Методическая статья

Изучение взаимодействий между миелоидными клетками и CAR-Т-клетками in vitro и in vivo

1.3K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/68013

⸱

25 июля 2025 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1T Cell Engineering, Mayo Clinic, 2Department of Molecular Medicine, Mayo Clinic, 3Mayo Clinic Graduate School of Biomedical Sciences, 4Division of Hematology, Mayo Clinic, 5Department of Immunology, Mayo Clinic

В этой статье

Краткое содержание

Учитывая ограниченные модели ксенотрансплантатов, доступные для изучения взаимодействий между человеческим CART и миелоидными клетками, мы создали модели in vitro и in vivo , чтобы понять влияние макрофагов человека на клетки CART. Полученные данные потенциально могут быть обобщены для оценки роли макрофагов в микроокружении опухоли и тестирования иммунотерапии, направленной на макрофаги.

Аннотация

Терапия клетками химерного антигенного рецептора Т (CART) привела к замечательным клиническим успехам в лечении гематологических злокачественных новообразований. Однако у большинства пациентов возникает рецидив в течение 1-2 лет. Было выявлено несколько механизмов, приводящих к резистентности к CART, включая ингибирование Т-клеток иммуносупрессивными миелоидными клетками. Растущее количество данных свидетельствует о том, что моноциты и макрофаги в опухолевом микроокружении (ТМЭ) способствуют снижению эффективности CART и клиническим исходам. Доклинические модели для изучения взаимодействий между макрофагами человека и клетками CART ограничены. В этой статье мы обсуждаем подходы к пониманию воздействия макрофагов человека на клетки CART как in vitro , так и in vivo. Мы описываем модели кокультуры in vitro , чтобы показать, что иммуносупрессивные макрофаги ингибируют функции CART. Кроме того, мы сообщаем о модели ксенотрансплантата, в которой макрофаги и опухолевые клетки человека подкожно приживаются мышам NSG для изучения взаимодействия M2-подобных макрофагов с клетками CART и опухолевыми клетками. Эти модели могут быть использованы для оценки роли макрофагов в ТМЭ и тестирования иммунотерапии рака, направленной на макрофаги.

Введение

Терапия аутологичными химерными антигенными рецепторами T (CART) достигла клинических успехов в лечении рецидивирующих или рефрактерных гематологических злокачественных новообразований, что привело к одобрению FDA США шести продуктов CART, нацеленных на CD19 или антиген созревания B-клеток (BCMA)1. Несмотря на впечатляющую начальную активность клеточной терапии CART, у большинства пациентов наблюдается рецидив в течение первых 1-2 лет после лечения2. Было выявлено несколько механизмов резистентности к CART, включая неоптимальную приспособленность Т-клеток, ускользание от антигена и плохую персистенцию CART, а также ингибирование, опосредованное иммуносупрессивным микроокружением опухоли (TME)2,3. Миелоидные клетки, такие как моноциты и макрофаги, часто составляют значительную часть ТМЭ и, как было показано, являются основными ингибиторами других иммунных клеток, включая Т-клетки 4,5. О вредном воздействии миелоидных клеток в контексте терапевтической эффективности CART-клеток сообщалось в доклинических моделях и клинических испытаниях как гематологических, так и солидных опухолей 3,6. Миелоид-опосредованное ингибирование может происходить с самого начала процесса производства CART — было продемонстрировано, что моноциты в исходном продукте афереза ингибируют ex vivo экспансию CART 7,8. Учитывая накапливающиеся доказательства миелоид-опосредованного ингибирования CART, многие исследования были направлены на создание CART-клеток для нацеливания и элиминации иммуносупрессивных макрофагов в TME для лучшегоиммунного ответа. Тем не менее, механизмы взаимодействия между клетками CART и иммуносупрессивными макрофагами до сих пор полностью не выяснены. Кроме того, существует ограниченное количество общедоступных моделей ксенотрансплантатов этих взаимодействий. В связи с этим существует острая потребность в моделях, изучающих взаимодействие между макрофагами человека и клетками CART как in vitro, так и на мышиных моделях.

В данной статье мы описываем метод, при котором клетки CART (CART19) человека, нацеленные на CD19, культивируются совместно с опухолевыми клетками CD19+ и ex vivo поляризованными M2-подобными макрофагами. Кроме того, мы сообщаем о мышиной модели ксенотрансплантата, в которой мышам с иммунодефицитом подкожно приживляются как клетки-мишени, так и макрофаги человека, что позволяет оценить представляющие интерес иммунотерапевтические методы в условиях иммуносупрессивных макрофагов. В частности, мы проанализировали антиген-специфическую пролиферацию CART в присутствии или отсутствии иммуносупрессивных макрофагов in vitro, показав значительное ингибирование экспансии Т-клеток как в трансвелл, так и в прямых кокультуральных планшетах. В нашей модели ксенотрансплантата мышам NSG подкожно приживляли опухолевые клетки и человеческие макрофаги, суспендированные в Матригеле, для терапевтического скрининга. Эта животная модель успешно показала, что ex vivo дифференцированные иммуносупрессивные макрофаги человека способны способствовать прогрессированию опухоли у мышей NSG. Следуя этому протоколу, можно проверить эффективность иммуносупрессивных макрофагальных препаратов, в том числе низкомолекулярных препаратов, биологических препаратов и других клеточных терапий. Однако, в связи с ограничениями использования иммунодефицитных мышей для изучения ТМЭ человека, предложенные модели лучше всего подходят для экспериментальных исследований.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Приведенный ниже протокол соответствует рекомендациям Институционального наблюдательного совета (IRB), Институционального комитета по биобезопасности (IBC) и Департамента сравнительной медицины в соответствии с протоколом A00001767 Институционального комитета по уходу за животными и их использованию.

