Этот протокол описывает усовершенствованную технику ортотопической трансплантации левого легкого у крыс, уделяя особое внимание снижению операционных трудностей и улучшению показателей выживаемости.
Методическая статья
* These authors contributed equally
Этот протокол описывает усовершенствованную технику ортотопической трансплантации левого легкого у крыс, уделяя особое внимание снижению операционных трудностей и улучшению показателей выживаемости.
Модель ортотопической трансплантации левого легкого крысы является важным инструментом в исследованиях трансплантации легких. Хотя трансплантация легких является сложной процедурой, ее сложность значительно снижается с введением манжетной техники. Большинство хирургов могут освоить эту технику после обучения, но ее применение было ограничено из-за длительной кривой обучения и низкой выживаемости модели. Для решения этих проблем мы предлагаем усовершенствованную технику с высокой повторяемостью, которая включает в себя забор донорского легкого, модификацию и имплантацию. По сравнению с предыдущими методами, наши усовершенствования в первую очередь сосредоточены на вскрытии забора донорского легкого, модификации донорского легкого и имплантации донорского легкого. Эта модификация упрощает процедуру, снижает сложность эксплуатации и повышает повторяемость. Кроме того, время холодной ишемии и теплой ишемии во время процедуры было сокращено, что еще больше повысило вероятность успеха трансплантации. Наши исследования обеспечивают более эффективную и воспроизводимую техническую основу для модели трансплантации легких крыс, поддерживая будущие исследования в области трансплантации легких.
Трансплантация легких в настоящее время является единственным эффективным методом лечения терминальной стадии заболеваний легких, которая стремительно развивается в последние годы. В настоящеевремя во всем мире проведено более 100 000 операций по трансплантации легких1, но 5-летняя и 10-летняя выживаемость после трансплантации легких составляет всего 54% и 32%соответственно2. По сравнению с другими трансплантациями солидных органов, выживаемость после трансплантации легких должна быть улучшена3. Ключевыми факторами, влияющими на выживаемость реципиентов, являются различные серьезные осложнения после трансплантации легких, включая первичную дисфункцию трансплантата, острое отторжение, хроническую дисфункцию аллотрансплантата легких и легочную инфекцию 4,5. Модель трансплантации легких крыс является ценным инструментом для изучения этих вопросов, но ее широкому внедрению препятствовали технические трудности. Несмотря на то, что об этой процедуре сообщили несколько лабораторий, она включает в себя крутую кривую обучения, высокую частоту послеоперационных осложнений и низкие показатели выживаемости, что ограничивает ее доступность для исследователей.
В этом исследовании мы представляем усовершенствованную технику ортотопической трансплантации легких, предназначенную для преодоления этих проблем. Наш метод основан на существующих протоколах, но включает ключевые усовершенствования, включая подготовку манжеты, диссекцию прикорневой структуры, фиксацию донорского легкого и оптимизированные методы анастомоза. Эти усовершенствования позволяют выполнять процедуру одним хирургом с минимальным оборудованием, снижают сложность анастомоза, сокращают время холодной и теплой ишемии и, в конечном итоге, повышают вероятность успеха модели. Этот подход направлен на поддержку более надежных и воспроизводимых фундаментальных исследований в области трансплантации легких.
Все эксперименты на животных были одобрены Комитетом по этике животных Guangzhou Lai'an Technology Co., Ltd. (Одобрение No G2024129). Эксперимент проводился на самцах крыс породы Льюис в возрасте 6-8 недель и массой 250-300 г. Крысы выращивались в 12-часовом цикле свет/темнота (свет: 25 люкс) и имели свободный доступ к пище и воде.
1. Подготовьте манжеты (Рисунок 1)
2. Забор донорского легкого (Рисунок 2)
3. Модификация донорского легкого (Рисунок 3)
4. Имплантация донорского легкого (Рисунок 4)
Мы зафиксировали время операции на каждом этапе процесса трансплантации легких у 30 крыс. Время подготовки манжеты, забора донорского легкого, холодовой ишемии и тепловой ишемии приведены в таблице 1. Используя наш усовершенствованный метод, после предварительного обучения, успешность операции по трансплантации достигла 100%. Эта технология может обеспечить поддержку для последующих исследований осложнений после трансплантации легких. Мы используем эту технологию уже более 2 лет. На следующих рисунках показан наш процесс от изготовления манжеты (Рисунок 1), извлечения донорского легкого (Рисунок 2C), модификации донорского легкого (Рисунок 3) до имплантации донорского легкого (Рисунок 4) и оценки результатов хирургического вмешательства (Рисунок 5). Через шесть месяцев после сингенной трансплантации мы провели компьютерную томографию (КТ) и патологическую оценку реципиентов. Мы обнаружили, что вентиляция трансплантированных легких была хорошей при компьютерной томографии, аналогичной таковой в группе фиктивной операции (только торакотомия без трансплантации легких); не было существенной разницы в макроскопическом виде легких ex vivo между группой фиктивной операции и аутологичным правым легким, а также не было обнаружено явных патологических изменений в результатах окрашивания гематоксилин-эозином (ПЭ). Таким образом, наша ортотопическая трансплантация левого легкого крысы прошла успешно, и зрелость этой технологии заложила основу для построения других моделей заболеваний после трансплантации легких.

