Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Получение органоида мозга человека с развитием микроглии

2.6K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/67491

⸱

17 января 2025 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Translational Neuroscience Center, National Institute of Neurological Disorders and Stroke, National Institutes of Health, 2Cancer Genetics and Comparative Genomics Branch, National Human Genome Research Institute, National Institutes of Health

В этой статье

Краткое содержание

Мы представляем протокол создания органоида человеческого мозга с резидентной микроглией путем включения гемопоэтических клеток-предшественников (HPC), полученных из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPSC), в развитие органоидов.

Аннотация

Трехмерные (3D) культуры органоидов мозга, полученные из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК), представляют собой важную альтернативу in vitro для изучения развития мозга человека и патогенеза неврологических заболеваний. Тем не менее, отсутствие включения микроглии в органоиды человеческого мозга по-прежнему является основным препятствием для 3D-моделей нейровоспаления. Современные подходы включают либо включение полностью дифференцированной микроглии в зрелые органоиды мозга, либо индукцию микроглиальной дифференцировки на ранней стадии эмбриоидных телец (БЭ), полученных из ИПСК. Первый подход пропускает стадию, когда микроглиальная дифференцировка взаимодействует с соседней нервной средой, а второй подход технически сложен, что приводит к несогласованности между конечными органоидами с точки зрения количества и качества микроглии. Для моделирования органоидов мозга с микроглией для изучения ранних взаимодействий между микроглией и развитием нейронов, высокочистые гемопоэтические клетки-предшественники (HPC), дифференцированные от человеческих iPSC, были включены в полученные из iPSC EB для создания органоидов мозга. Используя иммуноокрашивание и анализ секвенирования РНК одиночных клеток (sc-RNA-seq), мы подтвердили, что HPC были включены в 3D-органоиды, которые в конечном итоге развились в органоиды мозга с микроглией и нейронами. По сравнению с органоидами мозга без HPC, этот подход приводит к значительному включению микроглии в органоиды мозга. Эта новая 3D-модель органоида, которая включает в себя свойства развития микроглии и нервной системы, может быть использована для изучения ранних взаимодействий между врожденным иммунитетом и развитием нервной системы и, возможно, в качестве модели нейровоспаления и нейроинфекционных заболеваний.

Введение

Микроглия — это резидентные иммунные клетки в головном мозге, играющие важнейшую роль как в развитии мозга, так и в гомеостазе 1,2. Активация микроглии приводит к выработке провоспалительных факторов, повышенному фагоцитозу и реактивному окислительному стрессу, который удаляет вторгшиеся патогены и скомпрометированные клетки. Тем не менее, гиперактивация или длительная активация микроглии может, с другой стороны, вызвать нейродегенерацию как механизм патогенеза при многих неврологических расстройствах, включая болезнь Паркинсона. Важно, что микроглия включена в соответствующие модели для изучения неврологических расстройств человека. В последние годы стволовые клетки человека использовались для разработки 3D-органоидов в качестве моделей in vitro в качестве альтернативы животным моделям и исследованиям на людях5. В идеале человеческие органоиды представляют собой множественные типы клеток и тканевых структур, сходных с соответствующими человеческими органами, которые лучше представляют физиологию и патогенез человека, чем животные модели, но без этических проблем, связанных непосредственно с исследованиями человеческих индивидуумов. Они могут представлять собой будущее моделирования болезней человека для изучения патогенеза и разработки лекарств, а также для руководства индивидуализированной терапией. Например, 3D-органоиды человеческого мозга, полученные из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека (ИПСК), преобладают в области исследований в области нейробиологии, моделируя нейроинфекционные заболевания, включая вирус Зика, SARS-CoV-27, и нейродегенеративные заболевания, включая боковой амиотрофический склероз (БАС) и болезнь Альцгеймера 8,9. Тем не менее, обычные 3D-нейронные органоиды, использующие двойное ингибирование SMAD для индуцирования дифференцировки нейронов10, производят органоиды мозга, лишенные микроглии, поскольку они получены от предшественников, рекрутированных из крови, а не из линии нейроэктодермы, из которой нейроны происходят из11,12. Без наличия микроглии органоиды неадекватны для моделирования инфекций ЦНС, воспаления и связанной с ними нейродегенерации.