1. Подготовка классических моноцитов человека к исследованию in vitro

  1. Выделение мононуклеарных клеток периферической крови (ПМЦ) из здоровых доноров крови, как описано ранее9. Вкратце, разбавляют цельную кровь 2% FBS в PBS в объемном соотношении 1:1 с последующим выделением PBMC в среде с градиентом плотности.
  2. Выделение классических моноцитов человека (CD14+CD16-) из собранных МПК путем отбора отрицательных магнитных шариков в соответствии с инструкциями производителя (Таблица материалов). Кратко промыть соответствующее количество PBMC с изоляционным буфером и ресуспендировать элементы в указанном объеме в соответствии с инструкциями производителя. Помечайте клетки, кроме классических моноцитов, коктейлем антител и магнитными микрогранулами. Соберите классические моноциты из проточного канала, сохраняя при этом немоноциты в колонках.
    Примечание: Предположим, что 5% всех PBMC являются классическими моноцитами, и соответствующим образом отрегулируйте количество начальных клеток PBMC. Сохраните оставшиеся PBMC для подтверждения чистоты популяции моноцитов на шаге 1.7. Классические моноциты всегда следует выделять из свежих ПМК без предварительной криоконсервации.
  3. Подсчитайте количество выделенных моноцитов с помощью клеточного счетчика (Таблица материалов) и понизьте количество клеток при 300 x g при 4 °C в течение 5 минут. Ресуспендируйте клетки в изоляционном буфере до достижения конечной концентрации 1 x 106 клеток/мл. Возьмите 100 мкл клеточной суспензии и переложите в 96-луночный планшет с плоским дном.
  4. Перенесите 1 x 105 PBMC в ту же тарелку в качестве отрицательного контроля стробирования для подтверждения чистоты классической популяции моноцитов с помощью проточной цитометрии. Вращайте ячейки при 300 x g при 4 °C в течение 3 минут. Держите изолированные моноциты на льду во время этапов 1.5-1.12.
  5. Промойте ячейки суспензией с 200 μл буфера FACS и отжимайте ячейки при 300 x g при 4 °C в течение 3 минут. Аккуратно сцедите надосадочную жидкость.
  6. Для каждого образца готовят 50 мкл буфера FACS, содержащего 0,3 мкл живого/мертвого реагента (возбуждение при 405 нм), 0,5 мкл APC-конъюгированного античеловеческогоCD14 10 (1 нг/мкл) и 0,5 мкл ПЭ-конъюгированного античеловеческого CD1611 (1 нг/мкл; Таблица материалов).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы обеспечить равномерное окрашивание, создайте мастер-микс для нескольких образцов в соответствии с общим количеством образцов. В каждую лунку перелейте по 50 μл раствора для окрашивания.
  7. Добавьте в каждую лунку по 50 мкл раствора для окрашивания и аккуратно перемешайте клетки, чтобы избежать образования пузырьков. Инкубировать клетки в темноте при комнатной температуре в течение 15 минут.
  8. Добавьте 200 μL буфера FACS в каждую лунку и вращайте ячейки при 300 x g при 4 °C в течение 3 минут. Аккуратно сцедите надосадочную жидкость.
  9. Промойте, добавив 200 μL буфера FACS в каждую лунку, и подавите ячейки при 300 x g при 4 °C в течение 3 минут. Осторожно сцедите надосадочную жидкость и ресуспендируйте клетки в 200 мкл буфера FACS. Запустите образцы на проточном цитометре (Таблицы материалов).
  10. Популяция ворот CD14+CD16. Убедитесь, что популяция CD14+CD16- превышает 90% живых клеток для идеальной чистоты. Gate CD14+CD16- популяция живых синглетов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Предполагается, что пользователи знакомы с анализом проточной цитометрии.

2. Дифференцировка макрофагов M0 от классических моноцитов человека

Примечание: Дифференцировка М2-подобных макрофагов от классических моноцитов человека адаптирована из предыдущей публикации12.

  1. Отвращать изолированные моноциты при 300 x g при 4 °C в течение 5 мин и аспирировать надосадочную жидкость. Ресуспендируйте клетки в клеточных культуральных средах до достижения конечной концентрации 1 x 106 клеток/мл.
  2. Добавьте человеческий рекомбинант GM-CSF до конечной концентрации 10 нг/мл (Таблица материалов) и хорошо перемешайте. Перенесите 100 мкл клеток в обработанный тканевой культурой 48-луночный планшет и добавьте еще 50 мкл среды для клеточных культур. Убедитесь, что каждое условие имеет 3 репликации для окончательного считывания на 11-й день.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Пользователи могут добавить больше экспериментальных групп соответственно. Этот протокол включает только экспериментальные кокультуры опухолевых клеток и Т-клеток с М2-подобными макрофагами или без них (Таблица 1).
  3. Перенесите 100 мкл клеток в другой 48-луночный планшет и добавьте еще 50 мкл среды для клеточных культур для фенотипирования макрофагов. Обязательно включите одну лунку для фенотипирования М0-макрофагов и одну для фенотипирования М2-подобных макрофагов.
  4. Добавьте 200 мкл PBS в окружающие лунки, чтобы предотвратить испарение клеточной культуры. Инкубируйте моноциты при 37 °C в течение 7 дней для дифференцировки клеток в макрофаги M0.
  5. Для изучения взаимодействий между дифференцированными макрофагами и донор-совместимыми клетками CART19 выделите 1 x 107 Т-клеток из PBMC того же донора и сгенерируйте клетки CART19 после 8-дневной процедуры производства CART, как описано ранее 9,13,14.
    ПРИМЕЧАНИЕ: CART-клетки, коформатированные с сигнальным доменом CD28, генерируются из 5 x 106 Т-клеток, как описано ранее 9,13,14. Параллельно с этим по той же схеме генерируются нетрансдуцированные (UTD) Т-клетки 9,13,14. Т-клетки UTD будут использоваться в качестве отрицательного контроля в пролиферации Т-клеток для контроля аллогенной пролиферации.

