Методическая статья

Разработка модели острого повреждения легких у неонатального поросенка, воссоздающей раннюю среду легких недоношенных детей

1.2K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/68058

⸱

31 октября 2025 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Sinclair Centre for Regenerative Medicine, Ottawa Hospital Research Institute, 2Division of Neonatology, Karolinska University Hospital, 3Division of Neonatology, Children's Hospital of Eastern Ontario, 4Department of Obstetrics, Gynecology and Newborn Care, University of Ottawa, 5Faculty of Medicine, University of Ottawa

В этой статье

Краткое содержание

В этом протоколе описывается разработка неонатальной модели острого повреждения легких у поросенка, которая моделирует ранние патогенные события, происходящие в недоношенных легких, включая недостаточное количество сурфактанта, гипероксию, вентиляцию под высоким давлением и воспаление, чтобы облегчить понимание молекулярных триггеров бронхолегочной дисплазии и улучшить терапевтический перевод.

Аннотация

Преждевременные роды являются основной причиной детской заболеваемости и смертности. Бронхолегочная дисплазия (БЛД) является тяжелым последствием крайней недоношенности, приводящим к изменениям роста легких и долгосрочным последствиям для развития. Патогенез БЛД является многофакторным, включающим в себя искусственную вентиляцию легких, гипероксию и воспаление в качестве основных драйверов его развития. В настоящее время лечения ПРЛ не существует. В этом исследовании представлена осуществимая и воспроизводимая новая модель острого повреждения легких (ОПЛ) у неонатального поросенка, имитирующая клинические стимулы, с которыми сталкивается недоношенное легкое человека. Мультихитовая модель неонатального поросенка ALI, сочетающая истощение сурфактанта, гипероксию, вентиляцию высокого давления и внутритрахеальное введение липополисахаридов (ЛПС), приводит к нарушению оксигенации, нарушению функции легких, воспалению с инфильтрацией нейтрофилов и гистологическому повреждению легких. Его основными преимуществами являются использование вредных стимулов, которые, как известно, управляют патогенезом ПРЛ, и его неприхотливость. Он генерирует высокоточный ALI, соответствующий критериям ALI Американского торакального общества. Модели крупных животных, такие как эта модель поросенка, имеют решающее значение для понимания ранних патогенных факторов, определения терапевтических мишеней и облегчения клинической трансляции для пациентов.

Введение

Крайняя недоношенность является основной причиной смерти у детей в возрасте до пяти лет1. Наиболее распространенным тяжелым осложнением недоношенности является бронхолегочная дисплазия (БЛД), хроническое заболевание легких, многофакторное способствующее воздействию, включая воспаление, окислительный стресс от гипероксии и травму, вызванную искусственной вентиляцией легких2. Эта микросреда приводит к нарушению роста легких, что может оказывать долгосрочное влияние на рост и развитие недоношенных детей3. В настоящее время лечения ПРЛ не существует.

Недавний систематический обзор использования мезенхимальных стромальных клеток в качестве потенциального лечения БЛД показал, что доклинические данные были получены исключительно у грызунов4. Это явление распространено, учитывая широкую доступность, простоту использования и обслуживания моделей грызунов. Тем не менее, воспроизведение исследований на крупных животных моделях имеет решающее значение для обеспечения успеха в трансляционных усилиях по разработке новых и перспективных методов лечения недоношенных детей. Многие клинические испытания терпят неудачу из-за неадекватных доклиническихисследований5, что замедляет разработку лечения для пациентов. Несмотря на то, что использование модели приматов является предпочтительной доклинической моделью для создания основы для клинических испытаний на людях, она трудоемка, дорогостояща и нелегко доступна. Модель неонатального поросенка является предпочтительной, с использованием лекарств и оборудования, аналогичного неонатальному уходу, имитируя клиническую среду интенсивной терапии новорожденных, что приводит к большей возможности клинического перевода. Кроме того, иммунная система легких свиньи очень похожа на иммунную систему человека 6,7,8,9, разделяя более 80% генетической вариативности толл-подобных рецепторов 4 10, при этом макрофаги реагируют на липополисахариды (ЛПС) 11,12 и продукцию оксида азота13 - потенциальных участников воспаления в легких человека14. Кроме того, сурфактант легких, полученный из свиньи, является клинически признанным методом лечения, используемым при остром заболевании легких у недоношенных младенцев15.

В этом протоколе представлена новая однодневная модель множественного острого повреждения легких (ОПП) крупных животных у новорожденных поросят с последовательными, стандартизированными и переводимыми результатами в соответствии с критериями ALI Американского торакального общества 16,17,18. Повторные промывания легких солевым раствором для истощения поверхностно-активного вещества с помощью вентиляции под высоким давлением и последующего ЛПС или другого токсического воздействия использовались у взрослых свиней для индуцирования повреждения легких18. Однако подобных моделей, имеющихся у неонатальных поросят, мало. В этом протоколе описывается, как вызвать повреждение легких с помощью адаптированного протокола истощения поверхностно-активных веществ для промывания легких 21,22,23 в условиях гипероксической вентиляции и вентиляции под высоким давлением с последующим воспалительным триггером с использованием ЛПС, введенного непосредственно в легкое. Данная модель предназначена для назначения лечения по выбору либо местно (интратрахеальное - ИТ), либо системно (внутривенное - внутривенное) после индуцированного повреждения легких, с мониторингом его эффекта в течение 5 ч. Общая структура близко имитирует состояние легких недоношенных детей. Истощение сурфактанта воссоздает респираторный дистресс-синдром, характеризующийся недостатком сурфактанта при рождении. Этот недуг может быть связан с баротравмой, ателектотравмой и проблемами оксигенации, требующими высокого уровня кислорода и искусственной вентиляции легких. Наконец, большинство недоношенных детей рождаются в воспалительной среде из-за хориоамнионита или инфекции, особенности, которые пытались воспроизвести с помощью введения ЛПС в этой модели поросят. Эта многокомпонентная модель ОПЛ создает аналогичные клинические стимулы, с которыми сталкиваются недоношенные легкие человека, что позволит получить бесценную информацию о ранних патогенных процессах БЛД и потенциальной оптимизации доставки терапии для эффективного клиническогоперевода.

Протокол

Все эксперименты проводятся сертифицированным персоналом в соответствии с национальными и институциональными нормами (https://ccac.ca/en/guidelines-and-policies/) после утверждения региональным Комитетом по уходу за животными и Службой по уходу за животными и ветеринарной службой (протокол OHRIe-3731). Для этой модели использовали новорожденных поросят обоего пола, в возрасте 0–3 дней, со смешанной породой йоркшир, ландрас и дюрок. Приводится подробное описание этапов (в скобках указан номер этапа) подготовки, анестезии, управления инфузией и лекарствами, а также мониторинга, используемых на протяжении всего эксперимента (1-3), хирургических процедур (4), включая период стабилизации (5) до индуцирования множественного повреждения легких (7), с наблюдением после травмы и поддерживающей вентиляцией легких (6, 8), заканчивающихся эвтаназией и завершением эксперимента (10). Также представлена необязательная стандартизированная процедура интратрахеального лечения (9). Общее время от фермы до окончания эксперимента и сбора образцов составляет примерно 12-15 часов. Реагенты и оборудование, использованные в данном исследовании, перечислены в Таблице материалов.

