Методическая статья

Флуоресцентное мечение для визуализации низкоэкспрессированных белков у рыбок данио

1.5K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/67616

⸱

24 января 2025 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1State Key Laboratory of Cellular Stress Biology, School of Life Sciences, Faculty of Medicine and Life Sciences, Xiamen University, 2Technology Center, Shanxi Xinghuacun Fenjiu Distillery Co., Ltd., 3Research Unit of Cellular Stress of CAMS, Cancer Research Center of Xiamen University, Xiang'an Hospital of Xiamen University, School of Medicine, Xiamen University, 4Laboratory Animal Center, Xiamen University

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Здесь мы представляем протокол маркировки белков флуоресцентной белковой меткой у личинок данио-рерио, недавно разработанную и модифицированную систему in vivo , особенно полезную для визуализации белков с низким содержанием у рыбок данио.

Аннотация

Технология CRISPR/Cas9-опосредованная (KI) позволяет упростить мечение флуоресцентными белками у рыбок данио (Danio rerio), предпочтительных модельных организмов для визуализации in vivo благодаря его прозрачности на ранней стадии развития. Здесь мы предоставляем подробный протокол для проведения высокоэффективного флуоресцентного гена KI, быстрого скрининга на основателей KI и отслеживания белка с низким содержанием у личинок данио-рерио, что заложит важную основу для последующих физиопатологических исследований на рыбках данио. Текущий протокол включает в себя полные этапы дизайна sgRNA для интересующего гена, транскрипцию sgRNA in vitro , транскрипцию мРНК Cas9 in vitro , скрининг sgRNA in vivo для гена с наибольшей эффективностью, дизайн и конструирование донорских плазмид, микроинъекцию личинкам данио-рерио, скрининг основателя KI и визуализацию в реальном времени на рыбках данио. В него включены и обсуждены критические шаги, советы по устранению неполадок, методы контроля качества, а также преимущества и применение этого протокола. Этот протокол обеспечивает быстрые и точные результаты при низких затратах и был проверен многочисленными испытаниями.

Введение

Как общепризнанный модельный организм, данио рерио (Danio rerio) широко используется в научных исследованиях по развитию, регенерации, онкогенезу, инфекции и иммунитету и т.д. 1,2,3,4,5. Рыбки данио особенно подходят для визуализации in vivo в реальном времени при обработке PTU (1-фенил2-тиомочевина), токсичным химическим соединением, которое ингибирует меланогенез и делает личинки данио-рерио прозрачными в течение относительно длительного периода времени6. Также доступны генетически модифицированные прозрачные сорта данио-рерио, такие как каспер7 и кристалл8, что позволяет визуализировать их в реальном времени и прослеживать родословную до взрослого возраста. Помимо этих усилий по преодолению пигментации для лучшей визуализации в реальном времени у взрослых рыб, наши исследования также сосредоточены на разработке мощных стратегий редактирования генов, чтобы сделать мечение флуоресцентными белками более эффективным и менее искусственным.

Технология KI, основанная на CRISPR/Cas9-опосредованной микрогомологии и опосредованном MMEJ, в настоящее время широко применяется в генетических модификациях различных организмов, включая рыбок данио, благодаря своей относительно высокой эффективности KI 9,10,11,12. Для достижения успешной визуализации in vivo необходимо решить две задачи. Одним из них являются инделы или рубцы, образующиеся в процессе рекомбинации; Другая причина заключается в том, что некоторые гены-мишени эндогенно экспрессируются на низком уровне, что приводит к слабым сигналам ко-экспрессируемой флуоресцентной метки и сбою детектирования in vivo. В недавней работе, направленной на эффективное и точное мечение белков и минимизацию интерференции эндогенных уровней экспрессии генов, сообщается об оптимизированной стратегии, сочетающей метод мечения «VH», усиливающий флуоресцентный сигнал, и усовершенствованный рабочий процесс скрининга зародышевой линии, который больше подходит для флуоресцентного мечения генов с низкой экспрессией и более эффективен, чем предыдущие методы, за счет оптимизации донорской основы и сочетания полимеразной цепной реакции (ПЦР) и флуоресцентных проверок Внедрить экран зародышевой линии с наименьшими затратами времени и сил. Здесь мы представляем подробный пошаговый протокол для описанного метода, включающий этапы подготовки эмбрионов и разведения рыбок данио, дизайн sgRNA, транскрипцию sgRNA in vitro, транскрипцию мРНК Cas9 in vitro, микроинъекцию эмбрионов данио-рерио, скрининг in vivo на sgРНК с высочайшей эффективностью, дизайн и конструирование донорских плазмид, генотипирование KI данио-рерио, скрининг зародышевой линии KI, а также визуализацию и фенотипирование KI данио-рерио. Этот протокол «все в одном», обеспечивающий современный метод флуоресцентного мечения, несомненно, будет способствовать исследованиям с использованием рыбок данио в различных научных областях и принесет пользу читателям из разных академических кругов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все разведение и эксперименты с рыбками данио были рассмотрены и одобрены Комитетом по управлению лабораторными животными и этике Сямыньского университета и проводились в строгом соответствии с надлежащей практикой животных, определенной Центром лабораторных животных Сямыньского университета. Исследование соответствовало всем соответствующим этическим нормам в отношении использования животных.

