Методическая статья

Мультиплексная иммунофлуоресцентная визуализация на основе штрих-кодов ДНК для анализа образцов FFPE из генетически перепрограммированной меланомы мышей

DOI:

10.3791/68124

⸱

6 июня 2025 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Johns Hopkins University, 2Translational Tissue Engineering Center, Johns Hopkins University, 3Johns Hopkins Translational ImmunoEngineering Center, Johns Hopkins University, 4Department of Dermatology, Johns Hopkins University, 5Department of Oncology, Johns Hopkins University, 6Department of Pathology, Johns Hopkins University, 7Convergence Institute, Sidney Kimmel Comprehensive Cancer Center Johns Hopkins University School of Medicine, 8Bloomberg Kimmel Institute for Cancer Immunotherapy, Sidney Kimmel Comprehensive Cancer Center, Johns Hopkins University School of Medicine, 9Sidney Kimmel Comprehensive Cancer Center, Johns Hopkins University School of Medicine, 10Institute for Nanobiotechnology, Johns Hopkins University, 11Departments of Neurosurgery and Ophthalmology, Johns Hopkins University School of Medicine, 12Departments of Materials Science & Engineering and Chemical & Biomolecular Engineering, Johns Hopkins University

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол представляет собой пошаговое руководство по разработке мультиплексной иммунофлуоресцентной панели антител для визуализации тканей мышиной меланомы FFPE на основе штрих-кода. Мы также описываем конвейер анализа изображений с использованием инструментов с открытым исходным кодом для получения пространственной протеомики иммунного микроокружения опухоли мышиной меланомы.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь представлен новый метод мультиплексной визуализации на основе штрих-кодов ДНК, основанный на Co-Detection-by-indEXing, который анализирует пространственную протеомику микроокружения тканей. Для успешной визуализации требуется репертуар хорошо спроектированных и должным образом проверенных панелей антител, но в настоящее время существует очень мало образцов с фиксированным формалином парафином (FFPE). FFPE имеет ряд преимуществ по сравнению со свежезамороженными образцами, таких как широкая доступность, простота в обращении и хранении, а также возможность изготовления тканевых микрочипов (TMA). В данной работе мы представляем протокол разработки панели антител для визуализации и анализа тканей FFPE из модели меланомы мыши, обработанной наночастицами, которые доставляют плазмидную ДНК, кодирующую иммунологические сигналы для перепрограммирования микроокружения опухоли. Мы также описываем конвейер анализа изображений с использованием вычислительных инструментов с открытым исходным кодом для аннотирования тканей, сегментации клеток, обработки данных протеомики, фенотипирования популяций клеток и количественной оценки пространственных метрик. Протокол предлагает приложения для проектирования панелей антител в мышиной FFPE и получения новых идей в области пространственной протеомики сложных тканевых микроокружений.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Меланома кожи является наиболее распространенным раком кожи, с различными показателями заболеваемости и смертности по всему миру в зависимости от времени постановки диагноза и оказания первичной медицинской помощи1. За последнее десятилетие более глубокое биологическое понимание меланомы помогло ускорить разработку новых моделей рака для лечениясолидных опухолей. Недавнее развитие иммунотерапии привело к появлению революционной концепции лечения рака, основанной на активации эндогенной иммунной системы 3,4.

Опухолевое микроокружение (ТМЭ) является очень сложным и состоит из различных иммунных клеток, ассоциированных с раком фибробластов, перицитов, эндотелиальных клеток и различных тканевых резидентных клеток5. В прошлом для изучения ТМЭ применялось несколько методов, таких как проточная цитометрия и секвенирование одиночных клеток, которые ставят под угрозу пространственный контекст, поскольку они необходимы для разрушения опухолевой ткани. Традиционная микроскопическая визуализация, такая как иммунофлуоресценция (ИФ) и иммуногистохимия (ИГХ), позволяет визуализировать белковые биомаркеры без разрушения тканей образца. Однако эти подходы ограничены двумя или тремя биомаркерами и не могут обеспечить полное понимание пространственных и структурных отношений в рамках сложной TME 6.

Для решения этой проблемы было разработано несколько методов мультиплексной визуализации для пространственной визуализации комплекса TME 7,8,9,10. Одной из них является CoDetection-by-inDEXing, переименованная в систему PhenoCycler, основанная на ДНК-олигонуклеотид-конъюгированных антителах11. Система может обеспечить визуализацию отдельных клеток и анализ более 100 биомаркеров для образцов человека. Тем не менее, имеется очень мало инвентаризированных антител для визуализации и анализа образцов мышей, в частности, образцов с фиксированным формалином парафином (FFPE)12. FFPE имеет ряд преимуществ по сравнению с консервацией свежезамороженных (FF), таких как простота обращения и хранения, хорошо сохраняющаяся морфология с течением времени и, что наиболее важно, возможность подготовки микрочипов тканей/опухолей (TMA), которые позволяют визуализировать несколько образцов на одном предметном стекле. Недавно мы спроектировали и разработали мышиную панель антител FFPE CODEX/PhenoCycler и успешно применили ее для визуализации и анализа пространственной протеомики генетически перепрограммированных образцов мышиной меланомы13.