Для решения этой важнейшей проблемы были предприняты попытки включить дифференцированную микроглию в органоидымозга или индуцировать микроглиальную дифференцировку в органоидах с самого начала, используя альтернативные подходы вместо двойного ингибирования SMAD13. Тем не менее, при включении дифференцированной микроглии в органоиды мозга, ранние взаимодействия между развитием нейронов и микроглии упускаются. Это может иметь важное значение для развития ЦНС или патогенеза нейроинфекционных заболеваний, нацеленных на развитие мозга младенцев, таких как вирусная инфекция Зика14. С другой стороны, дифференцировка врожденной микроглии в органоидах мозга, полученных из ИПСК без прерывистых стадий, включает в себя длительный процесс и имеет более высокую вариабельность вконечных продуктах. В этом протоколе мы включили гемопоэтические клетки-предшественники (HPC), полученные из iPSC, в iPSC для создания эмбриоидных телец (EB), которые в дальнейшем дифференцировались в 3D-органоиды, включающие как нейроны, так и микроглию.

Наш протокол обеспечивает простой подход, который может быть использован для изучения центральной нервной системы человека, включающей ранние нейрон-микроглиальные взаимодействия, а также патогенез нервных инфекционных заболеваний и нейровоспаления с участием активации микроглии.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Исходные образцы крови здоровых взрослых доноров были собраны в Банке крови для трансфузионных препаратов NIH, а подписанные формы информированного согласия были получены в соответствии с Институциональным наблюдательным советом NIH.

1. Получение гемопоэтических клеток-предшественников (ГПК) из ИПСК человека

Примечание: Для получения репрезентативных результатов были использованы клетки 510 и 507 iPSC человека. Методы генерации и поддержания ИПСК можно найти в предыдущей публикации16.

  1. День 0: Покройте 12-луночный клеточный планшет, добавив 500 μл/лунку ледяного раствора Matrigel (матрица базальной мембраны [BMM]), разведенного в среде DMEM/F12, и инкубируйте его в течение не менее 30 минут при комнатной температуре (RT).
  2. Полностью удалите надосадочную жидкость покрытия и замените ее 1 мл среды E8 Flex на лунку.
  3. Проверьте посев ИПСК в 6-луночном планшете под микроскопом, чтобы убедиться, что ИПСК высокого качества и без признаков дифференцировки. Выберите колонию среднего размера, отметив ее маркером под нижней частью тарелки.
  4. Удалите среду из культуры iPSC и добавьте в лунку 500 μл буфера для диссоциации iPSC этилендиаминтетрауксусной кислоты (EDTA) (0,5 мМ ЭДТА, 0,45 г/л NaCl в DPBS).
  5. Наблюдайте под микроскопом за признаками клеточной диссоциации, когда три-четыре ряда клеток от краев колонии начинают сжиматься, а между клетками появляется пустое пространство. Обычно это занимает 1-3 минуты.
  6. Полностью откажитесь от раствора ЭДТА. Вытесните отмеченную колонию iPSC путем дозирования 1 мл среды E8 Flex с усилием и непосредственно на нее. Убедитесь, что колония полностью отделяется на клеточные участки, содержащие по 20-50 клеток каждая, после 1-3 пипетирования.
  7. Соберите надосадочную жидкость, содержащую клеточные участки, и добавьте ее в первую лунку из покрытых лунок в 12-луночном планшете.
  8. Перемешайте лунку с помощью пипетирования один или два раза и перенесите 1 мл клеток во вторую лунку, содержащую 1 мл среды.
  9. Повторите шаг 1.8 дважды, чтобы получить серийное разбавление культур iPSC в общей сложности в четырех лунках.
  10. Инкубируйте планшет в инкубаторе с температурой 37 °C, 5% CO2.
  11. Через 24 часа, в день 1, проверьте колонии под микроскопом и подсчитайте количество колоний, непрерывно проходя по всем полям в лунке. Выберите одну лунку, которая содержит 10-20 колоний iPSC.
  12. Замените среду на 1 мл среды А из набора для кроветворения. Поставьте тарелку обратно в инкубатор на 48 ч.
  13. На 3-й день удалите 500 μл отработанной среды и добавьте 500 μл свежей среды А.
  14. На 4-й день понаблюдайте под микроскопом и заметьте значительный рост клеток и дифференцировку от колоний iPSC. Замените среду на 1 мл среды В.
  15. Контролируйте дифференцировку клеток под микроскопом и проводите полусредние изменения с помощью 500 мкл среды B через день. HPC-подобные клетки появляются на 6-7 день.
  16. На 10-й день наблюдайте под микроскопом яркие одиночные круглые клетки с морфологией нормальных ГПК, плавающие в среде или слабо прикрепленные к единому нижнему слою плоских клеток, с некоторыми рыхлыми клеточными агрегатами.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Дифференцированные высокопроизводительные вычисления готовы к сбору для определения характеристик или проведения дальнейших экспериментов.
  17. Соберите все дифференцированные высокопроизводительные вычисления путем трехкратного пипетирования вверх и вниз с помощью наконечника для дозатора объемом 1 мл, чтобы разбить клеточные агрегаты и отделить высокопроизводительные медицинские вещества от поверхности планшета.
  18. Добавьте клетки в пробирку объемом 15 мл и центрифугируйте клетки при давлении 300 x g в течение 5 минут. Удалите надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клеточную гранулу в 1 мл среды В.
  19. Подсчитайте клетки и отрегулируйте концентрацию до 1 миллиона клеток/мл. На данном этапе генерируется более 1 млн HPC. При проверке с помощью проточной цитометрии убедитесь, что чистота составляет более 85% клеток с CD34+/CD43+. Убедитесь, что не замечены значительные мертвые клетки (более 5%).

