In vivo визуализация суставов — ценный метод для выявления миграционного поведения лейкоцитов и молекулярной динамики внутри воспалённых суставов. Здесь мы представляем подробный протокол для in vivo визуализации суставов с использованием мышиной модели коллаген-индуцированного артрита II типа (CIA).
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
In vivo Визуализация выявляет миграционное поведение лейкоцитов внутри суставов
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Лейкоциты — это клетки, передающиеся в крови, происходящие из костного мозга, которые должны мигрировать в ткани для опосредования воспаления. Контроль этой миграции, таким образом, является критическим моментом для разработки новых терапевтических стратегий по снижению воспаления. Традиционные исследования конечных точек не позволили полностью разобрать миграционное поведение лейкоцитов in vivo. Однако недавние достижения в технологиях визуализации предоставили беспрецедентные знания о миграции иммунных клеток у живых животных, значительно расширив наше понимание молекулярной регуляции трафика иммунных клеток.
Здесь мы представляем подробный протокол для in vivo визуализации суставов с использованием модели артрита, индуцированного коллагеном II у мышей (ЦРА). Мыши иммунизируются с помощью коллагена типа II, эмульгированного полным адъювантом Фройнда, а прогрессирование артрита отслеживается с помощью клинических оценок и измерения толщины лап. На пике артрита лейкоциты визуализируются in vivo с помощью конфокальной микроскопии у трансгенных мышей, экспрессирующих флуоресцентные белки, или у диких мышей после внутривенной инъекции флуоресцентно меченых антител и высокомолекулярного декстрахона для окрашивания сосудов. Тщательное хирургическое обнажение сустава, применение агарозы и правильное положение ноги позволяют проводить стабильную долгосрочную визуализацию, обычно длительное несколько часов. Этот подход позволяет в реальном времени анализировать остановку, ползение и трансэндотелиальную миграцию лейкоцитов внутри воспалённых суставов.
Этот протокол будет полезен для исследовательских групп, изучающих трафик лейкоцитов при артрите и других воспалительных заболеваниях. Он также может служить платформой для доклинической оценки терапии, направленных на миграцию иммунных клеток.
Введение
Поскольку лейкоциты — это клетки, передающиеся в крови, происходящие из костного мозга, они должны попасть в ткани, чтобы вызватьвоспаление 1. Контроль этого процесса является ключевым моментом, в котором могут быть разработаны новые терапевтические средства для снижениявоспаления 2. В целом трафик лейкоцитов в воспалённую ткань происходит в посткапиллярных венулах и следует за каскадом спайки, начиная с захвата свободно текущих лейкоцитов стенкой сосуда. Кроме того, за этим процессом следуют движения лейкоцитов вдоль стенки сосудов в направлении течения, остановка лейкоцитов на эндотелии, высвобождение из адгезии и ползение во всех направлениях по поверхности сосуда, чтобы найти рецептивный участок для трансэндотелиальной миграции (TEM) в определённое место внутриткани 1,3.
Эти отдельные этапы регулируются сочетанием молекулярных сигналов, включая селектины (для перекатывания), интегрины (для остановки, ползания) и хемоаттрактанты (CA) (для остановки, возможно, ползущего, и TEM)3. CAs активируют лейкоциты через семь трансмембранных хемоаттрактантных рецепторов G-белков, связанных с CAR, и играют важную роль в каскаде адгезии, повышая аффинность интегринов (что приводит к остановке) и вызывая TEM. Однако точные механизмы TEM до конца не изучены. Традиционные исследования конечных точек и эксперименты in vitro не дали представления о том, как сигнализация CA-CAR динамически регулирует миграционное поведение лейкоцитов in vivo.
Недавние достижения в технологиях визуализации предоставили беспрецедентные взгляды на миграцию иммунных клеток у живых животных, значительно расширяя наше понимание молекулярной регуляции трафика иммунных клеток in vivo 4,5,6.Например, эта технология прояснила молекулярный контроль трафика нейтрофилов в области воспаления тканей, такие как термическое повреждениепечени 7 и лазерное повреждениекожи 8. Поэтому мы применили к изучению молекулярных механизмов, контролирующих транспортировку нейтрофилов в места воспалениясуставов 9. Описанная здесь in vivo суставная визуализация показала, что рецептор комплемента компонента C5a 1 (C5aR1) играет ключевую роль в инициировании адгезии нейтрофилов к эндотелию суставов, вызывая воспаление в суставах. C5aR1 способствовал остановке и распространению интегрино-зависимых нейтрофилов, за которым следовал TEM, опосредованный рецептором лейкотриена B4, и полззание, вызванное CC-хемокиновым рецептором 1 (CCR1). Хемокиновый рецептор CXC 2 (CXCR2) сыграл роль на поздних стадиях нейтрофилного TEM в воспалённыхсуставах 10. Кроме того, in vivo суставная визуализация выявила новую парадигму реакций гиперчувствительности типа III в суставе, где C5a выступает инициатором воспаления, а клетки, проживающие в тканях, играют более значимую роль в воспалении в современной парадигме реакций гиперчувствительности типаIII 10,11.
