Чтобы облегчить быстрое и точное обнаружение Acinetobacter baumannii, мы представляем протокол, в котором используется амплификация рекомбиназной полимеразы (RPA) в сочетании с эндонуклеазой LbaCas12a для идентификации инфекций A. baumannii .
Acinetobacter baumannii, грамотрицательная бактерия, печально известна тем, что вызывает тяжелые инфекции с высоким уровнем смертности. Быстрое и точное обнаружение A. baumannii имеет решающее значение для быстрого лечения, эффективного инфекционного контроля и сдерживания устойчивости к антибиотикам. Тем не менее, не существует подходящего метода для быстрого и легкого обнаружения A. baumannii на месте. Система CRISPR Trans Reporter (DETECTR) предлагает быстрый, точный и чувствительный подход к обнаружению A. baumannii за счет интеграции возможностей распознавания Cas12a для специфичной мишени с эффективностью изотермической амплификации рекомбиназной полимеразной амплификации (RPA). В этом протоколе подробно описывается обнаружение A. baumannii с помощью RPA в сочетании с эндонуклеазой LbaCas12a. В этой статье описаны следующие этапы: экстракция ДНК, выбор конкретной последовательности ДНК, дизайн праймера и CRISPR РНК (crRNA), построение положительной рекомбинантной плазмиды, настройка анализа Cas12a-RPA, оптимизация системы амплификации RPA, визуализация анализа RPA-CRISPR/Cas12a с помощью инструмента обнаружения флуоресценции, такого как инструмент для ПЦР в реальном времени, и оценка чувствительности и специфичности.
В клинической микробиологии выявление инфекций, вызванных Acinetobacter baumannii, представляет собой серьезную проблему. Эта грамотрицательная бактерия может вызывать инфекции с тяжелыми клиническими симптомами, даже с высоким уровнем смертности, особенно среди пациентов с ослабленным иммунитетом1. Традиционные методы обнаружения патогенных инфекций на основе культуры требуют много времени и могут быть нечувствительными, что может привести к задержке лечения антибиотиками и ухудшить результаты лечения пациентов. Быстрая и точная идентификация A. baumannii имеет решающее значение для эффективного лечения и борьбы со вспышкой. Для удовлетворения этой потребности были изучены молекулярные методы, использующие амплификацию нуклеиновых кислот. Тем не менее, эти подходы часто требуют сложного оборудования для термоциклирования и могут быть ограничены хорошо обученными техниками и хорошо отлаженными лабораториями. Для преодоления этих проблем исследования все больше концентрируются на разработке методов изотермической амплификации 2,3,4.
Амплификация рекомбиназной полимеразы (RPA) — это метод, разработанный Piepenburg et al 5 и используемый для амплификации ДНК, аналогичный полимеразной цепной реакции (ПЦР), но без необходимости температурного циклирования. Этот метод включает 50 мМ Трис (рН 7,5), 100 мМ ацетата калия, 14 мМ ацетата магния, 2 мМ DTT, 5% PEG20000 (высокомолекулярный полиэтиленгликоль), 200 мкМ дНТФ, 3 мМ АТФ, 50 мМ фосфокреатина, 100 мкг/мл креатинкиназы, 120 мкг/мл UvsX, 30 мкг/мл UvsY, 900 мкг/мл Gp32, 30 мкг/мл Bsu LF, 450 нМ праймеров и ДНК-матриц. Процесс амплификации начинается со связывания белка рекомбиназы UvsX с праймерами в присутствии 3 мМ АТФ и 5% PEG20000 образуя комплекс рекомбиназа-праймер. Этот комплекс затем облегчает комбинацию праймеров с гомологичными последовательностями на двухцепочечной ДНК.
С помощью UvsY рекомбиназа UvsX облегчает обмен между праймером и матричной цепью, что приводит к смещению одной цепи целевой ДНК. Gp32 помогает поддерживать одноцепочечную структуру ДНК. Наконец, рекомбиназа диссоциирует, и ДНК-полимераза (Bsu LF), способная смещать нити ДНК, связывается с 3′-концом праймера, удлиняя его в присутствии дезоксирибонуклеозидтрифосфатов (dNTP). Этот процесс повторяется циклически, достигая экспоненциального усиления. Все процессы амплификации могут быть завершены в течение 20-40 минут при относительно постоянных температурах от 37 °C до 42 °C. Этот температурный диапазон примерно идентичен физиологическим температурам, что позволяет проводить RPA в минималистичных условиях, что делает RPA универсальным и эффективным инструментом для обнаружения и анализа ДНК.