1. Подготовка к эксперименту

  1. Включите и откалибруйте мониторы и аппарат искусственной вентиляции легких до прихода поросенка. Убедитесь, что в монитор вставлены карты памяти для непрерывной записи данных во время эксперимента.
  2. Установите аппарат ИВЛ с пиковым давлением на вдохе (PIP) 15 смH2O, положительным давлением на конечном выдохе (PEEP) 6 смH2O, потоком на вдохе 8 л/мин, частотой дыхания (RR) 30/мин, временем вдоха (Tinsp) 0,4 с, долей вдыхаемого кислорода (FiO2) 1,0 и подключите новый контур вентиляции и увлажнитель воздуха.
  3. Подготовьте стерильные хирургические упаковки, простыни, расходные материалы (в том числе лекарства - см. Таблицу материалов), катетеры и распечатанную ИРК. Увеличьте температуру в операционном помещении до 25 °C или выше, если это сочтет необходимым исследовательская группа. Включите греющее одеяло/водяной матрас до 39 °C. Подготовьте систему принудительного прогрева воздуха, готовую к использованию, если требуется дополнительная регулировка температуры.
  4. Поместите 1 л пакетика с обычным физиологическим раствором в теплую водяную баню (39 °C) для приготовления промывания легких.
  5. Настройте насосы для инфузии лекарств (кетамина и пропофола) и добавьте в насосы для жидкости новые пакеты с лактатированными рингерами комнатной температуры и декстрозой.
  6. Поросенок остается со свиноматкой на местной ферме и имеет свободный доступ к ней до тех пор, пока его не заберет член исследовательской группы. Обратите внимание на пол, возраст, размер помета и время рождения.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В утвержденном университетском транспортном средстве с квалифицированным водителем опытный член команды присутствует на протяжении всей перевозки. Поросенок помещается в большую закрытую мягкую переноску, которая позволяет поросенку безопасно, свободно передвигаться и лежать без ограничений (при необходимости с резиновой грелкой с горячей водой, завернутой в одеяла). Это гарантирует, что поросенок сохраняет спокойствие (часто засыпает) в этой успокаивающей среде. Переноска, в которой находится поросенок, фиксируется на месте с помощью ремня безопасности. Член команды должен мягко успокаивать поросенка и избегать громких звуков, чтобы свести уровень стресса поросенка к минимуму.
  7. По прибытии в научно-исследовательское учреждение сведите шум к минимуму и аккуратно держите поросенка, положив носовой конус для анестезии ему на лицо.

2. Подготовка животных

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот раздел включает в себя индукцию и поддержание анестезии (в соответствии с протоколами, утвержденными в учреждении).

  1. Инициируйтепоток О2 без изофлурана при установке носового конуса на место. Когда поросенок успокоится, начните прием изофлурана и увеличивайте дозу до введения 3% изофлурана (примерно 60 с). Внимательно следите за дыханием и соответствующим образом корректируйте изофлуран.
  2. Убедитесь, что поросенок не реагирует на происходящее, сильно ущипнув палец ноги.
  3. Если поросенок перестал реагировать, взвесьте и измерьте его для правильной дозировки лекарства.
  4. Вводите бупренорфина гидрохлорид (0,04 мг/ кг) внутримышечно (в/м) иглой 25 G в заднюю ногу для обезболивания.
  5. Прикрепите пульсоксиметр к верхнему правому копыту (преддуктовальному), неинвазивной манжете для измерения артериального давления (до тех пор, пока бедренная артерия не будет канюлирована) и проводам ЭКГ.
  6. Вставьте 24 G ангиокаты в оба уха. Прикрепите 6-дюймовые удлинители с промывкой от солевого раствора с 4-ходовыми запорными кранами. Поддерживайте ухо депрессором языка, чтобы избежать позиционной обструкции.
  7. Возьмите кровь из вставленного ушного катетера для измерения уровня глюкозы в крови (ГК) с помощью откалиброванного глюкометра в соответствии с инструкциями производителя.
  8. Начните внутривенную инфузию D5W (ВВ) в дозе 5 мл/кг/ч и отрегулируйте в зависимости от уровня глюкозы в крови до целевого уровня ГК 4-5 ммоль/л.
  9. Введение болюсных инъекций анальгезии/анестезии во вторую ушную вену.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Критическое понимание свойств и побочных эффектов этих препаратов требуется для их оптимального и безопасного использования.
    1. Вводите болюс 2 мг/кг в/в разбавленного кетамина (10 мг/мл) и болюс 5 мг/кг в/в пропофола (10 мг/мл, 1%) в виде нескольких болюсов меньшего объема. Остерегайтесь возможности возникновения апноэ после болюса пропофола. Продолжайте осторожное введение болюсов пропофола (всего 5 мг/кг) до тех пор, пока поросенок не перестанет реагировать на тест с жестким зажимом пальца ноги и не будет установлена непрерывная инфузия пропофола.
    2. Прекратите прием изофлурана (после начала внутривенной инфузии пропофола) и продолжайте непрерывную внутривенную анестезию в течение оставшейся части эксперимента.
  10. Начните непрерывную инфузию по следующей схеме анестезии с тщательным титрованием в зависимости от частоты сердечных сокращений и артериального давления, включая рефлекс отмены, для достижения стабильной хирургической глубины анестезии:
    1. Пропофол (10 мг/мл) из расчета 10-30 мг/кг/ч (эквивалентно 1-3 мл/кг/ч) в/в.
    2. Кетамин (100 мг/мл) из расчета 5-10 мг/кг/ч (эквивалентно 0,05-0,1 мл/кг/ч) в/в.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Инфузионные катетеры для анальгезии/анестезии прикрепляются к контралатеральному ушному катетеру инфузии D5W. Может потребоваться адаптация к общему потреблению жидкости и температуре окружающей среды для обеспечения надлежащей поддержки и гомеостаза.

3. Жидкости, лекарства и мониторинг

ПРИМЕЧАНИЕ: В этом разделе представлена информация о том, как поддерживать гидратацию, поступление глюкозы, анальгезию/анестезию, а также обеспечить надлежащий анализ экспериментальных данных, опасений или проблем.

  1. Убедитесь, что общая скорость внутривенной инфузии комбинированной жидкости (LRS и D5W) для гомеостаза обычно составляет 5-8 мл/кг/ч.
    1. Вводите D5W в венозный катетер уха со скоростью 5-10 мл/ч (корректируется ежечасно на основе значений глюкозы (ГГ) артериальной крови - целевой показатель 4-5 ммоль/л).
    2. Вводите LRS через венозный катетер бедренной кости со скоростью 1-6 мл/кг/ч для поддержания гомеостаза жидкости. Чтобы предотвратить свертывание крови как артериального, так и венозного доступа, прикрепите к датчику инфузионный мешок для гепаринизации NS под давлением и поддерживайте давление в пределах 250-300 фунтов на квадратный дюйм.
    3. Обеспечьте надлежащую общую глубину анестезии и обезболивания на протяжении всей операции и перед началом периода стабилизации (шаг 5.1) и индуцированием мышечного расслабления.
  2. Мониторинг различных параметров (полная занятость одного человека на протяжении всего эксперимента).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Мониторинг и документирование жизненно важных показателей, настроек аппарата искусственной вентиляции легких, вмешательств, взятых образцов, лекарств, с дозами и временем, в предварительно напечатанном CFR (см. Дополнительный файл 1) в течение всего эксперимента. Записанные непрерывные данные от монитора давления и аппарата искусственной вентиляции легких сохраняются в конце эксперимента для последующего анализа.
    1. Контролируйте сатурацию кислорода (SpO2) - обеспечьте пректальный (правое верхнее копыто) сигнал пульсоксиметра.
    2. Следите за частотой сердечных сокращений (ЧСС) - прикладывайте к поросенку отведения ЭКГ.
    3. Чтобы следить за температурой, вставьте смазанный ректальный термометр на глубину 3-4 см и закрепите его на хвосте скотчем. Поддерживайте ректальную температуру поросенка на уровне 38-39 °C, регулируя грелку и температуру окружающей среды в помещении (25 °C). При использовании электрического источника отопления убедитесь, что между поросенком и нагревательным ковриком лежит дополнительное одеяло, чтобы избежать ожогов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте дополнительный источник тепла, такой как система принудительного нагрева воздуха (например, одеяло, накрытое над поросенком), если температурный гомеостаз не достигается должным образом.
    4. Что касается артериального давления, проводите неинвазивный мониторинг с помощью манжеты соответствующего размера до окончания операции, затем определите инвазивное артериальное давление, включая среднее артериальное давление (MAP) и центральное венозное давление (CVP), и задокументируйте CRF.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что купола артериальных и венозных датчиков расположены и обнулены на уровне сердца для получения точных показаний.
    5. Выполняйте забор крови в заранее определенные моменты времени с помощью центрального артериального или венозного катетера. Проведите анализ газов крови 0,1 мл гепаринизированной артериальной крови с помощью портативного анализатора крови (устройство, которое может оценивать при минимальном pH, PCO2, PO2, HCO3, BE, BG, лактат, креатинин, Na, K, Cl - следует отметить по CRF) для управления вентиляцией и метаболическим контролем на протяжении всего эксперимента.
    6. Выполнение биологических проб для будущих экспериментов и анализа: сбор цельной крови, плазмы и мочи в соответствующие моменты времени в течение экспериментального протокола в соответствии с целями исследования. Также соберите образцы конечных точек, включая жидкость бронхоальвеолярного лаважа (BALF), легочную ткань и другие ткани16,17, в зависимости от целей исследования.
      1. Ограничение ятрогенной анемии и гиповолемии:
        1. Медленно наберите кровь в шприц (эквивалентно в три раза большему объему мертвого пространства), отложите в сторону и наберите достаточный объем для будущего экспериментального анализа (0,4-1,5 мл)25 , например, маркеры воспаления и окислительного стресса. Адаптируйте объемы образцов к массе тела, уровню гемоглобина и стабильности поросенка.
          ПРИМЕЧАНИЕ: Кровь из мертвого пространства возвращается животному, и катет промывают физиологическим раствором, по крайней мере, в объеме, эквивалентном тому, который был взят для забора крови (газ крови ± кровь для будущих экспериментов), чтобы очистить линию крови, ограничивая возможную окклюзию из-за тромба.
    7. Записывайте все жизненно важные и вентиляционные параметры в ИРК через равные промежутки времени каждые 15-30 минут, чаще во время индукции анестезии и хирургического вмешательства, или если поросенок нестабилен.
    8. Отмечайте изменения в лекарствах с начала анестезии на протяжении всего эксперимента, отмечая время начала и окончания, а также изменения дозы.
    9. Оцените глубину анестезии, оценив защемление пальца ноги/коронарного бандажа для отводного рефлекса первоначально с регулярной частотой. Как только будет достигнуто полное расслабление мышц, контролируйте частоту сердечных сокращений и артериальное давление для продолжения оценки глубины анестезии.
    10. Стремитесь к следующему, если ничего не указано, на протяжении всего эксперимента: ЧСС: 120-180 уд/мин, MAP: 50-80 мм рт.ст., CVP: 3-10 смH2O, температура тела: 38-39 °C, BG: 4-5 ммоль/л, PaCO2: 35-45 мм рт.ст., отрегулируйте RR (макс. 60 вдохов/мин), дыхательный объем (VT): 7 мл/кг, отрегулируйте PIP.

