/мин для камеры объемом 0,5 мл (дополнительный рисунок 3).

Протокол SUIT-003_D018, применяемый к тромбоцитам, включает до 14 этапов титрования. Он предназначен для изучения контроля связи живых клеток, ce и проницаемости плазматической мембраны в качестве показателя жизнеспособности клетки32. Поток кислорода, измеренный в двух типах камер (Рисунок 6), был тесно согласован во всех респираторных состояниях (Рисунок 7). Прерывистые реоксигенации необходимы, чтобы избежать функциональной гипоксии или ограничить экспериментальную концентрациюO2 до определенного диапазона. Реоксигенацию проводили путем открытия камеры в «открытое» положение после титрования Rot. После закрытия камеры потокО2 стабилизировался в течение 4 минут в камере объемом 2,0 мл, но для стабилизации и установления новой отметки требовалось примерно 10 минут в камере объемом 0,5 мл (рис. 6 и дополнительный рис. 4). Реоксигенация в состоянии rox при низких флюсахO2 позволяет избежать снижения концентрацииO2 в течение времени, необходимого для стабилизации. Ингибированный ротенон рокс составлял 0,9 ± 0,6 и 2,0 ± 0,6 пмоль∙s-1∙мл-1 при 98 ± 17 и 94 ± 17 μM O2 (среднее значение ± SD) в камерах sV и cV соответственно. Rox увеличивался на 3,1 ± 0,9 и 0,9 ± 0,4 пмоль∙с-1∙мл-1 при реоксигенации до 159 ± 8 и 147 ± 11 мкМО2 в камере sV и cV соответственно. Наблюдаемая кислородная зависимость рокса в тромбоцитах согласуется с результатами по фибробластам человека и эндотелиальным клеткам пупочной вены40.

Для анализа OXPHOS в пермеабилизированных фибробластах мы использовали два протокола SUIT с 17 и 20 стадиями титрования (SUIT-001 и SUIT-002, соответственно35; рисунок 8); Таким образом, коррекция объема титрования особенно важна, так как в конце SUIT-002 разведение составляло максимум 14 % и 10,5 % в камере sV и cV соответственно. Количество клеток фибробластов 0,35·106 x и 1,44·106 x в камерах 0,5 мл и 2,0 мл соответственно приводило к одинаковой концентрации клеток 0,75·106 x∙мл-1. Комбинация SUIT-001 и SUIT-002 рассматривала 20 респираторных состояний, все из которых тесно коррелировали в двухкамерных типах (r2 = 0,950 для SUIT-001 и r2 = 0,959 для SUIT-002). В обоих протоколах Комплекс IV имел относительно высокий разброс (Рисунок 9). Повторная оксигенация не требовалась в SUIT-001, начиная с низкого объемно-специфического потокаО2 18,7 ± 7,0 пмоль-с-1∙мл-1 в обычном состоянии (среднее значение ± SD), что позволило снизить концентрациюО2 до 56 мкМ до связанного с CIV раздела протокола (рис. 8A; 8Ama). Однако в SUIT-002 повторную оксигенацию проводили перед титрованием развязки, увеличивая концентрациюO2 со 100 мкМ до 180 мкМ (рис. 8B; 6Gp). Учитывая длительное время, необходимое для стабилизации потока после реоксигенации, следует избегать повторной оксигенации во время титрования размыкателя.

К изолированным митохондриям был применен сокращенный протокол SUIT (Рисунок 10). Концентрация митохондриального белка определялась после проведения респирометрического анализа, что делало невозможным заблаговременное определение точной концентрации образца в камере. Объемно-специфический дыхательный поток варьируется в зависимости от концентрации митохондрий. Таким образом, данные были представлены в виде объемно-специфического и массового потока белка (рис. 11). Оба представления демонстрируют тесную корреляцию между измерениями, полученными в камерах объемом 0,5 мл и 2,0 мл (рис. 11).

Остаточное потребление кислорода, измеренное после ингибирования комплекса III антимицином А, может быть использовано в качестве показателя инструментальной эффективности при очень низкой частоте дыхания. Во всех экспериментальных сериях rox был сопоставим между 0,5-мл и 2,0 мл камерами (тромбоциты: t(5) = -0,34, p = 0,74; фибробласты: SUIT-001: t(10) = 20,00, p = 0,06; SUIT-002: t(10) = 11,00, p = 0,96; изолированные митохондрии: t(4) = -1,18, p = 0,27). Разброс данных в значительной степени соответствовал инструментальной неопределенности ±1 пмоль∙с-1∙мл-13,28, как показано на рисунке 12. Исходные файлы доступны для открытого доступа в репозитории Zenodo: 10.5281/zenodo.11634408. 

