Method Article

Понимание изменений в морфологии митохондрий с помощью динамических и трехмерных флуоресцентных микрофотографий

DOI:

10.3791/68478

⸱

August 15th, 2025

 ,  ,  , 
1Department of Physiology, Stellenbosch University, 2Department of Biochemistry, University of Toronto, 3Department of Electrical and Electronic Engineering, Stellenbosch University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этой статье мы опишем локализатор митохондриальных событий (MEL), плагин ImageJ, полезный для количественной оценки трехмерных изменений в митохондриальном делении и термоядерной активности с течением времени. Мы также описываем конвейер обработки изображений, полезный для очистки микрофотографий перед анализом в ImageJ.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Митохондрии являются высокодинамичными органеллами, которые жизненно важны для выживания любого животного, претерпевая регулярные события деления и слияния в ответ на потребности или стрессы хозяина, что приводит к постоянному ремоделированию митохондриальной сети. Из-за этого возможность оценить митохондриальную сеть в трех измерениях, а также во времени, дает преимущество в понимании того, как система реагирует на такие факторы, как стресс или фармацевтическое вмешательство. Флуоресцентная визуализация митохондриальных сетей клеток позволяет визуализировать и контролировать эти изменения. Тем не менее, митохондриальная сеть часто описывается как двумерная и статичная структура, которая определяется нестандартизированными метриками. Поэтому мы решили описать конвейер, который позволяет пользователю подготавливать свои изображения для локализатора митохондриальных событий (MEL), плагина ImageJ, который обнаруживает события деления и слияния в митохондриальной сети с течением времени и в трехмерном виде, тем самым предлагая понимание динамических изменений, которые претерпевает эта сеть. Кроме того, мы описываем преимущества понимания деления и слияния в свете изменений в количестве митохондрий и морфологических изменений.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Митохондрии – это высокодинамичные органеллы, присутствующие во всех эукариотических клетках, обеспечивающие их энергией и регулирующие обмен веществ. Таким образом, митохондрии находятся на перекрестке клеточной смерти и выживания. Было показано, что митохондрии играют важную роль в различных процессах, начиная от лизосомального закисления и молекулярного моторного действия и заканчивая сокращением мышци возбуждением синапсов.

Митохондрии регулярно подвергаются делению и слиянию для поддержания митохондриальной сети, которая эффективно производит АТФ в ответ на метаболические потребности клетки и стресс. Действительно, было показано, что митохондрии подвергаются делению, чтобы облегчить митофагию, избирательное удаление митохондриальных фрагментов. Следовательно, в клеточной системе остаются только активно дышащие, а не деполяризованные митохондрии 3,4. Однако слияние происходит как средство увеличения выходной мощности АТФ сети в случае возросшей потребности 5,6. Кроме того, было показано, что как деление, так и слияние играют важную роль в разделении и защите митохондриальной ДНК 7,8. Следует отметить, что степень деления и слияния требует тщательного гомеостатического контроля для обеспечения здоровой митохондриальной сети, поскольку было показано, что слишком много или слишком мало того или иного процесса вредно.

Было показано, что чрезмерное деление приводит к фрагментации митохондриальной сети с последующим снижением уровня АТФ при болезни Альцгеймера, болезни Паркинсона и таупатиях 9,10,11, а низкий уровень деления может привести к накоплению деполяризованных митохондрий, что приводит к симптомам, похожим на болезнь Паркинсона 12. Известно, что гиперфузия сети происходит во время стресса для увеличения выхода АТФ. Тем не менее, было показано, что нахождение в этом состоянии в течение длительных периодов времени увеличивает уровни АФК и активность аутофагии, что приводит к началу гибели клеток 9,12.

Таким образом, становится ясно, что понимание состояния митохондриальной сети дает ключ к пониманию состояния клетки и, следовательно, организма. Очевидная важность понимания митохондриальной сети в контексте здоровья и болезней, ее способности подвергаться событиям деления и слияния, а также их влияния на здоровье клеток — вот что послужило мотивацией для разработки этого протокола и связанных с ним инструментов анализа. В частности, инструменты, которые позволяют охарактеризовать митохондриальную динамику, в значительной степени ограничены и плохо описаны в литературе.

Морфология митохондрий обычно определяется с помощью конфокальной микроскопии с последующим вычислительным анализом, который требует, чтобы необработанные микрофотографии подвергались некоторой степени обработки для повышения их качества для оценки, поскольку это лучше всего описывает организацию митохондрий. Таким образом, пользователи могут определить многие морфометрические результаты митохондриальной сети, такие как количество, объем, длина и соотношение сторон 13,14,15. Пользователи могут использовать либо 2D, либо 3D микрофотографии для морфологической оценки, хотя 3D-анализ обеспечивает большую точность и понимание, поскольку митохондриальная сеть состоит из 3D-структур. Для анализа деления и слияния рекомендуется использовать микрофотографии с осью z, так как это наилучшим образом компенсирует трехмерность митохондриальной сети16.