4. Хирургическая процедура (Время: ~30-40 мин)

  1. Поддерживайте вентиляцию во время операции.
    1. Поддерживайте RR на уровне 30 вдохов/мин, целевой VT на выдохе на уровне 10 мл/кг, скорректированный с помощью PIP, постоянный PEEP на уровне 6смH2O, Tinsp на уровне 0,4 с и FiO2 на уровне 1,0.
  2. Создайте стерильное поле, выполнив предпочтительный асептический скраб кожи на шее для трахеотомии и в паху для доступа к бедренным сосудам с использованием стандартных методов скрабирования.
    1. Выполните разрез на шее.
      1. Выполните разрез кожи на шее скальпелем между перстневидным хрящом и грудной выемкой (приблизительный размер 10 см). Используйте тупое рассечение, чтобы изолировать трахею.
      2. Проденьте две 12-дюймовые пуповинные завязки под трахею.
      3. Сделайте разрез 5 мм между кольцами трахеи и самой передней частью трахеи, чуть ниже перстневидного хряща. Введите эндотрахеальную трубку (ЭТТ). Завяжите первый узел сверху трахеи, ближайшей к разрезу.
      4. Надуйте манжету ETT, аккуратно втяните ETT до тех пор, пока манжета не будет остановлена галстуком. Затяните первую стяжку и закрепите вторую стяжку на ETT. Этот метод гарантирует, что кончик находится над килем, что подтверждается аускультацией симметричных и двусторонних дыхательных звуков.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Бронх правой доли черепа возникает проксимальнее разветвления трахеи. Будьте осторожны с закупоркой этого бронха, если ЭТТ размещен слишком глубоко. Если возникают проблемы с вентиляцией или происходят резкие изменения, рассмотрите возможность регулировки трубки. В этой области шеи лежат вагоссимпатические нервы туловища и гортани. Необходимо соблюдать осторожность, чтобы избежать стимуляции или травмирования этих нервов.
    2. Выполните разрез в паху.
      1. Пальпируйте бедренную артерию, выполните поверхностный разрез кожи в правом паху скальпелем (примерно 8-10 см).
      2. Используйте тупое рассечение, чтобы изолировать бедренную артерию и вену.
      3. Продеть по два шва (3,0 шелка) под каждую из бедренных артерий и вены изолировать их26. Подготовьте катетеры для введения.
        1. Для катетеризации правой бедренной вены поднимите оба шва, чтобы перекрыть любой кровоток. Перевяжите бедренную вену дистальнее предполагаемого места введения.
          1. Полностью вставьте катетер, слегка оттянув стилет назад и завязав дистальную завязку, чтобы зафиксировать катетер на месте. Снимите стилет и прикрепите 6-дюймовый удлинитель с помощью трехстороннего стопорного крана, загрунтованного физиологическим раствором.
          2. Перед тем, как закрепить катетер, отведите небольшое количество крови, чтобы обеспечить проходимость. Закрепите катетер в сосуде с помощью проксимальной шовной завязки, предотвращая выскальзывание катетера.
          3. Прикрепите вторичный порт для подачи поддерживающей жидкости и инфузии лекарств. Подсоедините первичный порт для измерения центрального венозного давления.
        2. Для катетеризации правой бедренной артерии используйте те же шаги на бедренной артерии, что и для вены, описанные в шагах с 4.2.2.3.1.1 по 4.2.2.3.1.3.
          1. Прикрепите первый порт 3-позиционного запорного крана для инвазивного мониторинга артериального давления и избавьтесь от разрезов в паху и шее с помощью хирургических скоб.
    3. Выполните введение надлобкового катетера мочевого пузыря для доступа к мочеиспусканию.
      1. Мочевой пузырь расположен поверхностно в нижней части живота, немного левее среднесагиттальной линии. Очистите брюшную полость с помощью асептической техники.
      2. Введите стерильный ангиокатетер 18 G (2 дюйма) параллельно брюшной стенке, краниально к самой нижней паре сосков (на 5-6 см ниже пупка), направленный в сторону пупка, в то время как одной рукой слегка надавите на обе стороны мочевого пузыря, чтобы стабилизировать его и сделать немного больше (дополнительный протокол для надлобковой аспирации можно найти в другом месте27).
      3. Как только поток мочи подтвердится, прикрепите катетер к брюшной полости, чтобы зафиксировать его положение. Прикрепите к катетеру удлинитель большого диаметра. Поместите дистальный конец в трубку объемом 50 мл, расположенную под животным.

5. Стабилизация и стандартизированное послеоперационное пополнение легких (время: ~30-60 минут)

ПРИМЕЧАНИЕ: Стабилизация начинается после завершения всех хирургических процедур. Достаточная глубина обезболивания/анестезии имеет важное значение перед расслаблением мышц, так как это гарантирует, что жизненно важные функции, такие как MAP и HR, находятся в пределах нормы и отсутствие рефлексов отмены. MAP и HR будут постоянно контролироваться на протяжении всего протокола, чтобы обеспечить надлежащую глубину анестезии.

