Тест обонятельных предпочтений для измерения обонятельных гедонистических смещений в мышиных моделях депрессии

Краткое содержание

Здесь мы представляем протокол теста обонятельных предпочтений, который позволяет оценить негативные обонятельные смещения как в отношении аппетитных, так и отвратительных стимулов запаха в мышиных моделях депрессии.

Аннотация

Депрессия является крупнейшим фактором инвалидности во всем мире, ежегодно затрагивая 280 миллионов человек. Помимо снижения активности и мотивации, депрессия связана с негативным смещением валентности: пациенты находят нейтральные и положительные сенсорные стимулы менее приятными, а отрицательные — более неприятными по сравнению со здоровыми людьми. В частности, обонятельное гедонистическое смещение может представлять собой маркер состояния заболевания у пациентов и может быть легко измерено на мышиных моделях. Тем не менее, существует очень мало тестов на животных для измерения эмоциональной предвзятости трансляционным способом. Здесь мы предлагаем протокол для надежной оценки валентности запаха у контрольных и депрессивных мышей путем исследования пахучих веществ, связанных с различными гедонистическими значениями. Используя этот тест обонятельных предпочтений и несколько поведенческих показаний, мы подтверждаем отрицательное обонятельное смещение как к аппетитным, так и к аверсивным стимулам в двух различных моделях депрессии у мышей. Важно отметить, что этот метод применим как к мужским, так и к женским особям. Наконец, этот протокол позволяет проводить различные адаптации для улучшения оценки эмоциональной реакции и может быть легко комбинирован с классическими инструментами для мониторинга активности нейронов в реальном времени.

Введение

Депрессия является серьезным расстройством настроения и основной причиной инвалидности во всем мире. По данным Всемирной организации здравоохранения, примерно 280 миллионов человек, то есть 4% населения, испытывают депрессию. Он на 50% чаще встречается среди женщин, чем среди мужчин, а вспышка COVID-19 увеличила на 25% распространенность депрессивных расстройств в первый год пандемии (Всемирная организация здравоохранения, 2022). Кроме того, около трети пациентов не реагируют на классическую антидепрессивную терапию, для наблюдения антидепрессивных эффектов требуются недели, а физиопатология расстройств настроения остается в значительной степени неизвестной.

Согласно DSM-5¹, диагноз депрессии основан на нескольких симптомах, включая подавленное настроение, потерю интереса или удовольствия, значительные колебания веса, физическое и психологическое замедление, усталость, чувство никчемности, трудности с концентрацией внимания и повторяющиеся мысли о смерти. Клинические исследования также показали, что расстройства настроения сопровождаются сенсорными изменениями: пациенты с депрессией находят сенсорные стимулы менее приятными, чем участники контрольной группы ^2,3,4.

Гедонистическая «валентность» относится к степени, в которой что-либо является приятным (положительная валентность) или отвратительным (отрицательная валентность). Присвоение валентности стимулу может вызвать адаптированное поведение, включая приближение или избегание⁵. Интересно, что этот процесс очень консервативен между различными видами от насекомых до человека⁶. Таким образом, депрессия связана с негативным смещением валентности. Тем не менее, клинический диагноз пока мало опирается на оценку сенсорных предубеждений.

Среди сенсорных модальностей особенно интересна обонятельность, поскольку обонятельные входы в значительной степени обходят таламические реле и проецируются на лимбическую систему у млекопитающих, включая человека. С эволюционной точки зрения, было показано, что эта система играет решающую роль в кодировании набора первичных реакций на стимулы окружающей среды 7,8,9,10,11,12. В дополнение к этим общим нейронным цепям, клинические исследования показывают двустороннюю связь между обонянием и депрессией, при этом пациенты с депрессией испытывают обонятельные изменения, а также обонятельные расстройства, вызывающие депрессивные^{симптомы}. Кроме того, у пациентов с депрессией после приема лекарств или терапии восстанавливается обонятельная функция 14,15,16,17. Эти результаты позволяют предположить, что обонятельный дефицит может быть биомаркером состояния (статус клинических проявлений у пациентов), а не чертой (свойствами, которые играют антецедентную, возможно, причинную роль в патофизиологии психического расстройства и, таким образом, могут быть использованы для ранней, предсимптоматической диагностики)^{заболевания.} Соответственно, лучшее и более глубокое понимание того, как обонятельная модальность изменяется при депрессии, может проложить путь к новым терапевтическим инструментам для диагностики и выявления реакции на лечение.

Таким образом, оценка обонятельного гедонистического смещения в моделях депрессии представляет особый интерес как для оценки индуцированного депрессивного фенотипа, так и в качестве инструмента для исследования нейронных механизмов, стоящих за этими изменениями в распределении валентности. В предыдущих исследованиях уже использовались поведенческие подходы для оценки распределения валентности запаха у мышей. Тем не менее, эти испытания содержат несколько предостережений: они требуют сложных устройств¹⁹, которые в основном включают коробки, закрытые крышкой 19,20,21, подразумевают постоянный физический контакт с раствором запаха 20,21,22 и/или приводят к очень короткому времени исследования запаха 21,22,23 . Это делает эти анализы несовместимыми с классическими инструментами мониторинга активности нейронов в реальном времени, которые требуют более длительной выборки у привязанных мышей.

