Method Article

Создание и сравнение методов определения активности T6SS на основе флуоресценции у Acinetobacter baumannii

DOI:

10.3791/67772

⸱

June 20th, 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Clinical Laboratory, Center for Infectious Diseases and Pathogen Biology, The First Hospital of Jilin University, 2Department of Respiratory Medicine, Center for Infectious Diseases and Pathogen Biology, The First Hospital of Jilin University

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В данной работе мы предлагаем метод количественного обнаружения, основанный на флуоресцентном мечении (особенно люциферазе) для эффективной и точной оценки активности бактериального T6SS, который подходит для высокопроизводительного анализа клинических штаммов.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Система секреции VI типа (T6SS) является важнейшим механизмом, опосредующим межклеточные взаимодействия у грамотрицательных бактерий, особенно у патогенных видов, таких как Acinetobacter baumannii. Предыдущие исследования показали, что большая плазмида pAB3 в штамме A. baumannii ATCC 17978 кодирует TetR-подобный белок, который ингибирует экспрессию основных генов T6SS. Напротив, штаммWT R- , в котором отсутствует pAB3, может стабильно экспрессировать и секретировать эффекторный белок T6SS Hcp и проявляет способность убивать E. coli. Ген tssM , один из основных генов T6SS, необходим для его активности; его удаление напрямую приводит к инактивации T6SS. Тем не менее, традиционные методы определения активности T6SS, такие как убийственные анализы, имеют низкую пропускную способность и недостаточную чувствительность. Чтобы обойти эти ограничения, мы разработали количественные методы обнаружения, основанные на флуоресцентном мечении.

Для улучшения детектирования активности T6SS мы разработали три метода флуоресцентного мечения: (1) метод количественного детектирования, основанный на мечении люциферазой, который характеризуется высокой специфичностью, чувствительностью и воспроизводимостью, что делает его пригодным для высокопроизводительного анализа; (2) Метод детектирования, основанный на мечении зеленым флуоресцентным белком (GFP), который, несмотря на свою восприимчивость к воздействию окружающей среды, имеет преимущество высокой пропускной способности; (3) Обнаружение проточной цитометрии, которое может количественно оценить жизнеспособность бактерий, но является сложным и дорогостоящим с операционной точки зрения. После всестороннего сравнения метод маркировки на основе люциферазы оказался наиболее точным, чувствительным и удобным для пользователя. При применении к 20 клиническим изолятам A. baumannii было подтверждено, что этот метод позволяет быстро и точно оценить активность T6SS.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Система секреции VI типа (T6SS) является важной системой секреции белка у грамотрицательных бактерий, широко участвующей в бактериальной конкуренции, антагонизме против эукариотических хозяев и регуляции иммунных реакций хозяина 1,2. Вводя токсичные эффекторные белки в соседние бактерии или эукариотические клетки, T6SS помогает бактериям сохранять конкурентное преимущество в сложных условиях. В последние годы значительная роль T6SS в бактериальной адаптивности, патогенности и микробных взаимодействиях сделала его горячей точкой исследований, особенно у патогенов с множественной лекарственной устойчивостью, где его функции обеспечивают потенциальные мишени для разработки новых антибактериальных стратегий 3,4,5.

Acinetobacter baumannii (Ab) является грамотрицательным условно-патогенным микроорганизмом, широко распространенным в больничных условиях. Благодаря своей высокой лекарственной устойчивости и сильной приспособляемости, он стал важным внутрибольничным патогеном во всем мире 6,7,8. Выживание A. baumannii в сложных микробных средах зависит от систем множественной секреции, среди которых T6SS играет ключевую роль в конкуренции с другими микробами и взаимодействии с хозяином. Благодаря высококонсервативному кластеру генов T6SS и четко определенным функциям, A. baumannii стал идеальной моделью для изучения механизмов T6SS. Кроме того, уникальная структура T6SS у A. baumannii дает отличительную перспективу для дальнейшего раскрытия разнообразия и функций T6SS.