  1. Введение рокурония (0,3 мг/кг) в/в виде болюса (через доступ D5W в ушную вену) и начало непрерывной инфузии рокурония (5,5 мг/кг/ч) для расслабления мышц перед маневром рекрутирования легких. Эта инфузия будет продолжаться в течение всего эксперимента, чтобы стандартизировать процедуру промывания и предотвратить асинхронность с аппаратом искусственной вентиляции легких.
  2. Выполните стандартизированный маневр рекрутинга легких.
    1. Ступенчатое увеличение PEEP: начните с PEEP 6 смH2O, увеличивая на 1 см H2O каждую минуту до тех пор, пока не будет достигнут PEEP 10 см H2O. Отрегулируйте PIP для поддержания VT 10 мл/кг.
    2. Оставайтесь на уровне PEEP 10 смH2O в течение 2 минут, прежде чем вернуться к PEEP 6 cmH2O в обратном порядке (как в шаге 5.2.1) с сохранением VT 10 мл/кг.
    3. При стабильном уровне ЖТ 10 мл/кг на ПДК 6 смЧ2О зарегистрируйте параметры дыхания, физиологические параметры и измерьте газовый анализ артериальной крови (временная точка ЖТ 10 мл/кг по ХПН).
      1. Убедитесь, что PaO2 составляет >400 мм рт.ст. (ожидаемая реакция на гипероксию у животного со здоровыми легкими). FiO2 1.0 используется на начальных этапах эксперимента для обеспечения адекватного ответа на гипероксию в качестве критерия включения.
      2. Если это не достигнуто:
        1. Проверьте положение эндотрахеальной трубки, настройки аппарата искусственной вентиляции легких, подачу кислорода и правильную технику забора крови. Повторите маневр по набору легких один раз, чтобы обеспечить правильный набор.
        2. Если состояние все еще не улучшилось, исключите животное и немедленно усыпьте его (в соответствии с институционально утвержденными протоколами) из-за потенциальной внутренней проблемы легкого (нездоровое легкое от предыдущего неэкспериментального воздействия, т.е. на ферме).
      3. Отрегулируйте ОР так, чтобы PaCO2 оставался в диапазоне 35-45 мм рт.ст.
      4. Уменьшите PIP до VT 7 мл/кг, сохраняя FiO2 1,0 и PEEP 6 смH2O.
      5. После стабилизации запишите исходные показания временной точки для ЖТ 7 мл/кг на листе ХПН с физиологическими параметрами и образцами, включая газовые газы артериальной и венозной крови. Стабилизация включает в себя жизненно важные показатели, как в шагах 3.2.10, и значения газов крови: PaO2: 400-500 мм рт.ст., PaCO2: 35-45 мм рт.ст., pH: 7,35-7,45, BG: 4-5 ммоль/л.

6. Вентиляция для контрольных животных

  1. Используйте вентиляцию с регулируемым объемом с дыхательным объемом 7 мл/кг, PEEP 6 смH2O и FiO2 1,0. Не вызывайте повреждение легких у контрольных животных (т.е. не проводите истощение сурфактанта или инстилляцию эндотоксина).
  2. Продолжайте вентиляцию в течение примерно 90 минут, чтобы соответствовать средней продолжительности, необходимой для индуцирования повреждения легких у экспериментальных животных (см. шаг 7 и рисунок 1). По истечении этого срока переходите непосредственно к шагу 10.

7. Индукция острого повреждения легких (мультиударная модель)

  1. Провести истощение поверхностно-активного вещества (Время: 1-2 часа)
    1. Перед началом промывания легких включите аспиратор и убедитесь, что он готов к использованию. Установите ведро для сбора омывания на место. Расположите абсорбирующие прокладки под головой животного и ниже операционного стола, чтобы захватить всю жидкость, вытекшую и восстановленную во время промывания зубов.
      1. Взвесьте прокладки до и после промывания. Установите аппарат ИВЛ на PEEP 5 смH2O, PIP 25 cmH2O, RR 25/мин и FiO2 1.0. Поддерживайте эти настройки вентиляции с контролем давления на протяжении всей процедуры лаважа. Ожидайте, что VT уменьшится примерно на 35%-45% во время полного промывания.
    2. Отсоедините вентиляционный контур от ЭТТ и прикрепите аппарат для воронки лаважа (см. Дополнительный файл 1).
    3. Закапывайте 30 мл/кг теплого изотонического раствора (NS) в легкие, осторожно вливая NS в воронку, расположенную примерно в 30 см над поросенком.
    4. Массируйте грудную клетку, надавливая двусторонне на боковую сторону, чтобы обеспечить механическое «сжатие». Помогите продвинуть физиологический раствор в легкие и циркулировать его в аппарате для промывания воды. Подождите 2-3 секунды между массажами.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте массажа слишком быстро или слишком медленно, чтобы предотвратить недостаточное удаление сурфактанта или нарушение венозного возврата. Не превышайте 30 с за один цикл промывания.
      1. Удалите жидкость для промывания, опустив воронку ниже поросенка. Слегка отсоедините воронку от ЭТТ, чтобы жидкость могла стечь в ведро для сбора на полу.
      2. Выполняйте активное отсасывание не более 10 с. Вставьте отсасывающий катетер в ЭТТ, продолжая массаж грудной клетки, чтобы облегчить отток жидкости. Контролируйте MAP и HR и своевременно подключайте вентиляцию, если какой-либо из параметров значительно падает.
      3. Снова подключите вентиляционный контур. Если в ЭТТ осталась лишняя жидкость, выполните повторное отсасывание.
    5. Дайте поросенку восстановиться не менее 3 минут между циклами промывания для снижения стресса и риска непереносимости.
    6. Начните следующий раунд промывания, как только SpO2 вернется к 100%. Если SpO2 не возвращается к 100%, проверьте PaO2с помощью газов крови, как только SpO2 стабилизируется
      1. Если PaO2 >100 мм рт.ст. - повторить промывание легких (шаги 7.1.2-7.1.6).
      2. Если PaO2 <100 мм рт.ст. - подождать 15 мин с сохранением настроек вентиляции лаважа, затем повторить анализ газов крови.
      3. Если PaO2 >100 мм рт.ст. - продолжить промывание и перейти к шагу 7.1.6 для повторной оценки степени повреждения.
    7. Подтвердите, что повреждение истощением поверхностно-активного вещества достигается, когда PaO2 остается на уровне <100 мм рт.ст. в течение 15 мин. Остановите промывание и перейдите к следующему шагу.
  2. Закапывание внутритрахеального эндотоксина (Время: 15 мин)
    1. Готовят липополисахарид (ЛПС) из кишечной палочки (1,5 мг/кг) путем разведения в НС до общего объема 2 мл в шприце объемом 3 мл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Выберите штамм и дозу в зависимости от обстоятельств, учитывая потенциальную вариабельность эффектов в зависимости от штамма.
    2. Подождите 15 минут после окончательного промывания легких, затем закапывайте ЛПС интратрахеально (IT) поросенку в положении лежа на спине.
    3. Улучшить однородное распределение ЛПС в ателектатическом легком можно с помощью следующих шагов:
      1. Замените стандартный конец ETT на адаптер с Y-образным отверстием, чтобы обеспечить одновременную вентиляцию и введение LPS через катетер через клапанный боковой порт.
      2. Нанесите PEEP 10 см H2O на 1 минуту. Отрегулируйте PIP для поддержания VT на уровне 7 мл/кг и установите RR на 40 вдохов/мин.
      3. Вставьте катетер через боковой порт в ЭТТ на заранее измеренную глубину, чтобы наконечник выступал за пределы ЭТТ на 1-2 мм.
      4. Введите ЛПС через катетер. Промойте катетер 1 мл НС, а затем введите воздушный болюс 9 мл для обеспечения полной доставки.
      5. Извлеките катетер и закройте боковой порт.
      6. Продолжайте проветривание с помощью PEEP 10 смH2O (отрегулируйте PIP для поддержания VT 7 мл/кг) в течение 3 минут после введения ЛПС.
      7. Отключите контур аппарата ИВЛ от ЭТТ на 30 с, чтобы обратить вспять любое непреднамеренное вовлечение легочной ткани.
      8. Во время отключения отрегулируйте настройки аппарата ИВЛ на FiO2 0,5, PEEP 6 смH2O, PIP для поддержания VT 7 мл/кг и увеличьте RR до 40-60 вдохов/мин для достижения PaCO2 35-45 мм рт.ст.
      9. Как только ЖТ стабилизируется на уровне 7 мл/кг, запишите физиологические измерения Timepoint 0 hour и заполните лист CRF. Корректируйте RR на основе PaCO2 по анализу газов крови.

8. Вентиляция в период наблюдения (Время: ~6 ч)

  1. Переключитесь на вентиляцию с регулируемым объемом с FiO2 при 0,5 и PEEP при 6 смH2O. При необходимости регулируйте PIP, чтобы поддерживать VT на уровне 7 мл/кг (не устанавливайте максимальный PIP). Отрегулируйте RR, максимум до 60 вдохов/мин, чтобы поддерживать нормальный PaCO2.
  2. Используйте ежечасные измерения газов крови для корректировки RR в течение оставшейся части эксперимента. Непрерывно регулируйте PIP, чтобы поддерживать VT на уровне 7 мл/кг.
  3. Равномерно применяйте эти параметры вентиляции как к контрольным, так и к многократным животным в течение всего 6-часового периода наблюдения (см. рис. 1).