Кроме того, Malkesman et al. уже разработали тест на обнюхивание мочи самок (FUST) для мониторинга активности грызунов по поиску вознаграждения путем измерения обонятельных исследований самцов мышей, подвергшихся воздействию мочи самок мышей^. Однако этот тест оценивает поведенческую реакцию только на один конкретный положительный стимул социального характера и с коротким временем взаимодействия. Кроме того, этот тест был разработан исключительно для самцов грызунов, хотя депрессия в два раза чаще встречается среди женщин, чем среди мужчин.

Чтобы преодолеть все эти ограничения, мы разработали тест обонятельных предпочтений (OPT), адаптированный из Bigot et ^al.14, в котором как самцы, так и самки мышей могут подвергаться воздействию большого разнообразия нейтральных, положительных и отрицательных запахов с целью точной оценки гедонистической реакции в контексте депрессии. Выбор запахов может быть основан на предыдущих публикациях^14,25, но этот тест также позволяет исследовать новые социальные, пищевые, связанные с инфекциями стимулы, используя как натуральные компоненты, так и мономолекулярные или специально разработанные химические смеси.

Протокол

Все процедуры ухода за животными и эксперименты соответствовали национальным и европейским (2010/63/EU) рекомендациям и были одобрены Министерством исследований Франции (APAFiS: #16380-2018080217358599_v1; APAFIS #51636-2024101718013761_v4). Самцы и самки мышей C57BL/6JRj (модель UCMS) и самцы мышей C57BL/6NTac (модель CORT) (в возрасте 8 недель) содержались в социальном жилье (4-5 мышей в клетке) и содержались в стандартных условиях (23 ± 1 °C; влажность 40%) в течение 14-10 часов в режиме свет/темнота (свет включается в 7 часов утра) с едой и водой в неограниченном количестве.

1. Экспериментальная установка

1. Монтаж арены
   1. Подготовьте экспериментальную установку, которая состоит из двухкамерной арены (45 см × 50 см × 25 см) из стен из серого плексигласа и белого пола. Разделите два отделения (25 см × 45 см) стеной из серого плексигласа (37 см × 25 см).
   2. На дно стенки из каждой камеры поставьте перфорированную чашку Петри (60 мм × 15 мм с 7 отверстиями диаметром 5 мм).
   3. Вертикально закрепите чашки Петри на стене с помощью двустороннего клея или клея, чувствительного к давлению (например, Blu-tack).
   4. Разместите камеру на вершине арены, чтобы записывать поведение животных (на высоте 2 м над ареной) и автоматически отслеживать их движения во время эксперимента.
2. Выбор запахов
   1. Перед началом эксперимента выберите список запахов с нейтральной, положительной и отрицательной валентностью, которые будут проверяться (примеры см. в таблице 1 ).
   2. Убедитесь, что все выбранные запахи имеют одинаковое давление пара. Кроме того, оцените диффузию некоторых запахов по всей арене с помощью фотоионизационного детектора (ПИД)²⁶.
   3. Проверяйте каждый запах в отдельный день.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется планировать использование сначала нейтральных запахов, затем аппетитных, и заканчивая отвратительными запахами, чтобы свести к минимуму эффект исследования от одного дня к другому. Этот порядок сводит к минимуму эффект переноса с одного дня испытания на другой. В качестве альтернативы можно использовать случайную презентацию, но все экспериментальные группы должны быть протестированы с одной и той же последовательностью запахов.
3. Дизайн экспериментальных групп
   1. Разделите мышей как минимум на две экспериментальные группы: контрольные мыши и мыши, которые будут проходить модель депрессии. Размещайте животных из одной группы в одних и тех же клетках.
      ВНИМАНИЕ: Каждая экспериментальная группа должна содержать, по крайней мере, примерно 7-8 особей для получения статистической значимости. Клетки должны быть расположены поблизости в домике для животных, чтобы свести к минимуму клеточный эффект.
   2. Индуцировать депрессивный фенотип в соответствующих группах мышей с использованием модели выбора депрессии.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Описание протоколов для индуцирования депрессивного поведения у мышей выходит за рамки данной статьи. Тем не менее, в этом исследовании представлены эксперименты с использованием двух различных моделей (непредсказуемый хронический легкий стресс [UCMS] и кортикостерон [CORT])^27,28 в качестве репрезентативных результатов для этого теста обонятельных предпочтений. Вкратце, модель UCMS основана на воздействии различных стрессовых факторов окружающей среды на протяжении нескольких недель, в то время как модель CORT состоит из хронического введения кортикостерона, растворенного в питьевой воде мышей (около 5 мг/кг/день в зависимости от того, сколько мыши пьют).

