Этот протокол описывает в яйце ксенотрансплантат клеток В- и Т-острого лимфобластного лейкоза (ОЛЛ) пациента, который происходит через 4 дня после инъекции.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
В Ово Ксенотрансплантация клеток острого лимфобластного лейкоза (ОЛЛ) от пациента (PDX-ОЛЛ)
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
В этом исследовании представлен быстрый, экономически эффективный и эффективный метод ово-ксенотрансплантации клеток острого лимфобластного лейкоза (ОЛЛ) пациента, охватывающий как В-клетки, так и Т-клеточные линии. Используя оплодотворенные куриные эмбрионы, мы ввели полученные от пациента B-ALL и T-ALL клетки в сосудистую сеть эмбрионов через 11 дней после оплодотворения (11dpf). Примечательно, что через четыре дня после инъекции приживленные клетки лейкемии человека продемонстрировали значительную выживаемость, пролиферацию и колонизацию сосудов в развивающемся курином эмбрионе. К 15dpf мы обнаружили заметное увеличение CD10/CD19+ B-ALL и CD4/CD8+ T-ALL клеток в образцах крови из сосудистой сети эмбриона, что подтвердило успешное приживление. Эта система способствует эффективной и воспроизводимой оценке поведения клеток лейкемии в живом организме без значительных затрат и этических ограничений, связанных с другими животными моделями. Этот быстрый подход обеспечивает высокопроизводительную и биологически актуальную платформу in vivo для оценки потенциальных терапевтических соединений. Представленная здесь система ксенотрансплантата (PDX)-ОЛЛ in ovo является многообещающим инструментом для доклинического скрининга лекарственных средств, механистических исследований и, возможно, для подходов персонализированной медицины в исследованиях лейкемии.
Введение
Хориоаллантоисная мембрана цыплят (CAM) начинает формироваться на 7-й день после оплодотворения после инкубации и завершается к 12-му дню. CAM находится в центре внимания как подходящая in vivo модель для ангиогенеза1 и приживления раковых клеток 2,3,4,5,6,7,8,9,10, в частности, родственных кровираковых клеток 11, так как он по своей природе иммунодефицитен и имеет хорошо развитую васкуляризацию. Кроме того, CAM также является желательной системой для исследования опухолевой инвазии и метастазирования, поскольку она несет ряд белков внеклеточного матрикса, включая коллаген, интегрин αVβ3, фибронектин, ламинин и матриксную металлопротеиназу-2 (MMP-2)10.
Острый лимфобластный лейкоз (ОЛЛ) – это рак костного мозга и крови, который характеризуется быстрым увеличением незрелых В- и Т-лимфоцитов. Это самый распространенный детский рак и основная причина смерти от рака среди детей. ОЛЛ излечим у >85% больных детей, но взрослые и младенцы имеют значительно более низкие показатели излечения, а рецидивирующая/рефрактерная ОЛЛ имеет 5-летнюю выживаемость <10%12. Таким образом, срочно необходима разработка новых стратегий лечения для предотвращения или остановки рецидива или рефрактерного ОЛЛ. Несмотря на то, что был разработан ряд моделей ксенотрансплантатов, таких как мышь и крыса13, эти методы являются трудоемкими (например, месяцами) и дорогостоящими, а также требуют всестороннего этического регулирования. Для удовлетворения неудовлетворенной клинической потребности в новой терапии ОЛЛ необходимо разработать воспроизводимую, экономичную по времени и затратам животную модель, подходящую для расширения основных работ in vitro .
В этом исследовании мы сообщаем об успешном создании протокола ксенотрансплантата in ovo , который надежно производит 3D-сосудистую колонизацию клеток B- и T-ОЛЛ пациента, что потенциально может быть использовано для разработки новой терапии, которая может остановить прогрессирование ОЛЛ, а также для разработки прогностического инструмента для исходов и рисков лечения ОЛЛ.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Эксперименты проводились на основе протокола, утвержденного Комитетом по этике Университета Калгари (REB15-1143; где было получено информированное согласие от ВСЕХ испытуемых) и Советом по этике исследований в области здравоохранения Комитета по раку Альберты (HREBA. СС-17-0108_REN8). В исследование были включены пациенты с ОЛЛ на момент постановки диагноза (до начала любой терапии), у которых были циркулирующие бласты (бласты не только в костном мозге, но и в крови). Используемые реагенты и оборудование приведены в Таблице материалов.