2. Развитие эмбриоидных тел из смешанных ИПСК и ГПК

  1. В тот же день сбора HPC убедитесь, что культура iPSC также достигает 80% слияния в одной лунке в 6-луночном планшете (или в двух лунках в 12-луночном планшете).
  2. Обработайте одну лунку микролуночного планшета для образования БЭ 500 мкл раствора для промывки, препятствующей прилипанию, добавив его для минимизации образования пузырьков.
  3. Вращайте пластину при давлении 2000 x g в течение 5 минут в качающемся роторе ковша, оснащенном держателями пластин, чтобы удалить возможные пузырьки.
  4. Полностью удалите промывочный раствор с помощью пипетирования и дважды промойте лунки 1 мл DPBS, а затем 1 мл DMEM/F12 без образования пузырьков.
  5. Диссоциируйте иПСК от планшета, обработав клетки 1 мл раствора Аккутазы.
  6. Наблюдайте под микроскопом до тех пор, пока клетки не проявят признаки разделения, но все еще не прикрепятся к дну. Обычно это происходит в течение 1-3 минут после лечения Аккутазой. Не переваривайте ИПСК чрезмерно.
  7. Раствор Аккутазы удалить полностью, не нарушая клетки, и добавить в лунки 1 мл среды DMEM/F12. Далее диссоциируйте клетки на отдельные клетки, пару раз пипетируя вверх и вниз с помощью наконечника объемом 1 мл.
  8. Соберите клетки в пробирку объемом 15 мл и заполните ее до 5 мл средой DMEM/F12. Вращайте ячейки при 300 x g в течение 5 минут.
  9. Удалите надосадочную жидкость с помощью пипетирования и ресуспендируйте клетки в 1 мл среды E8 Flex. Подсчитайте количество клеток и отрегулируйте концентрацию клеток до 1 миллиона клеток на мл в среде E8 Flex.
  10. Смешайте iPSC с HPC в соотношении 2:1, добавив 1 миллион iPSC (1 мл) и полмиллиона HPC (500 μL) вместе. Добавьте все смешанные клетки в предварительно обработанную лунку микролуночного планшета.
  11. Добавьте в надосадочную жидкость 1 мкл стокового раствора ингибитора породы Y27632 (1 мМ) на 1 мл среды. Встряхните пластину из стороны в сторону несколько раз, чтобы равномерно распределить ячейки.
  12. Вращайте планшет для микролунок с температурой 300 x g в течение 5 минут в качающемся роторе ковша, оснащенном держателями планшетов. Понаблюдайте под микроскопом, чтобы увидеть, осели ли клетки в микролунках. (Дополнительный рисунок 1А).
  13. Не тревожа клетки, поместите планшет в инкубатор с 5% содержаниемCO2 при температуре 37 °C.
  14. На 2-й день, через 48 часов, наблюдайте за клетками под микроскопом на предмет образования БЭ. Когда EB четко сформированы, переходите к следующему шагу (дополнительный рисунок 1B).
  15. Обработайте 24-луночный планшет для клеточных культур промывочным буфером, препятствующим адгезии (500 μл) в течение 15 минут, чтобы получить пластину с низким уровнем прикрепления.
  16. Полностью снимите промывочный буфер и дважды промойте лунки 1 мл DPBS, затем добавьте в лунки 1 мл среды E8 Flex.
  17. Ресуспендируйте БЭ в планшете для микролунок для культивирования, несколько раз наложив на них наконечник для пипетки с отверстием объемом 1 мл.
  18. Для каждой лунки с низкой адгезией обрабатывают 24 луночные планшеты, собирают и добавляют 100 мкл среды, содержащей БЭ. В результате получится 10-20 ЭБ на скважину. Добавьте среду E8 Flex в старую лунку, содержащую оставшиеся EB в качестве резерва.
  19. Инкубируйте планшет в клеточном инкубаторе с температурой 37 °C и 5%CO2 в течение 48 часов.

