Создание и сравнение методов определения активности T6SS на основе флуоресценции у Acinetobacter baumannii

Summary

В данной работе мы предлагаем метод количественного обнаружения, основанный на флуоресцентном мечении (особенно люциферазе) для эффективной и точной оценки активности бактериального T6SS, который подходит для высокопроизводительного анализа клинических штаммов.

Abstract

Система секреции VI типа (T6SS) является важнейшим механизмом, опосредующим межклеточные взаимодействия у грамотрицательных бактерий, особенно у патогенных видов, таких как Acinetobacter baumannii. Предыдущие исследования показали, что большая плазмида pAB3 в штамме A. baumannii ATCC 17978 кодирует TetR-подобный белок, который ингибирует экспрессию основных генов T6SS. Напротив, штамм^{WT R-} , в котором отсутствует pAB3, может стабильно экспрессировать и секретировать эффекторный белок T6SS Hcp и проявляет способность убивать E. coli. Ген tssM , один из основных генов T6SS, необходим для его активности; его удаление напрямую приводит к инактивации T6SS. Тем не менее, традиционные методы определения активности T6SS, такие как убийственные анализы, имеют низкую пропускную способность и недостаточную чувствительность. Чтобы обойти эти ограничения, мы разработали количественные методы обнаружения, основанные на флуоресцентном мечении.

Для улучшения детектирования активности T6SS мы разработали три метода флуоресцентного мечения: (1) метод количественного детектирования, основанный на мечении люциферазой, который характеризуется высокой специфичностью, чувствительностью и воспроизводимостью, что делает его пригодным для высокопроизводительного анализа; (2) Метод детектирования, основанный на мечении зеленым флуоресцентным белком (GFP), который, несмотря на свою восприимчивость к воздействию окружающей среды, имеет преимущество высокой пропускной способности; (3) Обнаружение проточной цитометрии, которое может количественно оценить жизнеспособность бактерий, но является сложным и дорогостоящим с операционной точки зрения. После всестороннего сравнения метод маркировки на основе люциферазы оказался наиболее точным, чувствительным и удобным для пользователя. При применении к 20 клиническим изолятам A. baumannii было подтверждено, что этот метод позволяет быстро и точно оценить активность T6SS.

Introduction

Система секреции VI типа (T6SS) является важной системой секреции белка у грамотрицательных бактерий, широко участвующей в бактериальной конкуренции, антагонизме против эукариотических хозяев и регуляции иммунных реакций хозяина ^1,2. Вводя токсичные эффекторные белки в соседние бактерии или эукариотические клетки, T6SS помогает бактериям сохранять конкурентное преимущество в сложных условиях. В последние годы значительная роль T6SS в бактериальной адаптивности, патогенности и микробных взаимодействиях сделала его горячей точкой исследований, особенно у патогенов с множественно....

Protocol

1. Источники штаммов и плазмид

1. Используйте стандартный штамм A. baumannii ATCC 17978, E. coli (pZY01) и клинический штамм A. baumannii , выделенный из отделения лабораторной медицины Первой больницы Цзилиньского университета.
2. Используйте плазмиду pZY01-GFP (несущую ген устойчивости к канамицину, способный к стабильной экспрессии у A. baumannii), которая была модифицирована и сохранена в лаборатории, и коммерчески приобретенную плазмиду pGEN-luxCDABE (несущую ген устойчивости к ампициллину).
3. Культура A. baumannii и E. coli в среде Лур....

Results

Традиционные методы обнаружения активности T6SS обычно включают совместное культивирование штаммов хищника и мишени на агаровых планшетах LB, не содержащих антибиотиков, в течение 5 ч с последующим соскабливанием бактериальных пятен, их суспендированием и выполнением серийных разведений. Затем разведенная бактериальная суспензия наносится на селективные агаровые пластины. Подсчитывая колонии целевого штамма на планшетах на следующий день, можно качественно оценить активность T6SS. Однако этот метод имеет ограничения, в т.......

Discussion

Система секреции VI типа (T6SS) представляет собой сложный мультибелковый механизм, функции которого реализуются в первую очередь за счет секреции эффекторных белков. Эти эффекторные белки опосредуют межбактериальную конкуренцию путем уничтожения или ингибирования других видов бактерий, тем самым обеспечивая бактерии-хозяину конкурентное преимущество в микробных^{сообществах}. Помимо его роли в конкуренции, исследования показали, что T6SS участвует в различных клеточ.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
10%, 15% SDS-PAGE Набор для приготовления геля	Epizyme	PG112-20
° C Морозильная камера	Haier	HYCD-290
37° C Инкубатор	Bluepard	181254254
4° C Холодильник	Haier	HYC390-80
° C Морозильная камера	Haier	DW-86L726G(726L)
96-луночная пластина	JET	TCP010096
Агар	Biofrox	8211KG001
Персульфат аммония (APS)	Thermo	7727-54-0
Шкаф биологической безопасности	ESCO	AC2-4S1
Электронные весы	Sartorius AG	BSA124S-CW
Аппарат для электрофореза	BIO-RAD	POWER
Машина для чешуйчатого льда	GRANT	XB70
Проточный цитометр	BECKMAN COULTER	AW38143
Проточная цитометрия Окрашивание буфера	Proteintech	PF00018
Gel Imaging System	BIO-RAD	Gel Doc 2000
Glycine	Zike	ZK-L2577
Высокоскоростная центрифуга	Eppendorf	5405IN106358
HRP-конъюгированное вторичное антитело кролика/мыши	proteintech	SA00001-2
LB Бульон	Solarbio	L8291
Низкотемпературная высокоскоростная центрифуга	Thermo	17R
Метанол	Thermo	R40121
Микро УФ-Вид спектрофотометр	Thermo	Nanodrop один
Микроцентрифуга	allsheng	Mini-6k
Считыватель микропланшетов	Bio-Tek	H1M
NuPAGE LDS Буфер для образцов	Thermo	NP0007
Фосфатный буферный раствор (PBS) Zike		ZK-L1649
Precision Plus Protein Dual Color Standards	Bio-Rad	1610374
SDS Буфер для загрузки образцов	Beyotime	poo15L
Сухое обезжиренное молоко	Thermo	LP0033B
додецилсульфат натрия (SDS)	Zike	zk6885
Термостатическая водяная баня	JingHong	DK-420S
Аппарат для переноса	Bio-Rad	PowerPac HC
Tris(hydroxymethyl)аминометан (Tris)	Zike	ZK-L2557
Аппарат для вертикального электрофореза	Bio-Rad	Mii-PROTEAN Tetra