Общая цель этого протокола — предоставить пошаговое руководство по проектированию панели антител FFPE у мышей и описать процесс конъюгации антитела со штрих-кодом, окрашивания тканей и визуализации. Кроме того, мы представляем подробный конвейер анализа изображений с использованием инструментов с открытым исходным кодом, таких как пакеты QuPath и R. Следуя этому протоколу, исследователи узнают, как разработать индивидуально конъюгированную панель антител, выполнить мультиплексную визуализацию с помощью устройства Phenocycler-Fusion и получить новое представление о пространственной протеомике меланомы TME. Кроме того, этот протокол может быть адаптирован для изучения различных иммунных микроокружений опухоли и сочетаться с существующими методами пространственной транскриптомики.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все работы с животными выполнялись в соответствии с руководящими принципами, установленными Комитетом по уходу за животными и их использованию при Университете Джонса Хопкинса, с использованием утвержденных протокольных номеров MO18M388 и MO21M384.

1. Подбор антител

  1. Разработайте панель антител на основе представляющей интерес ткани и обилия конкретного биомаркера. Выбирайте клоны антител на основе успешных предыдущих применений иммунофлуоресцентного (ИФ) и иммуногистохимического (ИГХ) окрашивания в литературе. Безопасные версии этих антител без носителей.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Очищенные антитела, не являющиеся носителями, важны для конъюгации штрих-кода. Избегайте любых консервантов на основе белка, таких как BSA, глютен, глицерин и т. д. Если антитела, не содержащие носителей, недоступны, запросите у поставщика индивидуальное антитело или используйте набор для удаления BSA, чтобы получить антитело без носителя. Азид натрия не препятствует конъюгации антител. Изотипы IgG рекомендуются по сравнению с изотипами IgM.
  2. Верифицируйте эти выбранные клоны на представляющей интерес ткани с помощью обычной иммунофлюоресцентной (ПЧ) визуализации11. Используйте двойную ПЧ-визуализацию для подтверждения специфичности определенных клонов (например, выполните двойную ПЧ-визуализацию с FOXP3 и CD4 для подтверждения окрашивания регуляторных Т-клеток).
    ПРИМЕЧАНИЕ: По возможности важно использовать для валидации IF ту же ткань, которая будет использоваться для окрашивания. Выберите подходящее решение для забора антигена. В этом протоколе мы использовали буфер AR9, предоставленный компанией Akoya Biosciences, для извлечения всех эпитопов тканей FFPE меланомы мыши. Другие решения для извлечения антигенов, такие как AR6 или Universal, могут быть использованы в зависимости от требований к эпитопам.