ПРИМЕЧАНИЕ: Все взрослые особи и личинки данио-рерио содержались в соответствии со стандартными протоколами при температуре 28,5 °C с циклом свет/темнота 13/11 часов в аквариумной системе данио-рерио Сямыньского университета. Эмбрионы содержались в буфере для эмбрионов (Таблица 1) в контролируемом инкубаторе (температура 28 ± 0,5 °C; светлый цикл 13 ч свет/11 ч темное время). Кормление и общий мониторинг всех рыбок данио проводились два раза в день (9 утра и 4 вечера). Штаммом дикого типа (WT), использованным в этом исследовании, был Tübingen (Tü).

1. Выбор интересующих генов и проектирование направляющей РНК

  1. Знайте информацию об интересующем вас гене. Выполните поиск в базе данных (https://zfin.org/) и убедитесь, что количество вариантов генов известно. Решите, с каким вариантом следует манипулировать, и загрузите информацию о целевых генах из Ensembl (https://www.ensembl.org/), включая последовательность генома, последовательность кДНК и кодирующую последовательность (CDS). Маркируйте экзоны, интроны, UTR, стартовые кодоны и стоп-кодоны в последовательностях.
  2. Выберите не более 200.о. CDS выше стоп-кодона (TAA, TAG или TGA) гена-мишени в качестве целевой области sgRNA.
    Примечание: Лучше убедиться, что в этой области нет однонуклеотидных полиморфизмов (SNP) с помощью секвенирования ДНК.
  3. Используйте веб-сайт CRISPRscan (https://www.crisprscan.org/) для разработки потенциальных sgРНК в выбранном целевом регионе и прогнозирования эффективности sgRNA.
    1. Введите последовательность ДНК в рамку проекта.
    2. Выберите соответствующую информацию, включая вид, максимальное несоответствие в нецелевых показателях, эндонуклеазу и промотор. В этом случае выбирайте данио-рерио - Danio rerio, No mismatch, Cas9-NGG и in vitro T7 promoter.
    3. Нажмите «Получить sgRNAs», чтобы получить некоторые sgРНК. Выберите 5-7 sgРНК с высоким показателем CRISPRscan и низким показателем off-target для скрининга in vivo.
  4. Разработайте праймеры для ПЦР, фланкирующие сайты-мишени sgRNA, продукт которых составляет около 500.о., для последующей амплификации ПЦР, теста ферментативного расщепления и секвенирования для проверки эффективности нокаута после микроинъекции sgRNA/Cas9. Выберите последовательность примерно 20.о. в регионах вверх и вниз по течению и убедитесь, что содержание GC в ней составляет около 50%, а значение Tm находится в диапазоне 50-55°C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Разработайте две грунтовки на входе и две на выходе, если есть необходимость в комбинировании.

2. Получение sgРНК

ПРИМЕЧАНИЕ: Общая последовательность каркаса sgRNA (Рисунок 1) была клонирована в плазмиду (Таблица материалов).

  1. ПЦР амплифицируют последовательность конъюгата промотор-sgРНК Т7 с использованием праймеров и смеси ПЦР, показанных в Таблице 2 и Таблице 3 соответственно. Запустите программу ПЦР, приведенную в таблице 4. Запустить гель-электрофорез (Агарозный гель, 1,2% агарозы в буфере ТАЕ; буфер TAE [Таблица 1]; 200 В; около 5 мин) с 2 мкл продуктов ПЦР, чтобы убедиться в правильности продуктов (MW составляет около 150.о.).
  2. Очистите продукты ПЦР с помощью набора для очистки (Table of Materials) или других имеющихся в продаже наборов, следуя инструкциям производителя.
    Примечание: С этого момента следует использовать реагенты и материалы, не содержащие РНКазы, а процедуры следует проводить с особой осторожностью, чтобы избежать контаминации РНКазы (см. Обсуждение).
    1. Добавьте буфер для связывания в продукты ПЦР в соотношении объема 5:1 и перемешайте. Нанесите смесь на колонку, помещенную в сборную пробирку объемом 2 мл. Центрифугируйте при 17 900 × г в течение 1 минуты при 25 °C. Выбросьте проточный поток и поместите колонну обратно в ту же сборную трубу.
    2. Добавьте 750 мкл промывочного буфера в колонку и центрифугируйте при 17 900 × г в течение 1 мин при 25 °C. Выбросьте проточный поток и поместите колонну обратно в ту же сборную трубу. Центрифугируйте при 17 900 × г в течение 2 мин при 25 °C. Поместите колонку в чистую пробирку объемом 1,5 мл.
    3. Добавьте в колонку 20 мкл воды, не содержащей нуклеаз, центрифугируйте при 17 900 × г в течение 2 мин при 25 °C, чтобы элюировать ДНК и измерьте концентрацию с помощью спектрофотометра.
  3. Используйте систему производства РНК Т7 из Таблицы материалов или эквивалентные наборы для транскрибирования in vitro 250 нг очищенной ДНК. Требуются операции и условия, не содержащие РНКазы.
    1. Приготовьте реакцию в пробирках для ПЦР (без РНКазы) в соответствии с таблицей 3 и аккуратно перемешайте. Выдерживать при температуре 37 °C в металлической ванне в течение 2 ч.
    2. Добавьте 0,5 мкл ДНКазы I (без РНКазы) и аккуратно перемешайте. Выдерживать при температуре 37 °C в металлической ванне в течение 15-20 минут.
    3. Осаждение этанола
      1. Добавляйте воду, не содержащую РНКазы, в каждую реакцию, чтобы конечный объем достиг 20 мкл, и переносите образцы в пробирки объемом 1,5 мл.
      2. Добавьте 50 μл 100% этанола (2,5 В, без РНКазы), хорошо перемешайте, положите смесь на лед на 10 минут и центрифугируйте при 21 000 × г в течение 15 минут при 4 °C.
      3. Выбросьте надосадочную жидкость, промойте гранулу 500 мкл 75% этанола (без РНКазы) и центрифугируйте при 21 000 × г в течение 5 минут при 4 °C.
      4. Выбросьте надосадочную жидкость, высушите гранулу при температуре 45 °C в металлической ванне и растворите в 40 мкл воды, не содержащей РНКазы.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Для KI sgРНК необходимо осаждать LiCl (см. ниже), но для KO это не обязательно.
    4. Прогон агарозных гелей (Агарозный гель: 1,2% агарозы в буфере ТАЕ; буфер TAE [Таблица 1]; 200 В; около 5 мин) с 1-2 мкл РНК для оценки качества и последующего измерения концентрации с помощью спектрофотометра.
      Примечание: sgРНК можно хранить при температуре -20 °Cor -80 °C для дальнейшего использования.

