JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Immunology and Infection

Быстрое и специфичное выявление инфекций Acinetobacter baumannii с помощью системы амплификации рекомбиназной полимеразы/Cas12A

Published: April 25, 2025
doi:
10.3791/67542
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
, , , , , , , , , , , , , ,
1Department of General Practice,The First Hospital of Jilin University2Department of Respiratory Medicine, Center for Pathogen Biology and Infectious Diseases,The First Hospital of Jilin University3Bioinformatics Laboratory,The First Hospital of Jilin University

Summary

Чтобы облегчить быстрое и точное обнаружение Acinetobacter baumannii, мы представляем протокол, в котором используется амплификация рекомбиназной полимеразы (RPA) в сочетании с эндонуклеазой LbaCas12a для идентификации инфекций A. baumannii .

Abstract

Acinetobacter baumannii, грамотрицательная бактерия, печально известна тем, что вызывает тяжелые инфекции с высоким уровнем смертности. Быстрое и точное обнаружение A. baumannii имеет решающее значение для быстрого лечения, эффективного инфекционного контроля и сдерживания устойчивости к антибиотикам. Тем не менее, не существует подходящего метода для быстрого и легкого обнаружения A. baumannii на месте. Система CRISPR Trans Reporter (DETECTR) предлагает быстрый, точный и чувствительный подход к обнаружению A. baumannii за счет интеграции возможностей распознавания Cas12a для специфичной мишени с эффективностью изотермической амплификации рекомбиназной полимеразной амплификации (RPA). В этом протоколе подробно описывается обнаружение A. baumannii с помощью RPA в сочетании с эндонуклеазой LbaCas12a. В этой статье описаны следующие этапы: экстракция ДНК, выбор конкретной последовательности ДНК, дизайн праймера и CRISPR РНК (crRNA), построение положительной рекомбинантной плазмиды, настройка анализа Cas12a-RPA, оптимизация системы амплификации RPA, визуализация анализа RPA-CRISPR/Cas12a с помощью инструмента обнаружения флуоресценции, такого как инструмент для ПЦР в реальном времени, и оценка чувствительности и специфичности.

Introduction

В клинической микробиологии выявление инфекций, вызванных Acinetobacter baumannii, представляет собой серьезную проблему. Эта грамотрицательная бактерия может вызывать инфекции с тяжелыми клиническими симптомами, даже с высоким уровнем смертности, особенно среди пациентов с ослабленным иммунитетом1. Традиционные методы обнаружения патогенных инфекций на основе культуры требуют много времени и могут быть нечувствительными, что может привести к задержке лечения антибиотиками и ухудшить результаты лечения пациентов. Быстрая и точная идентификация A. baumannii имеет решающее значение для эффективного лечения и борьбы со вспышкой. Для удовлетворения этой потребности были изучены молекулярные методы, использующие амплификацию нуклеиновых кислот. Тем не менее, эти подходы часто требуют сложного оборудования для термоциклирования и могут быть ограничены хорошо обученными техниками и хорошо отлаженными лабораториями. Для преодоления этих проблем исследования все больше концентрируются на разработке методов изотермической амплификации 2,3,4.

Амплификация рекомбиназной полимеразы (RPA) — это метод, разработанный Piepenburg et al 5 и используемый для амплификации ДНК, аналогичный полимеразной цепной реакции (ПЦР), но без необходимости температурного циклирования. Этот метод включает 50 мМ Трис (рН 7,5), 100 мМ ацетата калия, 14 мМ ацетата магния, 2 мМ DTT, 5% PEG20000 (высокомолекулярный полиэтиленгликоль), 200 мкМ дНТФ, 3 мМ АТФ, 50 мМ фосфокреатина, 100 мкг/мл креатинкиназы, 120 мкг/мл UvsX, 30 мкг/мл UvsY, 900 мкг/мл Gp32, 30 мкг/мл Bsu LF, 450 нМ праймеров и ДНК-матриц. Процесс амплификации начинается со связывания белка рекомбиназы UvsX с праймерами в присутствии 3 мМ АТФ и 5% PEG20000 образуя комплекс рекомбиназа-праймер. Этот комплекс затем облегчает комбинацию праймеров с гомологичными последовательностями на двухцепочечной ДНК.