figure-results-1
Рисунок 3: Инструментальный фон потока O2 для sV (0,5 мл; зеленый и черный) и cV камеры (2,0 мл; синий). Диапазон концентраций O2 от насыщения воздухом (около 180 мкМ) до ок. 50 мкМ. Открытые символы: концентрации O2 получены без Na-дитионита. Твердые символы: концентрации O2, контролируемые ручным титрованием Na-дитионита. Черные круги: концентрации O2 контролируются титрованием Na-дитионита с использованием TIP2k в камере объемом 0,5 мл (N = 8). Результаты инструментальных фоновых тестов были объединены из (A) серии 1 (sV: N = 2; cV: N = 2) перед использованием живых клеток (ce); (B) Серия 2 (sV: N = 38; cV: N = 50) перед использованием пермеабилизированных клеток (pce); (C) Серия 3 (sV: N = 10; cV: N = 10) перед использованием изолированных митохондрий (IMT). (D) Наложенные данные с панелей A-C. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-2
Рисунок 4: Влияние скорости вращения мешалки на сигнал POS при насыщении воздухом ('открытая' камера) в камере 0,5 мл (зеленая) и камере 2,0 мл (синяя). Отклик [%] относительно R0-скорректированного калибровочного воздуха сигнализирует R1-R0 [μA] при 750 об/мин (sV: N = 4; cV: N = 4). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-3
Иллюстрация 5: Шум наклона О2 в зависимости от скорости вращения перемешивания. Шум, выраженный в виде стандартного отклонения в (А) «открытой» камере; (В) закрытая камера (0,5 мл, зеленая; 2,0 мл, синяя). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-4
Рисунок 6: ПотреблениеО2 криоконсервированных тромбоцитов человека в камере объемом 0,5 мл. Репрезентативные следы концентрации O2 [μM] (синие линии) и потока O2 на клетку [amol∙s-1∙x-1], рассчитанные как поток O2 [pmol∙s-1∙mL-1], деленный на концентрацию клеток 157∙106 x∙mL-1 (красные линии, скорректированные на инструментальный фон потокаO2; скачки, вызванные титрованиями, были устранены). КонцентрациюО2 поддерживали на уровне выше 50 мкМ за счет прерывистой реоксигенации (воздух, «открытая» камера, синий оттенок). Последовательность респираторных состояний (титрации и частоты; протокол SUIT-003_D018): ce1, рутинное дыхание R живых клеток. ce1P, пируват 5 мМ в качестве наружной подложки. ce2Omy10 (панель A), титрование Omy с шагом 5 нМ; негерметичное дыхание L. ce3U0,3 (панель A) и ce3U0,1 (панель B), титрование развязки до оптимальной концентрации CCCP 0,3 и 0,1 мкМ соответственно; Емкость ЭТ Е. ce3Glc, глюкоза 11 мМ; E постепенно ингибируется размыкателем. ce4Rot, ротенон 0,5 мкМ ингибирует ДИ; Расход остаточного кислорода ROX. ce5S, сукцинат 10 мМ; стимуляция Е в плазматических мембранопроницаемых клетках. 1Dig15 (панель А) и 1Dig10 (панель В), титрование дигитонина в 5 мкг·мл-1 до оптимальных концентраций 15 и 10 мкг·мл-1 соответственно для полной пермеабилизации плазматической мембраны; емкость сукцинатного пути ЭТ SE. 1c, цитохром c 10 μM; Тест на целостность митохондриальной наружной мембраны. 2Ама, антимицин А 2,5 мкМ ингибирует CIII; Рокс. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-5
Рисунок 7: Корреляция дыхания криоконсервированных тромбоцитов человека, измеренная в камере объемом 0,5 мл и 2,0 мл. Rox-скорректированный потокO2 оценивали в протоколе SUIT-003_D018 (рис. 6); N = 6. (А) с олигомицином Оми; (Б) без Оми. Средние наклоны figure-results-6 и пересечения figure-results-7 инвертированного метода наименьших квадратов, регрессия и коэффициенты детерминации r2 , рассчитанные по всем данным. Пунктирные черные линии обозначают линии идентичности. Красными линиями обозначены вычисленные линии регрессии. ПотокиО2 в состоянии после добавления глюкозы были исключены (см. рис. 6). Протоколы с олигомицином и без него разделены на панелях А и В , чтобы избежать наложения точек данных. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-8