Кроме того, мы применили in vivo визуализацию сустава для изучения молекулярной динамики C5a внутри сустава. C5a, загруженный в ткань сустава у диких мышей, быстро переносился в сосудистый просвет, тогда как у мышей с дефицитом C5aR2 C5a полностью оставался внутри синовиальнойткани 12. Эти данные показывают, что C5aR2, экспрессируемый на суставном эндотелии, транспортирует C5a в просвет сосуда, процесс, необходимый для адгезии нейтрофилов C5aR1 всуставах 13.
In vivo визуализация суставов применима ко всем моделям воспалительного артрита и позволяет проводить длительное наблюдение (обычно пару часов), хотя визуализация глубоких тканей (>1 мм) может быть ограничена в зависимости от используемого микроскопа. В совокупности эта техника предоставляет мощный инструмент для изучения миграционного поведения лейкоцитов и молекулярной динамики внутри воспалённых суставов. Мы делимся этим протоколом для in vivo суставной визуализации, чтобы поддержать исследовательские группы, изучающие этот процесс в воспалённых суставах.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Все эксперименты на животных были одобрены Институциональным комитетом по уходу и использованию животных Медицинской школы Университета Святой Марианны (Одобрение No TG240926-2 и TG250801-2) и проводились в соответствии с институциональными и национальными рекомендациями.
1. Подготовка мышиной модели артрита
ПРИМЕЧАНИЕ: Животные модели с артритом предоставили ценные инструменты для понимания патогенеза заболевания и разработки новых методов терапии14. Хотя у нескольких мышиных моделей артрита есть уникальные преимущества и ограничения, коллаген-индуцированный артрит II типа (КИА) широко используется в исследованиях патогенеза ревматоидного артрита (РА)14. В этом разделе мы описываем протокол моделей ЦРУ при артрите (материалы и инструменты показаны на рисунке 1).
- Приготовьте разбавление бычьего коллагена типа II в уксусной кислоте 0,05 M (конечная концентрация 4 мг/мл), встряхивая ночью при 4 °C.
- Для создания эмульсии смешайте разбавление коллагена (4 мг/мл в уксусной кислоте 0,05 м) с полным адъювантом Фройнда (CFA) в соотношении 1:1 в стеклянном шприце. Это даёт итоговую концентрацию коллагена 2 мг/мл в эмульсии. Энергично перемешивайте вручную примерно 20 минут. Этот процесс генерирует тепло, охлаждая стеклянный шприц с эмульсией на льду. Используйте стакан, чтобы проверить консистенцию эмульсии во время приготовления.
ЗАМЕТКА. Сохраняйте оставшееся разбавление коллагена при -80 °C. Это можно использовать для второй прививки. - Перенесите эмульсию в стеклянный шприц объёмом 1 мл с иглой 26 x 1/2 G и держите его на льду до иммунизации.
- Анестезировать мышей DBA1/J возрастом 8 недель (самцов или самок) внутрибрюшническим введением медетомидина (0,3 мг/кг), мидазолама (4 мг/кг) и веторфала (5 мг/кг).
ЗАМЕТКА. Трансгенные мыши часто имеют происхождение C57BL6. Куриный коллаген обычно используется для ЦРУ у мышей C57BL6; однако частота и тяжесть ЦРА у мышей C57BL6 ниже, чем у мышей с DBA/1J. Если вы используете трансгенных мышей на фоне C57BL6, рассмотрите возможность проведения пилотного исследования для оценки заболеваемости и тяжести ЦРУ. - Сбрийте волосы вокруг хвоста с помощью машинки для машинки для подготовки к прививке.
- Медленно вводите 100 мкл объёма эмульсии (содержащего 200 мкг коллагена) в подкожное пространство вдоль хвостового спинного отделения (возле основания хвоста) (см. рисунок 2).