Кластер генов T6SS A. baumannii содержит 12 основных белковых генов (таких как tssA-tssM, лишенный tssJ) и несколько генов с неизвестными функциями (таких как tagX, tagN, tagF и т. д.)2,9,10. Среди них корегулируемый белок гемолизина (Hcp) является важным компонентом T6SS, а его секреция считается отличительной чертой функционального T6SS. Исследования показали, что большая плазмида pAB3 у A. baumannii ингибирует экспрессию T6SS, кодируя TetR-подобный регуляторный белок. Напротив, штаммы, которые потеряли pAB3 (такие как WTR-), могут стабильно экспрессировать и секретировать Hcp, проявляя значительную активность T6SS11. Ген tssM является одним из основных генов T6SS, и его делеция напрямую приводит к инактивации T6SS.

Тем не менее, традиционные методы определения активности T6SS (такие как анализы убийства) имеют ограничения, такие как низкая производительность, плохая воспроизводимость и недостаточная чувствительность, что серьезно ограничивает углубленное изучение и широкое применение T6SS5. Таким образом, разработка эффективных и точных методов обнаружения активности T6SS стала насущной необходимостью в современных исследованиях. Данное исследование направлено на создание и сравнение методов определения активности T6SS на основе флуоресцентного мечения для преодоления недостатков традиционных методов. Благодаря технологии флуоресцентного мечения мы добились количественного мониторинга активности T6SS в режиме реального времени, что является более точным и надежным инструментом для изучения бактериальных взаимодействий. Это исследование подтвердило эффективность методов флуоресцентного мечения и, сравнивая преимущества и недостатки различных стратегий флуоресцентного мечения, предоставило новые перспективы и методологическую поддержку для будущих исследований. Он не только предлагает новые технические средства для исследования T6SS, но и закладывает научную основу для понимания сложных механизмов бактериальных взаимодействий и разработки новых антибактериальных терапевтических стратегий.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Источники штаммов и плазмид

  1. Используйте стандартный штамм A. baumannii ATCC 17978, E. coli (pZY01) и клинический штамм A. baumannii , выделенный из отделения лабораторной медицины Первой больницы Цзилиньского университета.
  2. Используйте плазмиду pZY01-GFP (несущую ген устойчивости к канамицину, способный к стабильной экспрессии у A. baumannii), которая была модифицирована и сохранена в лаборатории, и коммерчески приобретенную плазмиду pGEN-luxCDABE (несущую ген устойчивости к ампициллину).
  3. Культура A. baumannii и E. coli в среде Лурия-Бертани (LB) или минимальной среде, содержащей: 50 мМ буфера фосфата калия (pH 7,4), 15 мМ (NH4)2SO4, 2 мМ MgSO4, 0,2% (w/v) сукцината натрия в качестве единственного источника углерода и 0,01% (w/v) дрожжевого экстракта12. При необходимости добавьте антибиотики в следующих концентрациях: кишечная палочка: ампициллин (100 г/мл) и канамицин (50 г/мл); A. baumannii: стрептомицин (100 мкг/мл).
    ПРИМЕЧАНИЕ: E. coli (pZY01) и E. coli (pZY01-GFP) проявляют резистентность к канамицину. E. coli (pZY01) не имеет флуоресцентного маркера, поэтому в следующем тексте ее можно называть E. coli .

2. Подготовка штаммов бактерий перед экспериментом

  1. Достаньте штаммы бактерий из морозильной камеры при температуре -80 °C за 2 дня до эксперимента. Инокулируйте штаммы бактерий на агаровые планшеты LB, содержащие соответствующие антибиотики. Инкубируйте планшеты в течение ночи при температуре 37 °C.
    Примечание: Убедитесь, что все клетки сохраняют плазмиды в начале эксперимента.
  2. Выберите две независимые одиночные колонии каждого штамма бактерий за 1 день до эксперимента. Инокулируйте каждую колонию отдельно в две отдельные пробирки, содержащие 5 мл жидкой среды LB. Инкубируйте культуры в течение ночи при 37 °C с встряхиванием при 200 об/мин. Используйте эти культуры для последующих экспериментов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Оптимизируйте время инкубации в зависимости от скорости роста бактерий, чтобы обеспечить получение достаточного количества бактериальной биомассы.