1. Инкубация яиц
- Заготовьте оплодотворенные куриные яйца. Получите на ~10% больше яиц, чем нужно, учитывая количество яиц, поврежденных во время транспортировки или процедуры растрескивания.
- Оплодотворенные яйца хранят до двух недель при температуре 12 °C без потери жизнеспособности.
- Переложите яйца во увлажненный (~50%-60%) передвижной инкубатор при температуре 39 °C.
- Инкубируйте яйца в инкубаторе по 10dpf. Обратите внимание, что 1 день начинается с момента переноса яиц в инкубатор.
2. Выделение клеток острого лимфобластного лейкоза из образцов крови пациентов с ОЛЛ
- Изолируйте клетки, как описано ранее 14,15.
- Соберите 10 мл периферической крови (или костного мозга) пациентов с В- и Т-ОЛЛ в гепаринизированные пробирки.
- Переложите образцы крови в стерильную центрифужную пробирку объемом 50 мл и разбавьте в три раза 2 объемами 1x фосфатно-солевого буфера (PBS), содержащего 137 мМ NaCl, 2,7 мМ KCl, 10 мМ Na2HPO4 и 1,8 мМ KH2PO4.
- Наложите 1 объем разведенных образцов крови на 1 объем градиентной среды плотности и центрифугируйте при комнатной температуре без тормоза при 300 х г в течение 30 мин.
- Соберите охристый слой мононуклеарных клеток (МНК) с границы раздела и перенесите его в новую стерильную пробирку объемом 15 мл с помощью стерильной пипетки.
- Добавьте 10 мл 1x PBS и центрифугируйте при 300 x g в течение 5 минут, чтобы удалить все оставшиеся компоненты сыворотки (повторите этот шаг дважды).
- Добавьте 2 мл 0,8% NH4Cl в клеточную гранулу, осторожно перемешайте, инкубируйте при комнатной температуре в течение 5 минут и вращайте при 300 x g в течение 5 минут, чтобы лизировать эритроциты (при необходимости повторите этот шаг).
- Промойте ячейки в 1x PBS, как описано в шаге 2.6.
- Ресуспендируйте клетки в RPMI 1640, содержащем 10% FBS, и подсчитайте количество клеток с помощью гемоцитометра.
- Оцените жизнеспособность клеток с помощью анализа исключения трипанового синего.
- Ресуспендируйте клетки в замораживающей среде (10% ДМСО в FBS), заморозьте их при температуре -80 °C и храните в жидком азоте.
3. Амплификация лентивируса2-го поколения, некомпетентного в репликации
- Семена HEK293T эмбриональные клетки почек человека при конфлюенции ~60%-70% в 6-луночный планшет, содержащий DMEM с добавлением 10% FBS и 1% пенициллин-стрептомицина при 37 °C в увлажненном инкубаторе с 5%CO2.
- Котрансфектируйте клетки (1,5 x 106) с помощью переноса FUW-Luc-mCherry-puro, упаковки pCMVΔr8.91 и оболочивания pVSV-G в соотношении 3:2:1 с использованием липофектамина 3000 в течение 2 дней.
- Соберите лентивируссодержащую надосадочную жидкость и профильтруйте через фильтр 0,45 мкм.
- Перелейте очищенную вирусную надосадочную жидкость в центрифужные пробирки, центрифугируйте при 20 000 x g в течение 2 ч при 4 °C, выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулу в 100 мкл PBS или среды, не содержащей сыворотки.
- Измерьте кратность инфекции (MOI) с помощью набора для титра лентивируса для количественной ПЦР.
4. Мечение непрерывно растущих клеточных линий ALL и клеток ALL, полученных от пациента, с помощью mCherry
- Планшет 1 x 106 клеток/мл B-(SEM) и T-ALL (MOLT3)16,17клеточных линий и полученных от пациента B- или T-ALL клеток в 6-луночных планшетах, содержащих RPMI 1640 + 10% FBS.
- Инфицируйте клетки 300 мкл лентивирусного препарата с титром вируса 3,47 x 106 МЕ/мл с получением MOI 1 на 1 x 106 клеток, осторожно перемешайте и инкубируйте при 37 °C с 5%CO2 в течение 2 дней.
- Добавьте 1 мкг/мл пуромицина в культуральную среду для отбора стабильно трансдуцированных клеток в течение 2 дней.