3. Дифференцировка М2-подобных макрофагов от М0 через кокультуру с клетками-мишенями

  1. На 7-й день возьмите 48-луночный планшет с макрофагами M0 и инкубируйте на льду не менее 30 минут. Энергично пипетируйте клетки постоянно, удерживая пластину на льду.
    Примечание: Продолжительность инкубации льда зависит от того, насколько адгезивы макрофаги, которые могут отличаться из-за дисперсии доноров. Первое смешивание заключается в сборе слабо адгезивных макрофагов, поэтому 5-минутного пипетирования должно быть достаточно.
  2. Переложите отделенные ячейки в свежую коническую пробирку объемом 15 мл (Таблица материалов), предварительно охлажденную на льду. Добавьте 200 мкл ледяного PBS в лунки 48-луночного планшета и энергично пипетируйте оставшиеся клетки каждые 10 мин до тех пор, пока большинство макрофагов не отделится от дна. После каждого пипетирования проверяйте клетки под микроскопом и при необходимости корректируйте время инкубации льда, увеличивая время инкубации для большего количества адгезивных клеток.
  3. Перенесите оставшиеся отделившиеся макрофаги M0 в коническую пробирку объемом 15 мл на льду. Тщательно перемешивайте ячейки и подсчитывайте ячейки на счетчике ячеек.
  4. Понизьте температуру клеток при 300 x g при 4 °C в течение 5 мин и аспирируйте надосадочную жидкость. Ресуспендируйте в ледяном PBS до достижения конечной концентрации 1 x 106 клеток/мл.
  5. Перенесите 200 мкл ячеек в 96-луночный планшет с плоским дном (Таблицы материалов). Вращайте ячейки при 300 x g при 4 °C в течение 3 минут. Аккуратно сцедите надосадочную жидкость. В качестве отрицательного контроля стробирования добавьте дополнительную лунку, окрашенную маркерами только родительской популяции.
  6. Добавьте в каждый образец 100 мкл буфера FACS с добавлением 1 мкл раствора, блокирующего Fc-рецепторы. Инкубировать клетки в течение 10 мин при комнатной температуре. Вращайте ячейки при 300 x g при 4 °C в течение 3 минут. Аккуратно сцедите надосадочную жидкость.
    Примечание: Важно предварительно инкубировать макрофаги с буфером, блокирующим Fc-рецепторы, до фактического окрашивания маркеров, чтобы предотвратить ложноположительные результаты.
  7. Для лунки для образца готовят 50 мкл буфера FACS, содержащего 0,3 мкл живого/мертвого реагента (возбуждение при 405 нм), 0,5 мкл APC-конъюгированного античеловеческогоCD14 10 (1 нг/мкл), 0,5 мкл APC/Cy7-конъюгированного античеловеческого CD20615 (2 нг/мкл) и 0,5 мкл PerCP-конъюгированного античеловеческого CD16316 (2 нг/μл; Таблица материалов). Для контроля отрицательного стробирования готовят 50 мкл буфера FACS, содержащего 0,3 мкл живого/мертвого реагента и 0,5 мкл APC-конъюгированного античеловеческого CD14.
  8. Добавьте в каждую лунку по 50 мкл раствора для окрашивания и аккуратно перемешайте клетки, чтобы избежать образования пузырьков. Инкубировать клетки в темноте при комнатной температуре в течение 15 минут.
  9. Добавьте 200 мкл буфера FACS в каждую лунку. Вращайте ячейки при 300 x g при 4 °C в течение 3 минут. Аккуратно сцедите надосадочную жидкость.
  10. Промойте, добавив 200 мкл буфера FACS. Вращайте ячейки при 300 x g при 4 °C в течение 3 минут. Осторожно сцедите надосадочную жидкость и ресуспендируйте клетки в 200 мкл буфера FACS.
  11. Проведите отбор образцов на проточном цитометре и зарегистрируйте популяцию клеток CD14+CD206+CD163+. Используйте экспрессию CD163 и CD206 на М0-макрофагах в качестве исходного уровня для М2-подобных фенотипов. В М2-подобных макрофагах ожидается миграция популяций от низкого CD163 CD206до CD163высокого или CD206высокого. Величина сдвига численности населения может зависеть от доноров.
  12. Подготовьте интересующую линию опухолевых клеток и подсчитайте на счетчике клеток.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В этом протоколе в качестве мишени используется неадгезивная клеточная линия мантийноклеточной лимфомы CD19+, JeKo-1. Другие линии опухолевых клеток и их способность дифференцировать М0 в М2-подобные макрофаги могут быть проверены по мере необходимости.
    1. Поддерживайте клетки JeKo-1 с помощью рекомендованных поставщиком питательных сред (Таблица материалов) в концентрации 1 x 106 клеток/мл в колбе для культуры тканей. Смешайте опухолевые клетки в колбе и подсчитайте их с помощью счетчика клеток.
  13. Вращайте клетки-мишени при 300 x g при 4 °C в течение 3 мин и аспирируйте надосадочную жидкость. Ресуспендируйте клетки-мишени с помощью клеточных культуральных сред до достижения конечной концентрации 2 x 106 клеток/мл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте соответствующее количество опухолевых клеток исходя из количества экспериментальных групп. Убедитесь, что существует 2 x 105 клеток-мишеней для каждой группы кокультуры М2-подобных макрофагов, включая пластину для фенотипирования М2.
  14. Перенесите 100 мкл опухолевых клеток в группы кокультуры М2-подобных макрофагов в 48-луночный планшет, приготовленный в день 0, и осторожно перемешайте с помощью пипетки. Инкубируйте клетки при 37 °C в течение еще 24 ч.
    Примечание: Соотношение макрофагов JeKo-1:M0 в соотношении 2:1 было протестировано на дифференциацию М2-подобного фенотипа. Другие соотношения могут быть протестированы по мере необходимости.
  15. На 8-й день положите на лед М2-подобную фенотипическую пластину, энергично отделите клетки и подготовьтесь к фенотипированию, как описано в шагах 3.4-3.11.
    Примечание: М2-подобные макрофаги гораздо более адгезивы, чем М0-макрофаги, поэтому ожидается необходимость более длительной инкубации льда. В этом протоколе используется только лед и ледяной PBS для отделения макрофагов, чтобы свести к минимуму стресс для клеток.
  16. Объедините файлы проточной цитометрии фенотипирования M0 с 7-го дня с M2-подобным фенотипированием. Gate CD206 и CD163 родительской клеточной популяции CD14+ образца макрофагов M0 и примените ту же стратегию гейтирования к образцу M2-подобных макрофагов для визуализации популяционного сдвига.
  17. Чтобы ввести Т-клетки в кокультуры, собирают Т-клетки CART19 и UTD на 8-й день, полученные на этапе 2.5, и переносят клетки в конические пробирки объемом 50 мл. Хорошо перемешайте пипеткой и посчитайте с помощью счетчика клеток.
  18. Понизьте температуру клеток при 300 x g при 4 °C в течение 5 минут и осторожно аспирируйте надосадочную жидкость. Ресуспендируйте Т-клетки CART или UTD в клеточных культуральных средах до достижения конечной концентрации 2 x 106 клеток/мл.
  19. Подготовьте линию опухолевых клеток и посчитайте на клеточном счетчике. Раскрутите клетки при 300 x g при 4 °C в течение 5 минут и аспирируйте надосадочную жидкость.
  20. Ресуспендируйте опухолевые клетки с помощью клеточных культуральных сред до достижения конечной концентрации 2 x 106 клеток/мл. Перенесите 100 мкл опухолевых клеток в кокультуральные лунки без М2-подобных макрофагов (табл. 1).
  21. Перенесите 100 μL Т-клеток CART или UTD в соответствующие лунки для кокультуры (Таблица 1). Конечная кокультура с М2-подобными макрофагами должна содержать опухолевые клетки, Т-клетки и макрофаги в соотношении 2:2:1. Используйте в качестве контроля кокультуры без макрофагов.
  22. Чтобы сохранить постоянный конечный объем между группами, добавьте еще 100 мкл среды для клеточных культур в лунки без макрофагов. Инкубируйте клетки при 37 °C в течение 3 дней.
    Примечание: Если используются аллогенные CART-клетки, пользователи должны включить донор-совместимые UTD Т-клетки в кокультуры в качестве надлежащего контроля для обнаружения любой аллогенно-индуцированной экспансии Т-клеток. В этом случае криоконсервированные ранее сгенерированные Т-клетки CART и UTD должны быть разморожены и восстановлены должным образом, после чего необходимо отдохнуть не менее 3-4 часов перед добавлением в кокультуры.