3. Получение мРНК Cas9

  1. Проводят ферментативное расщепление плазмиды Cas9 (Таблица материалов) в течение более 1,5 ч с использованием XbaI в соответствии с инструкциями производителя (реакционную смесь см. в таблице 3). Испытание методом гель-электрофореза (Агарозный гель: 1,2% агарозы в буфере TAE; буфер TAE [Таблица 1]; 200 В; около 10 минут) с 1 μл, чтобы убедиться, что пищеварение тщательное.
  2. Очистите продукты так же, как и продукты sgRNA PCR (шаги 2.2.1-2.2.3). С этого момента требуются материалы и операции, не содержащие РНКазы.
  3. Используйте набор для транскрипции Т3 (Таблица материалов) или эквивалентные наборы для транскрипции мРНК Cas9 in vitro .
    1. Приготовьте реакцию в ПЦР-пробирках без РНКазы в соответствии с таблицей 3 и аккуратно перемешайте. Выдерживать при температуре 37 °C более 2,5 часов.
    2. Добавьте 1 мкл турбо-ДНКазы без РНКазы и инкубируйте при 37 °C в течение 15-20 минут.
    3. Осадки LiCl
      1. Переложите образцы в пробирки объемом 1,5 мл, добавьте 30 мкл LiCl (1,5 В) и аккуратно перемешайте.
      2. Поставьте смесь при температуре -20 °C примерно на 30 минут, а затем центрифугируйте при 21 000 × г в течение 30 минут при 4 °C.
      3. Выбросьте надосадочную жидкость, промойте гранулы 500 μл 75% этанола (без РНКазы) и центрифугируйте при 21 000 × г в течение 5 минут при 4 °C.
      4. Выбросьте надосадочную жидкость, высушите гранулу при 45 °C и растворите ее в 40 μL воды, не содержащей РНКазы.
  4. Измерьте концентрацию мРНК Cas9 с помощью спектрофотометра. Прогон агарозных гелей (Агарозный гель: 1,2% агарозы в буфере ТАЕ; буфер TAE [Таблица 1]; 200 В; около 10 мин) с 1-2 мкл РНК для проверки концентрации и качества.
    ПРИМЕЧАНИЕ: OD 260/280 должен быть выше 2,0, а концентрация должна быть около или выше 1000 нг/μл. МРНК Cas9 можно хранить при температуре -20 °Cor -80 °C для дальнейшего использования.

4. Подготовка к микроинъекции

  1. Подготовьте рыбок данио: В ночь перед микроинъекцией поместите здоровую самку данио-рерио и двух здоровых самцов данио-рерио в брачный аквариум, используя разделитель, чтобы разделить самцов и самок, чтобы подготовить их к спариванию.
  2. Приготовьте 4% агарозу, буфер для лизиса и буфер для эмбрионов (pH 8,0) (Таблица 1).
  3. Подготовьте иглы для капиллярного стекла для микроинъекции (Таблица материалов).
  4. Подготовьте пластины для микроинъекций: Налейте 35 мл расплавленной 4% агарозы в чашку Петри диаметром 10 см и аккуратно заложите пластиковую форму, чтобы создать корыта клиновидной формы. Избегайте образования пузырьков воздуха, осторожно постукивая по форме. После того, как он застынет, добавьте в него немного двойной дистиллированной воды (ddw) и установите температуру 4 °C для последующего использования.