- Повторите шаги с 1.2 по 1.6 на 21-й день для второй прививки (рисунок 2).
2. Оценка клинической оценки артрита и измерение толщины лапы
ПРИМЕЧАНИЕ: Клиническая оценка артрита и измерение толщины лапы необходимы для оценки активности заболевания. Обычно клинические оценки при артрите и измерения толщины лапы проводятся каждые 1-3 дня после первой прививки.
- Клинический балл по артриту: Запишите сумму баллов для всех четырёх лап каждой мыши. Используйте следующую систему подсчёта очков:
0 = Нормальное
1 = Эритема и отёк одного пальца
2 = Эритема и отёк двух пальцев или эритема и отёк голеностопного сустава
3 = Эритема и отёк более чем трёх пальцев или отёк двух пальцев и суставов голеностопа
4 = Эритема и сильное отёк голеностопа, стопы и пальцев с деформацией.
ЗАМЕТКА. Опухший сустав голеностопа определяется как толщина лапы более 4 мм. - Измерение толщины лап: измерьте толщину каждой лапы с помощью цифровых затворных суппортов. Используйте среднюю толщину лапы на всех четырёх лапах каждой мыши.
3. In vivo визуализация суставов
ПРИМЕЧАНИЕ: In vivo визуализация суставов позволяет нам наблюдать миграцию лейкоцитов в суставы и анализировать их поведение в ткани у живых мышей. Для визуализации клеток применяются трансгенные мыши, генетически модифицированные для экспрессии флуоресцентных белков в определённых клетках, а также мыши, вводящие внутривенно антиклеточные маркерные антитела. Используемые материалы показаны на рисунке 3.
- Анестезия артритогенных мышей внутрибрюшинно с помощью медетомидина (0,3 мг/кг), мидазолама (4 мг/кг) и веторфала (5 мг/кг).
- Сбрийте лапку мыши машинкой для стрижки и используйте крем для удаления волос (<60 с с). Избегайте длительного нанесения, чтобы избежать раздражения кожи.
- Снимите крем влажной марлей (рисунок 4A). Убедитесь, что все волосы удалены, чтобы избежать нежелательной автофлуоресценции в области визуализации. Повторяйте, если потребуется.
- Стерильная смазка для роговицы наносится на оба глаза во время анестезии для предотвращения высыхания или язвы роговицы.
- Под хирургическим эндоскопом сделайте разрез диаметром 1 см по коже с помощью микроножниц (рисунок 4B).
ЗАМЕТКА. Этот шаг критически важен. Операция может вызвать рекрутацию лейкоцитов (особенно нейтрофилов). Избегайте повреждений, которые могут привести к появлению артефактов. Из-за ангиогенеза в артритных суставах эти суставы подвержены кровотечению. Для успешной операции может потребоваться несколько тренировочных сессий. - Разместите артритные суставы на пластиковой пластине (рисунок 4C).
ЗАМЕТКА. Для фиксации лапки мыши можно использовать клей для тканей. В этом исследовании используется глина для крепления стеклянного слайда к пластиковой пластине. - Покрыть область визуализации примерно 1 мл агарозы 1,5% с фосфатно-буферным физиологическим раствором (PBS) (рисунок 4D).
ЗАМЕТКА. Убедитесь, что агароза охладилась, чтобы предотвратить повреждение тканей, что может способствовать привлечению лейкоцитов в область визуализации. - Подготовьте сцену на микроскопе.
ЗАМЕТКА. Используйте грелку, чтобы поддерживать температуру тела мыши во время длительных сеансов съёмок. - Настройте настройки конфокального микроскопа (мощность лазера, усиление, смещение, расположение и т.д.). Здесь проводите съёмку на конфокальном микроскопе с объективом с погружением в воду 25, NA 1.1. Установите лазерное возбуждение на 488 нм, 561 нм и 640 нм, а излучение соберите на 488,0 нм, 561,6 нм и 638,5 нм.
- Проверьте скорость сканирования микроскопа. Используйте разрешение пикселей 512 x 512, с 5 оптическими секциями, Z-стеком 4 мкм и временем цикла 15 с для анализа отдельных подвижных ячеек на протяжении достаточного времени и получения значимых данных.
- Когда найдено подходящее место, начинайте сбор изображений.