Сгруппированные регулярно чередующиеся короткие палиндромные повторы (CRISPR) и система CRISPR-ассоциированных белков (CRISPR-Cas) функционируют как адаптивный иммунный механизм у бактерий и архей, охватывая системы класса I и класса II. Класс II включает такие белки, как Cas12 (a, b, f), Cas13 (a, b) и Cas14, которые идентифицируют и расщепляют целевую ДНК или РНК под управлением CRISPR RNA (crRNA)6,7,8. LbaCas12a (или Cpf1) — эндонуклеаза ДНК, управляемая crRNA. КРНК служит направляющей РНК в системе CRISPR-Cas, где она вступает в комплекс с белками Cas. Он использует свою область спейсера для сопряжения с целевой ДНК, эффективно направляя белковый комплекс к целевым последовательностям. Последовательность 5′-UAAUUUCUACUAAGUGUAGAU-3′ служит консервативным повтором crRNA, постоянным элементом всех crRNA LbaCas12a. За этим повтором следует сегмент, специфичный для мишени, который отличается в зависимости от предполагаемой мишени ДНК. Эта последовательность нацеливания имеет длину от 18 до 24 нуклеотидов.
Последовательность PAM (Protospacer-Adjacent Motif) (TTTV, где V может быть A, C или G) расположена на 5′-конце некомплементарной цепи ДНК-мишени. Cas12a разрезает двухцепочечную ДНК-мишень в последовательности PAM. Впоследствии активированные белки Cas осуществляют неспецифическое транс-расщепление одноцепочечной ДНК (одноцепочечной ДНК)9,10,11,12. Таким образом, одноцеклеящая ДНК, меченная флуорофором и гасителем, подвергается расщеплению, в результате чего после коллатерального расщепленияпроисходит излучение флуоресцентного сигнала 8,13. Интенсивность флуоресценции может быть количественно определена с помощью флуоресцентного считывателя для точного обнаружения нуклеиновых кислот14. Примечательно, что Cas12a широко используется для анализа ДНК, при этом его связывание и расщепление целевых последовательностей зависит от распознавания протоспейсер-смежного мотива (PAM), в то время как Cas13a работает независимо от такого требования.
Системы CRISPR-Cas 15,16,17 облегчают расщепление в рамках одной реакции 18,19,20,21. Сочетание этих двух факторов может создать надежный инструмент, известный как A. baumannii-DETECTR (LbaCas12a-Enabled Detection of Targeted A. baumannii) для обнаружения нуклеиновых кислот 22,23,24. Этот протокол демонстрирует использование RPA в сочетании с ДНКазной активностью Cas12a для специфического нацеливания и расщепления последовательности, управляемой crRNA, в гене 16s рДНК A. baumannii, что позволяет чувствительно и точно обнаруживать патоген.
Метод A. baumannii-DETECTR имеет ряд преимуществ по сравнению с традиционными методами обнаружения25,26. Во-первых, изотермические характеристики RPA оптимизируют операционные процедуры и снижают затраты благодаря независимому от термоциклера механизмуусиления5. Во-вторых, эндонуклеаза Cas12a повышает специфичность анализа за счет crRNA-опосредованного нацеливания и спаривания оснований Уотсона-Крика7. Наконец, использование однотрубного метода A. baumannii-DETECTR не только экономит время, но и значительно снижает риск загрязнения ампликонов19.
В протоколе изложены этапы экстракции ДНК, выбора целевых последовательностей ДНК, разработки праймеров и кРНК, конструирования положительных рекомбинантных плазмид, создания системы анализа Cas12a-RPA, оптимизации оптимизации амплификации RPA и визуализации результатов визуализации с помощью инструментов обнаружения флуоресценции, таких как машина для ПЦР в реальном времени. в комплекте с оценкой чувствительности и специфичности.
Метод A. baumannii-DETECTR обещает улучшить результаты лечения пациентов за счет содействия своевременному и эффективному лечению, надежному инфекционному контролю и сдерживанию распространения устойчивости к антибиотикам. Этот протокол может служить всеобъемлющим руководством по внедрению технологии Cas12a-RPA, повышая ее полезность в различных медицинских учреждениях. Тем не менее, важно отметить, что каждый этап должен быть оптимизирован с учетом конкретных лабораторных условий и разнообразия образцов, чтобы обеспечить стабильные и надежные результаты.
1. Конструкция A. baumannii-DETECTR
ПРИМЕЧАНИЕ: Создание A. baumannii-DETECTR представляет собой четырехэтапный процесс, включающий в себя разработку праймера и кРНК, конструирование положительной рекомбинантной плазмиды, приготовление реакционных растворов, изотермическую амплификацию ДНК с помощью RPA и визуализацию анализа RPA-CRISPR/Cas12a. Схема анализа DETECTR показана на рисунке 1.