5. Тест на эффективность sgRNA с помощью микроинъекций

  1. В день микроинъекции приготовьте смесь для микроинъекций, как указано в таблице 5 , на льду в среде, свободной от РНКазы.
  2. Загрузите раствор для микроинъекций в иглу с помощью наконечника для пипетки, не содержащего РНКазы (Таблица материалов). Будьте осторожны, чтобы не принести пузыри.
  3. Поместите заряженную иглу в микроманипулятор, прикрепленный к микроинжектору. Разрежьте кончик инъекционной иглы под микроскопом заостренным пинцетом, аккуратно защипывая кончик иглы, чтобы сломать его. Затем регулируйте давление инъекции до тех пор, пока игла не будет равномерно выбрасывать каплю объемом 1 нл, которая количественно измеряется с помощью ступенчатого микрометра и капилляра.
  4. Снимите разделитель и дайте рыбам размножиться около 6 минут. Соберите и перенесите эмбрионы 1-клеточной стадии в чашку Петри, содержащую буфер для эмбрионов.
    1. Изучите здоровье эмбрионов под световым микроскопом и удалите все неоплодотворенные яйцеклетки или мусор. Отложите 20 здоровых эмбрионов в качестве неинъекционного контроля в отдельную чашку Петри и наклейте этикетку.
  5. Перенесите и аккуратно выровняйте здоровые эмбрионы на стадии 1 клетки на бороздках микроинъекционной пластины, нагретой до комнатной температуры (RT), с помощью небольшой щетки. Удалите лишний буфер.
  6. Все последующие операции выполняйте под стереомикроскопом. С помощью кончика иглы аккуратно отрегулируйте положение эмбриона так, чтобы полюс животного был обращен к игле. Введите 1 мл смешанного раствора в столб животного.
  7. Примерно для введения 100 эмбрионов достаточно одной sgРНК. После инъекции аккуратно промойте эмбрионы в шестилуночную пластину с буфером для эмбрионов. Поместите чашку в инкубатор с постоянной температурой 28,5 °C. Примерно через 10 часов после оплодотворения (HPF) исследуйте эмбриональное развитие под стереомикроскопом и удалите мертвые эмбрионы.
  8. При 24 hpf соберите эмбрионы в пробирки объемом 1,5 мл для генотипирования (3 пробирки на sgРНК и 5 эмбрионов на пробирку). Осторожно слейте лишнюю воду с помощью пипетки, добавьте в каждую пробирку 100 μл буфера для лизиса, содержащего протеиназу К (в конечной концентрации 0,5 мг/мл), и инкубируйте при 56 °C в течение 1 часа, а затем при 95 °C в течение 15 минут.
  9. Добавьте 200 μL этанола (2V), хорошо перемешайте и центрифугируйте при 19 000 × г в течение 10 минут при RT.
  10. Выбросьте надосадочную жидкость, промойте гранулу 500 мкл 70% этанола и центрифугируйте при 19 000 × г в течение 3 минут при RT.
  11. Выбросьте надосадочную жидкость, высушите гранулу при RT и растворите ее с 50 μL ddw. Затем используйте 1 мкл экстрактов для приготовления реакционной смеси для ПЦР (Таблица 3) (для праймеров для ПЦР см. шаг 1.4).
  12. Прогон агарозных гелей (Агарозный гель: 1,2% агарозы в буфере ТАЕ; буфер TAE [Таблица 1]; 200 В; около 10 мин) с 2 мкл продуктов ПЦР, чтобы подтвердить, что ПЦР прошла успешно, а затем выполнить ферментативное расщепление (Таблица 3) для определения эффективности sgРНК. Аккуратно перемешайте ферментативную смесь для пищеварения. Инкубировать при температуре, рекомендованной производителем, в течение периода времени.
  13. Запустите агарозные гели для переваренных продуктов (Агарозный гель: 1,2% агарозы в буфере TAE; буфер TAE [Таблица 1]; 200 В; около 10 минут) с непереваренными продуктами ПЦР в качестве контроля для подтверждения того, происходит ли переваривание.
    Примечание: Сайт расщепления Cas9 находится примерно в 3.о. выше PAM, поэтому сайт узнавания фермента рестрикции лучше всего подходит для покрытия 6.о. выше PAM. Если эффективность sgRNA высока, разрезание и неправильная репарация приведут к образованию инделов, поэтому существует высокая вероятность того, что фермент рестрикции больше не сможет распознавать место разреза. Если sgRNA неэффективна, а сайт узнавания фермента рестрикции не поврежден, ферментативное расщепление может происходить нормально. С помощью электрофореза в агарозном геле можно определить, произошло ли ферментативное пищеварение.
  14. Если подходящего сайта узнавания фермента рестрикции нет, секвенируйте продукты ПЦР и проанализируйте эффективность sgRNA с помощью TIDE (https://tide.nki.nl/). Не забудьте провести ПЦР, а также секвенировать геномную ДНК WT в качестве контроля.
    1. Откройте веб-сайт и нажмите «Запустить TIDE». Введите направляющую последовательность sgRNA в рамку в разделе Направляющая последовательность.
    2. Нажмите кнопку Обзор в разделе Хроматограмма контрольного образца (.ab1 или .scf), чтобы ввести результат секвенирования для контрольной модели WT, и нажмите кнопку Обзор в разделе Хроматограмма тестового образца (.ab1 или .scf), чтобы ввести результат секвенирования для отредактированного образца.
    3. Нажмите кнопку Обновить вид. Веб-сайт выдаст процент от разницы между двумя последовательностями. Больший процент указывает на более высокую эффективность sgRNA. Для последующих процедур KI подходит sgРНК с эффективностью нокаута выше 80%.