4. Анализ антиген-специфической пролиферации кокультур

  1. На 11-й день поместите планшет для совместной культуры на лед и энергично пипетируйте клетки. Хорошо перемешайте ячейки и переложите их в микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл.
    Примечание: Основным считыванием данных кокультур является количественная оценка роста Т-клеток, поэтому отделение макрофагов не является необходимым, если пользователи не планируют анализировать другие маркеры на макрофагах в той же панели.
  2. Добавьте 200 μL ледяного PBS в лунки для образцов и энергично пипетируйте. Остатки раствора переложите в те же микроцентрифужные пробирки.
  3. Проверьте лунки под микроскопом (10x), чтобы убедиться, что суспензия полностью собирается. Понизьте температуру клеток при 300 x g при 4 °C в течение 5 мин и аспирируйте надосадочную жидкость.
  4. Ресуспендируйте ячейки из всех условий с помощью 200 мкл буфера FACS и перенесите в 96-луночный планшет с плоским дном. Вращайте ячейки при 300 x g при 4 °C в течение 3 минут. Аккуратно сцедите надосадочную жидкость.
  5. Приготовьте 50 мкл буфера FACS, содержащего 0,3 мкл живого/мертвого реагента (возбуждение при 405 нм) и 0,5 мкл APC-конъюгированного античеловеческого CD317 (1 нг/мкл; Таблица материалов) для каждой пробы лунка. Добавьте в каждую лунку по 50 мкл раствора для окрашивания и тщательно перемешайте клетки пипеткой, чтобы избежать образования пузырьков.
    ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе будут гранулы с большими ячейками. Чтобы убедиться в том, что все Т-клетки окрашены, проверьте дно планшета, чтобы убедиться, что после тщательного перемешивания не осталось гранул клеток.
  6. Инкубировать клетки в темноте при комнатной температуре в течение 15 минут. Добавьте 200 мкл буфера FACS в каждую лунку. Вращайте ячейки при 300 x g при 4 °C в течение 3 минут. Аккуратно сцедите надосадочную жидкость.
  7. Промойте, добавив 200 мкл буфера FACS. Вращайте ячейки при 300 x g при 4 °C в течение 3 минут. Осторожно сцедите надосадочную жидкость и ресуспендируйте клетки в 200 мкл буфера FACS.
  8. Прогоните образцы на проточном цитометре. Зарегистрируйте CD3+ клетки и количественно определите абсолютное количество живых CD3+ клеток, как показано ниже:
    figure-protocol-1
  9. Отобразите на графике абсолютное количество клеток CD3+ в каждом состоянии с помощью GraphPad Prism.
    Примечание: Ожидается, что кокультуры с М2-подобными макрофагами будут иметь гораздо более низкое абсолютное число CD3 Т-клеток, чем условия при отсутствии М2-подобных макрофагов.

5. Влияние М2-подобных макрофагов на CART-клетки в трансвелл-системе

Планшеты Transwell физически отделяют M2-подобные макрофаги от стимулированных CART-клеток и позволяют только растворимым молекулам перемещаться между типами клеток, что позволяет пользователям изучать динамику контактно-независимых взаимодействий между макрофагами и CART-клетками (рис. 1).