- Визуализируйте клетки, меченные mCherry, с помощью флуоресцентного микроскопа.
5. В яйце ксенопрививка
- На 10-й день (см. выше раздел «Инкубация яиц») исследуйте сосудистую сеть эмбрионов цыплят под светом, чтобы оценить жизнеспособность эмбрионов. Затем аккуратно вымойте яйца с 70% этанолом, чтобы стерилизовать поверхность.
- Просверлите в воздушной камере яиц, чтобы создать небольшое (~2,0 см в диаметре) окошко с помощью ручной дрели.
- Заклейте прозрачной клейкой лентой и верните в инкубатор с 5% содержаниемCO2 .
- На 11-й день введите 1 x 10 меченых7 mCherry ALL клеток в кровеносные сосуды развивающихся эмбрионов с помощью игл 34 G. Обратите внимание, что оказалось трудно подтвердить, были ли ВСЕ клетки введены в идентичные места у разных эмбрионов, потому что открытие окна в одних и тех же местах не гарантируется.
- Заклейте окна прозрачной клейкой лентой, вернитесь в инкубатор с 5%CO2 и ежедневно контролируйте жизнеспособность эмбрионов.
- На 15-й день препарируйте кровеносные сосуды эмбрионов, поместите их на предметные стекла и сфотографируйте успешные ксенотрансплантаты с помощью препарирующего микроскопа, оснащенного флуоресцентными возможностями.
ПРИМЕЧАНИЕ: При превышении 15dpf (поскольку перья покрывают все тело, а белок почти отсутствует) необходимо провести иммуногистохимическую терапию для оценки изменений в пролиферации и колонизации ВСЕХ клеток в сосудистой сети куриного эмбриона.
6. Проточная цитометрия
- На 15-й день соберите кровь из сосудистой сети куриного эмбриона с помощью стерильного шприца с иглой 32 G, перенесите ее в стерильную пробирку объемом 1,5 мл, содержащую гепарин, и центрифугируйте при 226 x g в течение 10 минут при 4 °C.
- Удалите надосадочную жидкость (плазму) и повторно суспендируйте клеточную гранулу в 1x PBS, содержащую 1% BSA (бычьего сывороточного альбумина).
- Выполните шаги 2.7 и 2.8 для лизиса эритроцитов.
- Мечите клетки B-ALL человеческими антителами FITC-CD10 и человеческим PE-CD19, а клетки T-ALL — человеческими антителами FITC-CD4 и человеческим PE-CD8 соответственно при 4 °C в темноте в течение 30 минут.
- Дважды промойте меченые клетки PBS, содержащим 1% BSA, центрифугируйте при 226 x g в течение 5 минут при 4 °C, повторно суспендируйте в 1x PBS и проанализируйте с помощью проточной цитометрии.
- Установите напряжение прямого рассеяния (FSC) и бокового рассеяния (SSC) на 400 В и 360 В соответственно. Отрегулируйте коэффициенты усиления детектора для каналов FITC и PE на 450-500 В и 400-450 В соответственно.
ПРИМЕЧАНИЕ: Стратегия стробирования: (a) стробирование светового рассеяния (FSC в сравнении с SSC): используйте FSC-A с. SSC-A для идентификации популяции с промежуточным прямым рассеянием (размером) и низким боковым рассеянием (зернистостью), которое соответствует области лимфобласта. Обратите внимание, что этот шаг помогает исключить мусор и более зернистые клетки, такие как моноциты или гранулоциты; (b) выбор синглетов (FSC-H в сравнении с FSC-H FSC-A): выполнять дискриминацию дублетов путем стробирования на FSC-H и . FSC-A, гарантируя, что анализируются только события одиночных клеток18. - Количественная оценка клеток CD10/CD19+ B-ALL и CD4/CD8+ T-ALL путем подсчета событий в квадранте 2 (Q2; FITC/PE+) FITC против Участки ПЭ18. Present означает ± SEM трех независимых экспериментов (n = 3).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Чтобы определить, было ли успешным приживление клеток ALL человека в развивающихся куриных эмбрионах, были амплифицированы лентивирусы2-го поколения, некомпетентные к репликации, несущие mCherry, и использовали их для маркировки клеточных линий B- и T-ALL, SEM и MOLT3 16,17, соответственно. Как показано на рисунке 1A, ~50% B- (две верхние левые панели) и T-(верхние правые две панели) ВСЕ ячейки были помечены mCherry. Впосл...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Для предотвращения микробного загрязнения и максимального выживания куриных эмбрионов были определены три важнейших этапа во время ксенотрансплантацииin ovo : (1) стерилизация поверхности яичной скорлупы 70% этанолом перед изготовлением окна и (2) плотная герметизация окна яичной скорлупы с помощью ленты Cellotape для предотвращения испарения содержимого куриного эмбриона во время инкубации. и (3) использование тонкой иглы (например, 34 G) и введение ВСЕХ клеток в минимальном о...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих финансовых интересов.