С помощью UvsY рекомбиназа UvsX облегчает обмен между праймером и матричной цепью, что приводит к смещению одной цепи целевой ДНК. Gp32 помогает поддерживать одноцепочечную структуру ДНК. Наконец, рекомбиназа диссоциирует, и ДНК-полимераза (Bsu LF), способная смещать нити ДНК, связывается с 3′-концом праймера, удлиняя его в присутствии дезоксирибонуклеозидтрифосфатов (dNTP). Этот процесс повторяется циклически, достигая экспоненциального усиления. Все процессы амплификации могут быть завершены в течение 20-40 минут при относительно постоянных температурах от 37 °C до 42 °C. Этот температурный диапазон примерно идентичен физиологическим температурам, что позволяет проводить RPA в минималистичных условиях, что делает RPA универсальным и эффективным инструментом для обнаружения и анализа ДНК.

Сгруппированные регулярно чередующиеся короткие палиндромные повторы (CRISPR) и система CRISPR-ассоциированных белков (CRISPR-Cas) функционируют как адаптивный иммунный механизм у бактерий и архей, охватывая системы класса I и класса II. Класс II включает такие белки, как Cas12 (a, b, f), Cas13 (a, b) и Cas14, которые идентифицируют и расщепляют целевую ДНК или РНК под управлением CRISPR RNA (crRNA)6,7,8. LbaCas12a (или Cpf1) — эндонуклеаза ДНК, управляемая crRNA. КРНК служит направляющей РНК в системе CRISPR-Cas, где она вступает в комплекс с белками Cas. Он использует свою область спейсера для сопряжения с целевой ДНК, эффективно направляя белковый комплекс к целевым последовательностям. Последовательность 5′-UAAUUUCUACUAAGUGUAGAU-3′ служит консервативным повтором crRNA, постоянным элементом всех crRNA LbaCas12a. За этим повтором следует сегмент, специфичный для мишени, который отличается в зависимости от предполагаемой мишени ДНК. Эта последовательность нацеливания имеет длину от 18 до 24 нуклеотидов.

Последовательность PAM (Protospacer-Adjacent Motif) (TTTV, где V может быть A, C или G) расположена на 5′-конце некомплементарной цепи ДНК-мишени. Cas12a разрезает двухцепочечную ДНК-мишень в последовательности PAM. Впоследствии активированные белки Cas осуществляют неспецифическое транс-расщепление одноцепочечной ДНК (одноцепочечной ДНК)9,10,11,12. Таким образом, одноцеклеящая ДНК, меченная флуорофором и гасителем, подвергается расщеплению, в результате чего после коллатерального расщепленияпроисходит излучение флуоресцентного сигнала 8,13. Интенсивность флуоресценции может быть количественно определена с помощью флуоресцентного считывателя для точного обнаружения нуклеиновых кислот14. Примечательно, что Cas12a широко используется для анализа ДНК, при этом его связывание и расщепление целевых последовательностей зависит от распознавания протоспейсер-смежного мотива (PAM), в то время как Cas13a работает независимо от такого требования.

Системы CRISPR-Cas 15,16,17 облегчают расщепление в рамках одной реакции 18,19,20,21. Сочетание этих двух факторов может создать надежный инструмент, известный как A. baumannii-DETECTR (LbaCas12a-Enabled Detection of Targeted A. baumannii) для обнаружения нуклеиновых кислот 22,23,24. Этот протокол демонстрирует использование RPA в сочетании с ДНКазной активностью Cas12a для специфического нацеливания и расщепления последовательности, управляемой crRNA, в гене 16s рДНК A. baumannii, что позволяет чувствительно и точно обнаруживать патоген.

Метод A. baumannii-DETECTR имеет ряд преимуществ по сравнению с традиционными методами обнаружения25,26. Во-первых, изотермические характеристики RPA оптимизируют операционные процедуры и снижают затраты благодаря независимому от термоциклера механизмуусиления5. Во-вторых, эндонуклеаза Cas12a повышает специфичность анализа за счет crRNA-опосредованного нацеливания и спаривания оснований Уотсона-Крика7. Наконец, использование однотрубного метода A. baumannii-DETECTR не только экономит время, но и значительно снижает риск загрязнения ампликонов19.

В протоколе изложены этапы экстракции ДНК, выбора целевых последовательностей ДНК, разработки праймеров и кРНК, конструирования положительных рекомбинантных плазмид, создания системы анализа Cas12a-RPA, оптимизации оптимизации амплификации RPA и визуализации результатов визуализации с помощью инструментов обнаружения флуоресценции, таких как машина для ПЦР в реальном времени. в комплекте с оценкой чувствительности и специфичности.