6. Конструкция донорской плазмиды для мечения флуоресцентными белками

  1. Последовательности дизайна, которые будут сначала клонированы в плазмиду, а затем вставлены в геном рыбы, как показано на рисунке 2: последовательность размером 25.о. вверх по течению от предсказанного сайта расщепления Cas9 спроектирована как левое плечо гомологии, а последовательность 25.о. ниже по течению от предсказанного сайта расщепления Cas9 является правой гомологической ветвью. Введите CDS между сайтом-мишенью sgRNA и стоп-кодоном в организм донора для поддержания целостности эндогенного гена.
    Примечание: 5' комплементарных CDS (элемент 4 на рисунке 2) должны быть синонимически мутированы, чтобы избежать вторичного расщепления рекомбинантного генома комплексом sgRNA/Cas9.
  2. Используйте лигионно-независимое клонирование (LIC)14 с использованием экзонуклеазы III (Таблица материалов) для конструирования донорской плазмиды. Другие методы, такие как сборка Гибсона, также возможны. Грунтовки для клонирования показаны на рисунке 2. Элементы «1», «2», «3» и «4» переносятся грунтовками:
    1. Дизайн грунтовки F1, который состоит из перекрывающейся последовательности с вектором, элементом "1" и частью элемента "2".
    2. Дизайн грунтовки R2, который состоит из части элемента "1", элемента "2" и элемента "3".
    3. Дизайн праймера F2, который состоит из элементов "3", "4" и 5' последовательности CDS, следующей за сайтом-мишенью sgRNA.
    4. Design Primer R1, который состоит из 3'-последовательности CDS гена и перекрывающейся последовательности с вектором.
    5. Используйте кДНК рыбок данио в качестве матрицы и проводите ПЦР с использованием праймеров.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуемое перекрытие между праймерами или между праймером и вектором составляет 15-20.о. Эти праймеры специфичны для гена-мишени, и пример праймеров для cx39.9 и cx44.1 приведен в таблице 2. Эта конструкция была успешно применена, как описано выше13. Подробные карты плазмид представлены в Дополнительном файле 1 и Дополнительном файле 2. Спроектированные последовательности ДНК и белков cx39.9 и cx44.1 представлены в дополнительном файле 3.
    6. Очистите продукты ПЦР так же, как и продукты ПЦР с гРНК (шаги 2.2.1-2.2.3).
  3. Расщепляйте донорский вектор (Рисунок 3 и Таблица 6) с помощью соответствующих ферментов рестрикции. В этом примере ферментами являются PciI и Acc65I (Таблица материалов). Проводите в соответствии с инструкциями производителя (Таблица 3). Расщепленный донорский вектор очищают так же, как и продукты ПЦР с гРНК (шаги 2.2.1-2.2.3).
  4. Количественно оценить очищенные фрагменты ПЦР и расщепленный донорский вектор методом электрофореза в ДНК-геле (гель ДНК: 1,2% агарозы в буфере ТАЕ; буфер TAE [Таблица 1]; 200 В; около 10 минут). Приготовьте реакционную смесь для LIC в соответствии с таблицей 3.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Все пробирки и компоненты реакции должны быть помещены на лед, а реакция и все манипуляции должны производиться на льду. Добавьте 1 μL Exo III (20 единиц) в реакцию в качестве последнего компонента, а затем немедленно пипетируйте вверх и вниз, чтобы хорошо перемешать все компоненты. Не забудьте включить одну реакционную смесь без фрагментов ПЦР в качестве контроля, чтобы показать потенциал самоотжига расщепленного вектора.
  5. Немедленно поместите реакционную смесь на лед и выдерживайте в течение 60 минут.
  6. Добавьте 1 мкл 0,5 М ЭДТА (pH 8,0), чтобы остановить реакцию, пипеткой вверх и вниз, чтобы хорошо перемешать, а затем инкубируйте при 60 °C в течение 5 минут, а затем на льду в течение 5 минут.
  7. Трансформируйте компетентные клетки, такие как DH5α, с помощью продуктов LIC и выращивайте бактерии на планшетах LB (Таблица материалов и Таблица 1) с помощью соответствующих антибиотиков (в данном случае ампициллина) в течение 16 часов.
  8. Убедитесь, что существует разница на порядки величины между количеством колоний на планшетах, содержащих фрагменты ПЦР, и на контрольной пластине. Выберите отдельные колонии из планшетов LIC для ферментативного анализа пищеварения и секвенирования ДНК.
  9. Извлекайте и очищайте правильные донорские плазмиды с помощью набора для очистки так же, как и продукты для пцр с гРНК (шаги 2.2.1-2.2.3). Убедитесь, что конечная концентрация превышает 300 нг/мкл.

7. Микроинъекция эмбрионов рыбок данио по гену KI

  1. Выполните все описанные выше манипуляции с микроинъекцией, кроме приготовления раствора для микроинъекций согласно таблице 7.