Благодарности
Мы благодарим доктора Эндрю Кунга из Колумбийского университета за предоставление FUW-Luc-mCherry-puro. Эта работа была поддержана грантами CIHR (PJT-174983) для KYL и Национальным исследовательским фондом Кореи (NRF; RS-2023-00284121) в KYL и M-YJ.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Иглы 34 г | BD Perisafe | ||
| Проточный цитометр Attune NxT | Термо Фишер | ||
| Шприц BD Perisafe (32 г) | BD Perisafe | ||
| Бычий сывороточный альбумин (BSA) | Миллипора Сигма | А9647 | |
| Среда для замораживания клеток | Gibco, ThermoFisher Scientific | 12648010 | |
| Центрифуга (центрифуга Allegra X-22R) | Бекман Коултер | ||
| Одноразовые перчатки | Нитриловые смотровые перчатки Royal Touch300 | ||
| Препарирующий микроскоп | Лейка MZ16FA | ||
| DMEM | Gibco, ThermoFisher Scientific | 11965092 | |
| ДМСО | Invitrogen, ThermoFisher Scientific | Д12345 | |
| Инкубатор для яиц, Vevitts 120 роликовый инкубатор | Виксест Трейдинг Ко. | ||
| Этиловый спирт (95%) | VWR Интернэшнл | BDH1158-4LP | |
| Фетальная бычья сыворотка (FBS) | Gibco, ThermoFisher Scientific | 26140079 | |
| Решение Ficoll (Ficoll?? Паке Плюс) | МиллипорСигма | ГЭ17-1440-02 | |
| Антитело FITC-CD10 | Санта Крус Биотех | sc-46656 ФИТК | |
| Антитела FITC-CD4 | Санта Крус Биотех | sc-19641 ФИТК | |
| Флуоресцентный микроскоп | Leica Microsystems | ||
| Ручная дрель (Dremel3000) | Бош | ||
| HEK293T | ATCC, ВИРДЖИНИЯ, США | КРЛ-3216 | |
| Гемоцитометр | VWR international, Hausser Scientific | 15170-263 | |
| Гепариновая натриевая соль из слизистой оболочки кишечника свиньи | Миллипора Сигма | Н3149 | |
| Гепаринизированные пробирки | BD Vacutainer | БД 366480 | |
| Липофектамин 3000 | Invitrogen, ThermoFisher Scientific | L3000008 | |
| Multiplex Lentivirus Titer Kit (qPCR Lentivirus Titer Kit) | АБМ | ЛВ900 | |
| NH4Cl (Аммонийный chloride_ | Миллипора Сигма | А9434 | |
| Инвертированный микроскоп Olympus IX71 | Олимп | ||
| Антитела PE-CD19 | Санта Крус Биотех | ПК-19650 ПЭ | |
| Антитела к PE-CD8 | Санта Крус Биотех | ПК-1177 ПЭ | |
| Пенициллин-стрептомицин (10 000 ЕД/мл) | Gibco, ThermoFisher Scientific | 15140122 | |
| Фосфатно-солевой буфер (PBS) | Сигма | П3813 | |
| Пипетки (регулируемый объем) | Эппендорф | ||
| Пуромицин | Gibco, ThermoFisher Scientific | A1113803 | |
| РПМИ 1640 | Gibco, ThermoFisher Scientific | 11875093 | |
| Скотч Канцелолент | 3 МИН. | ||
| Стерильные 6-луночные планшеты | VWR международный, Corning | 22250-140 | |
| Стерильные центрифужные пробирки | Axygen Inc, Корнинг | АКСИМКТ-150-С-С | |
| Стерильные колбы для культур (75Т) | VWR Интернэшнл | 10062-872 | |
| Стерильные пробирки Falcon (15 мл) | САРШТЕДТ | 62.554.502 | |
| Стерильные пробирки Falcon (50 мл) | САРШТЕДТ | 62.547.254 | |
| Стерильный фильтр (0,45 & микро; м) | VWR Интернэшнл | 76778-974 | |
| Стерильные щипцы | VWR Интернэшнл | 82027-404 | |
| Стерильные стеклянные предметные стекла | VWR международный | 48300-031 | |
| Стерильные наконечники для пипеток | VWR Интернэшнл | 76322-136, 76322-134, 76322-154 | |
| Стерильные шприцы | Шприц BD | 309628? | |
| Трипан синий | Invitrogen, ThermoFisher Scientific | Т10282 |
Ссылки
- Folkman, J. What is the evidence that tumors are angiogenesis dependent. J Natl Cancer Inst. 82 (1), 4-6 (1990).