3. Получение штаммов E. coli (GFP)/ E. coli (Luciferase)

  1. Преобразование
    1. Добавьте 50 нг плазмидной ДНК (pZY01-GFP или pGEN-luxCDABE, количественно определенную с помощью NanoDrop при A260/A280) в 100 мкл компетентных клеток E. coli DH5α соответственно и осторожно перемешайте.
    2. Инкубировать на льду в течение 30 минут, подвергнуть тепловому шоку при температуре 42 °C в течение 60 с и немедленно поместить на лед на 30 с.
    3. Добавьте 700 мкл бульона LB без антибиотиков и инкубируйте при 37 °C с встряхиванием при 180 об/мин в течение 2 ч.
  2. Покрытие и культивирование
    1. Центрифугируйте при 420 × г в течение 2 мин, выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клеточную гранулу в 100 мкл бульона LB, не содержащего антибиотиков.
    2. Распределите продукт трансформации pZY01 (GFP) на агаровые планшеты LB, содержащие 50 мкг/мл канамицина.
    3. Распределите продукт трансформации pGEN-luxCDABE на агаровые планшеты LB, содержащие 100 мкг/мл ампициллина. Инкубировать при температуре 37 °C в течение ночи.
  3. Проверка положительных клонов
    1. Выберите отдельные колонии и извлеките ДНК в виде шаблонов полимеразной цепной реакции (ПЦР) на следующий день. Проведите ПЦР-амплификацию и верификацию с помощью электрофореза в агарозном геле.
    2. Подтвердите положительные штаммы и пометьте их как E. coli (GFP) и E. coli (Luciferase).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что качество компетентных клеток высокое для эффективной трансформации. Избегайте чрезмерного количества бактериальной жидкости во время гальванического покрытия, чтобы предотвратить вмешательство в изоляцию одной колонии.

4. Вестерн-блоттинг

  1. Подготовка образцов
    1. Соберите бактериальные культуры и центрифугируйте (1500 × г, 10 мин, 4 °C) для отделения клеточной гранулы и надосадочной жидкости.
    2. Добавьте соответствующее количество загрузочного буфера как к грануле ячейки, так и к надосадочной жидкости. Кипятить при 100 °C на металлической бане 10 минут. Центрифугируйте (1500 г, 10 мин, 4 °C) и соберите надосадочную жидкость в виде образцов белка.
    3. Измерьте концентрацию белка с помощью бицинхониновой кислоты (BCA) или метода Брэдфорда и отрегулируйте до той же концентрации.
  2. Электрофорез в геле додецилсульфата натрия (SDS-PAGE)
    1. Приготовьте гели SDS-PAGE соответствующей концентрации (например, 12% разделительный гель, 5% стекирующий гель)13.
    2. Загрузите 20 мкг образцов белка в гелевые лунки вместе с 1-2 мкл предварительно окрашенного белкового маркера. Проводите электрофорез при напряжении 100-120 В до тех пор, пока бромфенольный синий индикатор не достигнет дна геля.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Рабочий буфер: Трис 25 мМ, глицин 192 мМ, SDS 0,1% (мас./об.), дистиллированная вода до 1 л.