Рисунок 8: ПотреблениеО2 фибробластов в камере объемом 0,5 мл. Репрезентативные следы потока cO2 (синие линии [μM]) и O2 на ячейку рассчитаны как поток O2 [pmol∙s-1∙mL-1], деленный на концентрацию клеток (0,75·106 x∙mL-1), скорректированные на инструментальный фон потока O2 (красные линии, спайки, вызванные титрованиями, были исключены). КонцентрациюО2 поддерживали на уровне выше 50 мкМ за счет прерывистой реоксигенации (воздух, «открытая» камера, синий оттенок). Последовательность респираторных состояний (титрования и частоты). (А) Протокол SUIT-001_D004: ce1, рутинное дыхание R. +Dig, дигитонин 10 мкг·мл-1 (от ce до pce), остаточное эндогенное дыхание ren. 1PM, пируват 5 мМ и малат 2 мМ; N-пути утечки дыхания NL. 2D, ADP 2,5 мМ; N-тракт емкость OXPHOS NP. 2c, цитохром c 10 μM; Тест на целостность митохондриальной наружной мембраны. 3U1.5, титрование развязки до оптимальной концентрации CCCP 1,5 мкМ; Емкость ET, связанной с NADH, NE. 4G, глутамат 10 мМ; N(PGM)E. 5S, сукцинат 10 мМ; Емкость NS-пути ET NSE. 6Рот, ротенон 0,5 мкМ; емкость сукцинатного пути ЭТ SE. 7Gp, глицерофосфат 10 мМ; SGpE. 8Ama, антимицин А 2,5 мкМ; Рокс. 9AsTm, аскорбат 2 мМ и TMPD 0,5 мМ; субстраты для стимуляции CIV; камеру держали открытой в течение 20 мин для обеспечения окислительно-восстановительного равновесия без истощения кислорода4; О2 флюс зашкаливает после закрытия камеры (205 амоль·с-1·х-1). 10Азд, азид 100 мМ; Кислородзависимый поток химического фона CHB. (B) Протокол SUIT-002_D007: ce1, R. +Копай, рен. +D, стимулирующий рен. +M.1, малат 0,1 мМ и 1Oct, октаноилкарнитин 0,5 мМ; Емкость F-пути OXPHOS FP = J(1Oct)-J(+M.1). 1c. 2M2, малат 2 mM, поддерживающий анаплеротический N-путь; Ф(Н). 3P и 4G, прогрессивная активация до FNP. 5S, FNSP. 6Gp, FNSGpP. 7У1.5, ФНСГпЭ. 8Рот, С.Г.. 9Ama, rox. 10AsTm O2 зашкаливающий поток 207 амоль·с-1·х-1. 11Азд, чб. В общем случае, активность комплекса IV представляет собой разность скоростей J(AsTm)-J(Azd) при близко согласованных концентрацияхO2. Более подробная информация приведена на рисунке 6. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-9
Рисунок 9: Корреляция дыхания пермеабилизированных фибробластов в камере объемом 0,5 мл и 2,0 мл. Rox-скорректированный поток O2 в (A) SUIT-001_D004 и (B) SUIT-002_D007 (N = 6). Средний наклон figure-results-10 и пересечение figure-results-11 инвертированных наименьших квадратов регрессии и коэффициент детерминации r2 рассчитаны по всем данным. Пунктирная черная линия обозначает линию идентичности. Красными линиями обозначены вычисленные линии регрессии. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-12
Рисунок 10: ПотреблениеО2 изолированными митохондриями сердца мыши в 0,5-мл (зеленый) и 2,0-мл (синий) камерах. Репрезентативные следы (А) масс-специфичного потокаО2 при концентрации митохондриального белка 0,023 мг∙мл-1 (с поправкой на инструментальный фон потокаО2, шипы, вызванные титрованиями, были устранены) и (В) концентрацииО2 [мкМ]. Последовательность респираторных состояний (титрования и частоты) по протоколу SUIT-002_D005: imt, резидуальное эндогенное дыхание ren. +D, ADP 2,5 мМ; Стимуляция рен. +M.1, малат 0,1 мМ и 1Oct, октаноилкарнитин 0,5 мМ; Емкость F-пути OXPHOS FP = J(1Oct)-J(+M.1). 1c, цитохром c 10 μM; Тест на целостность митохондриальной наружной мембраны. 2М2, высокий малат 2 мМ, поддерживающий анаплеротический N-путь; Ф(Н). 3P, пируват 5 мМ; Ф. Н.. 4G, глутамат 10 мМ; Ф. Н.. 5S, сукцинат 10 мМ; FNSP. 6Gp, глицерофосфат 10 мМ; FNSGpP. 7U0,5, титрование развязки до оптимальной концентрации CCCP 0,5 мкМ; FNSGpE. 8Rot, ротенон 0,5 мкМ, ингибирующий ДИ; SGpE. 9Ama, антимицин А 2,5 мкМ ингибирует CIII; Расход остаточного кислорода ROX. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-13
Рисунок 11: Корреляция дыхания изолированных сердечных митохондрий мыши, измеренная в камерах объемом 0,5 мл и 2,0 мл. O2 в протоколе, показанном на рисунке 10 (N = 4). (A) Объемный потокO2. (B) Rox-скорректированный потокO2, разделенный на концентрацию митохондриального белка (0,013 - 0,026 мг∙мл-1). Средний наклон figure-results-14 и пересечение figure-results-15 инвертированных наименьших квадратов регрессии и коэффициент детерминации r2 рассчитаны по всем данным. Пунктирные черные линии обозначают линию идентичности. Красными линиями обозначена рассчитанная линия регрессии. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-16
Рисунок 12: Остаточное потребление кислорода в камерах объемом 0,5 мл и 2,0 мл. Поток на объем, измеренный после добавления антимицина А, в результате экспериментов с живыми клетками (ce, квадраты), пермеабилизированными клетками (pce, круги) и изолированными митохондриями (imt, треугольники). Средний наклон figure-results-17 и пересечение figure-results-18 регрессии по инвертированному методу наименьших квадратов. Пунктирная линия: линия идентичности. Красная линия: рассчитанная линия регрессии. Shadow: диапазон разрешения приборов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