2. Конъюгация и подтверждение антител

  1. Назначьте проверенные антитела штрих-кодам, которые имеют дополнительные репортеры, прикрепленные к флуорофорам ATTO550 (Cy3), AF647 (Cy5) или AF750 (Cy7). Малораспространенные антигены обычно производят более низкие сигналы; конъюгируют такие антитела с каналами с низкой аутофлуоресценцией, такими как AF647 (Cy5). Конъюгировать высокоэкспрессированные антигены к ATTO550 (Cy3) и AF750 (Cy7) благодаря возможности аутофлуоресценции.
    ПРИМЕЧАНИЕ: На этом важном этапе учитывается чувствительность канала и распространенность антигена. Использование канала AF488 для FFPE ткани не рекомендуется из-за его более высокой автофлуоресценции.
  2. Для конъюгации антитела со штрих-кодом (4,5 ч) приобретите набор для конъюгации антител. Хранить все реагенты при температуре 4 °C, за исключением восстановительного раствора 1, который необходимо хранить при температуре -20 °C в виде небольших одноразовых флаконов.
    1. Измерьте концентрацию антител с помощью спектрофотометра.
    2. Начинайте конъюгацию антител путем нанесения 500 мкл раствора, блокирующего фильтр, на фильтрующую колонку MWCO с температурой 50 кДа для блокирования неспецифического связывания антител с фильтром. Вращайте при 12 000 x g в течение 2 минут при комнатной температуре (RT). Удалите лишнюю жидкость из колонки с помощью микропипетки объемом 200 мкл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Восстановительный раствор 1 представляет собой одноразовый флакон с раствором, которого достаточно для трех конъюгаций антител одновременно. Не используйте раствор повторно после размораживания; Выбросьте оставшийся реагент. Не используйте фильтр над фильтрующей колонной MWCO 50 кДа, так как это может привести к плохой очистке и конъюгации.
    3. Используйте эквивалентный объем 50 мкг раствора антитела и добавьте его в фильтр MWCO с массой 50 кДа. При необходимости отрегулируйте общий объем до 100 мкл с помощью PBS. Вращайте при 12 000 x g в течение 8 минут при 4 °C. В течение этого времени готовят восстановительную мастер-смесь с использованием 19,8 мкл восстановительного раствора 1 + 825 мкл восстановительного раствора 2 для трех конъюгаций антител.
    4. Отбросьте проточный слой и добавьте 260 μL восстановительной мастер-смеси в верхнюю часть каждого фильтрующего блока. Вихревой раствор поместить в фильтрующую установку в течение 2-3 секунд и инкубировать в течение 30 мин при RT.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Крайне важно не превышать 30 минут инкубации, чтобы избежать чрезмерного снижения антител, так как это повреждает их и может привести к неудачной конъюгации.
    5. После 30 минут инкубации снизьте температуру до 12 000 x g в течение 8 минут при 4 °C и выбросьте поток на дно. Добавьте 450 μL конъюгационного раствора в верхнюю часть колонки и вращайте при 12 000 x g в течение 8 минут при 4 °C. Во время центрифугирования приготовьте раствор штрих-кода CODEX. Действуйте быстро после извлечения штрих-кода от -20 °C, так как штрих-код начинает разрушаться.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Штрих-коды обычно поставляются в небольших стеклянных флаконах, содержащих лиофилизированные продукты (хлопья или порошок), хранящихся при температуре -20 °C. Эти флаконы можно использовать для конъюгации 50 мкг антител за один раз. Рекомендуется не конъюгировать более трех антител за один раз.
    6. Внимательно расположите лиофилизированный штрих-код на дне стеклянного флакона (он также может быть приклеен к стенкам). Постучите по стеклянному флакону на столе, чтобы твердые частицы опустились на дно. Локализация лиофилизированного продукта имеет важное значение при его растворении в 10 мкл воды молекулярного биологического качества, не содержащей нуклеаз. После добавления 10 μL воды, не содержащей нуклеаз, добавьте 210 μL конъюгационного раствора в каждый штрих-код. Растворите весь лиофилизированный материал и аккуратно перемешайте, пипетируя вверх и вниз. Откладывать.
    7. После завершения отжима на шаге 2.2.5 откажитесь от проточной части и добавьте соответствующий раствор штрих-кода из шага 2.2.6 в верхнюю часть каждого фильтрующего блока. Сохранить 1 мкг исходного неконъюгированного антитела; он будет запущен вместе с конъюгированным образцом антитела объемом 5 мкл во время валидации гель-электрофореза.
    8. Пометьте каждую пробирку соответствующим названием антитела и штрих-кодом. Закройте крышкой и перемешайте раствор путем вортекса в течение 2-3 с. Инкубируйте реакцию конъюгации антитело-штрих-код в течение 2 ч в ЛТ.
    9. После 2 ч инкубации удалить 5 мкл конъюгированного антитела и хранить в ПЦР-пробирке объемом 0,2 мл для подтверждения конъюгации с помощью гель-электрофореза.
    10. Уменьшите оставшийся конъюгированный раствор антитела при 12 000 x g в течение 8 мин при 4°C. Добавьте 450 μL очистного раствора в верхнюю часть колонны, вращайте при 12 000 x g в течение 8 минут при 4 °C и сбросьте поток. Повторите этот этап очистки 2 раза, каждый раз добавляя 450 мкл раствора для очистки и уменьшая его.
    11. После3-го центрифугирования откажитесь от сквозного потока. Верхний фильтр будет содержать антитела, конъюгированные со штрих-кодом.
    12. Чтобы собрать конъюгированное антитело, пометьте новую внешнюю трубку, в которой находится фильтровальная колонка, соответствующим антителом и штрих-кодом. Перед центрифугированием снимите крышку с внешней пробирки. Добавьте 100 мкл раствора для хранения антител в каждый фильтрующий блок и поместите только что помеченную внешнюю пробирку вверх ногами на фильтрующую колонку.
    13. Переверните фильтрующую колонку, чтобы собрать конъюгированное антитело в наружную трубку, и вращайте при 3000 x g в течение 2 минут при RT. Для этого должно собраться около 120 мкл конъюгированного раствора антитела. Переложите в стерильную микроцентрифужную пробирку и храните при температуре 4 °C в течение 18-24 месяцев.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Во избежание высокого фонового окрашивания ядер после конъюгации рекомендуется не использовать эти антитела в течение как минимум 2 дней.
  3. Выполните подтверждение конъюгации методом гель-электрофореза, как описано в уже опубликованном протоколе13.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот процесс только подтверждает успешность реакции химической конъюгации, используемой для конъюгации штрих-кодов с антителами. Это необязательно, так как валидация антител возможна только после успешного окрашивания и визуализации ткани.

3. Подготовка образцов Murine FFPE

  1. Получение образцов тканей FFPE от самок мышей C57BL/6J, которым имплантировали опухоли боковой стороны B16F10. Лечите мышей внутриопухолевыми инъекциями наночастиц на основе поли(β-аминоэфира), содержащих 4-1BBL и плазмиды IL-12, а также внутрибрюшинной доставкой анти-PD1 через 9, 11, 16 и 18 дней послеимплантации. Принесите мышей в жертву на 20-й день и исправьте опухоли в 10% формалине, встроенном в парафин, а затем разрежьте их в центре онкологической тканевой службы Джона Хопкинса.
  2. Внимательно изучите характеристики области визуализации, приведенные в руководстве пользователя, и установите образцы размером 5 мкм на предметное стекло внутри области визуализации. Мы смогли смонтировать четыре разных образца опухоли на одном предметном стекле.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Важно использовать рекомендованные слайды, доступные для визуализации, такие как Leica Apex Adhesive Slides или Fisherbrand Superfrost Plus Slides. Это поможет проточной ячейке прочно прилегать к предметному стеклу.