  3. Трансфер (вестерн-блоттинг)
    1. Снимите гель со стеклянных пластин и замочите его в трансферном буфере. Подготовьте мембрану из поливинилидендифторида (PVDF) или нитроцеллюлозы (NC), активируйте мембрану из PVDF метанолом, а затем замочите ее в буфере для переноса.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Трансферный буфер: 25 мМ Трис, 192 мМ глицина, 20% метанола
    2. Соберите передаточное устройство в конструкцию «сэндвич» (фильтровальная бумага-гель-мембрана-фильтровальная бумага). Перенос при напряжении 100 В в течение 60-90 мин (время регулировки в зависимости от молекулярной массы белка; Белки клетки-хозяина (HCP) имеют молекулярную массу около 17 кДа).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Поместите передаточный бак в ледяную воду и добавьте пакеты со льдом для поддержания низкой температуры. Если время переноса велико, замените пакеты со льдом на полпути.
  4. Блокировка
    1. После переноса поместите мембрану в 5% раствор для блокировки обезжиренного молока. Заблокируйте при комнатной температуре (RT) на шейкере в течение 1 часа или на ночь при 4 °C.
  5. Первичная инкубация антител
    1. Промойте мембрану трис-буферным физиологическим раствором (TBS), содержащим 0,1% буфера Tween 20 (TBST), каждый раз по 5 минут. Инкубируйте мембрану с разведенными первичными антителами (мышиное антитело к Hcp, разведение 1:1000; антитело к мышиной антиизоцитратдегидрогеназе (ICDH), разведение 1:1000) при 4 °C в течение ночи или RT в течение 2 ч.
  6. Вторичная инкубация антител
    1. Промойте мембрану буфером TBST 3 раза, по 5 мин каждый. Инкубировать мембрану с разбавленным вторичным антителом (пероксидаза хрена [HRP]-конъюгированная антимышиная IgG, разведение 1:3000) при ЛТ в течение 2 ч.
  7. Обнаружение
    1. Промойте мембрану буфером TBST 3 раза, по 5 мин каждый. Подготовьте хемилюминесцентный субстрат ECL и равномерно нанесите его на мембрану.
    2. Детектирование сигналов с помощью системы хемилюминесцентной визуализации и захват изображений (белок HCP имеет молекулярную массу около 17 кДа, ICDH является цитоплазматическим метаболическим ферментом с ожидаемой молекулярной массой около 45 кДа у A. baumannii).
      ПРИМЕЧАНИЕ: ICDH является важным маркером контроля качества, который может быть обнаружен только во фракции клеточных гранул (содержащей интактные бактерии), а не во фракции надосадочной жидкости (содержащей секретируемые белки), тем самым демонстрируя отсутствие лизиса клеток во время подготовки образца. Секреция Hcp (17 кДа) должна быть видна только у надосадочной жидкости из T6SS-активных штаммов.