8. Скрининг и идентификация потомства, меченного флуоресцентным белком

  1. Наблюдайте за флуоресценцией под стереофлуоресцентным микроскопом через 12-48 ч после микроинъекции.
  2. Применение вновь установленного метода скрин13. Если наблюдается явная флуоресценция, выберите флуоресцентные личинки и вырастите их. Если наблюдается только след флуоресценции или даже его отсутствие, разведите всех введенных личинок.
  3. В возрасте 1 месяца обезболивайте рыбок данио рерио с 0,02% трикаина (Таблица 1). Для каждой рыбки данио соберите небольшой кусочек хвостового плавника в помеченную ПЦР-пробирку и храните соответствующих обезболенных рыбок данио в одной лунке из шести лунок, содержащей стерилизованную ультрафиолетовым излучением фильтрованную воду (pH 7,2) с той же этикеткой.
  4. Для экстракции геномной ДНК используют метод щелочного лизиса (буфер для лизиса в таблице 1)15 с последующим проведением ПЦР с 5'-переходом. Спроектируйте передний праймер перед левым плечом гомологии и обратный капсюль на пластине (рис. 4). Размер продукта ПЦР составляет около 500.о. Примеры грунтовок см. в таблице 2.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для флуоресцентных рыбок данио эта ПЦР используется для проверки точности KI, поэтому продукт ПЦР затем подвергается секвенированию. Для рыбок данио без флуоресценции эта ПЦР используется для проверки наличия KI. Выберите рыб с положительным результатом ПЦР и вырастите их до взрослого состояния с F0.
  5. Исследуйте эмбрионы F1 , полученные от скрещивания скринингованного F0 с WT на паттерны экспрессии GFP и генотипированные с помощью ПЦР на соединение.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если вставка мишени происходит в F1 (независимо от того, совершенна она или нет), соответствующая F0 определяется как наследуемая F0, продукт ПЦР которой затем секвенируется. Если вставка выполнена правильно, соответствующая F0 определяется как желаемая F0.
  6. Когда желаемый F0 будет получен, используйте потомство для визуализации, чтобы наблюдать и отслеживать целевой белок.

9. Визуализация и обработка данных

  1. Определите стадию развития, которую необходимо визуализировать. Подготовьте рыбу заранее. Добавьте разведенный 1-фенил2-тиомочевину (ПТУ; 0,003%, Таблица материалов) в рыбу для удаления пигментов при необходимости.
    ПРИМЕЧАНИЕ: ПТУ будет менее эффективной, если применять ее после 24 hpf. В этом примере ПТУ добавляли в буфер для эмбрионов до 24 hpf и держали в буфере до 48 hpf, когда личинки данио-рерио обрабатывались для визуализации.
  2. Добавьте 2 мл растопленной 4% агарозы (Таблица 1) в форму диаметром 35 мм и оставьте в сторону для застывания. Переложите рыбу в буфер для эмбрионов, содержащий 0,02% трикаина (табл. 1).
  3. Разведите 200 мкл расплавленной 4% агарозы в 1 мл ddw. Переложите обезболенную рыбу в разведенную агарозу с помощью пипетки объемом 1 мл, когда агароза остынет. Аккуратно перемешайте и переложите агарозу для рыбы в посуду с застывшим 4% агарозным гелем, приготовленным на шаге 9.2.
  4. Расположите рыбу так, чтобы интересующая часть оказалась сверху.
  5. Используйте вертикальный конфокальный флуоресцентный микроскоп для визуализации и обработки данных, следуя инструкциям производителя (Таблица материалов).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Щелевые соединения, состоящие из полимерных белков, называемых коннексинами, необходимы для обмена низкомолекулярными метаболитами и ионами между контактирующими клетками. Описанный выше метод флуоресцентного мечения белков был использован для мечения коннексина 39.9 (рисунок 5А) и коннексина 44.1 (рисунок 5В) соответственно. Правильный KI был верифицирован с помощью ПЦР на переходе (рис. 6). В соответствии с опубл...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Чтобы провести этот эксперимент гладко и успешно, следует уделить больше внимания некоторым важным аспектам. Оптимальной стадией развития рыбок данио для инъекций должна быть одноклеточная стадия. Завершение инъекции на этой стадии может гарантировать, что все клетки, полученные в результате последующего деления, содержат необходимые компоненты для KI, тем самым увеличивая вероятность одновременного возникновения KI во всех клетках и улучшая общий показатель успешности KI. Понижение темп...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Все авторы заявляют об отсутствии конкурирующих интересов в данной статье.