4. Окрашивание тканей методом FFPE и визуализация

  1. Проверка и оптимизация концентрации антител и времени воздействия: Чтобы проверить успешность конъюгации антитела со штрих-кодом, окрашивайте интересующую ткань 6-9 конъюгированными антителами. Запустите устройство мультиплексной визуализации и запишите концентрацию каждого антитела и время воздействия. При необходимости отрегулируйте разведения и время воздействия, затем запустите 6-9 новых антител с ранее проверенными и обратите внимание на любые корректировки. Выполните следующие действия для окрашивания и визуализации.
  2. Окрашивание тканей и визуализация
    1. За день до окрашивания запекайте салфетки FFPE в духовке при температуре 60 °C на ночь. На следующий день охладите предметные стекла в течение 10 минут в режиме RT, прежде чем начать этапы депарафинизации и регидратации тканей.
    2. Начать депарафинизацию тканей путем инкубации в растворе ксилола 2 раза по 5 мин каждый.
    3. Чтобы увлажнить ткань, пропустите ее через два круга 100% раствора этанола в течение 5 минут каждый. Далее проведите его через ряд спиртовых растворов от 90% до 70%, 50% и 30% на 5 мин каждый. Наконец, промойте салфетку дистиллированной водой дважды по 5 минут каждый.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Менее токсичные альтернативы ксилолу, такие как раствор Neoclear, могут быть использованы для депарафинизации. Проведите депарафинизацию и регидратацию под вытяжным шкафом.
    4. Разбавьте 10x буфер AR9 до 1x с помощью дистиллированной воды. Наполните банку Coplin 50 мл 1x AR9 буфера, убедившись, что предметные стекла полностью погружены в буфер для извлечения антигена.
    5. Наполните скороварку водой так, чтобы уровень был на полпути вверх по банке Coplin, затем инкубируйте под высоким давлением в течение 20 минут.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Можно использовать специализированную скороварку или камеру для снятия маскировки для лучшего извлечения антигена, установив ее на 120 °C на 10 минут.
    6. После завершения этапа скороварки охладите горки в течение 45-60 минут. Промойте предметное стекло дистиллированной водой 2 раза по 2 минуты. Затем переложите предметное стекло в банку, содержащую 1x PBS.
    7. Чтобы свести к минимуму аутофлуоресценцию, выполните этап отбеливания ткани перед окрашиванием антителами. Свежеприготовленный отбеливающий раствор (25 мл 1x PBS + 0,8 мл 1М NaOH + 4,5 мл H2O2) с использованием рекомендованных реагентов и концентраций. Инкубируйте предметные стекла в пластиковом контейнере с отбеливающим раствором между двумя светодиодными лампами в течение 45 минут при комнатной температуре. Повторите со свежим отбеливающим раствором еще 45 минут.
    8. Начинайте готовить раствор коктейля антител на этом этапе отбеливания, особенно если в панели есть несколько антител с различными разведениями. Достаньте все четыре блокиратора (G, S, J и N) и положите их на лед, так как некоторым требуется время, чтобы оттаять при температуре -20 °C.
    9. После фотоотбеливания промойте салфетку 1x PBS, 2x по 2 мин каждая. Переместите салфетку в банки с буфером для гидратации и промойте 2 раза по 2 минуты каждая.
    10. Перенесите салфетки в буфер для окрашивания и дайте им сбалансироваться в течение 30 минут. Если препарат не был приготовлен на этапе отбеливания, приготовьте раствор коктейля антител в течение этого времени.
    11. Приготовьте 300 мкл раствора коктейля антител для окрашивания двух предметных стекол (обычно, при использовании гибридизационной пластиковой камеры, достаточно 100-120 мкл коктейля антител для окрашивания каждого предметного стекла).
    12. Окрасьте предметные стекла, нанеся раствор коктейля антител внутри камеры влажности на ночь при температуре 4 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Все антитела здесь показывают положительный сигнал при окрашивании в течение ночи при температуре 4 °C. Тем не менее, время окрашивания и температура каждого антитела могут варьироваться и должны быть оптимизированы. Наиболее часто используемые условия окрашивания — 3 часа при RT или в течение ночи при 4 °C. При необходимости также можно сначала окрашивать несколько антител при различных температурах, а затем оставшиеся антитела в течение ночи при 4 °C. После этого промойте салфетку PBS, если требуется последовательное окрашивание.
    13. На следующий день проведите фиксацию после окрашивания. Снимите пластиковую камеру и храните собранный коктейль антител при температуре 4 °C. Промойте предметные стекла 2 раза в буфере для окрашивания по 2 минуты каждая. Затем переместите предметные стекла в 40 мл фиксирующего раствора после окрашивания (4 мл 16% параформальдегида + 36 мл буфера для хранения) и инкубируйте в течение 10 минут. Смойте PBS 3x по 2 минуты каждый.
    14. Переместите предметные стекла в ледяной метанол на 5 минут, затем промойте PBS 3 раза по 2 минуты каждое. Нанесите окончательный фиксирующий раствор (20 мкл одной пробирки + 1 мл PBS) на предметные стекла под камерой влажности. Обычно на предметное стекло достаточно 200 мкл фиксирующего раствора. Оставьте фиксатор на 20 минут на RT. Выполните три заключительных промывки в PBS по 2 минуты каждое.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не снимайте фиксирующую трубку с температуры -20 °C заранее; Перед нанесением только разморозьте.
    15. При немедленной визуализации протрите предметное стекло вокруг ткани безворсовой салфеткой и примените проточную ячейку, надавливая на нее в течение 30 с с помощью оборудования для сборки проточных ячеек. Если визуализация выполняется позже, храните предметное стекло (без применения проточной ячейки) в буфере хранения при температуре 4 °C. Когда изображение будет готово, перенесите слайды из буфера хранения в PBS в течение 10 минут перед применением проточной ячейки.
  3. Начните подготовку рабочего буфера 1x с добавкой на основе желаемых циклов в эксперименте. Приготовьте буферы с низким (1:4) и высоким содержанием ДМСО (9:1), смешав 1-компонентный ДМСО с 4-компонентным рабочим буфером и 9-компонентный ДМСО с 1-компонентным рабочим буфером, необходимым для желаемых циклов. Сэкономьте около 20 мл 1x буфера с добавкой для изготовления репортерной пластины. Чтобы рассчитать требуемый буфер 1x с аддитивными буферами и буферами ДМСО с высоким/низким уровнем ДМСО, обратитесь к менеджеру приборов.
  4. Начните подготовку репортерной пластины. Во-первых, составьте репортер стокового решения, необходимого для общего количества циклов. Наклейте на микроцентрифужные пробирки черного или янтарного цвета объемом 1 мл с названиями циклов. Добавьте в соответствующую пробирку 250 μл исходного раствора репортера и по 5 μл каждого репортера. Затем перелейте раствор на черную 96-луночную пластину и запечатайте ее клеевой фольгой.
  5. Запустите устройство, используйте диспетчер приборов для установки параметров и времени экспозиции (в соответствии с таблицей 1) и получите изображения. На рисунке 1 обобщены процессы до и после окрашивания.