9. Процедура лечения - по желанию (Время: ~10-20 мин)

  1. Для потенциальных интервенционных исследований препарат должен быть введен клинически значимым путем , таким как интратрахеальное (ИТ), внутривенное (ВВ), подкожное, внутримышечное или интраназальное введение. Подбирайте сроки лечения исходя из плана эксперимента. Если лечение не проводится, перейдите к шагу 10. Ниже приведен пример ИТ-администрирования:
    1. Расположите поросенка в положении правого бокового лежания.
    2. Поддерживайте PEEP на уровне 6 смH2O. Отрегулируйте PIP для достижения VT 7 мл/кг.
    3. Вставьте катетер в клапанный боковой порт на заданную длину (как описано в шаге 7.2.3.3). Закапывайте половину предполагаемой дозы или объема вмешательства. Затем введите болюс из 1 мл NS и 9 мл воздуха. Ограничьте общий объем до 2,5 мл/кг, чтобы свести к минимуму риск окклюзии вентиляции после болюсной инъекции.
    4. Закройте боковой порт с клапаном крышкой, чтобы предотвратить утечку вентиляции.
    5. Переместите поросенка в левое боковое положение лежа и повторите шаги 9.1.3-9.1.4.
    6. Верните поросенка в положение лежа на спине. Отрегулируйте PIP, чтобы поддерживать VT на уровне 7 мл/кг.
    7. Продолжайте проветривание, как описано в шаге 8.

10. Эвтаназия и завершение эксперимента

  1. Выполните окончательную физиологическую регистрацию и сбор образцов после 6 часов вентиляции в течение периода наблюдения (шаг 8).
  2. Усыпьте животное с помощью 120 мг/кг пентобарбитала натрия внутривенно (240 мг/мл) в виде болюса (в соответствии с утвержденными в учреждении протоколами).
  3. Обеспечить смерть животного при отсутствии жизненно важных показателей (сердцебиение, артериальное давление, дыхание). Аускультат при отсутствии сердечного ритма и звуков дыхания стетоскопом для подтверждения смерти. Смерть также подтверждается с помощью терминального забора тканей сердца и легких.
  4. Сбор образцов тканей и жидкостей организма для дальнейшего биохимического, молекулярного и/или гистологического анализа 14,17 для будущих экспериментов.
  5. Сохраните все данные в оборудовании для мониторинга и аппарате искусственной вентиляции легких, обеспечьте загрузку резервных копий на локальный диск и общий диск, а также выключите все оборудование.
  6. Утилизируйте все острые и биологически опасные материалы в соответствии с местными правилами.
  7. Очистите все поверхности предпочтительным антисептическим средством.
  8. Вымойте все инструменты и дайте высохнуть на ночь.

Результаты

Конечные точки этой модели согласуются с критериями Американского торакального общества для ОПЛ (минимум 3 из 4), которые включают физиологические, гистологические, воспалительные и альвеолярно-капиллярные барьерные изменения16,17. Дополнительные конечные точки могут быть включены в зависимости от исследования и по усмотрению каждой исследовательской группы, желающей реализовать эту модель. Умеренное повреждение легких определяется как отношение частичной фракции кислорода в артериальной крови к фракции вдыхаемого кислорода (PaO2/FiO2, также известное как отношение P/F) < 200 мм рт. ст., а тяжелое < 100 мм рт.ст. Кислородный индекс (ОИ) рассчитывается по следующей формуле: ОИ = (среднее давление в дыхательных путях (mAWP) * %O2)/PaO2, а значения от 8 до 16 классифицируются как травма средней тяжести28. По сравнению с контрольными животными, у животных с множественными поражениями наблюдалось повреждение легких тяжелой и средней степени тяжести из-за нарушения индекса оксигенации, соотношения P/F и снижения податливости дыхательной системы (Рисунок 2). Явные признаки гистологического повреждения присутствовали при использовании 5-модальной оценки гистологического повреждения легких16,17 (рис. 3), с притоком нейтрофилов в альвеолярное и интерстициальное пространство, белковым мусором, заполняющим воздушное пространство, и утолщением альвеолярной перегородки. Приток нейтрофилов в BALF указывает на воспалительные процессы наряду с повышением цитокина IL-6 в легочной ткани (рис. 4).

figure-results-1
Рисунок 1: Блок-схема острого повреждения легких у неонатальных поросят. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-2
(A,B) Повышенный индекс оксигенации (между 8-12) и низкое соотношениеPaO2/FiO2 (P/F) получены в модели множественного удара, представленной здесь (красная линия) по сравнению с контрольной моделью (синяя линия), в соответствии с умеренным и тяжелым повреждением легких. (C) Функция легких нарушена у животных, подвергшихся многократному воздействию, что здесь показано как снижение податливости дыхательной системы на >50%. Количество животных (N): контрольное (N = 5) и многоствольное (штамм ЛПС O55:B5, 1,5 мг/кг) (N = 3). Все используемые значения означают ± SD. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-3
Рисунок 3: Модель множественного поражения ОЛП демонстрирует гетерогенное гистологическое повреждение. (A,B) Наблюдаются макроскопические признаки очагового повреждения легких, преимущественно поражающего заднюю центральную часть множественного пораженного легкого. (К,Г) Репрезентативные изображения (100x) окрашенных гематоксилином и эозином (H&E) срезов легких, показывающих нейтрофильный приток в альвеолярное и интерстициальное пространство с альвеолярным и септальным утолщением в множественном легком. (Э,Ж) Репрезентативные изображения (400x) окрашенных H&E срезов легких подчеркивают нарушение структурной целостности, нейтрофильную инфильтрацию и отложение мусора в альвеолярном пространстве множественного пораженного легкого. Синие квадраты представляют увеличенную область в точках (E,F). Черная масштабная линейка представляет 100 мм (C,D) и 50 мм (E,F). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-4
(A) Приток нейтрофилов с нейтрофилами, достигающий более 75% от доли всех клеток в жидкости бронхоальвеолярного лаважа (BALF) через 6 ч после индуцированного повреждения легких (multi-hit) по сравнению с контрольными животными. (В) Провоспалительный цитокин IL-6 повышается в жидкости бронхоальвеолярного лаважа (BALF) и (C) легочной ткани через 6 ч после индуцированной ОПЛ. Количество животных (N) варьируется в зависимости от материала, доступного на момент времени для анализа. Для BALF (B) был использован иммуноферментный анализ, в то время как для легочной ткани (C) была выполнена технология мультиплексных лазерных шариков. Все значения отображаются как среднее значение ± SD. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Дополнительный файл 1: Форма наблюдения за клиническим случаем для модели острого повреждения легких у неонатального поросенка. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту статью.

Обсуждение

Модель ALI у новорожденного поросенка состоит из мультихитовой модели, включающей промывание легких для удаления сурфактанта (имитируя респираторный дистресс-синдром, приводящий к ателектотравме), высокое воздействие кислорода (приводящее к активным формам кислорода), искусственную вентиляцию легких (баро/волю-травма), а также IT-введение ЛПС в качестве воспалительного стимула, отражая различные компоненты, которые, как считается, участвуют в патогенезе БЛД у недоношенных детей2. В процессе истощения поверхностно-активного вещества происходит целенаправленное повышение давления и кислорода, что способствует травме. Воздействие гипероксии с FiO2 1.0 составляет примерно 3 ч, а высокое давление добавляется в течение примерно 90 мин во время фазы индуцированного повреждения легких (лаваж истощения сурфактанта и установка эндотоксина). Высокий уровень кислорода во вдыхаемом воздухе во время реанимации (высокий FiO2 0,9 против низкого FiO2 0,3) у тяжело недоношенных новорожденных приводил к более высокому окислительному стрессу и воспалению при воздействии гипероксии менее 1 ч29. При истощении сурфактанта в модели поросенка легкие разрушаются, что приводит к ателектазу, а способность поддерживать альвеолярную проходимость снижается для соответствующей вентиляции и оксигенации. Таким образом, даже если настройки уменьшаются в течение периода наблюдения, удаление поверхностно-активного вещества приведет к необходимости более высокого давления для достижения приливного объема 7 мл/кг. Со временем легкие смогут вырабатывать сурфактант, и степень происходящего вредного процесса со временем может уменьшиться. Тем не менее, эта новая модель ОПЛ у неонатальных поросят показывает незначительное восстановление (Рисунок 2) функции легких (податливость) и оксигенации (коэффициент PF) в течение периода наблюдения в течение 6 часов после индуцированного повреждения легких. Эта модель очень похожа на наиболее распространенные начальные постнатальные обстоятельства, с которыми сталкиваются глубоко недоношенные дети, что делает ее очень актуальной для трансляционных усилий. Модель создает острую травму легких от умеренной (100-200 мм рт.ст.) до тяжелой (<100 мм рт.ст.), определяемую соотношением P/F28. Эффект ЛПС с воспалением достигает пика через один-2 часа после травмы. Эта модель может быть использована в качестве каркаса, которым могут манипулировать другие группы, изменяя продолжительность наблюдения или лечения в соответствии с их исследовательской программой.