Благодарности

Мы благодарим Лу Чжоу (Сямыньский университет) за корректуру и редактирование этой рукописи. Эта работа была поддержана Национальным фондом естественных наук Китая (грант 82388201 J.H.; грант 31801158 Y.Z.), Национальная программа ключевых исследований и разработок Китая (2020YFA0803500 до J.H.), Инновационный фонд медицинских наук CAMS (CIFMS) (2019-I2M-5-062 J.H.), Центральная специальная программа развития местной науки и технологий провинции Фуцзянь (2022L3079 до J.H.), и Программа сотрудничества района Фуся-Цюань Цзы-Чжуан (3502ZCQXT2022003 к Дж.Х.). Спонсоры не играли никакой роли в разработке исследования, сборе и анализе данных, принятии решений о публикациях или подготовке рукописей.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
1000 &микро; Л  наконечникиЛюбая маркаН/ДДля всех манипуляций
Пробирки 1,5 млЛюбая маркаН/ДДля хранения и центрифугирования различных
растворов Пробирки 1,5 мл (без РНКазы)Любая маркаН/ДДля хранения и центрифугирования растворов без РНКазы
10&микро; L наконечникиЛюбая маркаН/ДДля всех манипуляций
10 & микро; L наконечники (без РНКазы)Любая маркаН/ДДля манипуляций без РНКазы
1000 и микро; Л  советы (без РНКазы)Любая торговая маркаН/ДДля манипуляций без РНКазы
1-фенил2-тиомочевина (ПТУ)SigmaP7629Для ингибирования меланогенеза и сохранения прозрачности личинок
200 &микро; L наконечникиЛюбая маркаН/ДДля всех манипуляций
200 & микро; L наконечники (без РНКазы)Любая маркаН/ДДля манипуляций без РНКазы
2x Taq Plus Master Mix II (Краситель Плюс)VazymeP213-03ПЦР для тестов эффективности sgРНК
35 мм тарелкиCorning430165Для визуализации
6-луночных планшетовЛюбая маркаН/ДДля индивидуального и временного выращивания данио-рерио
Acc65INEBR0599SДля ферментативное сбраживание
Уксусная кислотаSigma695092Для буферного препарата TAE
AgarBiofroxx8211GR500Для пластин LB
Ампициллин, натриевая сольSangonA610028Для пластин LB
CaCl2SigmaC5080Для приготовления буфера для эмбрионов
Капиллярные трубкиHarvard Apparatus30-0016Для генерации игл для инъекций
Капиллярные трубкиИдентификатор любой марки(внутренний диаметр) = 0,1 ммДля количественного определения капли объемом 1 нл
CRISPRscanCRISPRscan  http://www.crisprscan.org/Для дизайна sgRNA
DH5αTIANGENCB101Для трансформации
EDTASigmaE6758Для лизисного буфера и получения буфера TAE
EnsemblEnsembl  https://asia.ensembl.org/Danio_rerio/Info/IndexДля поиска информации о гене
ЭтанолHUSHI64-17-5Для очистки и экстракции ДНК
Экзонуклеаза IIITakara2170A
LIC Газовый микроинъекторWarner InstrumentsPLI-100AДля микроинъекций
Система электрофореза геляWIXWIX-EP3000Для геля
ПерчаткиЛюбая маркаН/ДДля всех манипуляций
Глюкозаsgdbio10010518Для пластин LB
ГлицеринСангонA501745Для пластин
LB gRNA-pMD19-TКитайский ресурсный центр данио-рерио (CZRC)CZP3sgRNA плазмида содержащая sgРНК скаффолд
KClSigmaP5405Для эмбриона буферный препарат
Раствор осаждения хлорида литияThermofisherAM9480Осаждение sgРНК, без РНКазы
Низкая температура плавления агарозыSangonA600015Для приготовления 4% агарозных гелей
Сульфат магнияsgdbio20025118Для пластин LB
Металлическая ваннаЛюбая маркаН/ДДля инкубации при постоянной температуре
Метиленовый синийSigmaM9140Для приготовления буфера для эмбрионов
Микроинсекционная формаДомашняяН/ДДля создания бороздок для удержания эмбрионов во время микроинъекции
Микрозагрузчик, наконечник для наполнения Фемтотипы и другие стеклянные микрокапилляры, стерильные, 0,5 – 20 & микро; L, 100 мм, светло-серый, 192 шт. (2 стойки и раз; 96 шт.)Eppendorf5242956003Для загрузки раствора для микроинъекций в иглу для инъекций,
Вытягиватель микропипетокИнструмент Sutter InstrumentP-97Для генерации игл для инъекций
МикропипеткиEppendorfN/AДля всех манипуляций
Микроволновая печьлюбой маркиН/ДДля литья инъекционной пластины и агарозных гелей
MinElute PCR Набор для очистки (50)QIAGEN28004Для очистки продуктов ПЦР и продуктов пищеварения, без РНКазы
mMESSAGE mMACHINE T3 Набор для транскрипцииInvitrogenAM1348Транскрипция in-vitro мРНК Cas9, N
2N/AмаркиДля микроинъекций
NaClSigmaS5886Для приготовления буфера для эмбрионов и лизиса
NaHCO3SigmaS5761Для препарата буфера для эмбрионов
NaOHSangonA100173Для приготовления буфера TAE
Вода без нуклеазыThermofisherR0581Манипуляции, связанные с РНК, РНКазный
PciINEBR0655SДля ферментативного разложения
ПЦР машиналюбой маркиН/ДПолоски для ПЦР амплификации ПЦР
Пробиркилюбой маркиН/ДДля ПЦР
пробирокFEITONGKANGblp-200Для ПЦР
чашка Петрилюбой маркиН/ДДля выращивания личинок рыбок данио и т.д.
Фенол красныйSigmaP0290Для микроинъекций, держатель пипеток без РНКазы
Warner InstrumentsPLI-PH1Для микроинъекций
PrimeStar (Premix)TakaraDR040AДля молекулярного клонирования
Proteinase KMerck539480Для экстракции геномной ДНК
pT3TS (T3:zCas9-UTRglobin)Китайский ресурсный центр рыбок данио-рерио (CZRC)CZP11Cas9 шаблон плазмиды
Охлаждаемая центрифугаЛюбая маркаН/ДДля центрифугирования на основе РНК
ВесыSartoriusBCE124-1CCNДля литья инъекционных пластин и агарозных гелей
НожницыЛюбая маркаН/ДДля обрезки хвостов взрослых рыб
SDSSangonA600485Для приготовления
буфера для лизисаМаленькие щеткиЛюбая маркаН/ДДля бережного перемещения эмбрионов на микроинъекционных планшетах
СпектрофотометрThermofisherNanoDrop 2000Для измерения концентрации ДНК/РНК
Сценический микрометрЛюбая маркаDIV (Деление) = 0,01 ммДля количественного определения капли объемом 1 нл
Стереофлуоресцентный микроскопOlympusSZX16Для наблюдения за экспрессией генов
СтереомикроскопMoticSMZ-168Для наблюдения и микроинъекций
T7 RiboMAX Express Система производства РНК большого масштаба PromegaP1320Транскрипция sgРНК in vitro, без РНКазы
Инкубатор с регулируемой температуройЛюбая маркаN/AДля инкубации эмбрионов
TIDETIDEhttps://tide.nki.nl/Для анализа эффективности sgRNA 
Трикаин метансульфонатSigmaA5040Для приготовления раствора трикаина
TrisSangonA600194Для приготовления раствора трикаина, буфера лизиса и буфера TAE
ТриптонOXOIDLP0042Для пластин LB
Пинцетлюбой маркиН/ДДля резки инъекционных игл
XbaINEBR0145SДля ферментативных для пищеварения
Дрожжевой экстрактOXOIDLP0021Для тарелок LB
Аквариумная система для рыбок данио-рериоESEN ESEN-AW-S1Для выращивания взрослых рыб
Брарио Баки для спаривания (с разделителем)Любая маркаН/ДДля спаривания рыб
Zeiss LSM 900+Airyscan2ZEISSZeiss LSM900Для конфокальной визуализации рыб, меченных флуоресценцией, и анализа данных
Веб-сайтZFIN ZFINhttp://zfin.org/Найти информацию о гене
для электрофореза без РНКазы без РНКазы любой