5. Аннотирование тканей и сегментация клеток

  1. Настройте проект и рабочее пространство.
    1. Установите последнюю версию программного обеспечения для цифрового анализа патологии (например, QuPath версии 0.5.1 или выше). Нажмите « Создать проект», чтобы выбрать папку назначения для пространства проекта.
    2. Нажмите « Добавить изображения» > «Выбрать файлы», затем перейдите к файлу QPTIFF (полученному с помощью мультиплексной иммунофлуоресцентной визуализации). Установите тип изображения на Флуоресцентный, сохраните все остальные настройки по умолчанию и нажмите Импорт.
    3. Если вы используете QuPath, дважды щелкните по новому изображению, чтобы открыть рабочую область. Периодически нажимайте кнопку Файл > Сохранить , чтобы отслеживать изменения, внесенные в проект. Переключайте видимость маркера и настройки просмотра с помощью значка «Яркость и контрастность » (значок в виде полумесяца) в центре панели инструментов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Щелкните правой кнопкой мыши изображение в списке изображений, чтобы переименовать его. Это будет важно в дальнейшем при визуализации классификаций фенотипов.
  2. Аннотируйте полный срез ткани, внутриопухолевый компартмент и стромальный компартмент.
    1. С помощью инструмента «Кисть» и/или «Палочка» нарисуйте аннотацию вокруг всего участка ткани. Определите эту аннотацию как Full_Tissue. Исключите вышележащую кожу и/или любые участки, которые не следует анализировать. Чтобы создать отрицательную аннотацию и/или уменьшить границу аннотации, удерживайте клавишу Alt во время использования одного из инструментов аннотации.
    2. Продублируйте полную аннотацию ткани. Выберите Аннотацию на вкладке Аннотации, затем перейдите в раздел Объекты > Аннотации... > Дублируйте выбранные аннотации.
    3. Включите канал SOX10. На дублирующейся аннотации сожмите границу аннотации, чтобы захватить внутриопухолевое отделение, с помощью инструмента Alt + кисть/палочка. Определите эту аннотацию как опухоль (рисунок 2).
    4. Выбрав полную аннотацию ткани, перейдите в раздел Объекты > аннотации... > Разверните аннотации. Определите Радиус расширения как 1 мкм и нажмите Запустить.
    5. Переименуйте новую аннотацию в Full_Tissue_Expansion. Выберите аннотацию опухоли, щелкните правой кнопкой мыши и выберите «Вставить в иерархию».
    6. Повторно выберите аннотацию опухоли, перейдите в раздел Объекты > аннотации... > Сделайте обратное. Определите эту новую аннотацию как Stroma. Повторите для всех участков ткани.
  3. Выполняйте сегментацию ячеек и экспортируйте результаты.
    1. Перейдите на вкладку Изображение , чтобы найти ширину и высоту изображения в пикселях (рисунок 3A).
    2. Загрузите расширение StarDist по ссылке https://github.com/qupath/qupath-extension-stardist/releases. Перетащите файл qupath-extension-stardist-[version].jar в окно QuPath, затем нажмите на значок шестеренки в правом верхнем углу окна QuPath. В разделе Расширения определите пользовательский каталог QuPath в качестве местоположения папки StarDist.
    3. Загрузите файлы скриптов StarDist groovy и файл модели StarDist с сайта https://github.com/xzhou125/JOVE_QuPath_Spatial_Analysis (скрипты StarDist изначально были организованы компанией Akoya Biosciences).
    4. Для каждого участка ткани выберите аннотации «Опухоль » и «Строма» (используйте клавишу Ctrl для выбора нескольких аннотаций). На верхней панели настроек нажмите «Автоматизировать > редактор скриптов », чтобы открыть интерфейс скриптов. Откройте соответствующий скрипт сегментации ячеек StarDist (файл groovy), который соответствует размеру пикселя изображения. Когда появится запрос на выбор файла сегментации ячеек, откройте файл stardist_cell_seg_model.pb.
    5. После сегментации ячеек сохраните изображение. Перейдите в раздел Измерение > Экспорт измерений, затем выберите соответствующие изображения. Назначьте тип экспорта как Ячейки и Разделитель как .csv, затем выберите местоположение выходного файла . Нажмите « Заполнить» рядом со столбцами, чтобы включить интересующие их метрики. Важными столбцами для экспорта являются «Изображение», «Идентификатор объекта», «Родитель», «Центроид X», «Центроид Y» и «Площадь ядра».
      ПРИМЕЧАНИЕ: Идентификатор объекта используется на последующих этапах для повторного сопоставления классификаций с мультиплексным иммунофлуоресцентным изображением в программном обеспечении для цифрового анализа патологии. В столбце «Родитель» указывается имя аннотации, к которой принадлежит ячейка. Данные X и Y используются для пространственного анализа.
    6. Для каждого маркера происхождения, который будет использоваться в кластеризации/фенотипировании, выберите одно среднее значение для экспорта. Для ядерных маркеров (например, SOX10 и FOXP3) экспортируйте опцию Nucleus: Mean. Для цитоплазматических/мембранозных маркеров (например, CD45, CD3, CD4) экспортируйте опцию Цитоплазма: Среднее.