2. Фаза привыкания

1. Общее привыкание и обращение
   1. По прибытии оставьте мышей в покое на 1 неделю без смены постельных принадлежностей. Добавьте дополнительный хлопчатобумажный материал и иглу в клетку, чтобы уменьшить стресс.
   2. Через 1 неделю осторожно обрабатывайте всех мышей ежедневно в течение 3-4 дней и приучайте их к работе с чашками, желательно в экспериментальной комнате.
2. Экспериментальные условия испытания
   1. Перенесите мышь в комнату для поведенческого тестирования за 30 минут до начала эксперимента.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В идеале поведенческая комната должна состоять из двух отдельных частей, позволяющих животным находиться в одной части, в то время как тестируемая мышь работает в другой.
   2. Обратите внимание, что в помещении поддерживаются стандартные жилищные условия (23 ± 1 °C; влажность 40%), а в помещении нет мешающего звука, освещения или запаха.
   3. С помощью люксметра настройте освещение примерно на 40 люкс на арене. Следите за тем, чтобы освещение на арене было равномерным.
3. Привыкание к арене
   1. Добавьте чистую фильтровальную бумагу (42,5 мм) в обе чашки Петри (60 мм × 15 мм).
   2. С помощью прозрачной ленты прикрепите крышку чашки Петри к ее дну (потому что она будет размещена вертикально).
   3. В первый день аккуратно поместите всех мышей из одной клетки вместе на арену на 10 минут, чтобы уменьшить неофобию.
      ВНИМАНИЕ: Всегда помещайте мышей на арену с помощью чашки, чтобы избежать стресса из-за поднятия за хвост.
   4. На следующий день введите каждую мышь по отдельности на арену, как раз между двумя отсеками, и записывайте поведение в течение 10 минут.
   5. Повторяйте 2-3 дня подряд.
4. Критерий разведки
   1. Определите две зоны (25 см 15 см), в которых были размещены чашки Петри, и измерьте время, которое каждое животное проводит в каждой зоне.
   2. Усредните эти показатели по всем отдельным шагам привыкания.
   3. Если среднее время нахождения в каждой из зон превышает 50 с, критерий выполняется. Если нет, повторите сеансы приучения до достижения критерия, либо исключите животное из анализа.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В день можно проводить не более двух сеансов привыкания (утром и днем).

3. Этап тестирования

1. Приготовление запаха
   1. В день проведения теста приготовьте запах с правильным разбавлением под химическим колпаком. Разбавьте запах в минеральном масле или дистиллированной воде, в зависимости от химической структуры. Во избежание загрязнения храните минеральное масло в отдельном проветриваемом помещении вдали от одорантов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Использование новой бутылки минерального масла рекомендуется при начале нового эксперимента.
   2. Храните раствор одоранта в стеклянном флаконе. Избегайте пластиковых трубчатых контейнеров, которые могут добавить загрязнение запахом.
   3. Непосредственно перед тестированием каждой мыши соберите 200 μL раствора запаха с помощью микропипетки с помощью фильтрующих наконечников и поместите его на фильтровальную бумагу в одну из двух чашек Петри.
   4. Оставьте другую фильтровальную бумагу во второй чашке Петри нетронутой.
   5. Перенесите чашки Петри в испытательную комнату и закрепите их вертикально на стене арены.
      ВНИМАНИЕ: Не готовьте и не выбрасывайте растворы одорантов в экспериментальной комнате, чтобы избежать загрязнения запахом. Регулярно меняйте перчатки во время эксперимента. Если есть подозрение, что перчатки могут быть загрязнены во время манипуляций с запахом, смените их, прежде чем брать мышей для тестирования.
2. Поведенческий тест
   1. Поместите каждую мышь по отдельности на арену, как раз между двумя отделениями.
   2. Запись за 10 мин.
   3. Уберите мышь с арены.
   4. Уберите запах из чашки Петри.
   5. Очистите арену дезинфицирующим раствором (например, этанолом 70%) и высушите ее.
   6. Выбросьте фильтровальную бумагу и повторите подготовку запаха для следующей мыши.
   7. В идеале проверяйте только один запах в день. Сначала используйте нейтральные запахи, затем положительные запахи и, наконец, отрицательные запахи (см. рисунок 1).
      ВНИМАНИЕ: Проводите этапы привыкания и тестирования примерно в одно и то же время дня в течение всего дня эксперимента (в идеале с 9 утра до 3 часов дня). Если количество животных требует более длительного периода времени, будьте внимательны и тестируйте различные экспериментальные группы поочередно, чтобы избежать смещения дневного времени. Если самцы и самки должны быть протестированы в одном и том же эксперименте, отдайте предпочтение тестированию одного пола за другим.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте чистые чашки Петри каждый день после теста, чтобы избежать загрязнения запахом. Следует отметить, что перфорированные чашки Петри можно повторно использовать в течение нескольких экспериментов после надлежащей очистки и обеззараживания запахов.

4. Анализ данных

1. Отслеживание поведения
   1. Используйте программу автоматического слежения, чтобы записывать положение мыши во время тестов.
   2. Определите отдельные зоны на арене для анализа (см. рисунок 1):
      1. Определите «зону запаха» (25 см × 15 см), область, где помещается чашка Петри с фильтровальной бумагой, пропитанной запахом (т. е. область, ближайшая к запаху, составляющая примерно одну треть поверхности отсека).
      2. Определите «зону контроля» (25 см × 15 см), симметричную «зоне запаха», но без добавления запаха в чашку Петри.
      3. Определите «зону за запахом» (25 см × 30 см), т. е. остальная часть отсека — это место, где размещается чашка Петри с запахом.
      4. Определите «зону за контролем» (25 см × 30 см), симметричную «зоне за контролем», состоящую из остальной части отсека без запаха.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Отслеживание центральной точки тела мыши достаточно для анализа обонятельных предпочтений животного. Тем не менее, отслеживание носа каждой мыши может более точно проиллюстрировать обонятельное исследование животным.
2. Показания гедонистической реакции
   1. Используя автоматическое отслеживание, соберите следующую информацию для каждой мыши и каждого дня теста, включая шаги привыкания:
      1. Запишите общее расстояние, пройденное на арене (м).
      2. Записывайте время, проведенное в каждой зоне арены.
      3. Записывайте количество входов в каждую зону арены.
   2. Используйте общее пройденное расстояние для оценки основных локомоторных эффектов.
   3. Чтобы оценить различия в обонятельных предпочтениях по отношению к различным запахам, используйте основные показания:
      1. Используйте время, проведенное в зоне запаха.
      2. Используйте количество входов в зону запаха.
      3. Используйте индекс предпочтений, рассчитываемый как время, проведенное в зоне запаха, нормированное к времени, проведенному в этой зоне во время привыкания (нормализация проводится на мышах из всех групп). Среднее относится к среднему арифметическому времени, проведенному в зоне запаха, а sd — к его стандартному отклонению.
         