Ссылки

  1. Brittijn, S. A., et al. Zebrafish development and regeneration: new tools for biomedical research. Int J Dev Biol. 53 (5-6), 835-850 (2009).
  2. Gemberling, M., Bailey, T. J., Hyde, D. R., Poss, K. D. The zebrafish as a model for complex tissue regeneration. Trends Genet. 29 (11), 611-620 (2013).
  3. Haraoka, Y., Miyake, M., Ishitani, T. Zebrafish imaging reveals hidden oncogenic-normal cell communication during primary tumorigenesis. Cell Struct Funct. 48 (1), 113-121 (2023).
  4. Gomes, M. C., Mostowy, S. The case for modeling human infection in zebrafish. Trends Microbiol. 28 (1), 10-18 (2020).
  5. Trede, N. S., Langenau, D. M., Traver, D., Look, A. T., Zon, L. I. The use of zebrafish to understand immunity. Immunity. 20 (4), 367-379 (2004).
  6. Karlsson, J., von Hofsten, J., Olsson, P. E. Generating transparent zebrafish: a refined method to improve detection of gene expression during embryonic development. Mar Biotechnol (NY). 3 (6), 522-527 (2001).
  7. White, R. M., et al. Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis. Cell Stem Cell. 2 (2), 183-189 (2008).
  8. Antinucci, P., Hindges, R. A crystal-clear zebrafish for in vivo imaging. Sci Rep. 6, 29490(2016).
  9. He, M. D., et al. Efficient ligase 3-dependent microhomology-mediated end joining repair of DNA double-strand breaks in zebrafish embryos. Mutat Res. 780, 86-96 (2015).
  10. Hisano, Y., et al. Precise in-frame integration of exogenous DNA mediated by CRISPR/Cas9 system in zebrafish. Sci Rep. 5, 8841(2015).
  11. Luo, J. J., et al. CRISPR/Cas9-based genome engineering of zebrafish using a seamless integration strategy. FASEB J. 32 (9), 5132-5142 (2018).
  12. Wierson, W. A., et al. Efficient targeted integration directed by short homology in zebrafish and mammalian cells. Elife. 9, e53968(2020).
  13. Liu, J., et al. Optimal tagging strategies for illuminating expression profiles of genes with different abundance in zebrafish. Commun Biol. 6 (1), 1300(2023).
  14. Li, C., Evans, R. M. Ligation independent cloning irrespective of restriction site compatibility. Nucleic Acids Res. 25 (20), 4165-4166 (1997).
  15. Yu, C., Zhang, Y., Yao, S., Wei, Y. A PCR based protocol for detecting indel mutations induced by TALENs and CRISPR/Cas9 in zebrafish. PLoS One. 9 (6), e98282(2014).
  16. Hirata, H., et al. Connexin 39.9 protein is necessary for coordinated activation of slow-twitch muscle and normal behavior in zebrafish. J Biol Chem. 287 (2), 1080-1089 (2012).
  17. Cason, N., White, T. W., Cheng, S., Goodenough, D. A., Valdimarsson, G. Molecular cloning, expression analysis, and functional characterization of connexin44.1: a zebrafish lens gap junction protein. Dev Dyn. 221 (2), 238-247 (2001).
  18. Urushibata, H., et al. Control of developmental speed in zebrafish embryos using different incubation temperatures. Zebrafish. 18 (5), 316-325 (2021).
  19. Yu, D., et al. Cyclic digestion and ligation-mediated PCR used for flanking sequence walking. Sci Rep. 10 (1), 3434(2020).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

zebrafishCRISPRzebrafishsgRNAzebrafish

Похожие статьи