6. Предварительная обработка и нормализация данных по протеомике

  1. Откройте экспортированный CSV-файл. Для каждого маркера, используемого в кластеризации/фенотипировании, усеките имя заголовка столбца, чтобы включить только маркер. Например, переименуйте SOX10: Nucleus: Mean в SOX10 и CD3: Cytoplasm: Mean в CD3.
  2. Установите последнюю версию R и RStudio. Скачайте файл Marker Normalization.R с https://github.com/xzhou125/JOVE_QuPath_Spatial_Analysis и запустите скрипт. Во-первых, это включает в себя фильтрацию клеток по размеру ядер.
  3. Затем для каждого маркера выполняется нормализация min-max таким образом, чтобы наименьшее значение MFI в диапазоне выражения было установлено равным 0, а значение MFI в 99,7-м процентиле было установлено равным 1. Все интенсивности выше99,7-го процентиля обрезаются на уровне 1. После завершения сохраните новый CSV-файл, созданный с нормализованными данными.

7. Кластеризация и фенотипирование

  1. Выберите алгоритм кластеризации ячеек в соответствии с профилями экспрессии маркеров. В https://github.com/xzhou125/JOVE_QuPath_Spatial_Analysis предоставляются скрипты R для кластеризации с использованием Seurat v4.415 и FlowSOM v2.13.9 (инструмент кластеризации и визуализации)16.
  2. Фенотип клеток в соответствии с профилями экспрессии маркеров ключевых маркеров линии. Представленный здесь протокол использовал 14 маркеров линии для кластеризации и фенотипирования: SOX10, CD45, CD3, CD4, CD8, FOXP3, CD11C, F4/80, CD68, CD86, CD163, CD206, NK1.1 и CD31.
    1. Определите опухолевые клетки как SOX10hi. Определите CD4 Т-клетки как CD45mod-hi/ CD4hi/CD8low/FOXP3low. Определите CD8 Т-клетки как CD45mod-hi/ CD8hi/CD4low. Определите Tregs как CD45mod-hi/CD4hi/CD8low/FOXP3hi. Определите другие Т-клетки как CD45mod-hi/CD3hi/CD4low/CD8low.
    2. Определите макрофаги M1 как CD45mod-hi/F4/80hi/CD68hi/CD86hi/CD163low /CD206low. Определите макрофаги M2 следующим образом: CD45mod-hi/F4/80hi/CD68mod-hi/CD86low/CD163hi/CD206low, CD45mod-hi/F4/80hi/CD68mod-hi/CD86low/CD163low/CD206hi, или CD45mod-hi/F4/80hi/CD68mod-hi/CD86low/CD163hi/CD206hi. Определите другие макрофаги: CD45mod-hi/F4/80hi/CD68mod-hi/CD86low/ CD163low/CD206low или CD45mod-hi/F4/80hi/CD68mod-hi/CD86hi/CD163hi/CD206hi.
    3. Определите дендритные клетки как CD45mod-hi/CD11chi/CD86mod-hi. Определите NK-клетки как CD45mod-hi/NK1.1hi. Определите другие иммунные клетки как CD45mod-hi , которые не удовлетворяют условиям, описанным выше. Определите эндотелиальные клетки как CD31mod-hi. Удалите все остальные профили выражения.

8. Повторное присвоение классификаций фенотипов и проведение контроля качества

  1. Загрузите скрипт Remapping Classifications.groovy с сайта https://github.com/xzhou125/JOVE_QuPath_Spatial_Analysis (этот скрипт был адаптирован из поста на https://forum.image.sc/ от petebankhead).
  2. Откройте фенотипированный файл CSV и убедитесь, что все метки на вкладке «Изображение» точно соответствуют имени файла изображения в программном обеспечении для цифрового анализа патологии, которое будет использоваться для повторного сопоставления. Чтобы быстро изменить большое количество меток в файле CSV, используйте функцию «Заменить все».
  3. Если вы используете QuPath, запустите файл Groovy для повторного сопоставления классификаций, нажав кнопку "Автоматизировать > редакторе скриптов".
  4. На вкладке Аннотации нажмите на Три точки рядом с кнопкой Автонастройка, затем нажмите Заполнить из существующих объектов > Все классы (включая подклассы) > Да.
  5. Прокрутите список маркеров вниз, чтобы просмотреть различные классификации фенотипов и при необходимости настроить цветовую схему. Дважды щелкните мышью по любой ячейке, чтобы просмотреть ее фенотип (рядом с тегом Классификация) и кластер (рядом с тегом Имя). Проверьте репрезентативные поля зрения, чтобы определить точность присвоения фенотипов и при необходимости пересмотреть стратегию фенотипирования (рис. 3B).