Критические шаги в протоколе

Несмотря на то, что приоритет отдается доступности, эта большая животная модель остается сложной, требуя совместной работы высококвалифицированной команды, чтобы довести этот эксперимент до конца. В протоколе есть критические шаги, которые требуют особой осторожности. Эти соображения имеют решающее значение для обеспечения успеха этой сложной экспериментальной структуры.

Перевозка животного

Ожидается, что раннее отделение от матери будет чрезвычайно стрессовым временем для животного, что потенциально может привести к неспособности поддерживать сердечно-сосудистую стабильность и возможной смерти во время транспортировки. Тем не менее, представленный здесь протокол транспортировки (см. шаг 3) допускал очень спокойных животных (некоторые даже засыпают), что позволяет проводить полноценные эксперименты. Несмотря на то, что трудно дать четкие рекомендации относительно максимальной продолжительности транспортировки, по нашему опыту, поросята смогли комфортно выдержать транспортировку около 60 минут.

Оптимизация вентиляции

Аппарат ИВЛ должен быть настроен на компенсацию соответствия контуру, чтобы гарантировать, что полный дыхательный объем будет доставлен в легкие. Это особенно важно во время истощения поверхностно-активного вещества, так как поросенок может стать гемодинамически нестабильным, если дыхательный объем теряется в цепи. Исследователям необходимо подтвердить, что имеющийся аппарат искусственной вентиляции легких позволит обеспечить надлежащий дыхательный объем для новорожденного. Аппараты искусственной вентиляции легких для взрослых часто не могут достичь соответствующего дыхательного объема у новорожденных. PIP используется для поддержания значений дыхательного объема выдоха (7 мл/кг, используемое в этом протоколе, как ранее описано другими 14,19,20,21,31,32, за исключением периода промывания легких - см. следующий раздел). Стандартизированное использование адаптера эндотрахеальной трубки с клапанным боковым портом во время введения ЛПС или для любого ИТ-лечения позволяет поддерживать давление в дыхательных путях, избегая отключения от вентиляционного контура.

Стандартизированная стратегия рекрутинга легких после операции

Ателектаз может развиться в легких поросят на подготовительном и хирургическом этапах. Маневр «рекрутирования легких» после расслабления мышц был дан33 для обеспечения правильной аэрации легких. Ожидается, что после маневра рекрутирования парциальное давление кислорода в артериальной крови составит более 400 мм рт.ст., учитывая нормальную гипероксическую реакцию в здоровых открытых легких. Если это не достигнуто, исследователь должен рассмотреть, были ли легкие не подобраны надлежащим образом из-за неоптимизированных условий эксперимента или у поросенка может быть уже существующее заболевание (например, если поросенок получен с фермы, где могут произойти неизвестные воздействия). Протокол позволяет проверить предыдущее объяснение с повторным запуском маневра вербовки один раз, чтобы увидеть, может ли быть достигнута эта цель. Если не удается достичь 400 мм рт.ст. PaO2 во второй раз, рассмотрите исключение животного как ранее существовавшее состояние, которое может существовать и которое может ненадлежащим образом повлиять на результаты эксперимента.

Достаточное количество жидкости и метаболический гомеостаз имеют первостепенное значение

Это ограничит важные искажающие эффекты, связанные с плохой гидратацией и метаболическим контролем. Эти новорожденные доношенные поросята, обычно рожденные в большом помете, не у всех будут одинаковые возможности для кормления. Таким образом, они могут подвергаться некоторому уровню постнатального обезвоживания перед использованием в эксперименте. Обеспечение общего потребления жидкости в 5-8 мл/кг/ч достаточно для поддержания хорошего внутрисосудистого объема14,34. Обеспечение метаболического контроля происходит при поддержании уровня глюкозы в крови в пределах 4-5 ммоль/л (нормальный физиологический диапазон для новорожденных поросят35,36). Высокий уровень лактата в крови является еще одним эталоном, используемым для отражения плохой доставки кислорода и, возможно, может отражать низкий уровень внутрисосудистой жидкости до гипоксии. Достаточный инфузионный режим и хорошо гидратированное животное выдерживают истощение сурфактанта лаважи с сердечно-сосудистой стабильностью и не вызывают тяжелого ацидоза. Референсные значения гемоглобина и других биохимических параметров варьируют в зависимости от возраста и вида37,38. Более низкий уровень гемоглобина может влиять на оксигенацию, что требует оптимизированного и консервативного забора крови39,40. Каждый забор крови компенсируется равным объемом NS. Уровень электролитов в крови, мочевины и креатинина использовался для соблюдения достаточного режима жидкости.

Обеспечивает достаточное время восстановления во время процедуры промывания легких

Во время промывания легких между каждым промыванием требуется важное окно восстановления продолжительностью не менее 3-5 минут, чтобы обеспечить надлежащий венозный возврат и избежать опасного застоя в печени41, печеночного кровоизлияния и недостаточности правых отделов сердца. Этот феномен наблюдался у нескольких животных в экспериментальной когорте. Надлежащее и упреждающее управление инфузионными растворами является обязательным условием для поддержания клинической стабильности. При воссоздании небольшой интенсивной терапии для этой модели поросят важно иметь врача, неонатолога или старшего ветеринарного техника, которые могут способствовать передаче знаний среди членов команды для распознавания важных ситуаций и связанных с ними планов действий в чрезвычайных ситуациях.

Рекомендуемые способы устранения неполадок

Поросенок будет находиться под общим наркозом и обезболиванием в течение всего хирургического и экспериментального времени. Один человек занимается наблюдением за поросенком на протяжении всего эксперимента. Каждое животное отличается своей чувствительностью и реакцией на анестетики. Контроль состояния животного сразу после индукции наркоза жизненно важными веществами и ежечасным подачей газов крови имеет решающее значение. Он предоставит информацию об уровне анестезии и метаболической стабильности, в дополнение к физической оценке, если это необходимо. Существует вариабельность количества промываний легких (от 6 до 20) и, соответственно, времени (от 28-115 мин), необходимого для достижения истощения сурфактанта.

Потенциальные проблемы и решения во время индукции анестезии, стабилизации и хирургического вмешательства: (1) Если развивается апноэ, анестезирующий газ необходимо выключить, а дыхание необходимо поддерживать вентиляцией с помощью маски-мешка до тех пор, пока не вернется спонтанное дыхание. (2) При наличии признаков гиповолемии в виде высокого ЧСС, низкого MAP или низкого CVP необходимо ввести боклюсное введение жидкости в концентрации 10 мл/кг НС, а также рассмотреть возможность увеличения дозы поддерживающей жидкости. (3) При гипотензии со снижением MAP до 30-40 мм рт.ст., которая не устраняется с помощью болюса жидкости, насосы для анестезии должны быть уменьшены/прекращены, а признаки перфузии и гипотензии повторно оцениваются через 10-15 минут. Анализ газов крови на уровень гемоглобина для оценки возможного внутреннего кровотечения. (4) Если респираторные симптомы указывают на пневмоторакс (острая десатурация или брадикардия >20%), поросенка немедленно усыпляют.

Ограничения

Представленная здесь модель представляет собой краткосрочный (6 ч) неонатальный ОПЛ на крупной животной модели. Хронизация травмы, приводящей к ПРЛ, является важным фактором, который следует учитывать. Эта модель может не полностью отражать этот аспект патогенеза, и данные, информирующие о прогрессе повреждения легких за пределами 6 часов, остаются неопределенными. Тем не менее, согласованность этой модели является прочным фундаментом для развития (увеличение длины/модификация протокола), что обеспечивает универсальность исследовательским группам, которые будут его реализовывать. Несмотря на то, что во время ее разработки акцент делался на доступности и осуществимости этой модели крупного животного, для успешного проведения эксперимента необходимы определенные наборы навыков. Клинический опыт с прочной базой в области физиологии и знаниями для управления быстрыми изменениями/ухудшениями с помощью лекарств/инфузий и т.д. необходим для внедрения и успешного завершения на ранних стадиях. Этот набор навыков затем может быть передан членам команды для постоянного обслуживания модели с течением времени. Кроме того, команда, состоящая из ветеринарного техника, лаборантов и старших аспирантов, с которыми были установлены тесные связи и сотрудничество, может обеспечить надлежащий охват всех компонентов каждого эксперимента. Ожидается, что по крайней мере три члена команды потребуются для проведения эксперимента от начала до конца, когда рабочий процесс будет оптимизирован.