Рисунок 1: Подготовка манжеты. (А) Различные размеры канюль для внутривенных вливаний и лезвий для разрезания манжет. (B) Увеличение 5x. Разрезание манжеты под микроскопом. Масштабная линейка = 1 мм. (C) Манжеты для PA (16 G), PV (16 G) и Br (14 G). Сокращения: IV = внутривенно; PA = легочная артерия; PV = легочная вена; Br = бронхи. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 2: Забор донорского легкого. (A) Эндотрахеальная интубация донора. (Б) Перфузия донорского легкого. (В) Положите чистое перфузиированное донорское легкое на лед. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 3: Модификация донорского легкого. (А) Освободите ПА. (B) Освободить и лигатировать Br. (C) Освободить PV (D-F) Закрепить PA, Br и PV на манжете последовательно. Все микроскопические изображения были получены с увеличением 5x. Масштабная линейка = 1 мм. Сокращения: PA = легочная артерия; PV = легочная вена; Br = бронхи. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 4: Имплантация донорского легкого. (A) Реципиент был зафиксирован на термостатическом операционном столе; стенка грудной клетки была вскрыта; а левое легкое было втянуто и зафиксировано на разрезе. (B) Освободите и заблокируйте прикорневые структуры. (В) Предвязанный хирургический узел. (D) Сделайте небольшой разрез на дистальном конце PA, Br и PV. (E) Промойте гепаринизированным физиологическим раствором. (Ф,Г) Последовательный анастомоз ПА, Br и ЛВ. (H) Откройте кровоостанавливающий зажим, чтобы обеспечить вентиляцию и циркуляцию крови. (I) Резекция левого легкого реципиента. (J) Вернуть донорское легкое в грудную полость. (K) Закрытие сундука. (L) Ожидание пробуждения получателя. Все микроскопические изображения были получены с увеличением 5x. Масштабная линейка = 1 мм. Сокращения: PA = легочная артерия; PV = легочная вена; Br = бронхи. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 5: Оценка после трансплантации. В симуляционной операционной группе выполнялась только торакотомия без трансплантации. Компьютерная томография и патологическая оценка образцов были проведены через 6 месяцев. Группа трансплантатов получила сингенную трансплантацию и прошла компьютерную томографию и патологоанатомическую оценку через 6 месяцев. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.
| процедура | Время работы (мин) |
| Подготовка манжеты | 3,2±0,38 |
| Забор донорского легкого | 9,85±0,60 |
| Ишемия холода | 29.96±2.77 |
| Теплая ишемия | 12.62±2.35 |
Таблица 1: Время работы каждой процедуры. Подготовка манжеты: общее время, затраченное на изготовление трех манжет (включая манжеты для PA, PV и Br), Забор донорского легкого: время, затраченное на извлечение донорского легкого у донора. Холодовая ишемия: продолжительность, в течение которой донорское легкое удерживается на льду. Теплая ишемия: время, затраченное на удаление донорского легкого изо льда до реперфузии. Сокращения: PA = легочная артерия; PV = легочная вена; Br = бронхи.
Модель трансплантации легких крыс является широко используемой моделью в области фундаментальных исследований по трансплантации легких. Он может хорошо моделировать патофизиологический процесс трансплантации легких человека. Крысы также имеют преимущества быстрого размножения и низкой стоимости. Mizuta et al.6 впервые применили технологию манжет в 1989 году, чтобы значительно снизить сложность этой модели. Однако из-за сложности операции многие исследователи до сих пор колеблются.
