Генерация свободно плавающих нормальных сфероидальных культур эпителиальных фибробластов человека

Краткое содержание

Здесь мы представляем простой и очень практичный, но надежный протокол для прямого сфероидального совместного культивирования эпителиальных клеток легких человека и фибробластов без использования матрицы.

Аннотация

Трехмерные (3D) системы культивирования становятся все более популярными благодаря их способности воспроизводить естественные свойства и архитектуру клеток, имитируя таким образом тканевые структуры in vitro. Среди этих моделей культура сферических клеточных агрегатов (так называемых сфероидов), встроенных в полутвердый внеклеточный матрикс (ВКМ), представляет собой передовую модель клеточной культуры, близкую к vivo , поскольку она позволяет получать различные функциональные состояния клеток в результате межклеточных взаимодействий и взаимодействий между клетками и между клетками и ВКМ, а также градиентов кислорода и питательных веществ. Поскольку сфероиды технически менее требовательны и относительно недороги в получении, они часто используются для скрининга лекарств и тестирования на токсичность, что позволяет проводить скрининг с высоким содержанием для тестирования новых лекарств на доклинической стадии. С этой целью преимущественно воссоздаются 3D-структуры различных опухолей. В то же время, Matrigel в настоящее время является одним из наиболее широко используемых ЭБМ и считается золотым стандартом в выращивании сфероидов и органоидов, хотя это 3D-матрица, основанная на экспериментах на мышах, извлечение которой, как и испытания на животных в целом, связано с серьезными этическими проблемами. В данной работе мы представляем безматричный протокол для прямого сфероидального совместного культивирования эпителиальных клеток бронхов человека и фибробластов, который можно рассматривать как оптимизированный метод совместного культивирования, особенно в отношении коммуникации эпителиальных фибробластов и взаимодействий внутри соответствующих сфероидов, не полагаясь на матрицу-переносчик (животного происхождения). Путем создания этих свободно плавающих эпителиально-фибробластоидных сфероидных сокультур в качестве ориентированной на пациента платформы in vitro для моделирования токсичности нормальных (легочных) тканей терапевтических подходов к лечению рака, можно добиться не только сокращения числа экспериментальных животных, но и адекватной и значимой замены соответствующих экспериментов на животных.

Введение

Двумерные (2D) клеточные культуры, в которых плоские монослойные клетки культивируются, расширяются, а затем покрываются для исследовательских анализов на основе клеток, остаются простым, удобным, экономичным и широко используемым методом для ^{стандартных процедур} доклинического скрининга^. Для изучения интерактивных (паракринных) перекрестных помех между различными типами клеток in vitro может быть использована кондиционированная среда из одного типа клеток для стимуляции другого типа клеток. Кроме того, появились различные методы совместного культивирования, например, непрямые методы, когда совместно культивируемые клетки физически разделяются с помощью микропористой мембраны. Эти «системы Transwell» включают в себя вставку (микропористую мембрану), которая помещается в традиционную 2D-пластину для культивирования клеток. Затем один тип клеток засевают и выращивают на мембране, используя ту же среду, что и другой тип, растущий на лунке-компаньоне, тем самым обеспечивая двунаправленную паракринную^{коммуникацию.} Эти два типа клеток могут быть даже засеменены с двух сторон мембраны, образуя более прямую контактную культуру от клетки к клетке, которая подходит для исследования тканей с барьерной структурой ^3,4.