      4. Используйте индекс исследования запаха, рассчитанный как среднее арифметическое нормализованных значений пройденного расстояния, времени, проведенного в зоне запаха, и количества входов в зону запаха, как показано ниже:
         
         
         ПРИМЕЧАНИЕ: Этот индекс предпочтений может быть адаптирован при необходимости, например, путем сравнения времени, проведенного в зоне запаха, с контрольной зоной. Если группы демонстрируют значительные различия в исследовании «зоны запаха» во время привыкания, нормализация может быть выполнена только в отношении контрольной группы, а не всех групп вместе взятых.
   4. Визуально представьте эти показания для мышей контрольной группы и мышей с депрессией в виде среднего ± стандартной погрешности среднего (SEM).
   5. Используйте двухфакторный дисперсионный анализ повторных измерений (ANOVA) с последующими апостериорными тестами (в данном случае нескорректированный критерий наименьшей значимой разницы Фишера) для учета как экспериментальных групп, так и запахов (фактор повторного измерения) и факторов влияния взаимодействия. Фактор взаимодействия показывает, согласуются ли различия между группами для всех представленных запахов.
   6. Проверьте нормальность и гомоскедастичность с помощью адаптированных тестов (тест Шапиро-Уилка, тест Бартлетта). Статистическая значимость была установлена на уровне *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001.

Результаты

Чтобы убедиться в том, что мыши, похожие на депрессию, демонстрируют отрицательное обонятельное смещение^14,29 и что оно может быть надежно измерено с помощью протокола теста обонятельных предпочтений, который мы описываем здесь, мы оценили гедонистическую реакцию на различные запахи в двух различных мышиных моделях депрессии.

Во-первых, мы использовали мышиную модель непредсказуемого хронического легкого стресса (UCMS) продолжительностью 4 недели, адаптированную из²⁸ (подробный протокол см. в дополнительном файле 1), чтобы вызвать депрессивный фенотип у молодых самок мышей C57BL/6JRj (рис. 2A, B). Эти самки мышей были протестированы в тесте обонятельных предпочтений с мочой самцов мышей (MU, чистая) в качестве аппетитного запаха и 2,4,5-триметилтиазолом (TMT, 5% в минеральном масле) в качестве отвратительного запаха. В среднем, каждая мышь проводила не менее 50 с в зоне «контроля» и «запаха» во время привыкания, выполняя критерий (рис. 2В). Тем не менее, благодаря привыканию, мыши UCMS проводили значительно больше времени в «контрольной зоне» по сравнению с контрольной группой, но поскольку нет существенной разницы в отношении зоны, где будет добавлен запах, эту разницу можно игнорировать. Что касается расстояния, контрольные мыши двигались значительно больше, чем UCMS, при воздействии MU, но не во время привыкания или в присутствии TMT (рис. 2D). Наконец, все показания гедонистической реакции (время, проведенное в зоне запаха, количество входов в зону запаха и индекс предпочтения) показывают значительные различия или статистическую тенденцию между самками контрольной группы и женщинами UCMS (рис. 2E-G). Этот эффект также виден с помощью глобального индекса исследования запахов, который представляет собой комбинированный показатель гедонистической и локомоторной реакции (рисунок 2H). Таким образом, каждое считывание последовательно демонстрирует негативное гедонистическое смещение в ответ как на аппетитные, так и на аверсивные обонятельные стимулы. Интересно, что оценка эмоциональности, которая рассчитывается как нормализованное значение тревожного и депрессивного фенотипа на основе большой батареи поведенческих тестов¹⁴, положительно коррелирует с индексом исследования запаха как MU, так и TMT (рисунок 2I), показывая связь между поведенческой реакцией на положительные и негативные запахи и тревожным и депрессивным фенотипом.

Во-вторых, на этот раз мы использовали тот же протокол UCMS для индуцирования депрессивного фенотипа у самцов мышей. Во время теста обонятельных предпочтений эти мыши подвергались воздействию мочи самок мышей (FU, чистая), которая вызывает аппетит, и TMT, как и раньше, в виде отрицательного запаха (рис. 3A, B). Нет никакой разницы во времени, проведенном в четырех зонах во время привыкания, а также в расстоянии, пройденном в ходе теста (рис. 3C, D). Время, проведенное в зоне запаха, показывает значительное снижение исследования FU и TMT в UCMS по сравнению с контрольной группой (рис. 3E). Кроме того, мыши UCMS значительно меньше проникают в зону запаха или имеют тенденцию к этому, и демонстрируют значительно меньший индекс предпочтения как для FU, так и для TMT (рис. 3F, G), что подтверждает отрицательное обонятельное смещение в депрессивном состоянии. Аналогичным образом, индекс исследования запаха показывает отрицательно смещенную поведенческую реакцию на FU и TMT у мышей UCMS по сравнению с контрольной группой (рисунок 3H), которая, как правило, положительно коррелирует с оценкой эмоциональности животных (рисунок 3I).