9. Количественная оценка плотности и пространственный анализ

  1. После завершения фенотипирования получите области аннотаций в программном обеспечении для цифрового анализа патологии на вкладке «Аннотации». Преобразуйте значения площади в мм2, а затем разделите числа по областям аннотаций, чтобы вычислить плотности.
  2. Загрузите скрипт SPIAT Spatial Analysis.R с https://github.com/xzhou125/JOVE_QuPath_Spatial_Analysis и запустите. Соберите данные о средних минимальных расстояниях (AMD), составах окрестностей и нормализованных оценках смешивания (NMS).
  3. Генерируйте цифры в программном обеспечении для статистического анализа для представления результатов. При создании единой тепловой карты для средних минимальных расстояний условий лечения усредняйте результаты, полученные на разных срезах тканей.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В данной статье мы представляем протокол разработки панели антител для мышиной ткани FFPE, выполнения мультиплексной иммунофлуоресцентной визуализации и анализа изображений для количественной оценки протеомики и пространственных отношений. Валидированная панель содержит 27 антител, которые обеспечивают маркеры для визуализации клеток меланомы (SOX10), лейкоцитов (CD45), Т-клеток (CD3, CD4, CD8, FOXP3), В-клеток (CD20), макрофагов и подтипов (F4/80, CD68, CD86, CD163, CD206), дендритных кл...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Успех визуализации зависит от хорошо спроектированной и проверенной панели антител. Мультиплексная иммунофлуоресцентная визуализация образцов FFPE сопряжена с трудностями из-за высокой автофлуоресценции и трудности извлечения эпитопов, замаскированных заделкой парафина. Однако, учитывая, что FFPE имеет ряд преимуществ по сравнению с образцами FF, важно разработать и проверить панели антител FFPE. Первым шагом является окончательная доработка клонов антител, которые демонстрируют положите...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Компания J.C.S. выражает признательность за финансовую поддержку со стороны компании Emerson Collective LLC и Национальных институтов здравоохранения. J.J.G. также выражает признательность за финансирование со стороны Национальных институтов здравоохранения. J.C.S. сотрудничает с компанией Palleon Pharmaceuticals Inc., которая включает в себя финансирование грантов. S.Y.T. и J.J.G. имеют отношения с OncoSwitch Therapeutics, которые связаны с акциями. S.Y.T., J.J.G., J.C.S. и K.M.L. имеют патент, находящийся на рассмотрении. Все остальные авторы заявляют, что у них нет известных конкурирующих финансовых интересов или личных отношений, которые могли бы быть восприняты как влияющие на исследование, представленное в этой статье.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Компания J.C.S. выражает признательность Фонду дерматологии и премии за развитие карьеры в области дерматопатологии за продвижение карьеры автора. Авторы благодарят Синь-Пей Ли из Лаборатории данных о раке Национального института рака за помощь в разработке методов вычислительного анализа. Это исследование получило финансирование от Коллектива Эмерсона и Национальных институтов здравоохранения (R37CA246699, P41EB028239 и R01CA228133). Кроме того, ядро Онкологической тканевой службы Джона Хопкинса (OTS) поддерживается Национальными институтами здравоохранения (P30CA006973).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
16% параформальдегида (PFA)Науки электронной микроскопииУН# 15710Необходим в процессе окрашивания тканей
Фильтр MWCO 50 кДаМногородностьUFC50509625 кДа и 100 кДа приводят к выходу из строя
Штрих-коды Akoya и репортерыАкойя БионаукиРазнообразныйКаждый штрих-код может быть использован для конъюгации 50 мкг антител, не содержащих носителей, и поставляется с двумя флаконами репортеров
Набор для конъюгации антителАкойя Бионауки7000009Набор для конъюгации используется для создания пользовательских конъюгированных антител со штрих-кодом. Каждый набор содержит достаточное количество реагентов для десяти конъюгаций. Комплект состоит из одной коробки поднабора, хранящейся при 4° C и одна коробка с поднабором хранятся при температуре -20 °C. 4 ° В набор C входят раствор для блокировки фильтра, раствор для восстановления 2, раствор для конъюгации, раствор для очистки и раствор для хранения антител. При температуре -20 °°; В комплект C входит решение для редукции 1.
Бета2МГАбкам АБ214769
CD11bCST #41028
CD11CCST #39143SF
КД163САНТИСТОКС #68922BF
СД20CST #45839
КД206САНТИСТОКС #87887
CD3CST #24581
СД31CST #92841
СД38CST #68336BF
СД4Абкам АБ271945
СД45CST #98819
СД68САНТИСТОКС #29176
СД8Инвитроген #14-0808-82
КД86САНТИСТОКС #20018
ДиметилсульфоксидАвантор/ВВРBDH1115-4LP
ЭОМЕСАбкам АБ222226
Пробирки Eppendorf PCRЭппендорфE0030124286Требуемый магазин 5 μ L-конъюгированное антитело для подтверждения конъюгации методом гель-электрофореза
Этанол 200 proof
F4/80CST # 25514
Фокс П3CST #72338
Гран-БСАНТИСТОКС #79903SF
Нагревательная печь
Камера гибридизацииИспользуется для окрашивания тканей коктейлем антител
Перекись водородаСигма#216763Необходим для приготовления отбеливающего раствора
Скороварка быстрого приготовления или камера для снятия маскировки ARCРастворимый марихуана или Biocare Medical
Ки-67Акойя Бионауки
ЛАГ3CST #80282BF
ЛМП2Абкам АБ243556
Метанол
MHC-IIeBioscience #14-5321-82
НК1.1САНТИСТОКС #24395SF
Ядерное пятноАкойя Бионауки7000003
ПДЛ1CST #85095
ДНК спермы лосося, срезанная (10 мг/мл)ИнвитрогенАМ9680Может использоваться в качестве альтернативы реагенту для анализа (Akoya) на этапе подготовки репортерной пластины.
СОКС-10Абкам  АБ245760
Набор для окрашивания для PhenoCycler-FusionАкойя Бионауки7000017Набор образцов PhenoCycler-Fusion включает в себя буферы и реагенты, необходимые для окрашивания тканей с использованием антител, конъюгированных со штрих-кодами PhenoCycler, а также проточные ячейки для визуализации всего предметного стекла. Каждого набора достаточно для 10 экспериментов PhenoCycler-Fusion. Он состоит из одного подкомплекта, хранящегося при 4°°; С, другой при -20 °°; C и упаковку из 10 проточных ячеек, хранящихся при комнатной температуре. В подкомплекте хранится 4° C содержит буфер гидратации, буфер окрашивания, буфер хранения, блокиратор N и блокатор J. Подкомплект хранится при температуре -20°С; C содержит блокатор G, блокатор S и фиксирующий реагент.
Т-бетCST #53753
ТИМ-3САНТИСТОКС #72911
Ультрачистая дистиллированная вода, не содержащая ДНКазы/РНКазыИнвитроген10977015Требуется для растворения штрих-кодов во время конъюгации антител