Однако клеточные реакции этих даже усовершенствованных систем двумерных клеточных культур не всегда отражают результаты соответствующих экспериментов на животных и даже клинических исследований, что обусловлено, в том числе, отсутствием прямой передачи сигналов между различными типами клеток и, следовательно, отсутствием клеточных организаций in vivo. Таким образом, трехмерные (3D) системы культивирования становятся все более популярными из-за возможностей естественных клеточных характеристик и архитектуры, имитирующих тканевые структуры in vitro ^5,6. Среди этих моделей культура сферических клеточных агрегатов, называемых сфероидами, встроенных в полутвердые внеклеточные матрицы, обеспечивает более совершенную модель совместного культивирования клеток, в которой могут^{быть достигнуты} различные функциональные состояния клеток после межклеточных взаимодействий и взаимодействий между клетками и клетки с ВКМ, а также градиентов кислорода и питания. Эти желательные более сложные in vivo культуры in vitro должны быть созданы и поддерживаться однородными по размерам клеточных сборок, способствуя при этом развитию и дифференцировке клеток, оставаясь при этом эффективными, быстрыми, последовательными^{и удобными}.

Используя естественные характеристики самоагрегации и адгезии, сфероиды (в основном опухолевые сфероиды) обычно генерируются с помощью техники висячих капель ^9,10. Будучи одним из первых методов, использованных для создания эмбриональных тел, анализ висячих капель стал широко используемым методом для получения многочисленных однородных сфероидов, основанных на принципах гравитации и поверхностного натяжения перед встраиванием ЭКМ с использованием Матригеля, «золотого стандарта» внеклеточных матриц, хотя и основанных на мышах. Значительные усилия были предприняты для получения сфероидов в бескаркасных подходах ^8,11. Например, сфероиды могут быть получены с помощью бутылки для клеточных культур с мешалкой, тем самым предотвращая посев клеток, что является самым простым методом получения сфероидов в^{больших масштабах}.

Самым сложным в комплексообразовании клеточных культур и, таким образом, в создании физиологически ценной системы, как в лабораторных условиях, подобных in vivo , являются сложные протоколы с множеством различных этапов (которые еще предстоит разработать). Например, сначала создание клеточных структур с помощью метода, их сбор, а затем встраивание в матрицу, особенно использование матриц, с которыми нелегко работать, являются критическими шагами, которые требуют большей убедительности, прежде чем метод можно будет использовать регулярно и серийно. Здесь мы использовали планшет со сверхнизким уровнем прикрепления в формате 96 лунок, который практически не позволяет прикреплять клетки к культуре для создания сложных 3D-сфероидов эпителиальных клеток легких и фибробластов. Полученные сфероиды формируются высокоравномерно и довольно быстро в течение 24 часов, что сокращает сроки эксперимента. Длительное культивирование и, таким образом, надежный рост и дифференцировка клеток осуществляются в одной и той же лунке в течение всего периода, так что после первоначального покрытия в течение всего периода культивирования необходимо заменять только среду. Таким образом, мы представляем очень простой, быстрый и, следовательно, очень практичный протокол для создания сфероидов легких человека, которые морфологически и функционально реплицируют эпителий дыхательных путей на уровне, близком к физиологическому. Еще одним преимуществом является то, что этот протокол можно легко адаптировать к другим клеткам.

Протокол

Все этапы выполняются в стерильных условиях (шкаф биобезопасности). Композиции сред, использованные в данном исследовании, приведены в таблице 1.

1. Подготовка экспериментального материала

1. Культивирование и размножение нормальных эпителиальных клеток легких человека (HBEC3-KT) на стандартных пластиковых чашках для культивирования клеток (колбах T75) в питательной среде для нормального эпителия с использованием стандартного инкубатора¹³ (см. таблицу 1).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для улучшения роста среду можно дополнительно дополнить 10% фетальной сывороткой теленка (FCS).
2. Культивирование фибробластов человека (HS-5) в среде RPMI с добавлением 10% эмбриональной сыворотки теленка и пенициллина/стрептомицина^10,14 (см. табл. 1).
3. Приготовьте разветвленную органоидную среду легких (BLO-Medium), добавив в DMEM/F12 N-2, B27, пенициллин-стрептомицин, бычий сывороточный альбумин, монотиоглицерин, аскорбиновую кислоту, KGF/FGF7, FGF10, ATRA и CHIR99021. (см. Таблицу 1 и Таблицу материалов).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется готовить среду свежей, по крайней мере, с добавлением KGF/FGF7, FGF10, ATRA и CHIR99021. Если в течение короткого периода времени требуется больше среды, рекомендуется только короткий период хранения в несколько дней (до 1 недели) при температуре 4 °C. В качестве альтернативы можно использовать коммерчески доступную среду для дифференцировки органоидов дыхательных путей PneumaCult.