В третьем эксперименте мы прибегли к другой модели депрессии, которая основана на хроническом введении кортикостерона (CORT) в питьевую воду самцов мышей C57BL/6NTac, в то время как контрольные мыши получали только раствор носителя (Veh) (10% 2-гидроксипропилбета-циклодекстрина) ²⁷. После четырех недель лечения CORT или Veh мышей приучали в течение четырех дней, а затем подвергали воздействию нейтрального запаха (ОКТ: 2-трансоктенальный, 1% в воде), положительного запаха (ПО: арахисовое масло) и отрицательного запаха (ТМТ: 2,4,5-триметилтиазол, 5% в минеральном масле) (рис. 4A, B). Благодаря привыканию не было выявлено различий между Ве и КОРТ (рис. 4В). Тем не менее, обе группы значительно больше времени проводили в «зоне запаха» по сравнению с «контрольной зоной». Нет никаких различий в отношении расстояния перемещения, за исключением положительного запаха (PO), из-за которого мыши Veh двигались больше, чем CORT (рисунок 4D). Важно отметить, что, как и у мышей UCMS, время, проведенное в зоне запаха, было значительно сокращено у мышей CORT при воздействии нейтрального и аппетитного запаха (рис. 4E). Снижение интенсивности запаха также проявляется в значительном уменьшении или тенденции к меньшему количеству входов в зону запаха (рисунок 4F). В этом случае различия между группами выявляются в зависимости от анализируемых показаний, вероятно, из-за ограничений, связанных с количеством используемых животных, а также потенциального эффекта пола, вызванного малым временем исследования, наблюдаемым после экспозиции TMT. В целом, индекс предпочтения значительно ниже у мышей CORT для всех стимулов запаха по сравнению с Veh (Рисунок 4H). Наконец, индекс исследования запахов для всех запахов в значительной степени коррелирует с оценкой эмоциональности животных (рисунок 4I), что еще раз демонстрирует, что этот тест обонятельных предпочтений является подходящим инструментом для оценки негативной эмоциональной предвзятости в нескольких моделях депрессии у мышей.

Наконец, мы можем исключить возможность того, что наблюдаемые различия могут быть вызваны снижением двигательной активности, а не эмоциональными искажениями. Действительно, локомоция не различается между группами во время привыкания при оценке общего расстояния перемещения (Рисунок 2D, Рисунок 3D, Рисунок 4D). Кроме того, согласно статистическому анализу, общее снижение вовлеченности в задачу или эффект новизны также не могут объяснить эти смещения. Фактически, мы обнаружили значительное влияние фактора запаха при анализе индекса предпочтений, при этом не было значимого взаимодействия между экспериментальными группами и запахами. Эти результаты демонстрируют, что мыши, похожие на депрессивные, действительно выполняют эту задачу, и что их сниженное исследование специфично для каждого обонятельного сигнала.