Метод A. baumannii-DETECTR обещает улучшить результаты лечения пациентов за счет содействия своевременному и эффективному лечению, надежному инфекционному контролю и сдерживанию распространения устойчивости к антибиотикам. Этот протокол может служить всеобъемлющим руководством по внедрению технологии Cas12a-RPA, повышая ее полезность в различных медицинских учреждениях. Тем не менее, важно отметить, что каждый этап должен быть оптимизирован с учетом конкретных лабораторных условий и разнообразия образцов, чтобы обеспечить стабильные и надежные результаты.

Protocol

1. Конструкция A. baumannii-DETECTR

ПРИМЕЧАНИЕ: Создание A. baumannii-DETECTR представляет собой четырехэтапный процесс, включающий в себя разработку праймера и кРНК, конструирование положительной рекомбинантной плазмиды, приготовление реакционных растворов, изотермическую амплификацию ДНК с помощью RPA и визуализацию анализа RPA-CRISPR/Cas12a. Схема анализа DETECTR показана на рисунке 1.

  1. Дизайн праймера и кРНК (см . Дополнительный файл 1)
    1. Спроектируйте 12 пар грунтовок с помощью инструментов проектирования на основе принципов проектирования Primer. Возьмите четыре прямых праймера (F0-F3) и три обратных праймера (R1-R3), чтобы составить двенадцать пар праймеров (F0R1, F0R2, F0R3, F1R1, F1R2, F1R3, F2R1, F2R2, F2R3).
      1. Убедитесь, что 5′-конец праймера содержит С- или Т-основания в пределах первых 3-5 нуклеотидов, а не непрерывный G-растяжение. Кроме того, убедитесь, что последние три нуклеотида на 3′-конце в идеале являются основаниями G и C для усиления амплификации.
      2. Праймеры разработаны без самокомплементарных последовательностей во избежание образования шпилек и с не более чем четырьмя комплементарными или гомологичными основаниями между ними. Избегайте 3′-концевой комплементарности, чтобы избежать димеризации праймера.
    2. Оцените специфичность каждой пары праймеров с помощью инструмента Primer-BLAST Национального центра биотехнологической информации (NCBI) для оценки эффективности и специфичности праймеров.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Primer-BLAST может использовать базу данных NCBI для поиска последовательностей, которые соответствуют разработанным праймерам, помогая пользователям оценить эффективность и специфичность праймеров.
    3. После праймерного скрининга спроектируйте CRISPR РНК (crRNA) или направляющую РНК (gRNA) с использованием последовательности каркаса LbaCas12a crRNA (5′-UAAUUUCUACUAAGUGAU-3′) в качестве фиксированной последовательности. Включите целевой сегмент (5′-GUUAAUACCUAGAGAUAGUG-3′), гарантируя, что мотив PAM расположен на 5′-конце некомплементарной цепи.
      Примечание: Последовательности всех олигонуклеотидов и крРНК представлены в таблице 1.
  2. Положительная рекомбинантная плазмидная конструкция
    1. Амплифицируйте сегмент 16s рДНК с помощью набора праймеров A. baumannii 16s rDNA-F (прямой праймер) и A. baumannii 16s rDNA-R (обратный праймер).
      1. Добавьте 1 мкл 10 мкМ F и 10 мкМ R, 10 мкл 5x FastpFu Buffer, 1 л FastpFu Polymerase, 4 мкл 2,5 мМ dNTPs, 1 мкл 10 нг/л геномной ДНК A. baumannii и 32 мкл воды, не содержащей нуклеазы, в 50 мкл ПЦР-системы.
      2. Установите следующие условия цикличности ПЦР: начальная денатурация при 95 °C в течение 5 мин, затем 33 цикла денатурации при 95 °C в течение 30 с, отжиг при 55 °C в течение 30 с и удлинение при 72 °C в течение 1 мин и 20 с. Наконец, выполните 10 минут при температуре 72°C для окончательного расширения.
    2. Для очистки положительного результата ПЦР используйте набор для очистки ДНК в соответствии с инструкциями производителя. После этого клонируйте очищенную ДНК в вектор pUC57, который был расщеплен ферментами BamHI и SalI.
      Примечание: Этот процесс приведет к созданию положительной рекомбинантной плазмиды, содержащей консервативную область.
    3. Разбавляют положительную рекомбинантную плазмиду последовательно с десятикратным шагом стерилизованной ddH2O до концентрации от 1 копии/мкл до 107 копий/мкл. Разведенную плазмиду хранить при температуре -20 °C для последующих экспериментов.
  3. Приготовление раствора