МодульsVсV
Экспериментальная камера, том V0,5 мл2,0 мл
Внутренний диаметр стеклянного цилиндра12,0 мм16,0 мм
Внешний диаметр стеклянного цилиндра24,0 мм24,0 мм
Толщина стеклянной стенки6,0 мм4,0 мм
Мешалка с покрытием PVDF11,5 x 6,2 мм15,0 x 6,0 мм
Диаметр капилляра пробки1,00 мм1,30 мм
Площадь поперечного сечения стопорного капилляра0,79 мм21,33 мм2
Длина капилляра стопора50,64 мм48,86 мм
Капиллярный объем пробки39,8 мкл64,9 мкл
Стопор капиллярный мертвый объем Vstc включая небольшую каплюa0,04 мл0,07 мл
Volume V' для объемной калибровки0,54 мл2,07 мл

aКапля должна соответствовать 5 мкл для камеры cV и близкой к 0 мкл для камеры sV.
Таблица 1: Размеры модулей малого объема (сВ) и классического объема (сВ) со стопорами на основе полиэфирэфиркетона (ПЭЭК).

J°air / [пмоль∙с-1∙мл-1]J°50 / [пмоль∙с-1∙мл-1]
Экспериментальная камера, том V0,5 мл2,0 мл0,5 мл2,0 мл
Значить9.222.37-3.17-1.17
Медиана9.252.36-3.08-1.04
Стандартное отклонение0.490.340.930.83
Минимум8.201.79-5.11-3.72
Максимум10.413.42-0.820.67

Таблица 2: J°air экстраполирован на насыщенность воздухом и J°50 рассчитан при концентрации 50 μMO2 . Обобщенные данные инструментальных фоновых тестов в сериях 2 (pce) и 3 (imt) и перед титрованием TIP2k (0,5 мл: N = 48; TIP2k: N = 8; 2,0 мл: N = 60).