Рисунок 1: Общая схема временной шкалы и настройки теста обонятельных предпочтений. Мышей сначала приучают к арене. В первый день привыкания мышей из одной клетки помещают вместе, чтобы уменьшить неофобию. На следующий день их по отдельности размещают на арене. После привыкания в одну из камер добавляется запах. Сначала преимущественно проверяются нейтральные запахи, затем положительные запахи и, наконец, отрицательные запахи. Для анализа арену можно разделить на четыре разные зоны. Создано с помощью Biorender. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 2: Отрицательное обонятельное смещение в модели депрессии у самок UCMS у мышей. (А,Б) Хронология и экспериментальные группы исследования: Контрольная и UCMS (непредсказуемый хронический легкий стресс) самки мышей тестируются в тесте на обонятельные предпочтения с положительным (MU: моча самцов мыши, чистая) и отрицательным запахом (TMT: 2,4,5-триметилтиазол, 5% в минеральном масле). Создано с помощью Biorender. (C) мыши UCMS проводили в среднем значительно больше времени в «контрольной зоне» и меньше времени в «зоне за запахом» по сравнению с контрольной группой во время привыкания (группа: F(1, 12) = 74,03, p < 0,0001; Зона: F(2.434, 29.21) = 7.688, p = 0.0012; Взаимодействие: F(3, 36) = 5,148, p = 0,0046). (D) Общее расстояние, пройденное в значительном размере, уменьшилось при воздействии UCMS при воздействии MU, но не для Habituation (Hab) и TMT (Группа: F(1, 12) = 4,664, p = 0,0518; Запах: F(1.871, 22.45) = 4.846, p = 0.0195; Взаимодействие: F(2, 24) = 4,797, p = 0,0177). (E) Мыши UCMS потратили значительно меньше времени на изучение MU и TMT (Группа: F(1, 12) = 24,39, p = 0,0003; Запах: F(1, 12) = 59,69, p < 0,0001; Взаимодействие: F(1, 12) = 2,267, p = 0,1580). (F) мыши UCMS входили меньше зоны запаха или имели тенденцию к (Группа: F(1, 12) = 9,279, p = 0,0102; Запах: F(1, 12) = 5,100, p = 0,0433; Взаимодействие: F(1, 12) = 1,649, p = 0,2233). (G) Индекс предпочтения для MU и TMT значительно снижен у мышей UCMS (группа: F(1, 12) = 24,39, p = 0,0003; Запах: F(1, 12) = 59,69, p < 0,0001; Взаимодействие: F(1, 12) = 2,267, p = 0,1580). (H) Индекс исследования запаха для MU и TMT значительно снижен у мышей UCMS (F(1, 12) = 14,71, p = 0,0024; Запах: F(1, 12) = 0, p > 0,9999; Взаимодействие: F(1, 12) = 0,02630, p = 0,8739). (I) Индекс исследования запаха для MU и TMT положительно коррелирует с оценкой эмоциональности животных (MU: Pearson R² = 0,4837, F(1,12) = 11,24, **p = 0,0058; TMT: Pearson R² = 0,5340, F(1,12) = 13,75, **p = 0,0030). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 3: Отрицательное обонятельное смещение в модели депрессии у самцов мышей UCMS. (А,Б) Хронология и экспериментальные группы исследования: Контрольные мыши и самцы UCMS тестируются в тесте обонятельных предпочтений с положительным (FU: моча самок мыши, чистая) и отрицательным запахом (TMT: 2,4,5-триметилтиазол, 5% в минеральном масле). Создано с помощью Biorender. (C) Нет различий в среднем во времени, проведенном в разных зонах арены по привычке (Группа: F(1, 13) = 3,921, p = 0,0693; Зонер = F(1,688, 21,94) = 34,57, p < 0,0001; Взаимодействие: F(3, 39) = 0,7385, p = 0,5355). (D) Нет различий в общем расстоянии, перемещаемом между органами управления и UCMS (группа: F(1, 13) = 2,313, p = 0,1522; Запах: F(1.722, 22.38) = 1.746, p = 0.1998; Взаимодействие: F(2, 26) = 0,8806, p = 0,4266). (E) Время, затрачиваемое на изучение зоны запаха с помощью FU и TMT, значительно сокращается у мышей UCMS (Группа: F(1, 13) = 6,808, p = 0,0216; Запах: F(1, 13) = 16,21, p = 0,0014; Взаимодействие: F(1, 13) = 0,3304, p = 0,5753). (F) мыши UCMS входили в значительно меньшую зону запаха для ТМТ и имели тенденцию к FU (Группа: F(1, 13) = 6,572, p = 0,0236; Запах: F(1, 13) = 3,784, p = 0,0737; Взаимодействие: F(1, 13) = 0,2145, p = 0,6509). (G) Индекс предпочтения мышей UCMS значительно снижен для FU и TMT (группа: F(1,13 ) = 6,808, p = 0,0216; Запах: F(1, 13) = 16,21, p = 0,0014; Взаимодействие: F(1, 13) = 0,3304, p = 0,5753); (H) Индекс исследования запаха UCMS значительно снижен для обоих запахов (группа: F(1, 13) = 12,42, p = 0,0037; Запах: F(1, 13) = 0,002580, p = 0,9603; Взаимодействие: F(1, 13) = 0,5804, p = 0,4598). (I) Индекс исследования запаха для FU и TMT имеет тенденцию положительно коррелировать с оценкой эмоциональности животных (FU: Pearson R² = 0,2573, F(1, 13) = 4,504, p = 0,0536; TMT: Pearson R² = 0,2266, F(1, 13) = 3,809, p = 0,0729). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 4: Отрицательное обонятельное смещение в модели депрессии у самцов CORT. (A,B) Временная шкала и экспериментальные группы исследования: Самцы мышей Veh и CORT тестировались в тесте обонятельных предпочтений с нейтральным (ОКТ: транс-2-октенальный, 1% в воде), положительным (ПО: арахисовое масло, чистое) и негативным запахом (ТМТ: 2,4,5-триметилтиазол, 5% в минеральном масле). Мышам Veh и CORT вводили раствор Vehicle и Vehicle + Corticosterone соответственно в течение всего эксперимента. Создано с помощью Biorender. (C) Среднее время нахождения в различных зонах арены во время привыкания (Группа: F(1, 10) = 0,07588, p = 0,7886; Зона: F(2.224, 22.24) = 6.939, p = 0.0036; Взаимодействие: F(3, 30) = 0,7033, p = 0,5575). (D) Общее расстояние, пройденное во время теста на привыкание (Hab) и различные запахи (группа: F(1, 10) = 4,193, p = 0,0678; Запах: F(3, 30) = 11,80, p < 0,0001; Взаимодействие: F(3, 30) = 1,489, p = 0,2375). (E) мыши CORT проводят меньше времени в зоне запаха, чем Veh для OCT и PO (группа: F(1, 10) = 5,094, p = 0,0476; Запах: F(2, 20) = 28,87, p < 0,0001; Взаимодействие: F(2, 20) = 3,841, p = 0,0388). (F) мыши с CORT меньше проникают в зону запаха или имеют тенденцию к ней по сравнению с Veh (Группа: F(1, 10) = 6,832, p = 0,0259; Запах: F(2, 20) = 2,738, p = 0,0889; Взаимодействие: F(2, 20) = 0,2902, p = 0,7512). (G) CORT qmice показывает более низкий индекс предпочтения для ОКТ и ПО (группа: F(1, 10) = 5,895, p = 0,0356; Запах: F(2, 20) = 20,83, p < 0,0001; Взаимодействие: F(2, 20) = 1,437, p = 0,2611). (H) Индекс исследования запаха значительно снижен у мышей UCMS для всех запахов (группа: F(1, 10) = 12,35, p = 0,0056; Запах: F(2, 20) = 0,04381, p = 0,9572; Взаимодействие: F(2, 20) = 0,3622, p = 0,7006). (I) Индекс исследования запаха для каждого запаха положительно коррелирует с оценкой эмоциональности животных (OCT: Pearson R² = 0,5601, F(1, 10) = 12,73, **p = 0,0051; PO: Pearson R² = 0,4495, F(1, 10) = 8,165, *p = 0,0170; TMT: Pearson R² = 0,5061, F(1, 10) = 10,25, **p = 0,0095). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Имя	Сокращение	Разбавление	Валентность
2,4,5-Триметилтиазол	ТМТ	5% в минеральном масле	Отрицательная
2-трансоктенальный	Центр развертывания office	1% в воде	Нейтральный
Моча самки мыши	ФУ	Чистый	Положительная
Моча самцов мышей	МЮ	Чистый	Положительная
Арахисовое масло	Заказ на поставку	Чистый	Положительная