3. 3D индукции, пролиферации и созревания нервных органоидов

  1. На 2-й день после образования БЭ разморозьте аликвоты ВММ на льду не менее 30 минут.
  2. Используйте предварительно охлажденный наконечник объемом 20 мкл и добавьте 15 мкл ледяной капли BMM поверх среды, чтобы покрыть EB. В результате получается пленка из BMM, к которой будут прикрепляться и расти EB.
  3. Поместите планшет в клеточный инкубатор с температурой 37 °C, 5% CO2 .
  4. На 4-й день, после образования EB, осторожно удалите 500 μL среды, не отбрасывая EB, и повторите нанесение BMM-покрытия, следуя шагу 3.2.
  5. Немедленно начните нейронную индукцию, добавив 500 мкл среды для нейронной индукции PSC поверх клеток.
  6. На 6 и 8 день проведите половинную замену среды, осторожно удалив 500 мкл среды, не касаясь клеток, и добавив 500 мкл нейроиндукционной среды.
  7. На 10, 12 и 14 дни проведите половинное изменение среды с помощью нейростволовых клеток (НСК): Knockout DMEM/F12 + 1x добавка Glutamax + 1x Neural supplement + bFGF + EGF.
  8. На 15-й день переложите всю лунку сфер со средой на новую 12-луночную пластину, обработанную раствором для промывки, препятствующей адгезии, как описано ранее. Добавьте 500 мкл среды для созревания нейронов (DMEM/F12 + 1x добавка N2 + 1x добавка B27 + 1x антибиотики-антимикотики) поверх культуры.
  9. Проводите полу-средние изменения со средой созревания нейронов через день.
  10. На стадии созревания, если есть признаки истощения питательных веществ, такие как изменение цвета среды, переместите органоид в 6 луночных пластин, которые вмещают до 3 мл среды на лунку.
  11. По желанию, через 17 дней после формирования БЭ следует дополнить среду созревания цитокинами (IL-34, M-CSF, TGF-β1, CD200, CX3CL1) в течение 6 дней для облегчения созревания микроглии.
  12. На 23-й день соберите полученные нейронные органоиды для определения характеристик или дальнейших экспериментов.

4. Клиренс и иммуноокрашивание 3D нейроорганоидов

  1. Фиксируют до 10 органоидов путем погружения в 1 мл 4% параформальдегида (PFA) при 4 °C на 24 ч.
  2. Переложите органоиды на лунку в 96-луночную чистую донную пластину и промойте 200 мкл DPBS 2 раза в течение 1 часа каждый раз с легким встряхиванием.
  3. Пермеабилизируйте органоиды, промыв их один раз в 50% метанола в DPBS, 80% метанола в воде двойной дистилляции (dd) и 100% сухого метанола в течение 10 мин каждый, при 4 °C с легким встряхиванием.
  4. Промыть органоиды последовательно в 20% ДМСО/метаноле, 80% метаноле в воде dd, 50% метаноле в DPBS, в 100% DPBS, затем в DPBS с 0,2% Triton X-100, в течение 10 мин каждый при 4 °C с легким встряхиванием. Приложите усилия, чтобы полностью удалить остаточный буфер после каждой стирки.
  5. Инкубировать в проникающем буфере (DPBS с 0,2% Triton X100, 0,3% М глицина и 20% DMSO) с легким встряхиванием в течение 40 минут при RT.
  6. Блокируйте в блокирующем буфере (DPBS с 0,2% Triton X100, 6% козьей сывороткой и 10% DMSO) в течение 1 ч при 37 °C с легким встряхиванием на шейкере при 80 об/мин.
  7. Инкубируют с антителами в буфере для разведения антител (IBA1 1:100, TREM2 1:100, βIII-тубулин, 1:1000, 100 μL /лунка в DPBS с 0,2% Tween 20, 100 мкг/мл гепарина, 3% козьей сыворотки и 5% ДМСО) при 37 °C в течение 2 ч или в холодном помещении с легким встряхиванием при 80 об/мин в течение 3 дней.
  8. Умываться с DPBS 0,2% Tween 20, 100 мкг/мл Гепарина 5 раз, по 10 мин каждый в RT с легким встряхиванием на шейкере при 80 об/мин.
  9. Инкубировать с вторичными антителами (1:200 козьего антимышиного Alexa488) при 37 °C в течение 1 ч с последующей ЛТ в течение ночи с легким встряхиванием в шейкере при 80 об/мин.
  10. Для ядерного контрастного окрашивания выполняйте окрашивание DAPI вместе с инкубацией антител или в промывном буфере.
  11. Промойте органоиды 10 раз в промывочном буфере, каждый раз по 10 мин при температуре 37 °C, осторожно встряхивая.
  12. Наблюдайте под микроскопом. Если фон все еще высокий, продолжайте мыть его 5 раз.
  13. Выбросьте надосадочную жидкость как можно больше. Добавьте 200 мкл раствора для очистки органоидов и инкубируйте его в течение 5 мин перед наблюдением и сделайте снимки с помощью конфокального микроскопа.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Наш протокол следует схеме дифференциации HPC от iPSCs и последующего смешивания HPC с iPSC для получения EB с последующей нейронной индукцией, дифференцировкой и созреванием (рис. 1). Высокое качество дифференцировки HPC имеет решающее значение для успешного формирования EB и последующей дифференцировки органоидов. Метод серийного разведения используется для получения соответствующего количества и размера колоний iPSC для начала дифференцировки HPC (