    1. Приготовьте раствор А следующим образом: для каждой реакции добавьте 29,5 мкл буфера для свободной регидратации праймера, 2,4 мкл 10 мкМ A. baumannii-F и 10 мкМ A. baumannii-R, а также 12,2мкл ddH2O до конечного объема 46,5 мкл. Vortex и кратковременно вращайте. Далее добавьте реакционную смесь в ферментные реакционные пробирки из набора RPA. Пипеткой перемешать.
      Примечание: Праймеры A. baumannii-F и R используются в анализе, нацеленном на ген A. baumannii . Последовательность приведена в таблице 1 .
    2. Приготовьте раствор В следующим образом: для каждой реакции добавьте 0,24 мкл 10 мкМ репортера ссДНК, 2 мкл 10x реакционного буфера Cas12a, 1 мкл 1 мкМ кРНК, 1 мкл 1 мкМ Cas12a и 10,76мкл ddH2O для получения конечного объема 15 мкл.
      Примечание: Зонды (репортер ssDNA) были приобретены и состояли из одноцепочечного репортера ДНК, который был помечен флуорофором 5-карбоксифлуоресцеина (FAM) на 5′-конце и гасителя черных дыр 1 (BHQ1) на 3′-конце. В случае большого количества образцов, требующих обнаружения, приготовьте значительное количество раствора В, а затем разделите образцы на аликвоты.
  4. Изотермическая амплификация ДНК (RPA)
    1. Добавить 1 мкл положительной рекомбинантной плазмиды 107 копий/мкл в раствор А с различными парами праймеров; Тщательно перемешайте. Затем добавьте в раствор 2,5 мкл 280 мМ ацетата магния (MgOAc) и хорошо перемешайте.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Реакции RPA начинаются сразу после добавления MgOAc.
    2. Выдерживать при температуре 39 °C в течение 20 минут. Через 20 минут очистите продукты, усиленные различными праймерами, с помощью RPA с набором для очистки, а затем запустите чистые ампликоны на 1% агарозном геле при напряжении 120 В в течение 10 минут, чтобы выбрать самую яркую и широкую полосу в качестве лучшей пары праймеров.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При малом количестве копий шаблона, через 4 минуты снимите трубку EP, завихрейте и кратковременно вращайте; Затем установите его в нагревательный прибор еще на 16 мин. После амплификации трубки следует открывать с особой осторожностью, чтобы не загрязнить рабочие поверхности ампликонами. Эта мера предосторожности снизит риск получения ложноположительных результатов в последующих экспериментальных процедурах.
  5. Оптимизация системы амплификации ФАР
    ПРИМЕЧАНИЕ: Оптимальная пара праймеров F3R3, выбранная на предыдущем этапе, была настроена на различные конечные концентрации для реакции амплификации RPA с целью отсеивания оптимальной концентрации праймера и времени. NC представляет собой пустой регулятор для соответствующей концентрации праймера.
    1. Поддерживайте концентрации других компонентов постоянными и общим объемом 46,5 мкл в растворе А. Отрегулируйте объем не содержащего РНКазыddH2O соответственно для достижения конечных концентраций праймера 10 мкМ F3 и 10 мкМ R3 при 0,40 мкМ (2,0 мкл), 0,44 мкМ (2,2 мкл), 0,48 мкМ (2,4 мкл) и 0,52 мкМ (2,6 мкл), соответственно.
    2. Инкубировать при температуре 39 °C в разное время: 10 мин, 20 мин, 30 мин.
    3. Очистите продукты RPA с помощью набора для очистки ДНК и проведите электрофорез на 1% агарозном геле при напряжении 120 В в течение 10 минут, чтобы определить оптимальную концентрацию праймера и время инкубации путем анализа характеристик полос.
  6. Визуализация анализа RPA-CRISPR/Cas12a
    1. Добавьте 5 μL продукта RPA в раствор B и тщательно перемешайте до однородности.
    2. Поместите образцы в прибор для флуоресцентной количественной ПЦР, установите канал FAM и считывайте значения каждую минуту в течение 60 минут при 37 °C, 60x в общей сложности 60 минут.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Сигнал зеленой флуоресценции может длиться несколько дней. Чтобы убедиться в эффективности работы системы, лучше провести тест на отсутствие ДНК и РНКазы.

2. Оценка специфичности детектирующей платформы на базе RPA-CRISPR/Cas12a

ПРИМЕЧАНИЕ: Для проверки специфичности препарата A. baumannii-DETECTR нуклеиновые кислоты A. baumannii, Streptococcus pneumoniae, Staphylococcus aureus, Rickettsia mooseri, Enterobacter, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella, Chlamydia psittaci, Legionella, Cockerella burnetii, Serratia и образцы человека были подвергнуты тесту DETECTR.