5. Подготовка 96-луночных планшетов с агаровой средой LB

  1. Быстро добавьте автоклавную среду LB агар без антибиотиков, предварительно подогретую, в стерильный планшет на 96 лунок по 50 мкл на лунку. Дайте пластине постоять при RT не менее 1 часа, чтобы обеспечить полное затвердевание среды.
  2. Используйте пластины с черными стенками и прозрачным дном для обнаружения флуоресценции GFP.
  3. Используйте светозащищенные 96-луночные планшеты для обнаружения флуоресценции люциферазы, чтобы избежать интерференции флуоресценции в перекрестных лунках.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте образования пузырьков при добавлении среды, чтобы обеспечить равномерную толщину геля, что способствует оптимальному контакту с бактериями и росту.

6. Пробирный анализ на смерть A. baumannii

  1. Стандартный анализ на убийство
    1. Культуру мутантных штаммов WtR- иΔ tssM в течение ночи при 37 °С с встряхиванием в среде LB с добавлением 100 мкг/мл стрептомицина, выращивать E. coli отдельно в среде LB, содержащей 50 мкг/мл канамицина, в идентичных условиях.
    2. Дважды промойте бактериальные культуры стерильным PBS и повторно суспендируйте их в свежей среде LB, не содержащей антибиотиков. Отрегулируйте внешний диаметр600 до 1,0 для стандартизации.
    3. Смешайте мутантные штаммы WTR- и ΔtssM с E. coli в соотношении 1:1.
    4. Нанесите 10 мкл смешанной бактериальной суспензии на агаровые планшеты LB, не содержащие антибиотиков, и инкубируйте при 37 °C в течение 6 ч.
    5. Соскребите бактериальные пятна и повторно суспендируйте их в 1 мл PBS. Выполните пять 10-кратных последовательных разведений.
    6. Поместите 10 мкл разведенных бактериальных суспензий на LB-планшеты, содержащие канамицин, и инкубируйте в течение ночи при 37 °C.
    7. Анализ T6SS-зависимой антибактериальной активности мутантных штаммов WTR- и ΔtssM методом подсчета колоний.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Обеспечьте тщательное перемешивание бактериальных суспензий, чтобы избежать экспериментальных ошибок. Для обеспечения надежности данных выполните не менее трех независимых репликаций для каждой выборки.
  2. Количественное определение активности T6SS с помощью мечения люциферазой
    1. Стандартизируйте OD600 мутантов E. coli (Luciferase), WTR-, ΔtssM и других штаммов (например, ATCC 17978, E. coli, Ab#40, Ab#170, Ab#180) до 1,0. Добавьте 5 мкл бактериальной суспензии в 96-луночный планшет, содержащий LB-агар, не содержащий антибиотиков. После сушки на воздухе в темноте измерьте биолюминесценцию на основе люциферазы, чтобы проверить люминесцентную специфичность E. coli (люциферазы).
    2. Проводят 5-кратное серийное разведение кишечной палочки (люциферазы). Нанесите 10 мкл разведенной бактериальной суспензии на 96-луночный планшет с LB-агаром и пустой 96-луночный планшет (оба светонепроницаемые). Измерьте биолюминесценцию на основе люциферазы, чтобы оценить чувствительность метода детектирования на основе люциферазы и подтвердить, влияет ли агар LB на сигнал люминесценции.
    3. Смешайте E. coli (люциферазу) с мутантами WTR-, ΔtssM и 20 клиническими штаммами (OD600 , стандартизированный до 1,0) в соотношении 1:1. Разбавьте в 10 раз, добавьте 5 μL в 96-луночный планшет и настройте три технических повтора.
    4. После сушки на воздухе в темноте измерьте биолюминесценцию. Инкубируйте при температуре 37 °C в темноте в течение 4-6 часов, затем снова измерьте биолюминесценцию (длина волны излучения: 562 нм).
    5. Количественно оценить T6SS-зависимую антибактериальную активность путем сравнения значений биолюминесценции до и после совместного культивирования.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Обеспечьте тщательное перемешивание бактериальных суспензий, чтобы избежать экспериментальных ошибок. Для обеспечения надежности данных выполните не менее трех независимых репликаций для каждой выборки. Используйте t-критерий Стьюдента для статистического анализа.
