Для того чтобы понять динамику сети микросхем в коре головного мозга, очень важно одновременно записывать активность большого числа нейронов. В естественных условиях двухфотонного кальция изображений является единственным методом, который позволяет регистрировать активность нейронов плотной населения с одноклеточных разрешения.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
В Vivo 2-Фотон изображений кальция на уровне 2 / 3 от мышей
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Для того чтобы понять динамику сети микросхем в коре головного мозга, очень важно одновременно записывать активность большого числа нейронов. В естественных условиях двухфотонного кальция изображений является единственным методом, который позволяет регистрировать активность нейронов плотной населения с одноклеточных разрешения. Метод заключается в имплантации черепных окна изображения, потребители инъекционных флуоресцентного красителя показатель кальция, что может быть подхвачена большим количеством нейронов и, наконец, запись активности нейронов во времени изображений кальция промежуток использования в естественных условиях двухфотонного микроскопа. Сотрудничество инъекции астроцитов конкретных красителями позволяет дифференцировать нейронов из астроцитов. Техника может быть выполнена в мышей, экспрессирующих флуоресцентных молекул в конкретных субпопуляции нейронов, чтобы лучше понять сетевые взаимодействия различных групп клеток.
Протокол
- Подготовка решения флуоресцентных индикаторов кальция. Мы используем ацетоксиметил красителей эфир, или АМ красители для краткости. Эти красители, которые могут быть рассмотрены клетки при введении внеклеточно. Обычно мы используем Орегон-зеленый BAPTA-1 АМ или Fluo-4 утра в концентрации 1 мМ. AM красители могут быть получены из Invitrogen в 50 ампул мкг. Мы сначала подготовить 20% раствора Pluronic F-127 в ДМСО. Мы теплой решение перед применением каждый день, пока его ясно. Мы растворяем кальция показатель 20% Pluronic F-127/DMSO в течение 15-20 минут в концентрации 10 мМ. Затем разбавить раствор до 1 мм в раствор, содержащий, в мм: 150 NaCl, 2,5 KCl, 10 HEPES, рН 7,4. Кроме того, 100 мкМ Sulforhodamine 101 обычно включается для обозначения астроциты и визуализировать пипеткой во время инъекции. Мы фильтр решение перед инъекцией с 0,49 микрон центробежный фильтр (Stosiek и др., 2003;.. Garaschuk и др., 2006).
- Имплантат черепных окна на площадь для включения в образ. Мы описали общий подход в Юпитер , но следующие изменения важны для инъекций кальция красителя:
Сделать меньше краниотомии 2 мм в диаметре более корковые области интересов, с особой осторожностью, чтобы не повредить основной оболочки. Безопасные покровное на месте в течение трепанации черепа, но лишь частично покрывать трепанации черепа, оставляя небольшой зазор между краем трепанации черепа и стекло покровное, чтобы места для пипетки, чтобы войти в коре косо. До инъекции, сделать мелкий и с зубной цемент вокруг трепанации черепа. Также должно распространяться как ростральной по направлению и быть достаточно мелко, позволяющее вставить микропипетки для инъекций. - Передача мыши передаются столик микроскопа и иммобилизации головы, как показано в нашем видео по крови визуализации потока .
- Вытяните пипетки стеклянные микроэлектрода на диаметр кончика уступая 2-4 Мега Ом сопротивления, используя съемник пипетки. Нагрузка красителя кальция индикатор смесь на стеклянную пипетку использованием микрошприца. Использование микроманипулятора, осторожно опустите микропипетки на поверхность мозга с помощью 4X цель, которую затем мелко расположенный под 40X цели. Выберите подходящее место для инъекции, например, что Есть мало или совсем нет вышележащих кровеносные сосуды, чтобы скрыть изображения. С помощью двух-фотонной микроскопии, кончиком пипетки визуализируется и передовые медленно в коре на глубине до 200 мкм ниже оболочки. Потом, давление вводят краситель смеси при 10 PSI в течение 1 минуты использованием Picospritzer. Мы обычно доставить 3:58 инъекций красителя сочетание кальция А.М., разделенных в пространстве примерно на 200-300 микрон. Это массовый подход загрузка слегка перекрывая инъекции гарантирует, что площадь такого размера, как 600 х 600 микрон адекватно окрашенных в кальции изображений. Начните изображений через 1 час после введения красителя AM смеси, чтобы обеспечить красителя распространять и быть рассмотрен нейронов.
- Выполните в естественных условиях двухфотонного изображения с заказ двухфотонного микроскопа использованием Chameleon Ti-сапфирового лазера (настроен на 800-880 нм) и Кембриджа зеркала технологии гальванометра. Мы приобретаем изображения с помощью ScanImage Программное обеспечение, разработанное в лаборатории Карела Свободы (Pologruto и соавт., 2003). Мощность лазера, как правило, значительно ниже 70 мВт на образце. Всего изображения области приобрели либо с помощью 20X (0,95 NA) или 40Х (0,8 NA) Olympus целей, в 1.95-15.63 кадров в секунду (512 х 256 пикселей до 256 х 64 пикселей). Линия сканирования можно получить на 500 Гц. Во время обработки изображений, животные находятся под легкой анестезией изофлуран (0,6-0,9%), а также хранятся при температуре 37 ° С с использованием Температура Гарвардского Аппарат управления устройством. Осторожность, чтобы сохранить частоту дыхания животных как можно ближе к 100 вдохов / мин, как это возможно. Этот уровень анестезии используется самый низкий уровень, который обездвиживает животное, но все же позволяет спонтанной активности для записи.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Преимущество этого метода по сравнению с электрофизиологических записей является то, что она менее инвазивных и позволяет записях деятельности в плотных нейронов нейронной сети. При выполнении этой процедуры важно помнить, принять крайнюю осторожность при выполнении трепанации черепа, чтобы не повредить оболочку. Даже небольшое количество субдуральной кровотечения с очень неясными изображениями.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Благодарности
Мы хотели бы выразить признательность Ольга Garaschuk за полезные обсуждения по оптимизации массовой загрузки кальция показателей.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии | |
|---|---|---|---|---|
| Oregon Green BAPTA1-AM | Реагент | Invitrogen | O-6807 | |
| Fluo 4- AM | Реагент | Invitrogen | F-14201 | |
| Sulforhodamine 101 | Реагент | Invitrogen | S-359 | |
| Pluronic F-127 в DMSO | Реагент | Invitrogen | P-3000MP | |
| Центрифужный фильтр (0.45 micron) | Реагент | EMD Millipore | UFC3 0HV 0S |
Ссылки
- Garaschuk, O., Milos, R. I., Konnerth, A. Targeted bulk-loading of fluorescent indicators for two-photon brain imaging in vivo. Nat Protoc. 1, (2006).
- Stosiek, C., Garaschuk, O., Holthoff, K., Konnerth, A. In-vivo two-photon calcium imaging of neuronal networks. Proc Natl Acad Sci USA. 100, 7319-7324 (2003).
- Pologruto, T. A., Sabatini, B. L., Svoboda, K. ScanImage: flexible software for operating laser scanning microscopes. Biomed Eng Online 2:13. Biomed Eng Online. 2, (2003).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