Таблица 1: Примеры запахов с нейтральной, положительной и отрицательной валентностью.

Дополнительный файл 1: Протокол для 4-недельного непредсказуемого хронического легкого стресса. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Обсуждение

Негативная эмоциональная предвзятость является основной характеристикой депрессивных расстройств и представляет особый интерес для лучшего понимания физиопатологии заболевания. Таким образом, крайне важно включить оценку сенсорных смещений в доклинические модели для улучшения характеристики депрессивного фенотипа, а также для исследования биологических механизмов, лежащих в основе эмоциональной обработки и ее изменений в патологических состояниях. Более того, обоняние — это чувство выбора для изучения эмоциональных предубеждений. С точки зрения трансляции, этологически актуально оценивать процессы обработки эмоций как у мышей, так и у людей. Кроме того, обонятельная и эмоциональная системы тесно переплетены и имеют общие нейронные структуры на протяжении всей эволюции. Существует сильная обратная связь между нарушением обоняния и депрессией^{, что} делает обоняние многообещающим и мощным инструментом для использования в диагностике и реагировании на лечение, а также в фундаментальных исследованиях.

В этой статье мы разработали протокол теста обонятельных предпочтений для оценки обонятельных эмоциональных предубеждений в двух мышиных моделях депрессии. Важно отметить, что этот метод позволяет оценить реакцию на большое разнообразие стимулов с переменной валентностью, как положительных, так и отрицательных, а также нейтральных стимулов, значение которых может быть изменено в патологических условиях. Эти более поздние стимулы не являются обязательными для валидности теста, но они могут привнести в эксперимент интересную дополнительную информацию. Этот тест также позволяет оценить масштабируемость реакции с использованием различных концентраций запаха. Оценка реакции на стимулы с различными гедонистическими значениями и отделение позитивной эмоциональной обработки от негативной в контексте депрессии имеет решающее значение. Действительно, доклинические результаты указывают на то, что лечение антидепрессантами не может равномерно восстанавливать одинаково положительный и отрицательный обонятельный^{процесс}. Спонтанное исследование врожденно заметных аппетитных или аверсивных обонятельных стимулов также предотвращает искажающие факторы когнитивного или мотивационного дефицита, связанного с депрессивными состояниями ^30,31. Поэтому данный протокол не требует длительных этапов обучения, что имеет технические преимущества. Важно отметить, что обе модели, использованные в этом исследовании, основаны на вмешательствах, проведенных во взрослом возрасте, поэтому потребуются дальнейшие эксперименты, чтобы оценить, является ли этот протокол также чувствительным к оценке других факторов риска депрессии, включая неблагоприятные условия в раннем возрасте.

Важно отметить, что этот протокол применим как к мужчинам, так и к женщинам, что имеет решающее значение, поскольку женщины в два раза чаще страдают от депрессии, чем мужчины. Тем не менее, у мужчин, вероятно, не диагностируется депрессия из-за социальных ожиданий, стыда или стигмы, как описано в Shi et ^al.32. Тем не менее, депрессия, по-видимому, различается между мужчинами и женщинами с точки зрения симптоматики (клинические проявления), этиологии (биологические причины) и ^{предиктивности лечения, однако} многие модели и тесты депрессии по-прежнему в первую очередь предназначены только для мужчин. Например, стандартный женский тест на нюхание мочи²⁴ использует аналогичный протокол, но полагается на уникальный сигнал социального запаха. Несмотря на то, что этот тест очень информативен, он имеет короткое время исследования (30 с в контрольной группе) и в основном адаптирован к самцам мышей, поскольку моча самок не имеет одинакового этологического и гедонистического значения для обоих полов. Наконец, по-видимому, обонятельная гедонистическая реакция чувствительна к лечению антидепрессантами¹⁴, что делает наш тест предпочтительным инструментом для надежной характеристики депрессивных состояний, заменяя другие спорные анализы, такие как тест на форсированное плавание 36,37,38.

Важно отметить, что результат теста заключается в более длительном времени исследования стимула (100-200 с) по сравнению с ранее описанными тестами 21,22,23. Увеличение продолжительности исследования особенно важно, когда этот тест сочетается с методами мониторинга активности нейронов в реальном времени, например. Кроме того, этот тест не требует лишения пищи/воды, что позволяет избежать метаболических искажающих факторов. Наконец, этот тест может быть выполнен в течение светового периода, уменьшая экспериментальные ограничения (обратный цикл, инфракрасные записи).