  1. Используйте матрицы ДНК, полученные от различных видов, с помощью указанного набора ДНК или выделите их путем кипячения бактерий в воде. Убедитесь, что все шаблоны имеют одинаковую концентрацию. Используйте воду в качестве отрицательного контроля.
  2. Добавьте 10 нг или 1 мкл матриц ДНК в раствор А, содержащий праймеры F3R3. Добавьте 2,5 мкл MgOAc, тщательно перемешайте и инкубируйте смесь при температуре 39 °C в течение 20 минут.
  3. Через 20 минут добавьте 5 μL продукта с предыдущего этапа в раствор B и перемешайте.
  4. Поместите в флуоресцентный прибор для количественной ПЦР, установите канал в положение FAM и считывайте значение один раз в минуту при температуре 37 °C, в общей сложности 60 раз в течение 60 минут.

3. Оценка чувствительности детектирующей платформы на базе RPA-CRISPR/Cas12a

  1. В качестве матрицы для реакции используют положительную рекомбинантную плазмиду, полученную в концентрации 1-10-7 копий/мкл. Используйте воду для отрицательного контроля.
  2. Выполните метод, выполнив шаги 2.2-2.4.
    Примечание: Набор праймеров RPA-F3 и RPA-R3 предназначен для амплификации более короткого фрагмента из 174 пар оснований из положительной рекомбинантной плазмиды.

4. Подготовка, когда образец находится под воздействием ультрафиолетового излучения и обнаружения СЛФ

  1. Достаньте необходимое количество тест-полосок и промаркируйте их соответствующим образом.
  2. Перенесите 10 мкл амплифицированных продуктов с этапов 2 и 3 в отдельные ПЦР-пробирки соответственно. Затем добавьте 40 μL ddH2O в каждую пробирку.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При использовании самостоятельно готовящейся реакционной системы рекомендуется изучить оптимальное соотношение разбавления.
  3. Проведите тест.
    1. Подвергните ПЦР-пробирку, содержащую амплифицированные продукты, трансиллюминатору для оценки наличия флуоресценции.
    2. Вставьте тест-полоски в пробирки для ПЦР концом прокладки для образцов вниз.
    3. Дайте постоять при комнатной температуре 5-10 минут, чтобы прочитать результат. По истечении этого времени убедитесь, что уровень жидкости не превышает максимальную отметку, прежде чем двигаться дальше.
    4. Интерпретируйте результаты как отрицательные, если линия T не показывает цвет. Интерпретируйте результаты как положительные, если линия Т видна невооруженным глазом, указывающая на то, что зонд нуклеиновой кислоты был расщеплен ферментом Cas, и фермент Cas был активирован. Считайте результат недействительным, если ни линия C, ни линия T не отображают цвет.

Representative Results

Discussion

Традиционные методы диагностики инфекций A. baumannii имеют различные ограничения, которые делают их менее доступными и пригодными для тестирования в местах оказания медицинской помощи27. Например, ПЦР обладает хорошей чувствительностью и специфичностью, но требует специализированного оборудования для термоциклирования и сложных рабочих процессов, которые должны управляться профессионалами. Представленный здесь новый метод, который сочетает редактирование генома RPA и CRISPR-LbaCas12a с рекомбинированием, известный как анализ A. baumannii-DETECTR, позволяет эффективно манипулировать генетическими данными. Он обеспечивает быстрый, чувствительный и специфичный метод обнаружения инфекций Acinetobacter baumannii , а также для диагностики других бактериальных патогенов. Рабочий процесс показан на рисунке 1.

Наш метод особенно полезен при диагностике и лечении инфекций, что должно способствовать выздоровлению пациентов и смягчению последствий распространения A. baumannii за счет преодоления недостатков существующих методов диагностики. Установлено, что система A. baumannii-DETECTR позволяет идентифицировать A. baumannii с высокой специфичностью и чувствительностью (рис. 5 и рис. 6). Наши результаты показали, что только геном A. baumannii продемонстрировал положительное изменение флуоресценции во время оценки в реальном времени, в то время как геномы всех других видов показали отрицательные результаты (рис. 5).