Дополнительный файл 1: Подготовка образцов. Тромбоциты человека, фибробласты и митохондрии выделены из сердца мышей. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный рисунок 1: Инструментальный фоновый тест O2 с использованием TIP2k. Репрезентативные следы теста, проведенного с использованием TIP2k для титрования Na-дитионита (2,5 мМ) в камере объемом 0,5 мл. Среда: MiR05, температура: 37 °C, скорость перемешивания: 750 об/мин. Шипы, вызванные титрованием, были устранены. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный рисунок 2: Инструментальный фон потока O2 J°1 в зависимости от концентрации O2 . Камера sV (0,5 мл; зеленая, N = 48) и камера cV (2,0 мл; синяя, N = 60) в сериях 2 (pce, круги) и 3 (imt, треугольники), а также перед титрованием TIP2k в камере 0,5 мл (черные круги, N = 8). Красные линии: медиана ± SD. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительный рисунок 3: Экспоненциальная постоянная времени τ в зависимости от скорости вращения перемешивания. Индивидуальные значения τ для камеры объемом 0,5 мл при 37 °C (N = 2). В камере объемом 0,5 мл τ составлял 2,53 ± 0,05 с при 550 об/мин, 2,50 ± 0,05 с при 750 об/мин и 2,47 ± 0,04 с при 850 об/мин. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный рисунок 4: Потребление О2 криоконсервированных тромбоцитов человека в камере объемом 2,0 мл. Репрезентативный след протокола SUIT-003_D018, включая титрование олигомицина (Omy). Поток [pmol∙s-1∙mL-1] корректировали на инструментальный фоновый потокO2 и делили на концентрацию клеток (164∙106 x∙mL-1). Шипы, вызванные титрованием, были устранены. cO2 поддерживался на уровне выше 60 мкМ с помощью прерывистых реоксигениций (воздух, «открытая» камера, синий оттенок). Последовательность дыхательных состояний (титрования и скорости): ce1, рутинное дыхание R живых клеток. ce1P, пируват в качестве внешнего субстрата. ce2Omy10, титрования Omy с шагом 5 нМ; негерметичное дыхание L. ce3U2.0, развязывание титров до оптимальных концентраций 2 мкМ; Емкость ЭТ Е. ce3Glc, глюкоза 11 мМ; E постепенно ингибируется размыкателем. ce4Rot, ротенон 0,5 мкМ, ингибирующий ДИ; Расход остаточного кислорода ROX. ce5S, сукцинат 10 мМ; стимуляция Е в плазматических мембранопроницаемых клетках. 1Dig20, титрование дигитонина до оптимальных концентраций 20 мкг·мл-1, для полной пермеабилизации плазматической мембраны; емкость сукцинатного пути ЭТ SE. 1c, цитохром c 10 μM; Тест на целостность митохондриальной наружной мембраны. 2Ама, антимицин А 2,5 мкМ, ингибирующий CIII; Рокс. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительная таблица 1: Химические вещества, используемые в протоколах субстрат-ингибитор-развязка-титрование (SUIT). Аббревиатуры и концентрации исходного раствора для камер sV и cV . Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительная таблица 2: Сравнение R1-R0 и J°1 в камерах объемом 0,5 мл и 2,0 мл. Обобщенные данные инструментальных фоновых тестов в сериях 2 (pce) и 3 (imt) и перед титрованием TIP2k (0,5 мл: N = 48; TIP2k: N = 8; 2,0 мл: N = 60). Данные были усреднены только по результатам экспериментов серий 2 (pce) и 3 (imt), которые проводились при среднем барометрическом давлении 94,9 кПа (Инсбрук, Австрия), за исключением данных из серии 1 (ce), полученных на уровне моря. В камерах объемом 0,5 мл и 2,0 мл использовались один и тот же тип, но разные индивидуальные POS. Таким образом, при сравнении камер sV и cV необходимо учитывать вариабельность между датчиками. В то время как J°1 = 2,26 ± 0,41 пмоль∙с-1∙мл-1 , полученные экспериментально для камеры объемом 2,0 мл, близко соответствовали расчетному значению, экспериментальное J°1 = 8,48 ± 0,53 пмоль∙с-1∙мл-1 для камеры объемом 0,5 мл оказалось ниже ожидаемого. Это объяснялось следующими наблюдениями. После закрытия камеры более высокий фоновый потокО2 в камере объемом 0,5 мл снижает концентрациюО2 на отметках для J°1 , установленных через сопоставимые промежутки времени (рис. 1). Концентрация кислорода в J°1 была в среднем на 4,06 % и 1,72 % ниже насыщения воздухом в камере объемом 0,5 мл и 2,0 мл соответственно (дополнительный рисунок 2, дополнительный рисунок 2). При более низком cO2 уменьшение потребления O2 датчиком и некоторая обратная диффузия O2 уменьшают экспериментально определенный J°1. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительная таблица 3: Концентрация кислорода [μM], при которой были получены калибровки (R1) и J°1 , и их % разницы. Обобщенные данные инструментальных фоновых тестов в сериях 2 (pce) и 3 (imt) и перед титрованием TIP2k (0,5 мл: N = 48; TIP2k: N = 8; 2,0 мл: N = 60). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительная таблица 4: Измеренный и ожидаемый J°1 в камере объемом 2,0 мл. Независимая серия инструментальных фоновых испытаний с O2k серии A (с титановыми пробками13), V = 2,0 мл (37 °C, раствор NaCl с коэффициентом растворимостиO2 0,92; N = 52). nO2/Qe = 106/(96485,33·4) = 2,591 пмоль∙μC-1 = 2,591 пмоль∙s-1∙μA-1. Основано на предположении, что обратная диффузия O2 пренебрежимо мала при cO2,1, что верно только при cO2,1 ~ cO2*. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительная таблица 5: Остатки линейной регрессии (абсолютные значения [пмоль O2∙с-1∙мл-1]), рассчитанные для каждого инструментального фонового теста O2. Обобщенные данные инструментальных фоновых испытаний в сериях 2 (pce) и 3 (imt) и перед титрованием TIP2k. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Количество образцов, доступных для респирометрии, часто ограничено, например, при исследованиях биопсии, первичных клеток или медленно растущих клеточных культур с низким количествомклеток. Кроме того, дыхательная активность угнетается из-за митохондриальных повреждений11 или при исследовании митохондриальных путей с низкой емкостью, таких как окисление жирных кислот12. В этих случаях малый объем респирометрической камеры дает преимущества для разрешения потокаО2. Тем не менее, инструментальные фоновые потокиO2 увеличиваются при меньших объемах камеры и вызывают ошибки, если их ненадежно измерять и не корректировать должным образом в зависимости от концентрацииO2. Воспроизводимость инструментальных фоновых тестовO2 и коррекции фона особенно важна для камер малого объема. Почти идентичные значения теоретического (J°R1) и экспериментального (J°воздух) потокаО2 свидетельствуют о точности полярографических измерений с 4 e-/O2 при катодной реакции ПОС. Разница между J°R1 и J°air составила 1,64 ± 0,43 и 0,22 ± 0,31 пмоль-1∙мл-1 в камере sV и cV соответственно, что указывает на точность измерений, которая находится в пределах предела обнаружения камеры 2,0 мл (±1 пмоль-с-1∙мл-1)28. При использовании полярографических датчиков кислорода одного и того же типа в камере объемом 2,0 мл и 0,5 мл фоновый потокO2 увеличился в 4 раза обратно пропорционально объему камеры, а вариабельность была почти одинаковой в двух объемах камеры, при этом SD составлял 0,5 и 0,3 пмоль-1∙мл-1 для J°air и 0,9 и 0,8 пмоль-1∙мл-1 для J°50 в диапазоне sV и cV камеру соответственно (табл. 2). При минимальной дыхательной активности, для которой была разработана камера малого объема, даже небольшие фоновые эффекты становятся значительными (Дополнительная таблица 3; Дополнительный рисунок 2). Таким образом, для применения надлежащей коррекции28 требуется регулярная оценка инструментального фонового потокаO2 (рис. 1).