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Здесь представлен подробный протокол создания 3D нейронных органоидов, содержащих врожденную микроглию, из БЭ, полученных из смешанных ИПСК и ИПСК-дифференцированных ГПК. Это относительно короткий и простой подход, включающий только методы и оборудование для клеточных культур, обычно доступные в большинстве лабораторий.

Наиболее важным фактором для успеха этого протокола является качество дифференциации высокопроизводительных вычислений. Мы приняли опубликован...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Это исследование проводится при поддержке фондов внутренних исследований NINDS.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
12 луночных планшетов для клеточных культурCorning #3512
24 луночный планшет для культивирования клетокSARSTEDT#83.3922
AccutaseThermoA1110501
Aggrewell 400 планшетStemcell technologies#34411Упоминается как микролуночный планшет 
Alexa Fluor 488 козье антитело к мышамLife techniologiesA110011:400 разведение
Alexa Fluor 594 козье антитело против кроликаLife techniologiesA110121:400 разведение
Allegra X-30R Центрифуга с ротором S6069Beckman Couler
Anti- Adherence  Промывочный растворStem Cell Technologies#07010
анти-CD34 антителоStem Cell Technologies#600131:100 разведение
анти-Human CD43 антителоStem Cell Technologies#600851:100 разведение
анти-IBA1 раббит антителоFujifilm019-197412.5 µ g/mL
anti-TREM2  крысиный pAbRD Systemsmab172912.5 µ г/мл
Антибиотик-антимикотикGibco15240-0621x
B27 добавкаLife technologies17504-0441x
bFGFPeprotech100-18B20 нг/мл
CD200NovoproteinC311  Флаконы CryoTube 100 нг/мл
Thermo#368632
CX3CL1Peprotech300-31  100 нг/мл
DAPISigmaD95421 & микро; g/mL
DMEM/F12Life technologies12400-0241x
DMSOSigmaD2650
DPBSGibco#41901361x
E8 Flex средний наборThermoA2858501
EDTAMediatech46-034-Cl 0,5 мМ
EGFPeprotechAF-100-1520 нг/мл EVOS
FL АвтомикроскопТермофлуоресцентный микроскоп 
FastStart Universal SYBR Green PCR master mixRoche#4913850001
GlutamaxGibco#35050079
Сыворотка козья SigmaG90234%
IL-34Peprotech200-34  100 нг/мл
микроконфокальныемолекулярные устройства
Knockout DMEM/F12Gibco#10829018
M-CSFPeprotech300-25  25 нг/мл
MatrigelCorning#354277Матрица базальной мембраны (BMM)
Мышиный анти- и бета; III-тубулин антителоPromegaG712A1:1000 разведение
Mr. Frosty containerThermo5100-0001
N2 добавкаLife technologies17502-0481x
ParaformadehydeSigmaP61484%
PSC Нейроиндукционная средаGibcoA1647801
Rock ингибитор Y27632Стволовая клетка технологии#723041 мМ стоковый
RT LTS 1000 ul наконечники для пипетокRAININ#30389218  для переноса органоидов
STEMdiff Cerebral Organoid KitStem Cell Technologies#08570
STEMdiff Hematopoietic KitStemCell Technologies#5310Именуется гемопоэтическим набором
StemPro Neural SupplementGibcoA1050801Именуется как нейродобавка
TGF-β 1Peprotech100-2150 нг/мл
Очистка общей РНК плюс наборNorgen#48400
TritonX-100SigmaT92840,10%
Visikol Histo-Starter KitVisikolHSK-1Содержит раствор для очистки органоидов HISTO-M, промывочный буфер
Zeiss LSM 510-META Конфокальный микроскопZeiss
ImageXpress