2. Оценка специфичности детектирующей платформы на базе RPA-CRISPR/Cas12a
ПРИМЕЧАНИЕ: Для проверки специфичности препарата A. baumannii-DETECTR нуклеиновые кислоты A. baumannii, Streptococcus pneumoniae, Staphylococcus aureus, Rickettsia mooseri, Enterobacter, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella, Chlamydia psittaci, Legionella, Cockerella burnetii, Serratia и образцы человека были подвергнуты тесту DETECTR.
3. Оценка чувствительности детектирующей платформы на базе RPA-CRISPR/Cas12a
4. Подготовка, когда образец находится под воздействием ультрафиолетового излучения и обнаружения СЛФ
Традиционные методы диагностики инфекций A. baumannii имеют различные ограничения, которые делают их менее доступными и пригодными для тестирования в местах оказания медицинской помощи27. Например, ПЦР обладает хорошей чувствительностью и специфичностью, но требует специализированного оборудования для термоциклирования и сложных рабочих процессов, которые должны управляться профессионалами. Представленный здесь новый метод, который сочетает редактирование генома RPA и CRISPR-LbaCas12a с рекомбинированием, известный как анализ A. baumannii-DETECTR, позволяет эффективно манипулировать генетическими данными. Он обеспечивает быстрый, чувствительный и специфичный метод обнаружения инфекций Acinetobacter baumannii , а также для диагностики других бактериальных патогенов. Рабочий процесс показан на рисунке 1.
Наш метод особенно полезен при диагностике и лечении инфекций, что должно способствовать выздоровлению пациентов и смягчению последствий распространения A. baumannii за счет преодоления недостатков существующих методов диагностики. Установлено, что система A. baumannii-DETECTR позволяет идентифицировать A. baumannii с высокой специфичностью и чувствительностью (рис. 5 и рис. 6). Наши результаты показали, что только геном A. baumannii продемонстрировал положительное изменение флуоресценции во время оценки в реальном времени, в то время как геномы всех других видов показали отрицательные результаты (рис. 5).
Для оценки чувствительности детектирующей платформы RPA-CRISPR/Cas12a в качестве мишеней для определения предела обнаружения (LOD) системы использовали рекомбинантные плазмиды pUC57-16s рДНК, положительные на A. baumannii. В анализе RPA-CRISPR/Cas12a на основе флуоресценции обнаружение варьировалось от одной копии на микролитр до10-7 копий на микролитр, при этом заметное увеличение интенсивности флуоресценции наблюдалось в группе 1 копия/мкл по сравнению с отрицательной контрольной группой (рис. 6). Важно отметить, что для диагностики в режиме реального времени результаты обнаружения могут быть визуализированы непосредственно с помощью портативного устройства, независимого от лабораторного оборудования, что имеет важное значение для диагностики в режиме реального времени.
В отношении протокола необходимо учитывать несколько критических факторов26. Во-первых, важно предотвратить перекрестное загрязнение в процессе отбора проб, учитывая высокую чувствительность анализа A. baumannii-DETECTR. Кроме того, реактивные реагенты должны быть защищены от воздействия прямых солнечных лучей. Соблюдение всех процедурных шагов имеет решающее значение для достижения наилучших результатов. Положительный контроль, состоящий из плазмиды, содержащей фрагменты генов, специфичных для A. baumannii, должен быть включен для проверки надлежащей функциональности системы A. baumannii-DETECTR в практическом применении.
Протокол показывает, что параметры могут быть оптимизированы для конкретных лабораторных условий и типов образцов, таких как концентрация праймера, время реакции и другие переменные. В этом эксперименте оптимальная комбинация праймеров, концентрации праймеров и время реакции для амплификации RPA были выбраны для получения максимальной эффективности и специфичности амплификации. Это было определено с помощью электрофореза в агарозном геле (рис. 2 и рис. 3). Кроме того, в качестве контроля использовали положительную рекомбинантную плазмиду, содержащую консервативный участок генома A. baumannii , для обеспечения точности протокола. Стоит отметить, что коммерческие наборы для экстракции бактериальной геномной ДНК обеспечивают стандартизированный и надежный метод экстракции ДНК в этом протоколе. Однако в будущих исследованиях различные типы образцов, такие как клинические образцы или образцы окружающей среды, могут потребовать специфических методов экстракции28 для эффективной изоляции ДНК A. baumannii .
При отсутствии обнаруживаемых флуоресцентных сигналов от положительного контроля вполне вероятно, что в реакционной смеси присутствуют ингибиторы, что требует смены реагентов. И наоборот, если интенсивность флуоресценции недостаточна для четкой дифференцировки, увеличение продолжительности инкубации может быть полезным. Однако длительная инкубация также может привести к ложноположительнымрезультатам26.