ЗАМЕТКА. При использовании антиклеточных маркерных антител для маркировки лейкоцитов вводите антитела внутривенно за 3 минуты до начала визуализации. Для визуализации кровеносных сосудов одновременно вводите Qdots, антитела к CD31 или Dexn. Например, вводите примерно 2 мкг антител на мышь Ly6G для нейтрофилов и CD4 для Т-клеток, а также примерно 80 мкг 680-250k декстран на мышь для окрашивания кровеносных сосудов. Антитела и декстран обычно растворяются в 100 мкл стерильного PBS. Имейте в виду, что некоторые антитела могут истощать лейкоциты, поэтому убедитесь, что выбранные антитела не снижают количество лейкоцитов. - Обработка изображений ND2, полученных с помощью конфокального микроскопа, используя модуль General Analysis 3 (GA3) программного обеспечения для анализа изображений NIS-Elements (версия 6.20.00). Проведите удаление сосудистых областей и фоновый вычитание. После обработки всех временных кадров экспортируйте изображения в виде видео.
ЗАМЕТКА. В рамках анализа подсчитайте количество клеток, прилипших и экстравазируемых. - После завершения визуализации либо дайте животному восстановиться в рамках процедуры выживания, либо гуманно усыпить его, в зависимости от дизайна эксперимента. Если планируется выживание, аккуратно закройте место операции и обеспечьте соответствующий послеоперационный уход в соответствии с институциональными рекомендациями по уходу за животными.
ПРИМЕЧАНИЕ: В данном исследовании все животные были гуманно эвтаназированы сразу после проведения визуализации в соответствии с институциональными и национальными рекомендациями.
4. Статистический анализ
- Представить данные как среднее ± стандартную ошибку среднего значения (SEM). Проведите статистический анализ с использованием t-теста Студента для сравнения между двумя группами или одностороннего ANOVA для нескольких групп, затем пост-хок теста Тьюки. Рассмотрим p-значение < 0,05 как статистически значимое.
ПРИМЕЧАНИЕ: Весь анализ проводился с использованием GraphPad Prism версии 10.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Здесь 8-недельные самцы мышей DBA/1J иммунизируются эмульсией, содержащей коллаген и CFA крупного рогатого скота II типа в соотношении 1:1 на 0-й и 21-й день. Клиническая оценка и измерение толщины лапы при артрите проводятся каждые 1-3 дня с 0 по 42 день. Обычно начало артрита наблюдается примерно на 28-й день, при этом клинический показатель артрита и толщина лапы достигают пика около 35-го дня (рисунок 5A-C). Частота ЦРУ ...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Визуализация суставов in vivo в отличие от традиционных исследований конечных точек, даёт беспрецедентные знания о динамических биологических процессах у живых мышей. Например, эта техника позволяет понять, как четыре различных хемоаттрактантных рецептора — C5aR1, BLT1, CCR1 и CXCR2 — взаимодействуют для инициирования рекрутации нейтрофилов в воспалённые суставы приартрите 10,11. Кроме того, in vivo визуализация...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Y.M. получила грантовую и исследовательскую поддержку от Chugai Pharmaceutical Co., Ltd.
Благодарности
Работа Y.M. поддерживается Японским обществом содействия науке (JSPS) KAKENHI [грант номер JP22K08531, JP25K02574]; Японское агентство по медицинским исследованиям и разработкам (AMED) [Номер гранта 25bm1423033]; Фонд памяти Мочиды по медицинским и фармацевтическим исследованиям; Грант JCR на продвижение исследований для FRONTIER и Фонда Mitsubishi.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 29 G x 1/2" | Тэрумо | SS-10M2913 | |
| 0,1 млн уксусной кислоты | Fujifilm | 016-18835 | |
| Пластиковый шприц объёмом 1 мл | ВВЕРХ | 19531 | |
| 1 мм шприц для смазки | Тэрумо | SS-01T | |
| 18 G x 1 1/2" | Тэрумо | NN-1838R | |
| 26 G x 1/2" | Тэрумо | NN-2613S | |
| 680-250 кДа декстран | Биотиум | 80135 | |