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Schadendorf, D., et al. Melanoma. Lancet. 392 (10151), 971-984 (2018).
  2. Taube, J. M., et al. Implications of the tumor immune microenvironment for staging and therapeutics. Modern Pathol. 31 (2), 214-234 (2018).
  3. Marzagalli, M., Ebelt, N. D., Manuel, E. R. Seminars in cancer biology. 59, 236-250 (2019).
  4. De Visser, K. E., Joyce, J. A. The evolving tumor microenvironment: From cancer initiation to metastatic outgrowth. Cancer cell. 41 (3), 374-403 (2023).
  5. Balkwill, F. R., Capasso, M., Hagemann, T. The tumor microenvironment at a glance. J Cell Sci. 125 (23), 5591-5596 (2012).
  6. Phillips, D., et al. Highly multiplexed phenotyping of immunoregulatory proteins in the tumor microenvironment by codex tissue imaging. Front Immunol. 12, 687673(2021).
  7. Giesen, C., et al. Highly multiplexed imaging of tumor tissues with subcellular resolution by mass cytometry. Nat Methods. 11 (4), 417-422 (2014).
  8. Keren, L., et al. Mibi-tof: A multiplexed imaging platform relates cellular phenotypes and tissue structure. Sci Adv. 5 (10), eaax5851(2019).
  9. Lin, J. R., Fallahi-Sichani, M., Sorger, P. K. Highly multiplexed imaging of single cells using a high-throughput cyclic immunofluorescence method. Nat Comm. 6 (1), 8390(2015).
  10. Radtke, A. J., et al. Ibex: An iterative immunolabeling and chemical bleaching method for high-content imaging of diverse tissues. Nat Protoc. 17 (2), 378-401 (2022).
  11. Black, S., et al. Codex multiplexed tissue imaging with DNA-conjugated antibodies. Nat Protoc. 16 (8), 3802-3835 (2021).
  12. Aung, T. N., Bates, K. M., Rimm, D. L. High-plex assessment of biomarkers in tumors. Mod Pathol. 37 (3), 100425(2024).
  13. Surwase, S. S., et al. Highly-multiplexed immunofluorescence phenocycler panel for murine ffpe yields insight into tumor microenvironment immunoengineering. Lab Invest. 105 (1), 102165(2024).
  14. Luly, K. M., Green, J. J., Sunshine, J. C., Tzeng, S. Y. Biomaterial-mediated genetic reprogramming of merkel cell carcinoma and melanoma leads to targeted cancer cell killing in vitro and in vivo. ACS Biomater Sci Eng. 9 (11), 6438-6450 (2023).
  15. Satija, R., Farrell, J. A., Gennert, D., Schier, A. F., Regev, A. Spatial reconstruction of single-cell gene expression data. Nat Biotechnol. 33 (5), 495-502 (2015).
  16. Van Gassen, S., et al. Flowsom: Using self-organizing maps for visualization and interpretation of cytometry data. Cytometry Part A. 87 (7), 636-645 (2015).
  17. Butler, A., Hoffman, P., Smibert, P., Papalexi, E., Satija, R. Integrating single-cell transcriptomic data across different conditions, technologies, and species. Nat Biotechnol. 36 (5), 411-420 (2018).
  18. Watson, S. S., et al. Microenvironmental reorganization in brain tumors following radiotherapy and recurrence revealed by hyperplexed immunofluorescence imaging. Nat Comm. 15 (1), 3226(2024).
  19. Greenwald, N. F., et al. Whole-cell segmentation of tissue images with human-level performance using large-scale data annotation and deep learning. Nat Biotechnol. 40 (4), 555-565 (2022).
  20. Goldsborough, T., et al. Instanseg: An embedding-based instance segmentation algorithm optimized for accurate, efficient and portable cell segmentation. arXiv. , (2024).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Multiplex ImmunofluorescenceDNA Barcode ImagingFFPE SpecimensMurine MelanomaSpatial ProteomicsAntibody Panel DesignTissue MicroenvironmentImage Analysis PipelineCell PhenotypingTumor Microenvironment

Похожие статьи