Высокое и постоянное перемешивание среды требуется для поддержания однородной системы и обеспечения стабильного сигнала кислорода. Скорость перемешивания 750 об/мин установлена для камеры объемом 2,0 мл, но оптимальная скорость в камере объемом 0,5 мл неизвестна. Различная геометрия стеклянной камеры и мешалки (Таблица 2) требует независимой оценки оптимальной скорости перемешивания. Датчики кислорода реагировали на изменения скорости перемешивания в диапазоне от 550 об/мин до 950 об/мин с небольшим отклонением от сигнала O2 R1 при 750 об/мин, независимо от объема камеры. Экспоненциальная временная константа τ, рассчитанная для камерыs V , согласуется с τ , зарегистрированной для камеры объемом 2,0 мл при той же скорости перемешивания13. Эти результаты свидетельствуют о том, что перемешивание одинаково эффективно в камерах обеих геометрий и что стандартная скорость перемешивания 750 об/мин (камера объемом 2,0 мл) может быть применена к камере объемом 0,5 мл. Как в «открытой», так и в «закрытой» конфигурациях камеры объемом 0,5 мл камера имела более высокое отношение сигнал/шум, что свидетельствует о более высокой точности как преимуществе камеры объемом 0,5 мл (рис. 5), хотя нельзя исключать влияние вариабельности отдельных POS-терминалов. Поскольку шум не увеличивается при снижении скорости перемешивания с 750 об/мин до 550 об/мин, снижение скорости перемешивания до 550 об/мин в камере объемом 0,5 мл может быть полезным для минимизации напряжения сдвига без ущерба для соотношения сигнал/шум.

Почти идентичные нормы потребленияO2 были измерены в камерах 0,5 мл и 2,0 мл в трех экспериментальных моделях при применении соответствующей коррекции фона. Результаты, полученные с малыми тромбоцитами диаметром 2 мкм42, живыми и пермеабилизированными фибробластами и изолированными митохондриями, позволяют предположить, что можно ожидать получения стабильной частоты дыхания в камерах 0,5 мл и 2,0 мл в широком диапазоне типов клеток и митохондриальных препаратов. Пермеабилизированные мышечные волокна, однако, не были протестированы в настоящем исследовании. Точное измерение rox требует контроля уровня кислорода40 и высокого инструментального разрешения1. Объемно-специфическийпоток О2 рокса может быть настолько низким, насколько это предел обнаружения. Повторная оксигенация не требуется, когда в эксперименте используется низкое количество клеток или вообще небольшое количество образцов. Однако при необходимости рекомендуется проводить реоксигенацию в респираторных состояниях с низким потокомО2, чтобы избежать быстрого снижения концентрацииО2 в период, необходимый для стабилизации потокаО2. Стабилизация потокаО2 после реоксигенации занимает больше времени в камере объемом 0,5 мл.

В качестве вклада в контроль качества особое внимание должно уделяться разведению пробы в суспензии при частичной замене объема. После снятия полностью вставленной пробки общий объем V' дыхательной среды в камере определяется экспериментальным объемом V и капиллярным объемом пробки Vstc (табл. 2). Таким образом, исходный объем V J.i разбавляется в фактическом объеме V', который больше V, в результате чего коэффициент разбавления V/V' составляет 0,5/0,54 = 0,926 и 2,0/2,07 = 0,966 в камерах объемом 0,5 мл и 2,0 мл соответственно (рис. 2). В экспериментах с тромбоцитами использовали прототип пробки для камеры s V с капиллярным мертвым объемом 0,05 мл, что соответствует коэффициенту разведения 0,909.

В 0,5 мл требуется почти в четыре раза меньше живых клеток, проникнутых клеток и изолированных митохондрий, чем в камере 2,0 мл при идентичных концентрациях образцов (количество на объем), что дает количественно сопоставимые результаты потребления респираторногоO2, нормализованные по количеству клеток или массе белка. Это указывает на то, что камера V является ценным инструментом для исследований, в которых количество доступных образцов ограничено. С другой стороны, внесение идентичного количества образца в камеруV увеличивает объемно-специфический потокO2 и, таким образом, снижает погрешность измерений при низкой дыхательной активности.