  3. Определение активности T6SS с помощью маркировки GFP
    1. Следуйте той же процедуре, что и в эксперименте по мечению люциферазой (длина волны возбуждения: 480 нм, длина волны излучения: 509 нм).
    2. Смешайте E. coli (GFP) с мутантами WTR- и ΔtssM (OD600 , стандартизированный до 1,0) в соотношении 1:1. Нанесите 10 μL на агаровые пластины LB, не содержащие антибиотиков. После сушки на воздухе в режиме RT захватите изображения с помощью флуоресцентного канала GFP (программа Alex488, возбуждение: 488 нм, излучение: 509 нм) многофункциональной системы визуализации.
    3. Инкубируйте при температуре 37 °C в темноте в течение 4–6 часов, затем снова сделайте снимки. Оценка активности T6SS на основе изменения интенсивности флуоресценции бактериальных пятен.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Выполняйте все действия в темноте, чтобы избежать помех от флуоресцентных сигналов. Обеспечьте тщательное перемешивание бактериальных суспензий, чтобы избежать ошибок эксперимента. Для обеспечения надежности данных выполните не менее трех независимых репликаций для каждой выборки.
  4. Обнаружение проточной цитометрии
    1. Смешайте мутанты WTR- с E. coli (GFP) и ΔtssM с E. coli (GFP) в соотношении 1:1. Возьмите соответствующее количество смешанной бактериальной суспензии и разбавьте ее до подходящей концентрации (обычно наружный диаметр600 0,1-0,5) с использованием стерильного PBS или 1× буфера.
      ПРИМЕЧАНИЕ: 1× буфер относится к буферу для окрашивания проточной цитометрией (1×), ингредиенты включают: 1× PBS (137 мМ NaCl, 2,7 мМ KCl, 10 мМ Na2HPO4, 1,8 мМ KH2PO4, pH 7,4), дополненный: 2-5% (v/v) термоинактивированным FBS (или 1% BSA в качестве альтернативы), 2 мМ ЭДТА.
    2. Разбавленную смешанную бактериальную суспензию центрифугировать при 300 х г в течение 2 мин и выбросить надосадочную жидкость. Суспендируйте гранулу в 1 мл стерильного PBS или 1× буфера и аккуратно перемешайте. Отфильтруйте ресуспендированный раствор через сетчатый фильтр 35 мкм, чтобы удалить заполнители и обеспечить одноклеточную суспензию.
    3. Включите проточный цитометр, прогрейте лазер и откалибруйте прибор.
      1. Задайте параметры обнаружения: используйте лазер с длиной волны 488 нм для возбуждения GFP. Канал детектирования: FL1 (обычно фильтр 530/30 нм для детектирования флуоресценции GFP). Задайте параметры прямого рассеяния (FSC) и бокового рассеяния (SSC) для различения бактериальных клеток.
      2. Используйте немеченую E. coli в качестве отрицательного контроля, отрегулируйте напряжение и коэффициент усиления и убедитесь, что GFP-отрицательная популяция находится на базовой линии флуоресцентного сигнала.
    4. Аккуратно перемешайте отфильтрованный образец и переложите 100 мкл в пробирку для проточной цитометрии.
      1. Проанализируйте образцы с использованием следующих настроек прибора: Установите пороговое значение FSC-H на уровне 19 000, чтобы исключить мусор, со значениями усиления 100 (FSC), 110 (SSC) и 80 (FITC).
      2. Для стробирования сначала исключите мусор и нецелевые сигналы на диаграмме рассеяния FSC-A и SSC-A, а затем следует анализ популяции в канале FITC. Получите не менее 10 000 событий из целевой популяции (определяемой характеристиками FSC/SSC) для каждой выборки.
    5. Анализируйте данные с помощью программного обеспечения для проточной цитометрии (например, FlowJo, BD FACSDiva).
      1. Построение диаграмм рассеяния FSC и SSC для определения целевой бактериальной популяции. Построение гистограмм флуоресценции FL1 для различения GFP-положительных и GFP-отрицательных популяций.
      2. Рассчитайте процент GFP-положительных клеток и среднюю интенсивность флуоресценции (MFI).
    6. Оставшуюся смешанную бактериальную суспензию центрифугировать при 300 г в течение 2 мин и выбросить надосадочную жидкость. Повторно суспендируйте гранулу в 10 μл стерильной воды и поместите ее на пластины LB-агара, не содержащего антибиотиков.