- Hagedorn, M., et al. Accessing key steps of human tumor progression in vivo by using an avian embryo model. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (5), 1643-1648 (2005).
- Dumartin, L., et al. Netrin-1 mediates early events in pancreatic adenocarcinoma progression, acting on tumor and endothelial cells. Gastroenterology. 138 (5), 1595-1606 (2010).
- Aguirre-Ghiso, J. A., Estrada, Y., Liu, D., Ossowski, L. ERK activity as a determinant of tumor growth and dormancy: Regulation by p38. Cancer Res. 63 (7), 1684-1695 (2003).
- Baroni, T. E., et al. Ribonomic and short hairpin RNA gene silencing methods to explore functional gene programs associated with tumor growth arrest. Methods Mol Biol. 383, 227-244 (2007).
- Lopez-Rivera, E., et al. Inducible nitric oxide synthase drives mTOR pathway activation and proliferation of human melanoma by reversible nitrosylation of TSC2. Cancer Res. 74 (4), 1067-1078 (2014).
- Balke, M., et al. A short-term in vivo model for giant cell tumor of bone. BMC Cancer. 11, 241(2011).
- Balke, M., et al. Morphologic characterization of osteosarcoma growth on the chick chorioallantoic membrane. BMC Res Notes. 3, 58(2010).
- Sys, G. M. L., et al. The CAM-assay as a xenograft model for sarcoma. J Vis Exp. (77), e50522(2013).
- Li, M., et al. The Chick Chorioallantoic Membrane (CAM) assay as an efficient xenograft model of hepatocellular carcinoma. J Vis Exp. (104), e52411(2015).
- Pontel, L. B., et al. Acute lymphoblastic leukemia necessitates GSH-dependent ferroptosis defenses to overcome FSP1-epigenetic silencing. Redox Biol. 102408, (2022).
- Oriol, A., et al. Outcome after relapse of acute lymphoblastic leukemia in adult patients included in four consecutive risk-adapted trials by the PETHEMA Study Group. Haematologica. 95 (4), 589-596 (2010).
- Xin, Q., Chen, Z., Wei, W., Wu, Y. Animal models of acute lymphoblastic leukemia: Recapitulating the human disease to evaluate drug efficacy and discover therapeutic targets. Biochem Pharmacol. 198, 114970(2022).
- Gilmore, M. J., Prentice, H. G., Blacklock, H. A., Janossy, G., Hoffbrand, A. V. A technique for rapid isolation of bone marrow mononuclear cells using Ficoll-Metrizoate and the IBM 2991 blood cell processor. Br J Haematol. 50 (4), 619-626 (1982).
- Boyer, T., et al. Flow cytometry to estimate leukemia stem cells in primary acute myeloid leukemia and in patient-derived xenografts, at diagnosis and follow-up. J Vis Exp. (133), e56976(2018).
- Kang, S. M., et al. Genome-wide loss-of-function genetic screening identifies opioid receptor mu1 as a key regulator of L-asparaginase resistance in pediatric acute lymphoblastic leukemia. Oncogene. 36 (42), 5910-5913 (2017).
- Lee, J. K., et al. HAP1 loss confers L-asparaginase resistance in ALL by downregulating the calpain-1-Bid-caspase-3/12 pathway. Blood. 133 (20), 2222-2232 (2019).
- Kalina, T., et al. EuroFlow standardization of flow cytometer instrument settings and immunophenotyping protocols. Leukemia. 26 (9), 1986-2010 (2012).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