Кислородный режим в настоящем исследовании был ограничен диапазоном O2 насыщения воздухом до 30 мкМ. Применимость при уровнях кислорода, превышающих этот диапазон, требует дальнейшей оценки для изучения функции митохондрий при нормоксии или гипоксии тканей тканей43 и пермеабилизированных тканей при гипероксии9. Несколько мультисенсорных конфигураций модулей Oroboros NADH- и Q-; pH, NO и TPP+-электроды10,44 - не могут быть размещены в камереV и требуют камеры 2,0 мл.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

EL является сотрудником компании Oroboros Instruments. EG является основателем и генеральным директором Oroboros Instruments.

Во время работы над проектом компания LFGS была нанята компанией Oroboros Instruments. EÅF и EE являются сотрудниками компании Abliva AB, Лунд, Швеция, которая заключила коммерческое соглашение с Oroboros Instruments.

LR не заявляет о конфликте интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы благодарим Мануэлу Пассруггер за сбор данных по изолированным митохондриям, Патрицию Герт за техническую поддержку по тестированию скорости вращения мешалки и Матеуса Грингса за анализ постоянной времени из тестов мешалки. Мы благодарим нашего партнера, компанию WGT Elektronik GmbH & Co KG, Кользасс, Австрия, за информацию о технических характеристиках стеклянных камер, пробок и напряженности магнитного поля. Мы благодарим Луизу Х.Д. Кардозу, Алехандру Ромеро-Мартинес, Ондрея Соботку, Альбу Тимон-Гомес и Хайме Уиллиса за их комментарии. Эта работа была частично профинансирована в рамках программы исследований и инноваций Европейского Союза «Горизонт 2020» в рамках грантового соглашения No 859770, проект NextGen-O2k. Вклад в COST Action CA15203 MitoEAGLE при финансовой поддержке краткосрочных научных миссий (LFGS, LR).

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Anaconda3Anaconda Software Distributionhttps://www.anaconda.com/software
ADPMerck, Германия117105
Антибиотики-антимикотики 100xBiosera, ФранцияXC-A4110ОСТОРОЖНО H317 Может вызвать аллергическую кожную реакцию
Антимицин АSigma-Aldrich, СШАA8674ОСТОРОЖНО H300  Смертельный исход при проглатывании, H400 кратковременная (острая) водная опасность 
AscorbateSigma-Aldrich, СШАA7631
ATPSigma-Aldrich, США  A 2383
BSA без жирных кислотSigma-Aldrich, СШАA 6003бычий сывороточный альбумин
CaCO3Sigma-Aldrich, СШАC 4830
CCCPSigma-Aldrich, СШАC2759карбонилцианид m-хлорфенилгидразон ОСТОРОЖНО H301 + H311 + H331 Токсичный при проглатывании, контакте с кожей или при вдыхании
Countess Automated cell counter Thermo Fisher Scientific, США AMQAX100
цитохром cSigma-Aldrich, СШАC7752
DatLab Oroboros Instruments, АвстрияВерсия 7.4Программное обеспечение для сбора и анализа данных
DatLab Oroboros Instruments, АвстрияВерсия 8.1Программное обеспечение для сбора и анализа данных
DC Protein AssayBio-Rad, СШАнабордля анализа 5000112 белков; ОСТОРОЖНО H314 Вызывает сильные ожоги кожи и повреждение глаз
ДигитонинSigma-Aldrich, СШАD5628ОСТОРОЖНО H301 Токсичен при проглатывании
ДитиотреитолSigma-Aldrich, СШАD 0632ОСТОРОЖНО H318 Вызывает серьезные повреждения глаз
DMEMPan Biotech, ГерманияP04-05551Dulbecco' s модифицированный Eagle' s среда
ДМСОSigma-Aldrich, СШАD2650диметилсульфоксид
DPBSLonza Bioscience, ШвейцарияLONBE17-512FDulbecco без кальция s фосфатно-солевой буферный раствор
EGTASigma-Aldrich, СШАE 4378
FBSThermo Fisher Scientific, США A5256701фетальной бычьей сыворотки
глюкозы Sigma-Aldrich, США  G7528
Глутамат Sigma-Aldrich, СШАG1626
ГлицерофосфатСанта Круз Биотехнологияsc-215789
Heraeus Multifuge 3s LargeThermo Fisher Scientific, СШАЦентрифугаHM3S
Hettich Rotina 380R Andreas Hettich GmbH & Co. KG, Германия1701центрифуга
ИмидазолHoneywell Fluka, Австрия56750ОСТОРОЖНО H302 Вреден при проглатывании, H314 Вызывает серьезные ожоги кожи и повреждение глаз, H360D Может повредить нерожденному ребенку
jamovi Проект jamoviВерсия 2.3.13программное обеспечение
K+-MESSigma-Aldrich, СШАM 8250
Leucosep tube Greiner Bio-One GmbH, АвстрияZ642843-300EAцентрифужная пробирка с полиэтиленовым барьером
Malate Sigma-Aldrich, СШАM1000ОСТОРОЖНО H319 Вызывает серьезное раздражение глаз.
Маннитолсигма-Олдрич, СШАM 4125
MgCl2 Шарлау, ИспанияMA 0036
MiR05-KitOroboros Instruments, Австрия60101-01Митохондриальная дыхательная среда
Mixer Swelab Instruments, Швеция440Sстол-качалка
Mr Frosty Морозильный контейнерThermo Fisher Scientific, США5100-0001морозильный контейнер
Oroboros OroborosInstruments, АвстрияNextGen-O2k и O2k обозначаются термином « Ороборос
Oroboros Chamber cVOroboros Instruments, Австрия23100-01классическая объемная камера
Oroboros Chamber sVOroboros Instruments, Австрия33100-01малая объемная камера
Oroboros TIP2k-ModuleOroboros Instruments, Австрия11100-03Титрование-впрыск микронасос
O2-Zero PowderOroboros Instruments, Австрия26600-02  На-дитионит ОСТОРОЖНО H251 Самонагревающийся: может загореться, H302 Вреден при проглатывании, H319 Вызывает серьезное раздражение глаз
октаноилкарнитинBiotrend - APExBIO Technology, ГерманияB6371
ОлигомицинSigma-Aldrich, СШАO4876
ФосфокреатинSigma-Aldrich, СШАP 7936
ПируватSigma-Aldrich, СШАP2256ОСТОРОЖНО H317 Может вызвать аллергическую кожную реакцию
RotenoneSigma-Aldrich, СШАR8875ОСТОРОЖНО H300 Смертельный исход при проглатывании
клеточных линий фибробластов кожи   ATCC, США
Азид натрияSigma-Aldrich, СШАS2002ОСТОРОЖНО H300 + H310 + H330 Смертельно опасен при проглатывании, контакте с кожей или при вдыхании
субтилизина ASigma-Aldrich, СШАP 5380ОСТОРОЖНО H318 - Вызывает серьезное повреждение глаз, H334 - Может вызвать симптомы аллергии или астмы или затрудненное дыхание при вдыхании
СукцинатSigma-Aldrich, СШАS2378
СахарозаSigma-Aldrich, СШАS 7903
Счетчик клеток крови Swelab Alfa Boule Diagnostics AB, Швеция1420041
Таурин Sigma-Aldrich, СШАT 0625
Tecan Infinite TM F200Tecan, Швейцарияспектрофотометр
TMPDSigma-Aldrich, СШАT3134N,N,N',N'-Тетраметил--фенилендиамин дигидрохлорид ОСТОРОЖНО H315 Вызывает раздражение кожи, H319 Вызывает серьезное раздражение глаз
ТрипсинSigma-Aldrich, СШАT4799ОСТОРОЖНО H334 может вызвать симптомы аллергии или астмы или затрудненное дыхание при вдыхании
VacuetteGreiner Bio-One GmbH, Австрия15452520