    7. Инкубировать при температуре 37 °C в темноте в течение 5 ч, затем соскоблить бактериальные пятна и повторно суспендировать их в 500 мкл 1× PBS. Возьмите 100 мкл ресуспендированного раствора, разбавьте соответствующим образом и выполните детектирование проточной цитометрии, повторяя шаги 6.4.4-6.4.5.
    8. Сравните процент GFP-положительных клеток и интенсивность флуоресценции до и после совместного культивирования. Оцените убивающий эффект мутантов WTR- и ΔtssM на E. coli (GFP).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что суспензия одиночных клеток не влияет на результаты обнаружения. Откалибруйте прибор перед обнаружением, чтобы обеспечить точность и воспроизводимость сигналов флуоресценции. Избегайте воздействия на образцы яркого света во время эксперимента, чтобы предотвратить гашение флуоресценции GFP. Выполните не менее трех репликаций для каждой выборки, чтобы обеспечить надежность данных.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Традиционные методы обнаружения активности T6SS обычно включают совместное культивирование штаммов хищника и мишени на агаровых планшетах LB, не содержащих антибиотиков, в течение 5 ч с последующим соскабливанием бактериальных пятен, их суспендированием и выполнением серийных разведений. Затем разведенная бактериальная суспензия наносится на селективные агаровые пластины. Подсчитывая колонии целевого штамма на планшетах на следующий день, можно качественно оценить активность T6SS. Однако этот метод имеет ограничения, в т...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Система секреции VI типа (T6SS) представляет собой сложный мультибелковый механизм, функции которого реализуются в первую очередь за счет секреции эффекторных белков. Эти эффекторные белки опосредуют межбактериальную конкуренцию путем уничтожения или ингибирования других видов бактерий, тем самым обеспечивая бактерии-хозяину конкурентное преимущество в микробныхсообществах. Помимо его роли в конкуренции, исследования показали, что T6SS участвует в различных клеточ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы выражаем признательность и благодарность всем авторам, а также всей лаборатории за помощь в технической поддержке и рецензировании рукописей. Эта работа была поддержана проектом «Бетьюн» Цзилиньского университета 2024B20 и Проектом развития науки и технологий города Чанчунь 23YQ10, а также Национальным крупным проектом «Неинфекционные хронические заболевания» 2024ZD0529700.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
10%, 15% SDS-PAGE Набор для приготовления геляEpizymePG112-20
° C Морозильная камераHaierHYCD-290
37° C ИнкубаторBluepard181254254
4° C ХолодильникHaierHYC390-80
° C Морозильная камераHaierDW-86L726G(726L)
96-луночная пластинаJETTCP010096
АгарBiofrox8211KG001
Персульфат аммония (APS)Thermo7727-54-0
Шкаф биологической безопасностиESCOAC2-4S1 
Электронные весыSartorius AGBSA124S-CW
Аппарат для электрофорезаBIO-RADPOWER
Машина для чешуйчатого льдаGRANTXB70
Проточный цитометрBECKMAN COULTERAW38143
Проточная цитометрия Окрашивание буфераProteintechPF00018
Gel Imaging SystemBIO-RADGel Doc 2000
GlycineZikeZK-L2577
Высокоскоростная центрифугаEppendorf5405IN106358
HRP-конъюгированное вторичное антитело кролика/мышиproteintechSA00001-2
LB БульонSolarbioL8291
Низкотемпературная высокоскоростная центрифугаThermo17R
МетанолThermoR40121
Микро УФ-Вид спектрофотометрThermoNanodrop один
МикроцентрифугаallshengMini-6k
Считыватель микропланшетовBio-TekH1M
NuPAGE LDS Буфер для образцовThermoNP0007
Фосфатный буферный раствор (PBS) ZikeZK-L1649
Precision Plus Protein Dual Color StandardsBio-Rad1610374
SDS Буфер для загрузки образцовBeyotimepoo15L
Сухое обезжиренное молокоThermoLP0033B
додецилсульфат натрия (SDS)Zikezk6885
Термостатическая водяная баняJingHongDK-420S
Аппарат для переносаBio-RadPowerPac HC
Tris(hydroxymethyl)аминометан (Tris)ZikeZK-L2557
Аппарат для вертикального электрофорезаBio-RadMii-PROTEAN Tetra
PAC1000 данных