В процессе подготовки манжеты большинство исследователей изготавливали манжеты с подобной формой. Wu et al.7 сделали углубление в середине манжеты, чтобы предотвратить соскальзывание узла во время процесса анастомоза, но для выполнения анастомоза им требовалось два человека, что, несомненно, увеличило бы затраты на рабочую силу и материалы. Некоторые исследователи также модифицировали хвост манжеты, чтобы сделать его более гладким, но они не удаляли хвост манжеты перед имплантацией манжеты реципиенту, что облегчало скручивание или складку кровеносных сосудов и дыхательных путей у реципиента.
Что касается выбора размера манжеты, предыдущие исследования показали, что манжета 18 г должна использоваться для PA, когда вес получателя меньше 270 г, и манжета 16 G, когда вес получателя превышает 270г9. Некоторые исследователи также единообразно используют манжету18 G 7,10. Что касается модификации донорского легкого, Tian et al.8 поместили донорское легкое в самостоятельно разработанную культуральную чашку для фиксации легочных кровеносных сосудов и Br таким образом, чтобы облегчить их фиксацию на манжете. Однако этот метод требует специального сосудистого зажима и не имеет преимущества в сокращении времени холодной ишемии донорского легкого. В последних исследованиях в процессе реципиентного анастомоза сообщалось о методе маятникового анастомоза8. Однако этот метод предъявляет строгие требования к приборам и оборудованию. Новички часто испытывают трудности с получением ключевого оборудования и сталкиваются с риском длительного времени анастомоза и даже разрыва сосудов из-за высокого напряжения во время процесса анастомоза.
Некоторые исследователи впервые выполняют ПВ анастомоз в процессе анастомоза. Они считают, что ПВ анастомоз – самый сложный этап. Сначала анастомозирование ПВ может гарантировать, что донорское легкое будет иметь достаточно места для движения. Однако, поскольку ПВ жестче, чем Br и PA, это приводит к риску отпадения манжеты PV или даже разрыва вены при анастомозировании Br и PA10. Некоторые исследователи пытались уменьшить напряжение во время анастомоза, используя правое полулежачее положение 8,11 или положение лежа на спине. Однако метод подкладки правой грудной клетки изменит угол наклона эндотрахеальной трубки и повысит давление в дыхательных путях7. Вышеупомянутые исследователи внесли инновации в производство манжет, модификацию донорских легких и имплантацию донорских легких. Хотя эта модель была усовершенствована многими исследователями, она не получила широкого распространения и применения.
В нашем исследовании мы улучшили производство манжет, модификацию донорских легких и имплантацию донорских легких в надежде, что исследователи смогут быстрее освоить эту модель. В качестве манжеты PA мы выбрали венозную игольчатую канюлю 16 G, потому что манжета 16 G может быть легко анастомизирована к артериям с лучшей прочностью, а в манжете достаточно места для обеспечения хорошего кровотока. Поскольку манжета 18 G значительно меньше внутреннего диаметра ПА реципиента, это не способствует плавному кровотоку, а в процессе анастомоза манжета слишком мала и не хватает достаточного трения между стенками ПА реципиента, что увеличивает сложность анастомоза и легко вызывает соскальзывание манжеты.
Что касается подбора размера манжет Br и PV, то большинство исследователей придерживаются относительно последовательного мнения. Стоит отметить, что для минимизации возникновения обструкции Br-анастомоза, выбранная Br-манжета должна быть как можно большего размера. При обработке манжеты Hiroaki et al.6 сделали несколько насечек на поверхности манжеты для увеличения трения, а некоторые исследователи использовали манжеты без хвостиков12,13. В нашем исследовании для облегчения фиксации с помощью гемостатических щипцов использовалась манжета с хвостом. После того, как PA, Br и PV были исправлены, хвост был удален. Этот метод позволяет сэкономить время при фиксации PA, Br и PV на манжете и предотвратить повреждение кровеносных сосудов и донорских легких из-за движения хвоста манжеты у реципиента после анастомоза.
Во время модификации донорского легкого сложная анатомическая структура увеличивает время холодной ишемии донорского легкого. В этом исследовании поверхность и дно донорского легкого были покрыты предварительно обрезанной стерильной хрусталиковой бумагой, а донорское легкое было помещено на стерильную чашку для культивирования, а затем помещено на лед для модификации. Стерильная хрусталиковая бумага, покрывающая поверхность донорского легкого, была слегка пропитана предварительно охлажденным физиологическим раствором. Это не только обеспечивает увлажнение донорского легкого и предотвращает повреждение донорского легкого щипцами, но и обеспечивает достаточное трение для корректировки положения левого и правого легких при разделении прикорневой структуры, чтобы полностью обнажить прикорневую анатомическую структуру и быстро отделить PA, Br и PV от дорсальной стороны донорского легкого. В предыдущих исследованиях марлю клали на поверхность донорского легкого 7,10,14. Из-за большого разрыва в середине марли донорское легкое легко повреждалось щипцами в процессе разделения, что в конечном итоге приводило к пневмотораксу. Наш метод позволяет быстро освободить PA, Br, PV и другие структуры и сократить время холодной ишемии донорского легкого.