Значение и его потенциальное применение

Клинический перевод опирается на сильные фундаментальные исследования на доклиническом уровне. Тем не менее, многие клинические испытания терпят неудачу из-за несоответствия между доклинической моделью и физиологией человека, что подчеркивает важность тесно связанных моделей крупных животных для усиления потенциала трансляции. Создание новой модели повреждения легких у неонатального поросенка имеет решающее значение для лучшего понимания ранних патогенных событий, способствуя созданию благоприятной среды для развития БЛД в легких недоношенных у человека. Представленная здесь модель воссоздает важные аспекты интенсивной терапии (гипероксия, вентиляция под высоким давлением и недостаток сурфактанта) для недоношенных детей в течение первых нескольких дней жизни, что точно смоделировано. Эта новая универсальная модель множественных попаданий у неонатального поросенка предложит бесценную информацию о ранних патогенных процессах ПРЛ, углубит знания о терапевтических кандидатах, а также оптимизирует их терапевтическую доставку для эффективного клинического перевода. Он будет выступать в качестве отличного вектора для сотрудничества, способствуя созданию структуры для проверки гипотез для исследований с точки зрения безопасности и эффективности, а также для получения знаний. Эта модель, служащая основой для будущих исследований, значительно продвинет усилия по клиническому переводу острого повреждения легких, наблюдаемого у недоношенных детей.

Раскрытие информации

У всех остальных авторов нет конкурирующих интересов, о которых они могли бы заявить.

Благодарности

Мы благодарны доктору Мартину Посту из Hospital for SickKids, Торонто, который любезно предоставил нам аппарат искусственной вентиляции легких для новорожденных, который использовался на протяжении всего этого проекта. Мы также благодарим Дэна ДеВетта и его команду из Службы ухода за животными и ветеринарии Института сердца Университета Оттавы за всю помощь во время разработки этой модели. Эта работа была поддержана инновационным фондом CHAMO CHEO, Сетью стволовых клеток, ассоциацией принцессы Ловисы [HKH Kronprinsessan Lovisas förening], Фондом Дэвида и Астрид Хагелен и Шведским фондом сердечных легких.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
#10 СкальпельКожный разрез
1 мл шприцБектонДиксонBD309659Slip tip 
10 мл шприцевБектонДиксонBD302995Промывочные шприцы для артериальных и венозных линий
18 G ангиокатетер InsyteКаннуляция мочевого пузыря
20 мл шприцевБектонДиксонBD302830Жидкий болюс, если это необходимо.
22 G гиподермические иглыБектонДиксонШприц для заправки
24 G-ангиокатетераInsyte160465Доступ IV в ухо и бедренная артерия и вена
25 г шподежных иглБектонДиксонВнутримышечная инъекция бупенорфина
3 мл шприцевБектонДиксонВведение лекарств и удаление мёртвого пространства на линии мониторинга
Шёлковые галстуки 3-0EthiconA304Hиспользуется для закрепления артериальных и венозных катетеров
Четырёхпозиционные запорные краныДискофикс, БраунD500456020подключён к жидкости и мониторинговым линиям для промыва и отбора проб
Удлинительный набор 6"Технологии инфузии SAIExt-6прикреплены к капельницам/артериальным линиям 
Удлинительный набор 60"BBV6223Линии инфузии лекарств
Адаптер доступа AirLife Neo-Verso Y для эндотрахеальных трубокВяиреCSC300используется для введения материала внутритрахеально
Бупенорфин, 0,3 мг/млCDMV128140ИВ-болюс как обезболивающее
Декстроза — 5%БакстерJB0063Поддержание уровня глюкозы в крови
Одноразовые шторы3M3M1050Стерильные полевые шторы
ЭКГ-электроды3M220790Одноразовые электроды для ЭКГ
Катетера для эндотрахеальной трубки (ЭТТ)
Эндотрахеальная трубка 3,5 Teleflex5-10107Используется для трахеостомии
Адреналин, 1 мг/млHospira07541L01При необходимости разбавлять стерильным нормальным физиологическим раствором до 0,1 мг/мл для реанимации
Анализатор газов крови Epoc Сименс10736398Система анализа крови epoc с носителем NXS
Образцы карт EpocСименсBD309659Картриджи с кровяным газом
Формалин, буферизованный 10%Fisher ScientificSF100-4Фиксация лёгких
ГрелкуКент СайентификTPZ-814EAОдеяло для циркуляции воды
Внутривенные (IV) инфузионные насосы x 3Сигма ОлдричZ401358Инфузия кетамина/пропофола и рокурония
Кетамин, 10 мг/млВетокинол112170Непрерывная инфузия (разбавленная стерильным физиологическим раствором) в шприцовом насосе для поддержания анестезии 
Кетамин, 100 мг/млВетокинол112170Используется как болюс для индукции общей анестезии и насос с шприцем для поддержания анестезии 
Лактатные РингерыБакстерJB2323Поддержание объёма крови
Оборудование для промывания: воронка, трёхпозиционный соединитель, разъём ETT, трубка длиной 4 футан/дн/дСамодельная трубка для промывки
Липополисахарид, ЛПС (O55:B5), 100 мгСигма-ОлдричL2880-100 мгВторое поражение лёгких
Дыхательный увлажнитель MR850Фишер и ПайкелMR850JXX*
Пентобарбитал натрия (эвтанил), 240 мг/млВетокинол381IV болюс для гуманной эвтаназии
Датчик давленияMcCarthy Veterinary SuppliesV6402для артериального/венозного давления на Surgivet
Пропофол, 10 мг/млИспользуется как болюс для индукции общей анестезии и насос с шприцем для поддержания анестезии 
ПульсоксиметрMaismoNEOPT-500
Рокуроний, 10 мг/млAuropharma2498820Используется после операции и перед началом индукции при повреждении лёгких, после чего проводится непрерывная инфузия
Физиологический раствор, 0,9%БакстерJB1324Промывка крови и реанимация объёма крови
Стерильная водан/дн/дДля увлажнителя вентилятора
Отсосной катетер 10 CH/25 смMediplast608810251Используется для бронхеоальвеолярного промывания доли лёгких
отсосочный катетер 6 CH/40 смMediplast60880640Удалите избыточный физиологический раствор во время промывания
Хирургические инструменты: рукоятка скальпеля, щипцы от комаров, щипцы для большого пальца, ножницы для метценбаума, скобы, хирургические ножницы, ретракторы, марля, чаша из нержавеющей сталиН/ДН/ДХирургический пакет с автоклавом
Сургивет: манжета NIBP, температурный датчик и nbsp; 2 инвазивных давления, ЭКГ, пульсоксиметрMcCarthy Veterinary Suppliesv9203содержит: неинвазивный манжет для измерения давления (NIBP), термометр, 2x инвазивное давление (BP), электрокардиография (ЭКГ) и пульсоксиметр
Шприцовые насосы x 3Анестезиологические насосы
ЛентаЗакрепление внутривенных линий в ушах
Умбликальная лентаEthiconзакрепляет эндотрахеальную трубку внутри трахеи
Вентилятор (Servo-I)GetingeНужен неонатальный режим для правильного приливного объёма
Вентиляционный контурФишер и ПайкелRT265с увлажнителем
Зажим с окклюзией ворсовой трубкин/дн/дЗакрывает трубки во время мывки