Однако для успешного выполнения этого протокола критически важны некоторые технические шаги. Во-первых, важно, чтобы эксперименты проводились в очень контролируемой и нестрессовой среде: освещение должно быть однородным и не слишком ярким, а в комнате не должно быть мешающих звуков или запахов. Мышей можно тестировать на арене один раз в день, причем тест нужно проводить примерно в одно и то же время каждый день. Кроме того, при проведении этих экспериментов рекомендуется использовать уникального экспериментатора для снижения стресса животных.

Во-вторых, необходимо обеспечить достаточное изучение арены в течение дней привыкания. Если мышь проводит в среднем менее 50 с в любой из зон, где расположены чашки Петри во время привыкания, можно добавить один или два дополнительных дня привыкания до тестирования запахов. Если мышь все еще недостаточно долго исследует арену, ее следует исключить из анализа. В случае первоначального диссимметричного исследования «зоны запаха» во время привыкания между экспериментальными группами расчет индекса предпочтений может быть адаптирован для коррекции дифференциальных спонтанных смещений предпочтений, например, путем нормализации по времени, затраченному во время привыкания по отношению к каждой группе, или даже по отношению к их собственному исследованию во время привыкания. Действительно, еще одной сложностью может быть высокая вариабельность среди экспериментальных групп. Если проблема возникает, чтобы ограничить внутрииндивидуальную изменчивость, мышей можно тестировать два дня подряд с одним и тем же запахом. Затем результаты могут быть усреднены за два дня. Важно отметить, что последовательное тестирование обонятельной реакции не должно существенно влиять на исследовательское поведение¹⁴.

Что касается приготовления запаха, растворы должны быть приготовлены в помещении, отличном от помещения для тестирования, и экспериментаторы должны знать, что раствор не распространяется чрезмерно в поведенческой комнате. Наконец, растворы желательно готовить незадолго до испытания и хранить в стеклянном флаконе без запаха, чтобы запах не исчезал и не был загрязнен. Для некоторых запахов, таких как моча самцов и самок мышей, которые предположительно очень аппетитны, если контрольные мыши не показывают исследовательских показаний, связанных с высокой положительной валентностью, раствор следует проверить. В частности, мышиная моча должна быть свежесобрана у молодых мышей (не старше 5 месяцев) незадолго до тестирования (максимум за 2-3 дня) и храниться при температуре 4 °C для сохранения обонятельных свойств. Следует отметить, что сбор в течение нескольких дней подряд должен предотвратить эффекты из-за стадий эстрального цикла у самок мышей. При необходимости мочу можно хранить при температуре -20 °C для более длительного хранения, хотя эта процедура не рекомендуется, так как она заметно снижает интенсивность запаха. Точно так же воспринимаемая приятность арахисового масла также может варьироваться, например, в зависимости от партии или бренда. Важно отметить, что два различных запаха или запаха с разной концентрацией могут быть добавлены в отсеки вместо «контрольной зоны» без запаха, чтобы измерить предпочтение между двумя растворами одоранта.

Наконец, тест на обонятельные предпочтения может быть адаптирован различными способами для улучшения его дизайна и расширения его потенциальных применений. Действительно, помимо моторного считывания, оценка эмоциональной реакции с помощью этого теста может быть улучшена путем комбинации различных методов измерения различных компонентов^{эмоций.} Например, рядом с ареной может быть размещен ультразвуковой микрофон для записи ультразвуковых вокализаций, которые могут издаваться в ответ на определенные положительные и отрицательные стимулы^24,39. Температуру тела также можно контролировать с помощью инфракрасной камеры или имплантируемого телеметрического передатчика 40,41,42 в реальном времени. Некоторые из этих передатчиков даже способны получать данные о частоте сердечных сокращений и дыхания 43,44,45. Сочетание этих инструментов помогло бы построить более точную поведенческую оценку эмоциональной реакции. Тест обонятельных предпочтений также может быть легко сочетан с другими методами для дальнейшего выяснения нейронных механизмов, лежащих в основе эмоциональной дисрегуляции, такими как оптогенетика, волоконная фотометрия или мини-скопическая визуализация в реальном времени или записи электрофизиологии in vivo. Наконец, этот протокол может быть легко перенесен в клинику путем интеграции оценки сенсорных искажений и гедонистической обонятельной реакции в исследования на людях и даже в качестве инструмента диагностики или реагирования на лечение.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
2,4,5-Триметилтиазол	Сигма-Олдрич	W332518-100Г-К
2-трансоктенальный	Сигма-Олдрич	52464-1МЛ
Блю-такт	UHU	Н/Д
Фильтровальная бумага	Научный центр Фишера	11710125	42,5 мм
Стеклянный флакон	ДЮТШЕР ДОМИНИК	958983
Нефтепродукт	Сигма-Олдрич	М5904-500МЛ
Нолдус Этовидение	Нолдус Этовидение	Версия 17.5	В качестве альтернативы можно использовать Single Mouse Tracker в программном обеспечении ICY с открытым исходным кодом или Deeplabcut
Чашка Петри	Сокол	351007	Чашка Петри 60 мм x 15 мм с 7 отверстиями, изготовленными по индивидуальному заказу, диаметром 5 мм
Арена из плексигласа	Изготовление на заказ	Н/Д	Арена из оргстекла размером 45 см x 50 см x 25 см разделена на две камеры стеной размером 37 см x 25 см посередине.