Для оценки чувствительности детектирующей платформы RPA-CRISPR/Cas12a в качестве мишеней для определения предела обнаружения (LOD) системы использовали рекомбинантные плазмиды pUC57-16s рДНК, положительные на A. baumannii. В анализе RPA-CRISPR/Cas12a на основе флуоресценции обнаружение варьировалось от одной копии на микролитр до10-7 копий на микролитр, при этом заметное увеличение интенсивности флуоресценции наблюдалось в группе 1 копия/мкл по сравнению с отрицательной контрольной группой (рис. 6). Важно отметить, что для диагностики в режиме реального времени результаты обнаружения могут быть визуализированы непосредственно с помощью портативного устройства, независимого от лабораторного оборудования, что имеет важное значение для диагностики в режиме реального времени.

В отношении протокола необходимо учитывать несколько критических факторов26. Во-первых, важно предотвратить перекрестное загрязнение в процессе отбора проб, учитывая высокую чувствительность анализа A. baumannii-DETECTR. Кроме того, реактивные реагенты должны быть защищены от воздействия прямых солнечных лучей. Соблюдение всех процедурных шагов имеет решающее значение для достижения наилучших результатов. Положительный контроль, состоящий из плазмиды, содержащей фрагменты генов, специфичных для A. baumannii, должен быть включен для проверки надлежащей функциональности системы A. baumannii-DETECTR в практическом применении.

Протокол показывает, что параметры могут быть оптимизированы для конкретных лабораторных условий и типов образцов, таких как концентрация праймера, время реакции и другие переменные. В этом эксперименте оптимальная комбинация праймеров, концентрации праймеров и время реакции для амплификации RPA были выбраны для получения максимальной эффективности и специфичности амплификации. Это было определено с помощью электрофореза в агарозном геле (рис. 2 и рис. 3). Кроме того, в качестве контроля использовали положительную рекомбинантную плазмиду, содержащую консервативный участок генома A. baumannii , для обеспечения точности протокола. Стоит отметить, что коммерческие наборы для экстракции бактериальной геномной ДНК обеспечивают стандартизированный и надежный метод экстракции ДНК в этом протоколе. Однако в будущих исследованиях различные типы образцов, такие как клинические образцы или образцы окружающей среды, могут потребовать специфических методов экстракции28 для эффективной изоляции ДНК A. baumannii .

При отсутствии обнаруживаемых флуоресцентных сигналов от положительного контроля вполне вероятно, что в реакционной смеси присутствуют ингибиторы, что требует смены реагентов. И наоборот, если интенсивность флуоресценции недостаточна для четкой дифференцировки, увеличение продолжительности инкубации может быть полезным. Однако длительная инкубация также может привести к ложноположительнымрезультатам26.

Современные методики обнаружения A. baumannii требуют использования дорогостоящего оборудования для ПЦР, стационарных рабочих мест и специализированного персонала. В отличие от этого, предложенный здесь метод способствует точной и чувствительной диагностике A. baumannii в полевых условиях, делая его доступным для более широкой демографической группы.

Характеристики изотермической амплификации и данные, собранные с помощью флуоресценции, делают рабочий процесс A. baumannii-DETCTER простым и нетребовательным к оборудованию, а также позволяют выполнять быстрое обнаружение патогенов в отдаленных районах или во время вспышек. RPA-LFS 29,30,31,32, новый метод амплификации изотермических нуклеиновых кислот, получил значительную популярность в обнаружении вирусных, бактериальных, грибковых и паразитарных патогенов благодаря своей простоте работы и сниженным временным требованиям. В протоколе подробно описывается сигнал флуоресценции образца при обнаружении ультрафиолетового (УФ) света или трансиллюминатора и полосок бокового потока (LFS). Это позволяет избежать зависимости от высокоточных приборов и специализированных техников, так как визуальный осмотр дает результат в короткие сроки (рис. 7), тем самым устраняя необходимость в дорогостоящем и сложном лабораторном оборудовании и операционном персонале. Кроме того, метод с одной пробиркой не только экономит время, но и снижает риск загрязнения ампликоном33.

Будущие исследования должны быть направлены на совершенствование метода, чтобы сделать его пригодным для различных типов образцов и различных условий окружающей среды, например, изучение более эффективных и дешевых методов экстракции ДНК. A. baumannii-DETECTR используется не только для клинической диагностики, но и для оценки окружающей среды, мониторинга и управления вспышками, что позволяет сообществам и больницам быстро идентифицировать A. baumannii. Кроме того, модифицируя кРНК и праймеры, этот молекулярный диагностический подход может быть адаптирован для обнаружения различных респираторных бактериальных инфекций, таких как Streptococcus pneumoniae, золотистый стафилококк и энтеробактер.