Ссылки

  1. Perin, J., et al. regional, and national causes of under-5 mortality in 2000-19: An updated systematic analysis with implications for the sustainable development goals. Lancet Child Adolesc Health. 6 (2), 106-115 (2022).
  2. Thebaud, B., et al. Bronchopulmonary dysplasia. Nat Rev Dis Primers. 5 (1), 78(2019).
  3. Demauro, S. B., et al. Early motor development in infants with moderate or severe bronchopulmonary dysplasia. J Neonatal Perinatal Med. 15 (1), 55-62 (2022).
  4. Augustine, S., et al. Mesenchymal stromal cell therapy in bronchopulmonary dysplasia: Systematic review and meta-analysis of preclinical studies. Stem Cells Transl Med. 6 (12), 2079-2093 (2017).
  5. Contopoulos-Ioannidis, D. G., Ntzani, E., Ioannidis, J. P. Translation of highly promising basic science research into clinical applications. Am J Med. 114 (6), 477-484 (2003).
  6. Haworth, S. G., Hislop, A. A. Adaptation of the pulmonary circulation to extra-uterine life in the pig and its relevance to the human infant. Cardiovasc Res. 15 (2), 108-119 (1981).
  7. Rendas, A., Branthwaite, M., Reid, L. Growth of pulmonary circulation in normal pig--structural analysis and cardiopulmonary function. J Appl Physiol Respir Environ Exerc Physiol. 45 (5), 806-817 (1978).
  8. Starbaek, S. M. R., et al. Animal models for influenza a virus infection incorporating the involvement of innate host defenses: Enhanced translational value of the porcine model. ILAR J. 59 (3), 323-337 (2018).
  9. Schneberger, D., Aharonson-Raz, K., Singh, B. Pulmonary intravascular macrophages and lung health: What are we missing. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 302 (6), L498-L503 (2012).
  10. Thomas, A. V., Broers, A. D., Vandegaart, H. F., Desmecht, D. J. Genomic structure, promoter analysis and expression of the porcine (sus scrofa) TLR4 gene. Mol Immunol. 43 (6), 653-659 (2006).
  11. Islam, M. A., et al. Age-related changes in phagocytic activity and production of pro-inflammatory cytokines by lipopolysaccharide stimulated porcine alveolar macrophages. Cytokine. 60 (3), 707-717 (2012).
  12. Kapetanovic, R., et al. The impact of breed and tissue compartment on the response of pig macrophages to lipopolysaccharide. BMC Genomics. 14, 581(2013).
  13. Chen, L., He, H., Fernandez Mondejar, E., Hedenstierna, G. Cyclooxygenase inhibitor blocks rebound response after no inhalation in an endotoxin model. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 284 (1), H290-H298 (2003).
  14. Spengler, D., Rintz, N., Krause, M. F. An unsettled promise: The newborn piglet model of neonatal acute respiratory distress syndrome (nards). Physiologic data and systematic review. Front Physiol. 10, 1345(2019).
  15. Tridente, A., De Martino, L., De Luca, D. Porcine vs. bovine surfactant therapy for preterm neonates with RDS: Systematic review with biological plausibility and pragmatic meta-analysis of respiratory outcomes. Respir Res. 20 (1), 28(2019).
  16. Kulkarni, H. S., et al. Update on the features and measurements of experimental acute lung injury in animals: An official American Thoracic Society workshop report. Am J Respir Cell Mol Biol. 66 (2), e1-e14 (2022).
  17. Matute-Bello, G., et al. An official American Thoracic Society workshop report: Features and measurements of experimental acute lung injury in animals. Am J Respir Cell Mol Biol. 44 (5), 725-738 (2011).
  18. Matute-Bello, G., Frevert, C. W., Martin, T. R. Animal models of acute lung injury. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 295 (3), L379-L399 (2008).
  19. Preuss, S., et al. Inositol-trisphosphate reduces alveolar apoptosis and pulmonary edema in neonatal lung injury. Am J Respir Cell Mol Biol. 47 (2), 158-169 (2012).
  20. Spengler, D., et al. Novel therapeutic roles for surfactant-inositols and -phosphatidylglycerols in a neonatal piglet ARDS model: A translational study. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 314 (1), L32-L53 (2018).
  21. Von Bismarck, P., et al. Improved pulmonary function by acid sphingomyelinase inhibition in a newborn piglet lavage model. Am J Respir Crit Care Med. 177 (11), 1233-1241 (2008).
  22. Van Kaam, A. H., et al. Response to exogenous surfactant is different during open lung and conventional ventilation. Crit Care Med. 32 (3), 774-780 (2004).
  23. Lachmann, B., Robertson, B., Vogel, J. In vivo lung lavage as an experimental model of the respiratory distress syndrome. Acta Anaesthesiol Scand. 24 (3), 231-236 (1980).
  24. Thebaud, B., et al. Benefits and obstacles to cell therapy in neonates: The incubator (innovative neonatal cellular therapy for bronchopulmonary dysplasia: Accelerating translation of research). Stem Cells Transl Med. 10 (7), 968-975 (2021).
  25. Davies, M. W., Mehr, S., Morley, C. J. The effect of draw-up volume on the accuracy of electrolyte measurements from neonatal arterial lines. J Paediatr Child Health. 36 (2), 122-124 (2000).
  26. Ettrup, K. S., et al. Basic surgical techniques in the Gottingen minipig: Intubation, bladder catheterization, femoral vessel catheterization, and transcardial perfusion. J Vis Exp. (52), e2652(2011).
  27. Stenersen, E. O., et al. A piglet perinatal asphyxia model to study cardiac injury and hemodynamics after cardiac arrest, resuscitation, and the return of spontaneous circulation. J Vis Exp. (191), e64788(2023).
  28. Force, A. D. T., et al. Acute respiratory distress syndrome: The Berlin definition. JAMA. 307 (23), 2526-2533 (2012).
  29. Vento, M., et al. Preterm resuscitation with low oxygen causes less oxidative stress, inflammation, and chronic lung disease. Pediatrics. 124 (3), e439-e449 (2009).
  30. Vincent, D., et al. Intratracheal E. coli lipopolysaccharide induces platelet-dependent bronchial hyperreactivity. J Appl Physiol (1985). 74 (3), 1027-1038 (1993).
  31. Preuss, S., et al. 18:1/18:1-dioleoyl-phosphatidylglycerol prevents alveolar epithelial apoptosis and profibrotic stimulus in a neonatal piglet model of acute respiratory distress syndrome. Pulm Pharmacol Ther. 28 (1), 25-34 (2014).
  32. Von Bismarck, P., et al. Surfactant "fortification" by topical inhibition of nuclear factor-kappa b activity in a newborn piglet lavage model. Crit Care Med. 35 (10), 2309-2318 (2007).
  33. Pape, A., et al. Neuromuscular blockade with rocuronium bromide increases the tolerance of acute normovolemic anemia in anesthetized pigs. Eur Surg Res. 48 (1), 16-25 (2012).
  34. Gasthuys, E., et al. Repetitive urine and blood sampling in neonatal and weaned piglets for pharmacokinetic and pharmacodynamic modelling in drug discovery: A pilot study. Lab Anim. 51 (5), 498-508 (2017).
  35. Noblet, J., Dourmad, J. Y., Etienne, M., Le Dividich, J. Energy metabolism in pregnant sows and newborn pigs. J Anim Sci. 75 (10), 2708-2714 (1997).
  36. Keibl, C., Kerbl, M., Schlimp, C. J. Comparison of Ringer's solution with 0.4% glucose or without in intraoperative infusion regimens for the prevention of hypoglycemia in juvenile pigs. Lab Anim. 48 (2), 170-176 (2014).
  37. Perri, A. M., O'sullivan, T. L., Harding, J. C., Wood, R. D., Friendship, R. M. Hematology and biochemistry reference intervals for Ontario commercial nursing pigs close to the time of weaning. Can Vet J. 58 (4), 371-376 (2017).
  38. Egeli, A. K., Framstad, T., Morberg, H. Clinical biochemistry, haematology and body weight in piglets. Acta Vet Scand. 39 (3), 381-393 (1998).
  39. Linderkamp, O., et al. Blood volume in newborn piglets: Effects of time of natural cord rupture, intra-uterine growth retardation, asphyxia, and prostaglandin-induced prematurity. Pediatr Res. 15 (1), 53-57 (1981).
  40. Talbot, R. B., Swenson, M. J. Blood volume of pigs from birth through 6 weeks of age. Am J Physiol. 218 (4), 1141-1144 (1970).
  41. Berger, D., et al. Effect of PEEP, blood volume, and inspiratory hold maneuvers on venous return. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 311 (3), H794-H806 (2016).

Перепечатки и разрешения

Теги

o
Разработка модели острого повреждения легких у неонатального поросенка, воссоздающей раннюю среду легких недоношенных детей
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.