  1. Выделите 1 x 106 классических моноцитов человека и подтвердите чистоту популяции с помощью проточной цитометрии, как описано на этапах 1.1-1.10. Вращайте 1 x 106 моноцитов при 300 x g при 4 °C в течение 5 мин и аспирируйте надосадочную жидкость.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Пользователи могут захотеть создать автологичное CART и донор-совместимые UTD-клетки, как описано в шаге 2.5.
  2. Ресуспендируйте клетки в клеточных культуральных средах до достижения конечной концентрации 1 x 106 клеток/мл. Добавьте человеческий рекомбинантный GM-CSF до конечной концентрации 10 нг/мл и хорошо перемешайте.
  3. Переведите 200 мкл ресуспендированных элементов в дневную лунку 24-луночной трансвелл-планшета (0,4 мкм) с 3 техническими репликами. Добавьте еще 100 мкл среды для клеточных культур в каждую лунку и убедитесь, что дно лунки полностью покрыто. Добавьте 300 мкл среды для клеточных культур еще в 3 лунки для условий без макрофагов (положительный контроль).
  4. Добавьте 200 мкл PBS в окружающие лунки, чтобы предотвратить испарение клеточной культуры. Инкубировать клетки при 37 °C в течение 7 дней.
  5. На 7-й день подготовьте 1,4 x 106 опухолевых клеток JeKo-1 и перенесите их в коническую пробирку объемом 15 мл. Раскрутите клетки при 300 x g при 4 °C в течение 5 минут и аспирируйте надосадочную жидкость.
  6. Ресуспендируйте опухолевые клетки с помощью клеточных культуральных сред до достижения конечной концентрации 2 x 106 клеток/мл. Добавьте 200 мкл опухолевых клеток в донные лунки всех условий образца и хорошо перемешайте. Инкубируйте клетки при 37 °C в течение еще 24 ч. Используйте придонные скважины только с JeKo-1 в качестве положительного контроля.
  7. На 8-й день сбора урожая CART и UTD T-клеток, сгенерированных на шаге 5.1. и ресуспендировать Т-клетки в питательных средах для клеточных культур до достижения конечной концентрации 1 x 106 клеток/мл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если используются аллогенные CART-клетки, пользователи должны включить донорские UTD T-клетки в кокультуры, как описано в шаге 3.22.
  8. Подсчитайте и подготовьте 1,4 x 106 ячеек JeKo-1. Перенесите опухолевые клетки в центрифужную пробирку объемом 15 мл и вращайте клетки при 300 x g при 4 °C в течение 5 минут.
  9. Аспиратируйте надосадочную жидкость и ресуспендируйте клетки в клеточных культуральных средах до достижения конечной концентрации 1 x 106 клеток/мл. Перенесите 100 мкл подготовленных Т-клеток и 100 мкл опухолевых клеток в каждую верхнюю лунку для всех условий образца.
  10. Тщательно перемешайте клетки в верхней лунке и инкубируйте при 37 °C в течение 3 дней.
  11. На 11-й день смешайте клетки в верхней камере и переложите в микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл. Промойте верхние лунки 200 мкл PBS и перенесите оставшиеся ячейки в микроцентрифужные пробирки.
  12. Понизьте температуру клеток при 300 x g при 4 °C в течение 5 мин и аспирируйте надосадочную жидкость. Проведите анализ пролиферации Т-клеток, как описано в шагах 4.4-4.9.
    JeKo-1-поляризованные M2-подобные макрофаги могут подавлять антиген-специфическую пролиферацию Т-клеток контактно-независимым образом. При необходимости могут быть протестированы другие модели опухолей.

6. Создание модели ксенотрансплантата как с человеческими макрофагами, так и с опухолью у мышей NSG