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zdrazilova, L., Hansikova, H., Gnaiger, E. Comparable respiratory activity in attached and suspended human fibroblasts. PLoS ONE. 17 (3), e0264496(2022).
  2. Schöpf, B., et al. OXPHOS remodeling in high-grade prostate cancer involves mtDNA mutations and increased succinate oxidation. Nat Commun. 11 (1), 1487(2020).
  3. Meszaros, A. T., et al. The predictive value of graft viability and bioenergetics testing towards the outcome in liver transplantation. Transplant International. 37, 12380(2024).
  4. Doerrier, C., Garcia-Souza, L. F., Krumschnabel, G., Wohlfarter, Y., Mészáros, A. T., Gnaiger, E. High-resolution fluorespirometry and OXPHOS protocols for human cells, permeabilized fibers from small biopsies of muscle, and isolated mitochondria. Methods Mol Biol. 1782, 31-70 (2018).
  5. Gnaiger, E., Steinlechner-Maran, R., Méndez, G., Eberl, T., Margreiter, R. Control of mitochondrial and cellular respiration by oxygen. J Bioenerg Biomembr. 27 (6), 583-596 (1995).
  6. Gnaiger, E., Méndez, G., Hand, S. C. High phosphorylation efficiency and depression of uncoupled respiration in mitochondria under hypoxia. Proc Natl Acad Sci. 97 (20), 11080-11085 (2000).
  7. Gnaiger, E. Oxygen Conformance of Cellular Respiration. Hypoxia. Advances in Experimental Medicine and Biology. Roach, R. C., Wagner, P. D., Hackett, P. H. , Springer. Springer, Boston, MA. (2003).
  8. Harrison, D. K., Fasching, M., Fontana-Ayoub, M., Gnaiger, E. Cytochrome redox states and respiratory control in mouse and beef heart mitochondria at steady-state levels of hypoxia. J Appl Physiol. 119 (10), 1210-1218 (2015).
  9. Pesta, D., Gnaiger, E. High-resolution respirometry: OXPHOS protocols for human cells and permeabilized fibers from small biopsies of human muscle. Methods Mol Biol. 810, 25-58 (2012).
  10. Komlódi, T., Cardoso, L. H. D., Doerrier, C., Moore, A. L., Rich, P. R., Gnaiger, E. Coupling and pathway control of coenzyme Q redox state and respiration in isolated mitochondria. Bioenerg Commun. 2021.3, (2021).
  11. Suomalainen, A., Nunnari, J. Mitochondria at the crossroads of health and disease. Cell. 187 (11), 2601-2627 (2024).
  12. Cardoso, L. H. D., et al. Fatty acid β-oxidation in brain mitochondria: Insights from high-resolution respirometry in mouse, rat and Drosophila brain, ischemia and aging models. Biochim Biophys Acta Mol Basis Dis. 1871, 167544(2025).
  13. Gnaiger, E. Bioenergetics at low oxygen: dependence of respiration and phosphorylation on oxygen and adenosine diphosphate supply. Respir Physiol. 128 (3), 277-297 (2001).
  14. Gnaiger, E. Polarographic Oxygen Sensors, the Oxygraph and High-Resolution Respirometry to Assess Mitochondrial Function. Mitochondrial dysfunction in drug-induced toxicity. Dykens, J. A., Will, Y. , John Wiley & Sons, Inc. Hoboken, NJ. 327-352 (2008).
  15. Gnaiger, E. Mitochondrial pathways and respiratory control. An Introduction to OXPHOS analysis. Bioenerg Commun. 2020.2, (2020).
  16. Diaz, E. C., Adams, S. H., Weber, J. L., Cotter, M., Børsheim, E. Elevated LDL-C, high blood pressure, and low peak VO₂ associate with platelet mitochondria function in children-The Arkansas Active Kids Study. Front Mol Biosci. 10, 1136975(2023).
  17. Ehinger, J. K., Morota, S., Hansson, M. J., Paul, G., Elmér, E. Mitochondrial dysfunction in blood cells from amyotrophic lateral sclerosis patients. J Neurol. 262 (6), 1493-1503 (2015).
  18. Heimler, S., et al. Platelet bioenergetics are associated with resting metabolic rate and exercise capacity in older adult women. Bioenerg Commun. 2022.2, (2022).
  19. Palacka, P., et al. Platelet mitochondrial bioenergetics reprogramming in patients with urothelial carcinoma. Int J Mol Sci. 23 (1), 388(2021).
  20. Fischer, C., et al. Mitochondrial respiration in response to iron deficiency anemia: Comparison of peripheral blood mononuclear cells and liver. Metabolites. 12 (3), 270(2022).
  21. JedIicka, J., et al. Impact of aging on mitochondrial respiration in various organs. Physiol Res. 71 (Suppl. 2), S227-S236 (2022).
  22. Westerlund, E., et al. Correlation of mitochondrial respiration in platelets, peripheral blood mononuclear cells and muscle fibers. Heliyon. 10 (5), e26745(2024).
  23. Hütter, E., Renner, K., Pfister, G., Stöckl, P., Jansen-Dürr, P., Gnaiger, E. Senescence-associated changes in respiration and oxidative phosphorylation in primary human fibroblasts. Biochem J. 380 (3), 919-928 (2004).
  24. Yépez, V. A., et al. OCR-Stats: Robust estimation and statistical testing of mitochondrial respiration activities using Seahorse XF Analyzer. PLoS One. 13 (7), e0199938(2018).
  25. Gnaiger, E. Bioenergetic cluster analysis - mitochondrial respiratory control in human fibroblasts. MitoFit Preprints. 2021.8, (2021).
  26. Palmer, J., Tandler, B., Hoppel, C. Biochemical properties of subsarcolemmal and interfibrillar mitochondria isolated from rat cardiac muscle. J Biol Chem. 252, 8731-8739 (1977).
  27. Lai, N. M., Kummitha, C., Rosca, M. G., Fujioka, H., Tandler, B., Hoppel, C. L. Isolation of mitochondrial subpopulations from skeletal muscle: Optimizing recovery and preserving integrity. Acta Physiol. 225 (2), e13182(2019).
  28. Baglivo, E., Cardoso, L. H., Cecatto, C., Gnaiger, E. Statistical analysis of instrumental reproducibility as internal quality control in high-resolution respirometry. Bioenerg Commun. 2022.8, (2022).
  29. Mela, L., Seitz, S. Isolation of mitochondria with emphasis on heart mitochondria from small amounts of tissue. Methods Enzymol. 55, 39-46 (1979).
  30. Cardoso, L. H. D., Doerrier, C., Gnaiger, E. Magnesium Green for fluorometric measurement of ATP production does not interfere with mitochondrial respiration. Bioenerg Commun. 2021.1, (2021).
  31. Gnaiger, E. The elementary unit — count and numbers in the International System of Units. BEC preprints. , (2025).
  32. Vernerova, A., et al. Mitochondrial respiration of platelets: Comparison of isolation methods. Biomedicines. 9 (12), 1859(2021).
  33. Oroboros Instruments SUIT-003 O2 ce-pce D018. , https://wiki.oroboros.at/index.php/SUIT-003_O2_ce-pce_D018 (2024).
  34. Oroboros Instruments SUIT-001 O2 ce-pce D004. , https://wiki.oroboros.at/index.php/SUIT-001_O2_ce-pce_D004 (2024).
  35. Timón-Gómez, A., et al. Bioenergetic profiles and respiratory control in mitochondrial physiology: Precision analysis of oxidative phosphorylation. Exp Physiol. , 1-33 (2025).
  36. Oroboros Instruments SUIT-002 O2 ce-pce D007. , https://wiki.oroboros.at/index.php/SUIT-002_O2_ce-pce_D007 (2024).
  37. Oroboros Instruments SUIT-002 O2 mt D005. , https://wiki.oroboros.at/index.php/SUIT-002_O2_mt_D005 (2024).
  38. The Jamovi Project jamovi (Version 2.3.13). , https://www.jamovi.org/ (2024).
  39. Gnaiger, E. Preface: A biologist´s view. Polarographic Oxygen Sensors. Aquatic and Physiological Applications. Gnaiger, E., Forstner, H. , Berlin, Heidelberg, New York. Springer. V-VII (1983).
  40. Hütter, E., Renner, K., Jansen-Dürr, P., Gnaiger, E. Biphasic oxygen kinetics of cellular respiration and linear oxygen dependence of antimycin A inhibited oxygen consumption. Mol Biol Rep. 29 (1/2), 83-87 (2002).
  41. Oroboros Instruments Cell count and normalization in HRR. , https://wiki.oroboros.at/index.php/Cell_count_and_normalization_in_HRR (2020).
  42. Williams, O., Sergent, S. R. Histology Platelets. , StatPearls Pubs. Treasure Island, FL. (2022).
  43. Donnelly, C., et al. The ABC of hypoxia - what is the norm. Bioenerg Commun. 2022.12.V2, (2022).
  44. Aguirre, E., Rodríguez-Juárez, F., Bellelli, A., Gnaiger, E., Cadenas, S. Kinetic model of the inhibition of respiration by endogenous nitric oxide in intact cells. Biochim Biophys Acta. 1797 (5), 557-565 (2010).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Oroboros

Похожие статьи