Таким образом, A. baumannii-DETECTR может идентифицировать A. baumannii максимально быстро и точно благодаря своей высокой чувствительности и специфичности, удобному дизайну и портативности. Этот метод может улучшить результаты лечения пациентов, способствуя своевременному и эффективному лечению, инфекционному контролю и смягчению распространения устойчивости к антибиотикам, а также борясь с растущей угрозой инфекций A. baumannii .

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Materials

 -20 °C FreezerHaierHYCD-290China
Agarose BasicBioFroxx1110GR100China
All oligonucleotides and crRNA were synthesized by companywww.comatebio.com
Cas12a cutting substrate – ssDNA – fluorescent typeEZassay Biotech. Co. Ltd.DNA-FAM-BHQChina
Cas12a cutting substrate – ssDNA – test paper typeEZassay Biotech. Co. Ltd.DNA-FAM-BIOChina
Electrophoresis apparatusBIO-RADPOWER PAC1000USA
Fluorescence quantitative PCR instrumentBIO-RADCFX ConnectUSA
Gel Imaging SystemBIO-RADGel Doc 2000USA
https://ezassay.com/rna
https://www.ezassay.com/primer  
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast
Lateral flow paper strip (Biotin/FAM)EZassay Biotech. Co. Ltd.HD-FMBOChina
LbaCas12a (Cpf1) enhanced proteinEZassay Biotech. Co. Ltd.CAS-12E-001China
LED TransilluminatorLABGICBL-20China
Magnesium acetate, MgOAcTwistDxTABAS03KITUK
MicrocentrifugeallshengMini-6kChina
PCR strip tubesPCR strip tubesPST-0208-FT-CChina
TGrade Dry Bath IncubatorTiangen biochemical technology OSE-DB-01China
Tianamp Bacteria DNA KitTiangen biochemical technology DP302-02China
TIANamp Bacteria DNA Kit TIANGEN BIOTECH (BEIJING) CO.; LTD.DP302 China 
TransStart FastPfu DNA Polymerase TransGen Biotech. Co. Ltd.AP221 China 
TwistAmp Basic KitTwistDXTABAS03KITUK
Universal DNA Purification KitTiangen biochemical technology DP214-03China
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lenie, D., Alexandr, N., Harald, S. An increasing threat in hospitals: Multidrug-resistant Acinetobacter baumannii. Nat Rev Microbiol. 5 (12), 939-951 (2007).
  2. Li, P., et al. Rapid detection of Acinetobacter baumannii and molecular epidemiology of carbapenem-resistant A. baumannii in two comprehensive hospitals of Beijing, China. Front Microbiol. 6, 997 (2015).
  3. Wu, X., et al. A diagnostic test that uses isothermal amplification and lateral flow detection sdaA can detect tuberculosis in 60 min. J Appl Microbiol. 130 (6), 2102-2110 (2020).
  4. Huang, B., et al. A cas12a-based fluorescent microfluidic system for rapid on-site human papillomavirus diagnostics. Appl Microbiol Biotechnol. 107 (20), 6287-6297 (2023).
  5. Piepenburg, O., Williams, C. H., Stemple, D. L., Armes, N. A. DNA detection using recombination proteins. Plos Biology. 4 (7), 1115-1121 (2006).
  6. Abudayyeh, O. O., et al. C2c2 is a single-component programmable RNA-guided RNA-targeting CRISPR effector. Science. 353 (6299), aaf5573 (2016).
  7. Chen, J. S., et al. CRISPR-Cas12a target binding unleashes indiscriminate single-stranded DNase activity. Science. 360 (6387), eaar6245 (2018).
  8. Xiong, D., et al. Rapid detection of SARS-CoV-2 with CRISPR-Cas12a. PLoS Biol. 18 (12), e3000978 (2020).
  9. Gootenberg, J. S., et al. Nucleic acid detection with crispr-Cas13a/C2C2. Science. 356 (6336), 438-442 (2017).
  10. Harrington, L. B., et al. Programmed DNA destruction by miniature CRISPR-Cas14 enzymes. Science. 362 (6416), 839-842 (2018).
  11. Li, S. Y., et al. CRISPR-Cas12a has both cis- and trans-cleavage activities on single-stranded DNA. Cell Res. 28 (4), 491-493 (2018).
  12. Wang, B., et al. Cas12aVDet: A CRISPR/Cas12a-based platform for rapid and visual nucleic acid detection. Anal Chem. 91 (19), 12156-12161 (2019).
  13. Huang, Z., et al. Ultra-sensitive and high-throughput crispr-p owered COVID-19 diagnosis. Biosens Bioelectron. 164, 112316 (2020).