2. Препарирование эпителиальных клеток и фибробластов

ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте оба типа клеток, когда конфлюенция клеток достигает около 80%. Подготовьте каждый тип клеток отдельно.

1. Удалите и выбросьте питательную среду.
2. Промойте ячейки, кратковременно промыв слой клеток 5 мл PBS.
3. Трипсинизируют эпителиальные клетки путем добавления 2 мл 0,5% трипсина-ЭДТА, после чего проводят короткую инкубацию при 37 °C в течение 4-8 минут.
4. Соберите округлые и почти отделившиеся клетки путем добавления обычной питательной среды или PBS с добавлением 10% FCS с помощью серологической пипетки объемом 5 мл.
5. Переведите соответствующий объем вверх и вниз несколько раз в колбе Т75 (вдоль поверхности роста) для дальнейшего разделения клеточных сгустков и переноса клеточной суспензии в пробирку объемом 15 мл.
6. Соберите фибробласты HS5 соответственно с помощью трипсинизации TE при 37 °C в течение 3-5 мин.
7. Гранулируют каждый тип клеток (и, таким образом, освобождают от трипсина) центрифугированием (например, 300-400 × г в течение 5 мин при комнатной температуре [RT]) и ресуспендируют (как эпителиальные клетки, так и фибробласты) в 1-2 мл нормальной эпителиальной среды для роста перед подсчетом.
8. Определение жизнеспособного количества клеток с использованием соответствующего объема ресуспендированных клеток; каждый разбавлен на 1/5 с использованием 0,4% трипанового синего красителя в счетной камере Нейбауэра под микроскопом.

3. Генерация 3D сфероидальных культур эпителиальных фибробластов

1. Разведите нужное количество клеток в нормальной эпителиальной питательной среде с помощью пробирки объемом 15 мл. Рассчитайте 2000 эпителиальных клеток с 50 фибробластами в 100 мкл среды для каждой лунки из 96 луночных планшетов. Результирующее количество клеток, достаточное для одного 96-луночного планшета, составляет 200 000 клеток HBEC и 5 000 фибробластов HS5 в 10 мл нормальной эпителиальной среды для роста.
2. Аккуратно перемешайте с помощью стерильных серологических пипеток объемом 10 мл.
3. Перенесите клеточную суспензию в стерильный резервуар для реагентов для многоканальной микропипетки.
4. Засейте клетки в планшет со сверхнизким уровнем прикрепления, перенеся 100 мкл клеточной суспензии в каждую лунку с помощью многоканальной пипетки (12 каналов).
5. Инкубировать в стандартных условиях клеточного культивирования при 37 °C и 5%_CO2 в увлажненной атмосфере.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Образование сфероидов оценивается с помощью регулярного микроскопического исследования с использованием инвертированного микроскопа и фотографирования сфероидов для каждого желаемого момента времени.
6. Через 4 дня добавьте 100 мкл BLO-Medium на лунку к образовавшимся сфероидам.
7. Далее инкубировать в стандартных условиях культивирования клеток при 37 °C и 5%_CO2 во влажной атмосфере.