| Агарозе | invitrogen | 16520-100 | |
| Коллаген бычьего типа II | Центр исследований коллагена | K42 | |
| Клей | debika | 93186 | |
| Полный фрейнд s адъювант (CFA) | Хондрекс | 7001 | |
| Конфокальный микроскоп | Nikon | A1 | |
| Стекло на обложке | Matsunami Glass IND., Ltd | C024401 | |
| Цифровой слайдовый суппорт | Мицутойо | 500-180-30 | |
| Трубка Falcon (15 мл) | Корнинг | NA | |
| Трубка Falcon (50 мл) | Корнинг | NA | |
| FITC-конъюгированное антитело Ly6G против мышей | Биолегенда | 127606 | |
| Щипцы | Робоз | RS-5070 | |
| Щипцы | NAPOX | MA-48-2 | |
| Стеклянный шприц и разъём | Tsubasa Industry Co., Ltd | S7P | |
| Grease | Torray Dow Corning Silicone | NA | |
| Машинка для стрижки волос | Валь | WA5109 | |
| Машинка для стрижки волос | Валь | 9966 | |
| Удаление волос crè я | Крейси | Н/Д | |
| Медетомидин | Мэйдзи | Н/Д | |
| Микроножницы | Робоз | RS-5610 | |
| Микроножницы | Робоз | RS-5630 | |
| Мидазолам | Сандоз | Н/Д | |
| Влажная марля | Nippon Paper Crecia Co., Ltd | S-200 | |
| Анализ изображений NIS-Elements 6.20.00 | Nikon | NA | |
| PBS в трубке Falcon (50 мл) | Симадзу Диагностическая Корпорация | 5913 | |
| ПЭ-конъюгированное антитело CD4 к мыши | Биолегенда | 100408 | |
| Пластиковая пластина | Корнинг | 351029 | |
| Prism 10.3.1 | GraphPad | NA | |
| Стекло с слайдом | Muto Pure Chemicals Co., Ltd | 5115 | |
| Хирургический обхват | Олимп | VMZ | |
| Тканевая связь | 3M | 1469SB | |
| Vetorphale | Мэйдзи | Н/Д |
Ссылки
- Nourshargh, S., Alon, R. Leukocyte migration into inflamed tissues. Immunity. 41 (5), 694-707 (2014).
- Miyabe, Y., Lian, J., Miyabe, C., Luster, A. D. Chemokines in rheumatic diseases: pathogenic role and therapeutic implications. Nat Rev Rheumatol. 15 (12), 731-746 (2019).
- Griffith, J. W., Sokol, C. L., Luster, A. D. Chemokines and chemokine receptors: positioning cells for host defense and immunity. Annu Rev Immunol. 32, 659-702 (2014).
- Murooka, T. T., et al. HIV-infected T cells are migratory vehicles for viral dissemination. Nature. 490 (7419), 283-287 (2012).
- Mempel, T. R., Henrickson, S. E., Von Andrian, U. H. T-cell priming by dendritic cells in lymph nodes occurs in three distinct phases. Nature. 427 (6970), 154-159 (2004).
- Sumen, C., Mempel, T. R., Mazo, I. B., von Andrian, U. H. Intravital microscopy: visualizing immunity in context. Immunity. 21 (3), 315-329 (2004).
- Wang, J., et al. Visualizing the function and fate of neutrophils in sterile injury and repair. Science. 358 (6359), 111-116 (2017).
- Lammermann, T., et al. Neutrophil swarms require LTB4 and integrins at sites of cell death in vivo. Nature. 498 (7454), 371-375 (2013).
- Miyabe, Y., Kim, N. D., Miyabe, C., Luster, A. D. Studying chemokine control of neutrophil migration in vivo in a murine model of inflammatory arthritis. Methods Enzymol. 570, 207-231 (2016).
- Miyabe, Y., et al. Complement C5a receptor is the key initiator of neutrophil adhesion igniting immune complex-induced arthritis. Sci Immunol. 2 (7), eaaj2195(2017).
- Sadik, C. D., Miyabe, Y., Sezin, T., Luster, A. D. The critical role of C5a as an initiator of neutrophil-mediated autoimmune inflammation of the joint and skin. Semin Immunol. 37, 21-29 (2018).
- Miyabe, Y., Miyabe, C., Mani, V., Mempel, T. R., Luster, A. D. Atypical complement receptor C5aR2 transports C5a to initiate neutrophil adhesion and inflammation. Sci Immunol. 4 (35), eaav5951(2019).
- Kohl, J. Igniting the flame in arthritis: C5aR2 controls endothelial transcytosis of C5a. Sci Immunol. 4 (35), eaax0352(2019).
- Miyabe, Y., Miyabe, C., Luster, A. D. LTB4 and BLT1 in inflammatory arthritis. Semin Immunol. 33, 52-57 (2017).
- Miyabe, Y., et al. Necessity of lysophosphatidic acid receptor 1 for development of arthritis. Arthritis Rheum. 65 (8), 2037-2047 (2013).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
Теги