На этапе имплантации донорского легкого фиксация левого легкого реципиента в передней области грудной клетки более тесно связана с анатомической структурой реципиента. Мы значительно снизили напряжение анастомоза между донорским легким и кровеносными сосудами и бронхами реципиента, тем самым снизив хирургическую сложность и риск послеоперационных осложнений. Кроме того, заднее грудное пространство относительно больше, что облегчает манипуляции с хирургическими инструментами и имплантацию донорского легкого. Напротив, в большинстве предыдущих исследований левое легкое реципиента фиксировалось на тыльной стороне 7,8,12. Такой подход создает большее напряжение во время процесса анастомоза, увеличивая хирургическую сложность и риск послеоперационных осложнений. Кроме того, ограниченное операционное пространство в передней грудной полости может ограничивать гибкость хирургических инструментов.
Наконец, этот подход требует обширной ретракции легкого реципиента, что может увеличить риск механической травмы. Кроме того, мы сохранили левое легкое реципиента до проведения анастомоза и обрезали на нем платформу. Это способствовало более качественной постановке донорского легкого и корректировке его положения во время проведения анастомоза. В предыдущих исследованиях культя легкого реципиента была полностью удалена до проведения анастомоза, а PA, PV и Br были зажаты инструментами для фиксации15, что могло легко вызвать разрыв сосудов. Перед проведением анастомоза следует использовать гепаринизированный солевой раствор для орошения сосудов для удаления тромбов и предотвращения тромбоэмболических осложнений. Об этом сообщалось во многих предыдущих исследованиях 7,10,16. Однако многие исследователи не обращают внимания на то, что в процессе анастомоза могут легко заноситься пузырьки воздуха, приводящие к воздушной эмболии. В нашей процедуре мы используем тонкую ватную палочку для удаления более крупных пузырьков воздуха из кровеносных сосудов реципиента и донорской манжеты, эффективно предотвращая воздушную эмболию. Более мелкие пузырьки могут впитываться и не вызывают существенных проблем.
При процедуре анастомоза сначала воздействует на легочную артерию (PA), затем на бронх (Br), завершаясь легочной веной. Этот последовательный подход является стратегически целесообразным благодаря превосходной эластичности ПА, которая сводит к минимуму риск повреждения сосудов или смещения манжеты, вызванного чрезмерным напряжением во время последующего венозного анастомоза. Первичный анастомоз ЛВ или БР может предрасполагать к разрыву сосудов или бронхов, а также к миграции манжеты из-за осложнений, связанных с напряжением. Благодаря систематическим протоколам обучения и повторяющейся практике, эта оптимизированная последовательность продемонстрировала значительные преимущества в снижении технической сложности и повышении показателей успеха операции. Примечательно, что наш подход достиг 100% успеха анастомоза, превзойдя результаты, зарегистрированные в сопоставимых исследованиях. Во время процедуры имплантации оператору достаточно одной рукой втянуть край разреза, ввести донорскую манжету в просвет реципиента и зафиксировать ее узлом одной рукой. Этот метод, который позволяет фиксировать и завязывать узлы одной рукой, значительно снижает потребность в персонале и повышает эффективность хирургического вмешательства. Таким образом, проведенное нами исследование усовершенствовало метод ортотопической трансплантации левого легкого крысы, сократило время и сложность хирургической операции, а также улучшило повторяемость данной модели.
Работа выполнена при поддержке Национального фонда естественных наук Китая (грант No 82470103), Специального исследовательского гранта Медицинского фонда Ву Цзепина (No 320.6750.2025-01-1), Китайской ассоциации медицинского образования (грант No. ZJWYH-2023-YIZHI-003), научно-исследовательский проект по клинической эпидемиологии Государственной ключевой лаборатории респираторных болезней (грант No. SKLRD-L-202504), Технологический проект по клиническим характеристикам в Гуанчжоу (грант No 2023C-TS10) и Крупный проект клинических исследований в рамках Программы повышения исследовательского потенциала Гуанчжоуского медицинского университета (грант No. GMUCR2024-01007).