  1. Выделите 1 x 107 классических моноцитов человека и подтвердите чистоту с помощью проточной цитометрии, как описано в шагах 1.1-1.10. Используйте мышей NSG, приживленных только JeKo-1, в качестве контроля для подтверждения проопухолевых эффектов M2-подобных макрофагов, как показано на рисунке 2.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол приживляет мышам NSG 5 x 105 человеческих макрофагов подкожно. Восстановление макрофагов после отслоения на 7-е сутки составляет примерно 50%. Пользователи могут соответствующим образом настроить номера ячеек и обязательно подготовить дополнительные ячейки.
  2. Отвращать изолированные моноциты при 300 x g при 4 °C в течение 5 мин и аспирировать надосадочную жидкость. Ресуспендируйте клетки в клеточных культуральных средах до достижения конечной концентрации 1 x 106 клеток/мл.
  3. Добавьте человеческий рекомбинантный GM-CSF до конечной концентрации 10 нг/мл и хорошо перемешайте. Перенесите моноциты в колбу для культуры тканей T25 и инкубируйте клетки при 37 °C в течение 7 дней.
  4. На 7-й день энергично пипетируйте клетки на льду каждые 10 минут и проверяйте клетки под микроскопом до тех пор, пока большинство макрофагов не отделятся. Переложите клетки в коническую трубку объемом 15 мл на льду, промойте колбу ледяным PBS, чтобы ослабить оставшиеся клетки, и объедините клетки в коническую трубку.
  5. Подсчитайте ячейки на счетчике ячеек. Понизьте температуру клеток при 300 x g при 4 °C в течение 5 мин и аспирируйте надосадочную жидкость.
  6. Промойте и повторно суспензируйте клетки 5 мл ледяного PBS. Понизьте температуру клеток при 300 x g при 4 °C в течение 5 мин и аспирируйте надосадочную жидкость.
  7. Ресуспендируйте клетки в ледяном PBS до достижения конечной концентрации 2 x 107 клеток/мл. Перелейте раствор ячейки в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл и держите ее на льду.
  8. Приготовьте 1,5 x 107 клеток люциферазы + JeKo-1 и перенесите клетки в коническую пробирку объемом 15 мл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Из-за небольшого количества вводимых клеток для мониторинга опухолевой нагрузки необходима биолюминесцентная визуализация (BLI). Количество макрофагов и опухолевых клеток для подкожных инъекций может быть увеличено по мере необходимости. Если опухоли видны и доступны с помощью штангенциркуля после инъекции, вместо них можно использовать опухолевые клетки дикого типа.
  9. Вращайте клетки при 300 x g при 4°C в течение 5 минут и аспирируйте надосадочную жидкость. Ресуспендируйте клетки в ледяном PBS до достижения конечной концентрации 4 x 107/мл.
  10. Тот же объем макрофагов и опухолевых клеток переложите в другую свежую микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл и хорошо перемешайте. Добавьте такой же объем солюбилизированной матрицы базальной мембраны в раствор смешанной ячейки и хорошо перемешайте на льду.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Матрица базальной мембраны должна быть разморожена на льду в течение ночи, чтобы предотвратить затвердевание. На этом этапе каждые 100 мкл клеточного раствора содержат 5 x 105 макрофагов и 1 x 106 JeKo-1, взвешенных в матрице базальной мембраны, в которой используется то же соотношение числа клеток, которое используется в протоколе дифференцировки М2-подобных макрофагов in vitro .
  11. В качестве контроля переложите оставшиеся подготовленные клетки JeKo-1 с тем же объемом ледяного PBS в свежую микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл, добавив в раствор клетки такой же объем матрицы базальной мембраны и хорошо перемешайте на льду.
  12. Подготовить 10 6-8-недельных самок и самцов мышей NOD-SCID-γ-/- (NSG) (~20 г) к ингаляционной анестезии 2,5% изофлураном. Вводят изофлурановую анестезию с помощью аппарата для ингаляционной анестезии грызунов. Испаренный изофлуран подается в камеру и нагреваемую ступень с носовыми конусами.
  13. Поместите мышей в анестезиологическую камеру на 1-2 минуты. Перенос мышей на конусы носа на нагретой сцене после утраты постурального и правого рефлексов18. Держите мышей на стадии нагрева на протяжении всей процедуры. Нанесите глазную мазь на оба глаза мышей, чтобы предотвратить повреждение роговицы из-за потери мигательного рефлекса во время анестезии.
  14. Осторожно выбрейте правый бок каждой мыши, чтобы обнажить кожу после того, как мыши будут обезболены. Загрузите в шприц объемом 0,5 мл 100 мкл смеси клеток JeKo-1-макрофага и тщательно удалите пузырьки в растворе.
  15. Осторожно приподнимите обнаженную кожу рукой и введите иглу в подтянутую область. Продолжайте поднимать кожу иглой и надавите одним пальцем на место инъекции. Старайтесь не перемещать иглу после введения, чтобы предотвратить случайные проколы и утечку клеток.
  16. Медленно отпустите клетки в подкожный слой и аккуратно удалите иглу. Повторите подкожные инъекции для всех 10 мышей NSG, при этом 5 мышей получали как JeKo-1, так и макрофаги, а 5 мышей получали только JeKo-1.
  17. Приготовьте D-люциферин (Таблица материалов) в концентрации 15 мг/мл. Загрузите в шприц объемом 0,5 мл 200 мкл D-люциферина и введите каждой мыши внутрибрюшинно.
  18. Поместите мышей под наркозом на сцену для введения BLI через 10 минут после инъекции D-люциферина. Выполните BLI для каждой мыши и запишите в качестве исходного уровня (день 0) опухолевую нагрузку. Поместите мышей обратно в клетки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Пользователи должны убедиться, что мыши, находящиеся под наркозом, не остаются без присмотра до тех пор, пока они не придут в сознание, чтобы сохранить лежачее состояние грудины после процедуры визуализации.
  19. Контролируйте опухолевую нагрузку с помощью BLI 2 раза в неделю до тех пор, пока не будут достигнуты экспериментальные или гуманные конечные точки. Общая конечная точка выживаемости достигается, когда объем опухоли находится на уровне или выше 2000мм3, рассчитанном по следующей формуле:
    figure-protocol-2
    ПРИМЕЧАНИЕ: Продолжительность мониторинга опухоли может быть скорректирована в зависимости от цели эксперимента и желаемых показаний. В связи с крайне малыми размерами опухоли в первые 2-3 недели, BLI рекомендуется по показаниям к опухолевой нагрузке. Как только опухоли становятся видимыми и доступными с помощью штангенциркуля, для точного анализа опухоли рекомендуются измерения как BLI, так и штангенциркуля.
  20. Для изучения взаимодействий между приживленными макрофагами человека и аутологичными клетками CART19 у мышей NSG необходимо получить и приживить ex vivo-дифференцированные макрофаги человека, как описано на этапах 6.1-6.16. Выделите аутологичные Т-клетки от того же донора крови на шаге 6.1 в соответствии с 8-дневным протоколом производства CART, как описано ранее 9,13,14.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Каждая мышь NSG обрабатывается 2 x 106 клетками CART19. Пользователи должны создать не менее 2 x 107 CART-клеток для лечения 10 мышей. Клетки CART криоконсервируют на 8-й день и хранят до тех пор, пока JeKo-1/макрофаги не приживутся у мышей, через 5 дней после подкожных инъекций.
  21. После 5 дней инъекций опухолей/макрофагов рандомизируйте мышей на основе BLI, как описано в шагах 6.17-6.18. Разморозьте и подготовьте ячейки CART, как описано в шаге 3.22. Промойте ячейки CART с помощью PBS и отверните ячейки при 300 x g при 4 °C в течение 5 минут.
  22. Ресуспендируйте клетки CART в PBS до достижения конечной концентрации 2 x 107 клеток/мл. Загрузите в шприц объемом 0,5 мл 100 мкл подготовленных клеток CART и введите каждой мыши, привитой опухолью, внутривенно через хвостовую вену.
  23. Контролируйте опухолевую нагрузку с помощью BLI один раз в неделю в течение 4 недель.
    Примечание: Из-за иммуносупрессивных функций приживленных макрофагов человека, у мышей, которым вводили JeKo/макрофаги, ожидается нарушение противоопухолевой активности CART и более высокая опухолевая нагрузка.

7. Подтверждение М2-подобного фенотипа у привитых макрофагов человека методом иммунофлуоресцентного окрашивания