Современные методики обнаружения A. baumannii требуют использования дорогостоящего оборудования для ПЦР, стационарных рабочих мест и специализированного персонала. В отличие от этого, предложенный здесь метод способствует точной и чувствительной диагностике A. baumannii в полевых условиях, делая его доступным для более широкой демографической группы.
Характеристики изотермической амплификации и данные, собранные с помощью флуоресценции, делают рабочий процесс A. baumannii-DETCTER простым и нетребовательным к оборудованию, а также позволяют выполнять быстрое обнаружение патогенов в отдаленных районах или во время вспышек. RPA-LFS 29,30,31,32, новый метод амплификации изотермических нуклеиновых кислот, получил значительную популярность в обнаружении вирусных, бактериальных, грибковых и паразитарных патогенов благодаря своей простоте работы и сниженным временным требованиям. В протоколе подробно описывается сигнал флуоресценции образца при обнаружении ультрафиолетового (УФ) света или трансиллюминатора и полосок бокового потока (LFS). Это позволяет избежать зависимости от высокоточных приборов и специализированных техников, так как визуальный осмотр дает результат в короткие сроки (рис. 7), тем самым устраняя необходимость в дорогостоящем и сложном лабораторном оборудовании и операционном персонале. Кроме того, метод с одной пробиркой не только экономит время, но и снижает риск загрязнения ампликоном33.
Будущие исследования должны быть направлены на совершенствование метода, чтобы сделать его пригодным для различных типов образцов и различных условий окружающей среды, например, изучение более эффективных и дешевых методов экстракции ДНК. A. baumannii-DETECTR используется не только для клинической диагностики, но и для оценки окружающей среды, мониторинга и управления вспышками, что позволяет сообществам и больницам быстро идентифицировать A. baumannii. Кроме того, модифицируя кРНК и праймеры, этот молекулярный диагностический подход может быть адаптирован для обнаружения различных респираторных бактериальных инфекций, таких как Streptococcus pneumoniae, золотистый стафилококк и энтеробактер.
Таким образом, A. baumannii-DETECTR может идентифицировать A. baumannii максимально быстро и точно благодаря своей высокой чувствительности и специфичности, удобному дизайну и портативности. Этот метод может улучшить результаты лечения пациентов, способствуя своевременному и эффективному лечению, инфекционному контролю и смягчению распространения устойчивости к антибиотикам, а также борясь с растущей угрозой инфекций A. baumannii .
The authors have nothing to disclose.
-20 °C Freezer | Haier | HYCD-290 | China |
Agarose Basic | BioFroxx | 1110GR100 | China |
All oligonucleotides and crRNA were synthesized by company | www.comatebio.com | ||
Cas12a cutting substrate – ssDNA – fluorescent type | EZassay Biotech. Co. Ltd. | DNA-FAM-BHQ | China |
Cas12a cutting substrate – ssDNA – test paper type | EZassay Biotech. Co. Ltd. | DNA-FAM-BIO | China |
Electrophoresis apparatus | BIO-RAD | POWER PAC1000 | USA |
Fluorescence quantitative PCR instrument | BIO-RAD | CFX Connect | USA |
Gel Imaging System | BIO-RAD | Gel Doc 2000 | USA |
https://ezassay.com/rna | |||
https://www.ezassay.com/primer | |||
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast | |||
Lateral flow paper strip (Biotin/FAM) | EZassay Biotech. Co. Ltd. | HD-FMBO | China |
LbaCas12a (Cpf1) enhanced protein | EZassay Biotech. Co. Ltd. | CAS-12E-001 | China |
LED Transilluminator | LABGIC | BL-20 | China |
Magnesium acetate, MgOAc | TwistDx | TABAS03KIT | UK |
Microcentrifuge | allsheng | Mini-6k | China |
PCR strip tubes | PCR strip tubes | PST-0208-FT-C | China |
TGrade Dry Bath Incubator | Tiangen biochemical technology | OSE-DB-01 | China |
Tianamp Bacteria DNA Kit | Tiangen biochemical technology | DP302-02 | China |
TIANamp Bacteria DNA Kit | TIANGEN BIOTECH (BEIJING) CO.; LTD. | DP302 | China |
TransStart FastPfu DNA Polymerase | TransGen Biotech. Co. Ltd. | AP221 | China |
TwistAmp Basic Kit | TwistDX | TABAS03KIT | UK |
Universal DNA Purification Kit | Tiangen biochemical technology | DP214-03 | China |