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kapitein, N., Mogk, A. Type VI secretion system helps find a niche. Cell Host Microbe. 16 (1), 5-6 (2014).
  2. Carruthers, M. D., Nicholson, P. A., Tracy, E. N., Munson, R. S. Jr Acinetobacter baumannii utilizes a type VI secretion system for bacterial competition. PLoS One. 8 (3), e59388(2013).
  3. Kandolo, O., et al. Acinetobacter type VI secretion system comprises a non-canonical membrane complex. PLoS Pathog. 19 (9), e1011687(2023).
  4. Boyer, F., Fichant, G., Berthod, J., Vandenbrouck, Y., Attree, I. Dissecting the bacterial type VI secretion system by a genome-wide in silico analysis: what can be learned from available microbial genomic resources. BMC Genomics. 10, 104(2009).
  5. Russell, A. B., Peterson, S. B., Mougous, J. D. Type VI secretion system effectors: poisons with a purpose. Nat Rev Microbiol. 12 (2), 137-148 (2014).
  6. Pogue, J. M., Kaye, K. S., Cohen, D. A., Marchaim, D. Appropriate antimicrobial therapy in the era of multidrug-resistant human pathogens. Clin Microbiol Infect. 21 (4), 302-312 (2015).
  7. McConnell, M. J., Actis, L., Pachón, J. Acinetobacter baumannii: human infections, factors contributing to pathogenesis and animal models. FEMS Microbiol Rev. 37 (2), 130-155 (2013).
  8. Wong, D., et al. Clinical and pathophysiological overview of Acinetobacter infections: a century of challenges. Clin Microbiol Rev. 30 (1), 409-447 (2017).
  9. de Berardinis, V., et al. A complete collection of single-gene deletion mutants of Acinetobacter baylyi ADP1. Mol Syst Biol. 4, 174(2008).
  10. Weber, B. S., et al. Genetic dissection of the type VI secretion system in Acinetobacter and identification of a novel peptidoglycan hydrolase, TagX, required for its biogenesis. mBio. 7 (5), e01253-e01316 (2016).
  11. Scherzinger, E., et al. Replication of the broad host range plasmid RSF1010: requirement for three plasmid-encoded proteins. Proc Natl Acad Sci U S A. 81 (3), 654-658 (1984).
  12. Weber, B. S., Ly, P. M., Irwin, J. N., Pukatzki, S., Feldman, M. F. A multidrug resistance plasmid contains the molecular switch for type VI secretion in Acinetobacter baumannii. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (30), 9442-9447 (2015).
  13. Gallagher, S. R. One-dimensional SDS gel electrophoresis of proteins. Curr Protoc Mol Biol. Chapter 10 (unit 10.2A), (2012).
  14. Tsien, R. Y. The green fluorescent protein. Annu Rev Biochem. 67, 509-544 (1998).
  15. Cianfanelli, F. R., Monlezun, L., Coulthurst, S. J. Aim, load, fire: the type VI secretion system, a bacterial nanoweapon. Trends Microbiol. 24 (1), 51-62 (2016).
  16. Hood, R. D., et al. A type VI secretion system of Pseudomonas aeruginosa targets a toxin to bacteria. Cell Host Microbe. 7 (1), 25-37 (2010).
  17. Silverman, J. M., Brunet, Y. R., Cascales, E., Mougous, J. D. Structure and regulation of the type VI secretion system. Annu Rev Microbiol. 66, 453-472 (2012).
  18. Smith, M. G., et al. New insights into Acinetobacter baumannii pathogenesis revealed by high-density pyrosequencing and transposon mutagenesis. Genes Dev. 21 (5), 601-614 (2007).
  19. Repizo, G. D., et al. Differential role of the T6SS in Acinetobacter baumannii virulence. PLoS One. 10 (9), e0138265(2015).
  20. Lin, J., et al. A Pseudomonas T6SS effector recruits PQS-containing outer membrane vesicles for iron acquisition. Nat Commun. 8, 14888(2017).
  21. Bernard, C. S., Brunet, Y. R., Gueguen, E., Cascales, E. Nooks and crannies in type VI secretion regulation. J Bacteriol. 192 (15), 3850-3860 (2010).
  22. Sana, T. G., et al. Salmonella Typhimurium utilizes a T6SS-mediated antibacterial weapon to establish in the host gut. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (34), E5044-E5051 (2016).
  23. Contag, C. H., Bachmann, M. H. Advances in in vivo bioluminescence imaging of gene expression. Annu Rev Biomed Eng. 4, 235-260 (2002).
  24. Meighen, E. A. Bacterial bioluminescence: organization, regulation, and application of the lux genes. Faseb J. 7 (11), 1016-1022 (1993).
  25. Close, D. M., et al. Autonomous bioluminescent expression of the bacterial luciferase gene cassette (lux) in a mammalian cell line. PLoS One. 5 (8), e12441(2010).
  26. Pletzer, D., et al. The Pseudomonas aeruginosa PA14 ABC transporter NppA1A2BCD is required for uptake of peptidyl nucleoside antibiotics. J Bacteriol. 197 (13), 2217-2228 (2015).
  27. Szittner, R., Meighen, E. Nucleotide sequence, expression, and properties of luciferase coded by lux genes from a terrestrial bacterium. J Biol Chem. 265 (27), 16581-16587 (1990).
  28. Daaboul, G. G., et al. Digital detection of exosomes by interferometric imaging. Sci Rep. 6, 37246(2016).
  29. Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nat Methods. 2 (12), 905-909 (2005).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Type VI SecretionT6SS ActivityAcinetobacter BaumanniiFluorescence DetectionLuciferase LabelingGFP LabelingFlow CytometryBacterial Killing AssayHcp SecretionTssM Gene
Video Coming Soon

Related Articles