  1. Чтобы подтвердить JeKo-1-индуцированный M2-подобный фенотип у прижившихся макрофагов человека, описанных на шаге 6, методом иммунофлуоресцентного окрашивания, выполните шаги 6.1-6.19 и увеличьте количество вводимых макрофагов и люциферазы+ JeKo-1 до 5 x 106 клеток и 1 x 107 клеток на мышь NSG, соответственно.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Пользователи должны убедиться, что конечный объем инъекции для каждой мыши составляет 100 μл.
  2. На 7-й день усыпить мышей NSG поCO2, выполнить вывих шейки матки и подтвердить потерю роговичных рефлексов, как описано ранее19. Поместите мышей на рабочий стол так, чтобы опухоли были направлены вверх. Распылите 70% этанол на участки опухолей и осторожно соберите прижившиеся опухоли ножницами и щипцами.
  3. Перенесите опухолевую ткань в конические пробирки объемом 50 мл, заполненные 20-30 мл 4% параформальдегида для фиксации, как описано ранее20. Криоконсервация и криосекция опухолевых тканей для иммунофлуоресцентного окрашивания по ранее опубликованному протоколу20.
  4. Окрашивание опухолевой ткани слайдами с антителом CD206 мыши против человека, конъюгированным с AF546 (1:50) и антителом iNOS против человека кролика, конъюгированным с AF647 (1:100), разведенным в буфере для окрашивания иммунофлуоресценции, с последующим окрашиванием ядра и консервацией, как описано ранее21.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для достижения оптимальных результатов окрашивания пользователи должны выполнять титрование антител соответствующим образом, особенно при использовании различных линий опухолевых клеток.
  5. Получение иммунофлуоресцентных изображений с помощью конфокальной микроскопии при 40-кратном увеличении. Чтобы подтвердить, что приживленные человеческие макрофаги развивают М2-подобный фенотип, можно ожидать увидеть экспрессию человеческого CD206 и минимальную экспрессию человеческого iNOS.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Целью данного протокола является создание моделей in vitro и in vivo для изучения взаимодействий между иммуносупрессивными макрофагами человека и CART-клетками из-за сложной природы и динамики взаимодействий и ограниченности существующих моделей ксенотрансплантатов. В соответствии с протоколом изолированные классические моноциты человека дифференцируются для приобретения М2-подобных фенотипов и становятся функционально иммуносупрессивными.

Чтобы подтвердить чистоту выделенных...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Клеточная терапия CART показала многочисленные клинические успехи в лечении подгрупп пациентов с гематологическими злокачественными новообразованиями, но у большинства пациентов наблюдается рецидив в течение 1-2 лет после инфузии CART1,2. Были идентифицированы различные потенциальные механизмы резистентности к CART, а также обнаружено, что иммуносупрессивные миелоидные клетки играют важную роль в иммуносупрессии ТМЭ и последующей...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

SSK является изобретателем патентов в области иммунотерапии CAR, лицензированных компаниями Novartis (по соглашению между клиникой Майо, Университетом Пенсильвании и Novartis), MustangBio (через клинику Майо) и Sendero (через клинику Майо). RLS и SSK являются изобретателями патентов в области иммунотерапии CAR, которые лицензированы компанией Humanigen (через клинику Майо). KY, RLS, TH, BK, ES и SSK являются изобретателями по патентам в области иммунотерапии CAR, которые лицензированы компанией Immix. SSK получает финансирование на исследования от Kite, Gilead, Juno, BMS, Novartis, Humanigen, MorphoSys, Tolero, Sunesis/Viracta, LifEngine Animal Health Laboratories Inc., Incyte и Lentigen. SSK принимала участие в консультативных совещаниях с компаниями Kite/Gilead, Humanigen, Juno/BMS, Capstan Bio и Novartis. SSK входила в состав совета по безопасности и мониторингу данных в компаниях Humanigen и Carisma. SSK работал консультантом в компаниях Torque, Calibr, Novartis, Capstan Bio, Carisma и Humanigen.

Благодарности

Это исследование было частично профинансировано Комплексным онкологическим центром клиники Майо (SSK), Центром индивидуализированной медицины клиники Майо (SSK), Клиническим центром регенеративной биотерапии Майо (SSK), грантом Национальных институтов здравоохранения R37CA266344-01 (SSK) и грантом CA201127 Министерства обороны (SSK).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Шприц 0,5 млНаучный центр Фишера329461
Микроцентрифужная пробирка объемом 1,5 млЭппендорф1415-2508 
Коническая трубка 15 млCorning Медико-биологические науки352097
24-луночный трансвеллерный планшет (0,4 μ m)Corning Медико-биологические науки3397
Коническая трубка 50 млCorning Медико-биологические науки352098
APC/Cy7-конъюгированный античеловеческий CD206Биолегенда321119Проточные антитела
APC-конъюгированный античеловеческий CD14Биолегенда325607Проточные антитела
APC-конъюгированный античеловеческий CD3Биолегенда344811Проточные антитела
Раствор для полоскания autoMACSМилтеньи Биотек130-091-222Классический буфер для изоляции моноцитов 
Матрица базальной мембраныCorning Медико-биологические наукиCLS356237Солюбилизированная матрица базальной мембраны
Среды для клеточных культур10% сыворотка AB человека 1% пенициллин-стрептомицин-глутамин в среде гемопоэтических клеток X-VIVO 15 без сыворотки
Классический набор для выделения моноцитов, человекМилтеньи Биотек130-117-337
Система CytoFLEX  Б5-Р3-В5Бекман КоултерС04652Проточный цитометр
D-люциферинЗолотая биотехнологияЛАК-1Г
D-PBS (фосфатно-солевой буфер Дульбекко)Gibco14190250 
Глазная мазьТермоФишер19-090-832
Буфер FACS2% FBS 1% азид натрия в PBS
Фетальная бычья сывороткаCorning Медико-биологические науки35-011-ЧВ
Плоскодонный 96-луночный планшетCorning Медико-биологические наукиCLS3997
Термоинактивированная пуловая человеческая AB сыворотка Инновационные исследования4931
Human TruStain FcX (раствор для блокирования рецепторов Fc)Биолегенда422301
Изофлуран жидкий   Пирамал Фарма Лимитед66794-017-10
Система визуализации IVIS Spectrum in vivoПеркинЭлмер124262
Питательные среды для клеточной линии JeKo-110% FBS 1% пенициллин-стрептомицин-глутамин в среде RPMI-1640
Живой/мертвый Исправимый Aqua Dead Cell Stain Kit, для возбуждения 405 нмИнвитрогенЛ34966
Колонна LSМилтеньи Биотек130-042-401Выбор отрицательного шва
ЛимфопрепТехнологии стволовых клеток07811Градиент плотности среды
Решение MACS BSA StockМилтеньи Биотек130-091-376Классический буфер для изоляции моноцитов 
Мышиное антитело к человеческому CD206, конъюгированное с AF546 Санта Крус БиотехнологииСК-376232
КИВОК. Cg-Prkdcscid  Мыши Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG)Лаборатория Джексона 5557
ПЭ-конъюгированный античеловеческий CD16Биолегенда302007Проточные антитела
Пенициллин-стрептомицин-глутамин (100x), жидкостьGibco10378-016
PerCP-конъюгированный античеловеческий CD163Биолегенда333625Проточные антитела
Антитело iNOS к кролику и человеку, конъюгированное с AF647 ПротеинтекКЛ647-18985
Рекомбинантный человеческий GM-CSFТехнологии стволовых клеток78015
RPMI-1640 среднийGibco11875093
СепМат-50 ИВДТехнологии стволовых клеток85450Изоляция PBMC методом центрирования градиента плотности 
Азид натрия, 5% (мас./об.)Рикка Кемикал7144.8-16
48-луночный планшет, обработанный тканевой культуройCorning Медико-биологические науки3548
Анализатор жизнеспособности клеток Vi-cell XRБекман КоултерСчетчик ячеек
X-VIVO 15 Бессывороточная гемопоэтическая клеточная средаЛонза04-418Q