4. Регулярная смена СМИ

1. Через 7-8 дней проведите регулярную смену носителя. Поэтому расположите пластину под небольшим углом, чтобы сфероиды опускались в направлении наклона под действием силы тяжести.
2. Тщательно и как можно лучше отасывайте надосадочную жидкость с помощью наконечника для дозатора объемом 100-200 мкл.
3. Установите планшет в горизонтальное положение и заполните 100-150 мкл среды BLO на лунку (с помощью многоканальной пипетки)
4. Продолжайте инкубацию в стандартных условиях культивирования клеток при 37 °C и 5%_CO2 в увлажненной атмосфере или начните эксперимент/лечение.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Сфероиды можно культивировать в течение более длительных периодов времени (до 21 дня). Затем необходимо проводить полную смену среды не реже двух раз в неделю.

5. Последующие анализы (сбор сфероидов)

1. Выполняйте регулярное микроскопическое обследование и документирование путем фотосъемки в сочетании с измерениями размера сфероида и расчетом объема, что в конечном итоге позволяет количественно оценить рост сфероида и потенциальные изменения роста после лечения.
2. Для визуализации живых клеток в желаемые моменты времени инкубируйте сфероиды в течение дополнительных 15 минут с помощью 1 мкг/мл Hoechst 33342 (или DAPI) для окрашивания ядер и проанализируйте с помощью флуоресцентной микроскопии.
3. Собирайте полученные сфероиды в нужный момент времени с помощью пипетки объемом 200 мкл с отрезанным выходным отверстием (сохраняйте стерильность) для увеличения диаметра. Поэтому отсасывайте и среду, содержащую сфероид. Соедините и соберите сфероиды в пробирку объемом 2-5 мл. Через 2-5 минут, когда сфероиды опустятся под действием силы тяжести, удалите надосадочную жидкость и приступайте к анализу ниже по потоку.
4. Для получения цельных лизатов сфероидного белка добавьте непосредственно ледяной лизисный буфер (150 ммоль/л NaCl, 1% NP40, 0,5% дезоксихолата натрия, 0,1% додецилсульфата натрия, 50 ммоль/л Tris/HCl, pH 8, дополненный коктейлем ингибиторов протеазы) в пробирку, содержащую собранные сфероиды. После двух-трех циклов замораживания и размораживания определите содержание белка в лизатах и приступайте к последующему анализу, например, вестерн-блоттингу¹⁵.
5. Для получения лизатов целых сфероидных РНК добавьте непосредственно буфер для лизиса РНК в пробирку, содержащую собранные сфероиды, и выполните выделение РНК в соответствии с инструкциями производителя соответствующего используемого набора для выделения РНК.
6. Для иммуногистохимии (ИГХ) и иммунофлуоресцентного окрашивания выполните шаги 5.6.1-5.6.3.
   1. Собранные сфероиды обрабатывают 1-2 мл 4% параформальдегид/фосфатного буферного раствора (PBS) в течение 30 мин и затем подвергают заделке парафином и срезу (3-5 мкм).
   2. Перед иммунофлуоресцентным окрашиванием подготовьте образцы с помощью нисходящего ряда спирта и инкубации с целевым раствором для извлечения. После этого заблокируйте предметные стекла блокирующим раствором (2% обычной козьей сыворотки/PBS) для уменьшения неспецифических взаимодействий и инкубации первичных антител в течение ночи при 4 °C.
   3. Выявляйте антигены с помощью флуоресцентно меченых вторичных антител. Контрокрашивание ядер с помощью DAPI. Выполните дополнительное окрашивание (например, набором для окрашивания PAS) в соответствии с протоколами производителя для гистологической оценки.
7. Для суспензий одиночных клеток следуйте шагам 5.7.1 и 5.7.2.
   1. Ресуспендировали собранные сфероиды в 1-2 мл TrypLE, содержащего 100 Ед/мл ДНКазы I с последующей 15-минутной инкубацией при 37 °С. Остановите пищеварение, добавив PBS, содержащий 2-5% FCS, 2 мМ ЭДТА и ДНКазу I.
   2. Пропустите клеточный раствор через клеточный фильтр 70 мкм в свежую коническую пробирку перед последующим анализом (например, проточной цитометрией или анализом отдельных клеток).
8. Для анализа секвенирования РНК одиночных клеток выполните шаги 5.8.1-5.8.3.
   1. Маркируйте различные интересующие суспензии одиночных клеток, представляющие различные временные точки или методы лечения, с помощью набора для мультиплексирования одиночных клеток (человека) в соответствии с инструкциями производителя.
   2. После этого объедините образцы и загрузите их на одноэлементный картридж, стремясь к 10 000-40 000 ячеек.
   3. Извлечение отдельных клеток, выполнение обратной транскрипции и подготовки библиотеки в соответствии с инструкциями производителя, а также секвенирование выделенной РНК.