Ссылки

  1. Sabate-Soler, S., et al. Microglia integration into human midbrain organoids leads to increased neuronal maturation and functionality. Glia. 70 (7), 1267-1288 (2022).
  2. Lazarov, T., Juarez-Carreño, S., Cox, N., Geissmann, F. Physiology and diseases of tissue-resident macrophages. Nature. 618 (7966), 698-707 (2023).
  3. Wang, T., Liu, B., Zhang, W., Wilson, B., Hong, J. S. Andrographolide reduces inflammation-mediated dopaminergic neurodegeneration in mesencephalic neuron-glia cultures by inhibiting microglial activation. J Pharmacol Exp Ther. 308 (3), 975-983 (2004).
  4. Qian, L., Flood, P. M., Hong, J. S. Neuroinflammation is a key player in Parkinson's disease and a prime target for therapy. J Neural Transm (Vienna). 117 (8), 971-979 (2010).
  5. Clevers, H. Modeling development and disease with organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
  6. Fakıoğlu, D. M., Altun, B. New therapeutic approaches in cystic fibrosis. Turk J Pharm Sci. 17 (6), 686-697 (2020).
  7. Mcmillan, R. E., Wang, E., Carlin, A. F., Coufal, N. G. Human microglial models to study host-virus interactions. Exp Neurol. 363, 114375(2023).
  8. Scopa, C., et al. Jun upregulation drives aberrant transposable element mobilization, associated innate immune response, and impaired neurogenesis in Alzheimer's disease. Nat Commun. 14 (1), 8021(2023).
  9. Tamaki, Y., et al. Spinal cord extracts of amyotrophic lateral sclerosis spread TDP-43 pathology in cerebral organoids. PLoS Genet. 19 (2), e1010606(2023).
  10. Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human es and IPS cells by dual inhibition of smad signaling. Nat Biotechnol. 27 (3), 275-280 (2009).
  11. Kim, S. H., Chang, M. Y. Application of human brain organoids-opportunities and challenges in modeling human brain development and neurodevelopmental diseases. Int J Mol Sci. 24 (15), 12528(2023).
  12. Ginhoux, F., et al. Fate mapping analysis reveals that adult microglia derive from primitive macrophages. Science. 330 (6005), 841-845 (2010).
  13. Ormel, P. R., et al. Microglia innately develop within cerebral organoids. Nat Commun. 9 (1), 4167(2018).
  14. Abdelmalek, C. M., et al. Building a growing genomic data repository for maternal and fetal health through the ping consortium. medRxiv. , (2024).
  15. Wei, Z., et al. Human IPSC-derived brain organoids: A 3D mini-brain model for studying HIV infection. Exp Neurol. 364, 114386(2023).
  16. Wang, T., et al. Regulation of stem cell function and neuronal differentiation by HERV-K via mTOR pathway. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (30), 17842-17853 (2020).
  17. Mcquade, A., et al. Development and validation of a simplified method to generate human microglia from pluripotent stem cells. Mol Neurodegener. 13 (1), 67(2018).
  18. Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Generation of cerebral organoids from human pluripotent stem cells. Nat Protoc. 9 (10), 2329-2340 (2014).
  19. Fiorenzano, A., et al. Single-cell transcriptomics captures features of human midbrain development and dopamine neuron diversity in brain organoids. Nat Commun. 12 (1), 7302(2021).
  20. Qian, X., et al. Brain-region-specific organoids using mini-bioreactors for modeling ZIKV exposure. Cell. 165 (5), 1238-1254 (2016).
  21. Park, D. S., et al. IPS-cell-derived microglia promote brain organoid maturation via cholesterol transfer. Nature. 623 (7986), 397-405 (2023).
  22. Schafer, S. T., et al. An in vivo neuroimmune organoid model to study human microglia phenotypes. Cell. 186 (10), 2111-2126.e20 (2023).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Получение органоида мозга человека с развитием микроглии
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.