Ссылки

  1. Yun, K., Siegler, E. L., Kenderian, S. S. Who wins the combat, CAR or TCR. Leukemia. 37 (10), 1953-1962 (2023).
  2. Neelapu, S. S., et al. Axicabtagene Ciloleucel CAR T-Cell Therapy in Refractory Large B-Cell Lymphoma. New England J Med. 377 (26), 2531-2544 (2017).
  3. Shah, N. N., Fry, T. J. Mechanisms of resistance to CAR T cell therapy. Nat Rev Clin Oncol. 16 (6), 372-385 (2019).
  4. Kiss, M., Caro, A. A., Raes, G., Laoui, D. Systemic Reprogramming of Monocytes in Cancer. Fronti Oncol. 10, (2020).
  5. Rodriguez-Garcia, A., et al. cell-mediated depletion of immunosuppressive tumor-associated macrophages promotes endogenous antitumor immunity and augments adoptive immunotherapy. Nat Commun. 12 (1), (2021).
  6. Kankeu Fonkoua, L. A., Sirpilla, O., Sakemura, R., Siegler, E. L., Kenderian, S. S. CAR T cell therapy and the tumor microenvironment: Current challenges and opportunities. Mol Ther Oncolyt. 25, 69-77 (2022).
  7. Stroncek, D. F., et al. Elutriated lymphocytes for manufacturing chimeric antigen receptor T cells. J Trans Med. 15 (1), (2017).
  8. Stroncek, D. F., et al. Myeloid cells in peripheral blood mononuclear cell concentrates inhibit the expansion of chimeric antigen receptor T cells. Cytotherapy. 18 (7), 893-901 (2016).
  9. Sterner, R. M., Cox, M. J., Sakemura, R., Kenderian, S. S. Using crispr/cas9 to knock out gm-csf in car-t cells. J Vis Exp. (149), e59629(2019).
  10. Ali, L. R., et al. PD-1 blockade and CDK4/6 inhibition augment nonoverlapping features of T cell activation in cancer. J Exp Med. 220 (4), e20220729(2023).
  11. Wang, T., et al. Proteomic and Metabolomic Characterization of SARS-CoV-2-Infected Cynomolgus Macaque at Early Stage. Front Immunol. 13, 954121(2022).
  12. Ruella, M., et al. Overcoming the immunosuppressive tumor microenvironment of Hodgkin lymphoma using chimeric antigen receptor T cells. Cancer Dis. 7 (10), 1154-1167 (2017).
  13. Sakemura, R., et al. Development of a Clinically Relevant Reporter for Chimeric Antigen Receptor T-cell Expansion Trafficking, and Toxicity. Cancer Immunol Res. 9 (9), 1035-1046 (2021).
  14. Sterner, R. M., et al. GM-CSF inhibition reduces cytokine release syndrome and neuroinflammation but enhances CAR-T cell function in xenografts. Blood. 133 (7), 697-709 (2019).
  15. Smith, A., et al. A Novel Three-Dimensional Skin Disease Model to Assess Macrophage Function in Diabetes. Tissue Eng Meth. 27 (2), 49-58 (2021).
  16. Nowak, W., et al. Pro-inflammatory monocyte profile in patients with major depressive disorder and suicide behaviour and how ketamine induces anti-inflammatory M2 macrophages by NMDAR and mTOR. EBioMedicine. 50, 290-305 (2019).
  17. Ajith, A., et al. Humanized Mouse Model as a Novel Approach in the Assessment of Human Allogeneic Responses in Organ Transplantation. Front Immunol. 12, 687715(2021).
  18. Tsukamoto, A., Serizawa, K., Sato, R., Yamazaki, J., Inomata, T. Vital signs monitoring during injectable and inhalant anesthesia in mice. Exp Animals. 64 (1), 57-64 (2015).
  19. Hickman, D. L. Minimal Exposure Times for Irreversible Euthanasia with Carbon Dioxide in Mice and Rats. J Am Assoc Lab Animal Sci. 61 (3), 283-286 (2022).
  20. Zhou, R., Mei, L. Neural Development: Methods and Protocols. , Humana Press. Totowa, NJ. (2013).
  21. Gutierrez-Ruiz, O. L., et al. Ectopic expression of DOCK8 regulates lysosome-mediated pancreatic tumor cell invasion. Cell Rep. 42 (9), 113042(2023).
  22. Kirkiles-Smith, N. C., et al. Development of a Humanized Mouse Model to Study the Role of Macrophages in Allograft Injury. Transplantation. 87 (2), 189-197 (2009).
  23. Chuprin, J., et al. Humanized mouse models for immuno-oncology research. Nat Rev Clin Oncol. 20 (3), 192-206 (2023).
  24. Yun, K., et al. Intrinsic immunosuppressive features of monocytes suppress CAR-T19 through IL-1 pathway modulation in mantle cell lymphoma. Mol Ther Oncol. 33 (2), 200985(2025).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

in vitroin vivo

Похожие статьи