Результаты

Этот простой протокол обеспечивает безматричное сфероидальное совместное культивирование эпителиальных клеток бронхов человека и фибробластов в сочетании со сверхнизкими прикрепленными пластинами (рис. 1A). В процессе культивирования из первоначально сгенерированных сфероидов постепенно формируются более сложные сфероиды легких, при этом эффективное образование различных эпителиальных и фибробластических структур представляет собой прямые клеточные взаимодействия, как это было выявлено морфо...

Обсуждение

Для преодоления разрыва между 2D-культурами и исследованиями in vivo были предложены 3D-модели клеточных культур, поскольку этот тип (ко-) культуры лучше имитирует физиологические, морфологические и патологические свойства, присутствующие in vivo,^{поскольку в} более активном взаимодействии между клетками присутствует взаимодействие между клетками и ВКМ, ответы на стимулы, экспрессия генов, экспрессия белков и дифференцировка.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
10 мл стерильных серологических пипеток	ThermoFischer	170356N	Nunc стерильные серологические пипетки, или эквивалент
15 мл конической трубки	Corning	430052	или эквивалент
37 ° C / 5% CO2 увлажненный
5 мл стерильные серологические пипетки	ThermoFischer	170355N	Nunc стерильные серологические пипетки, или эквивалент
50 мл конической трубки	Corning	CLS430829	или эквивалент
ATRA (All-Trans Retinoic Acid)	StemCell Technologies	Cat#72262	50 нМ
B-27 Supplement (50x),	ThermoFischer/Gibco	Cat#17504044	1x
BD Rhapsody WTA Amplification Kit	BD Bioscience	Cat#633801	использовать согласно инструкции производителя
Шкаф
Бычья сыворотка Альбумин	Roche Cat	#BSAVHS-RO	0.4% (v/v)
Клеточный фильтр	Corning	352350	Falcon 70 и микро; m Клеточный фильтр, белый, стерильный, в индивидуальной упаковке
Центрифуга	Eppendorf	https://www.fishersci.com/shop/products/eppendorf-5804-series-centrifuge-rotor-packages-9/p-4119001	, например, Eppendorf Centrifuge 5804 - Настольная центрифуга
DMEM/F12	Invitrogen	Cat#11330-032	500 мл
ДНКазы I, без РНКазы (1  U/μ L)	ThermoFischer	Cat#EN0521	100 U/mL
ЭДТА (0,5 М), pH 8,0, безРНКаза	ThermoFischer	AM9260G	2 мМ
Eppendorf Research плюс 12-канальный многоканальный дозатор	Eppendorf		, например, #3125000044 (10– 100 &микро; L) или #3125000060 (30– 300 &микро; L)
Фетальная сыворотка теленка	ThermoFischer/Gibco	Cat#A5256701	10% (v/v)
HBEC3-KT	ATCC	CRL-4051	линия нормальных эпителиальных клеток легких человека
Раствор гепарина (0,2%)	StemCell Technologies	Cat#7980	0,8 мл
Hoechst 33342	ThermoFischer	Cat#H1399	1 &микро; г/мл
HS-5	ATCC	CRL-3611	человеческие стромальные фибробласты