  14. Zhang, W. S., et al. Reverse transcription recombinase polymerase amplification coupled with CRISPR-Cas12a for facile and highly sensitive colorimetric SARS-CoV-2 detection. Anal Chem. 93 (8), 4126-4133 (2021).
  15. Marraffini Luciano, A. CRISPR-Cas immunity in prokaryotes. Nature. 526 (7571), 55-61 (2015).
  16. Mohanraju, P., et al. Diverse evolutionary roots and mechanistic variations of the CRISPR-Cas systems. Science. 353 (6299), aad5147 (2016).
  17. Makarova, K. S., et al. An updated evolutionary classification of CRISPR-Cas systems. Nat Rev Microbiol. 13 (11), 722-736 (2015).
  18. Li, S. Y., et al. CRISPR-Cas12a-assisted nucleic acid detection. Cell Discovery. 4 (1), 20 (2018).
  19. Li, L., Li, S., Wu, N., Wu, J., Wang, J. Holmesv2: A CRISPR-Cas12b-assisted platform for nucleic acid detection and DNA methylation quantitation. ACS Synth Biol. 8 (10), 2228-2237 (2019).
  20. Liang, M., Li, Z., Wang, W., Liu, J., Zhang, L. X. A CRISPR-Cas12a-derived biosensing platform for the highly sensitive detection of diverse small molecules. Nat Communications. 10 (1), 3672 (2019).
  21. Aquino-Jarquin, G. CRISPR-Cas14 is now part of the artillery for gene editing and molecular diagnostic. Nanomedicine. 18, 428-431 (2019).
  22. Zetsche, B., et al. Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRISPR-Cas system. Cell. 163 (3), 759-771 (2015).
  23. Fonfara, I., Richter, H., Bratovic, M., Le Rhun, A., Charpentier, E. The CRISPR-associated DNA-cleaving enzyme Cpf1 also processes precursor CRISPR RNA. Nature. 532 (7600), 517-521 (2016).
  24. Swarts, D. C., John, V. D. O., Jinek, M. Structural basis for guide RNA processing and seed-dependent DNA targeting by CRISPR-Cas12a. Mol Cell. 66 (2), 221-233 (2017).
  25. Jiang, Y., et al. CRISPR-Cpf1 assisted genome editing of Corynebacterium glutamicum. Nat Commun. 8, 15179 (2017).
  26. Yan, M. Y., et al. CRISPR-Cas12a-assisted recombineering in bacteria. Appl Environ Microbiol. 83 (17), e00947-e01017 (2017).
  27. Ashraf, A., et al. A novel multiplex pcr assay for simultaneous detection of nine clinically significant bacterial pathogens associated with bovine mastitis. Mol Cell Probes. 33, 57-64 (2017).
  28. Zhu, L., et al. A rapid on-site visualization platform based on RPA coupled with CRISPR-Cas12a for the detection of genetically modified papaya ‘huanong no.1’. Talanta. 277, 126437 (2024).
  29. Zheng, C., et al. Rapid developments in lateral flow immunoassay for nucleic acid detection. Analyst. 146 (5), 1514-1528 (2021).
  30. Wang, Y., et al. Establishment and clinical application of a RPA-LFS assay for detection of capsulated and non-capsulated Haemophilus influenzae. Front Cell Infect Microbiol. 12, 878813 (2022).
  31. Wang, F., et al. Rapid and sensitive recombinase polymerase amplification combined with lateral flow strips for detecting Candida albicans. Anal Biochem. 633, 114428 (2021).
  32. Ma, B., et al. A simple and efficient method for potential point-of-care diagnosis of human papillomavirus genotypes: Combination of isothermal recombinase polymerase amplification with lateral flow dipstick and reverse dot blot. Anal Bioanal Chem. 411 (28), 7451-7460 (2019).
  33. Sun, Y., Yu, L., Liu, C., Ye, S., Huang, W. One-tube SARS-CoV-2 detection platform based on RT-RPA and CRISPR/Cas12a. J Transl Med. 19 (1), 74 (2021).

Tags

Immunology and Infection
Rapid and Specific Detection of Acinetobacter baumannii Infections Using a Recombinase Polymerase Amplification/Cas12a-based System

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Zhang, X., Duan, M., Zhao, Y., Zhang, K., Liu, F., Jie, J., Li, C., Chen, D., Li, D., Hua, S., Wang, C., Guan, Q., Wu, J., Liu, B., Song, L. Rapid and Specific Detection of Acinetobacter baumannii Infections Using a Recombinase Polymerase Amplification/Cas12a-based System. J. Vis. Exp. (218), e67542, doi:10.3791/67542 (2025).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image