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 0,9% физиологического раствора | Хоупбио | HBPP008-100 | |
| 10 см стерильная чашка Петри | Бэкмен | Пластиковая чашка Петри 10 см | |
| Направляющий провод для интубации трахеи 16 г | Вега | - | |
| Тонкие щипцы Dumont #7-изогнутые/11,5 см | Ф.С.Т | 11271-30 | |
| Ножницы для глаз 10 см прямые острые | Цзинчжун | У00030 | |
| Гемостатические (изогнутые полнозубные) щипцы | Цзинчжун | Дж31180 | |
| Раствор гепарина натрия | Лиген | Р10119 | |
| Игла Introcan 14 G игла для бабочки | Б.Браун | 4254210Б | |
| Игла Introcan 16 G игла-бабочка | Б.Браун | 4254171Б | |
| Светодиодная двухволоконная лампа с источником холодного света | Задний привод | 76312 | |
| Бумага для чистки объектива | Кимберли | 34155 | |
| Льюис Крыс | Guangzhou Dean Gene Technology Co., LTD. (Гуанчжоу, Китай) | ||
| Медицинские ватные палочки | Победитель/Вэньцзянь | 10 см х 50 штук | |
| Иглодержатель медицинский | Чэнхэ | - | |
| Шприц медицинский стерильный | Победитель/Вэньцзянь | 20мл | |
| Ножницы хирургические медицинские 12,5 см прямые острые | Пулун | ПЛ1251 | |
| Медицинская лента | Вэньсянь | 1527 | |
| Щипцы медицинские тканевые | Задний привод | Дж30607 | |
| Медицинский титановый ретрактор для век | Юдиканг | - | |
| Микроизогнутые щипцы | Цзинчжун | JzCrWA3050 0,3/140 мм | |
| Микрососудистые кровоостанавливающие щипцы 12,5 см изогнутые | Цзиньчжун | Ш40350 | |
| Микрососудистые кровоостанавливающие щипцы 12,5 см прямые | Цзиньчжун | Ш40340 | |
| Микрокомпьютерная томография | Пиньшень | Однопланетная телеграф SNC-100 | |
| Миниатюрные сосудистые зажимы | Ф.С.Т | 18055-06 | |
| Многоканальный аппарат для анестезии мелких животных | Задний привод | Р550 | |
| Нейрохирургический набор для свертывания, набор для свертывания крови | Ф.С.Т | 18010-00 | |
| Пентобарбитал натрия | Сигма | П3761 | |
| Остроконечные ватные палочки | Другой | 1000 штук | |
| Платформа для интубации крыс/мышей | Пуксин | - | |
| Система водяной бани для крыс/мышей (интраоперационная) 10-65 °°; Контроль температуры C, 310 x 290 ММ, 220 В | Хуаяян | 36-0041 | |
| Шанхайские медицинские микроскопические щипцы Golden Bell Микроскопические тонкие щипцы прямой изгиб микроручные хирургические инструменты Микроскопические инструменты | Цзинчжун | ВА1020 | |
| Шанхай Пудун Цзиньхуань Медицинские рассасывающиеся хирургические нити Стерильные шовные материалы с игольчатой имплантацией лифтинг (4-0) | Шанхай Пудун Цзиньхуань | 473445 | |
| Аппараты ИВЛ для мелких животных | Кент Сайентифик | РоВент-младший | |
| Система изоляции водяной бани для мелких животных | ХУАЙОН | ТГ-ТП-БЛ | |
| Пружинные ножницы (большие) | Цзин Чжун | JzCrWA1020 | |
| Медицинские щипцы от комаров из нержавеющей стали | Джиате | ЛЗ1021 | |
| Стальная плоская ручка изогнутая без зубьев 0,3 зуба | Чжэньбан (медицина) | Зубчатый с крючком/платформой для связывания | |
| Стальная плоская ручка прямая без зубьев 0,3 зуба | Чжэньбан (медицина) | Зубчатый с крючком/платформой для связывания | |
| Стерильные ватные шарики | Бошенгтянай | Небольшие размеры | |
| Стерильная марля | Хизерн | 6 см x 8 см | |
| Наложение швов с иглой | Линцяо | 8-0 | |
| Наложение швов с иглой | Линцяо | 6-0 | |
| Пинцет Dumont #5 Щипцы, прямой | Ф.С.Т | 11254-20 | |
| Ультралегкая глина | Боки | КВНТ-24 | |
| Держатель сосудистого зажима | Задний привод | Р34001-14 |