Hu Recom FGF-10 (KGF-2) ACF	StemCell Cell Technologies	Cat#78173.1	10 нг/мл
Hu Recom FGF-7 (KGF) ACF	StemCell Technologies	Cat#78186.1	10 нг/мл
Набор для мультиплексирования одиночных клеток человека	BD Bioscience	Cat#633781	применение согласно инструкции производителя
Hydrocortisin Stock Solution	StemCell Technologies	Cat#7926	0,5 мл на 500 мл
Laduviglusib (CHIR-99021)	Biozol/Selleckchem	Cat#S1263	3 µ M
L-аскорбиновая кислота	Sigma-Aldrich	Cat#A92902	50 &; г/мл
Микроскоп	ZEISS
Monothioglycerin	Sigma-Aldrich	Cat#M6145	0.4 µ
M N-2 Добавка (100x)	ThermoFischer/Gibco	Cat#17502048	1x
Neubauer счетная камера	Merck	BR718605	например, BRAND  счетная камера BLAUBRAND  Neubauer pattern
Нормальная козья сыворотка	ThermoFischer	Cat#31873	2 % (v/v) в PBS
NP-40	Merck/Millipore	Cat#492016	NP-40-Alternative, 1 %
PAS Staining Kit	Sigma Aldrich	Cat#1016460001	использовать в соответствии с инструкцией производителя
PBS	ThermoFischer	Cat#10010023	1x
Пенициллин-стрептомицин (10.000  U/mL), 100x	ThermoFischer/Gibco	Cat#15140122	1x
PFA	ThermoFischer	Cat#J61899. AK	Paraformaldehyd, 4 % в PBS
PneumaCult Airway Organoid Differentiation Medium (ODM)	StemCell Technologies	Cat#05060	PneumaCult Airway Organoid Basal Medium (#05061, 360 мл) и PneumaCult Airway Organoid Differentiation Supplement* (#05063, 40 mL)
PneumaCult Ex Plus Medium	StemCell Technologies	Cat#5040	Набор, состоящий из базальной среды PneumaCult-Ex Plus (#05041, 490 мл ) и добавки PneumaCult-Ex Plus 50X*(#05042, 10 мл)
Коктейль ингибиторов протеазы	Merck/Roche	Cat#4693132001	1 таб/10 мл
Rhapsody cDNA Kit	BD Bioscience	Cat#633773	использовать в соответствии с инструкцией производителя
RPMI 1640 Medium	ThermoFischer/Gibco	Cat#11875093	500 мл
Хлорид натрия	Merck/Sigma-Aldrich	S9625	150 ммоль/л
цитрат натрия Merck	/Sigma-Aldrich	Cat#1613859-1G	0,10%
Дезоксихолат натрия	Merck/Sigma-Aldrich	Cat#30970	0,50%
Додецилсульфат натрия	Merck/Sigma-Aldrich	Cat#11667289001	0,10%
Стерильный резервуар для реагентов для многоканальной микропипетки (например, 60 мл)	ThermoFischer	9510037	или аналог
TC-Platte 96well BIOFLOAT a 4 Stü ck	Sarstedt (или facellitate)	83.3925.400 (или F202003)	сверхнизкая крепежная пластина
Tris/HCl	ThermoFischer	Cat#AM9855G	50 ммоль/л, pH 8
Triton  X-100	Sigma-Aldrich	Cat#X100-5ML	0.05 %
Трипан синий морилка (0,4%)	ThermoFischer	Cat#15250061	1/5 (v/v) с NGM
TrypLE	ThermoFischer	Cat#12604013	1x
Trypsin-EDTA (0,5 %)	ThermoFischer	Cat#15400054	0,05 % раствор трипсина-ЭДТА (TE) асептически разбавленный до 1X с использованием фосфатного буферного раствора (без кальция и магния)
WST-1 реагент	CELLPRO-RO, Roche	Cat#5015944001	реагент для пролиферации клеток