Многие исследования включают в себя категоризацию митохондрий на фрагментированные, нитевидные или промежуточные состояния в качестве средства описания сети16,17. 3D-анализ особенно полезен из-за различных форм, которые митохондрии принимают в клетке. Добавление трехмерности к исследованию придает уверенности, особенно в отношении количества митохондрий, поскольку митохондрии, вероятно, будут двигаться вверх или вниз по оси z. MEL — это плагин ImageJ, который зависит от 3D-изображений. В данной работе мы использовали нейрональные клетки гиппокампа мыши GT1-7, окрашенные TMRE и методом Хёхста, для визуализации митохондриальной сети, а также ядра клетки. Затем клетки были помещены через конвейер предварительной обработки для повышения качества микрофотографий в рамках подготовки к анализу изображений.

Существует множество методов, которые позволяют определять морфологию митохондрий на основе статических показателей. Лишь немногие из них включают активность деления и синтеза и позволяют количественно зафиксировать динамическое поведение митохондрий 13,19,20,21. Здесь мы опишем протокол улучшения изображения до определения характеристик сети, уделяя особое внимание митохондриальному делению и термоядерной активности. Мы продемонстрируем, как эта методика может дополнить ранее опубликованные методы определения морфологии митохондрий.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Клеточная обработка и микроскопия

  1. Культивирование клеток GT1-7 в 8 камерных чашках в DMEM с добавлением 10% FBS и 1% Penstrep (полная среда). Дайте клеткам прикрепиться на ночь, а затем обработайте 2,5 мМ метформина гидрохлоридом, изготовленным в DMEM, с 10% FBS в течение 72 ч, обязательно заменяя среду каждые 24 ч. Одновременно обрабатывайте клетки 10 мкМ CCCP за 6 ч до визуализации и 400 нМ бафиломицина А1 (Baf) за 4 ч до визуализации.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это можно сделать с любой линией эукариотических клеток по выбору.
  2. Перед визуализацией приготовьте коктейль из предварительно подогретых готовых сред, содержащих 5 нМ Hoechst и 100 нМ TMRE.
  3. Замените среду для обработки клеток коктейлем для визуализации и дайте 10 минут времени инкубации перед визуализацией.
    Примечание: Из-за динамической активности митохондрий клетки следует визуализировать с помощью микроскопа с инкубационной камерой, установленной на 37 °C и 5%CO2.

2. Визуализация

  1. Изображение ячеек с использованием 100-кратного увеличения с 1,4 NA.
  2. Отрегулируйте мощность лазера таким образом, чтобы мощность была достаточно низкой, чтобы избежать фотообесцвечивания, ~2%. Убедитесь, что скорость сканирования высокая. Снимайте изображения с разрешением 512 x 512.
  3. Установите интервалы Z-среза с шагом 0,25 мкм. Чтобы следовать этому протоколу, визуализируйте ячейки таким образом, чтобы они состояли из 10 Z-стеков. Получение пяти таймфреймов без какого-либо интервала между получением Z-стека.
    ПРИМЕЧАНИЕ: После оптимизации этот протокол не следует корректировать между группами лечения или экспериментальными группами, так как перечисленные здесь макросы требуют стандартизации протокола визуализации для всех клеток.

3. Вычислительная оценка

ПРИМЕЧАНИЕ: Вся последующая обработка производилась с помощью ImageJ v1.53t. Плагин MEL, а также вспомогательные модули можно найти на https://github.com/rensutheart/MEL-Fiji-Plugin, а все используемые макросы можно найти на https://github.com/rensutheart/FMPP/tree/master/Sections.

  1. Подготовка изображения
    1. Откройте исходный файл в программе ImageJ.
    2. Чтобы обрезать несколько клеток из одной микрофотографии, начните с дублирования изображения до количества отдельных клеток, которые должны быть проанализированы.
    3. Используйте инструмент синхронизации окон, инструмент рисования от руки и коррекцию цвета, чтобы нарисовать область интереса вокруг интересующей ячейки, где в поле зрения есть несколько ячеек (дополнительный рисунок S1).
    4. Нажмите на Редактировать | Чисто снаружи.
    5. Отделите красный и синий каналы друг от друга и сохраните митохондриальный канал как . Файл Tiff.
  2. Генерация функции спреда точки и деконволюция
    1. Чтобы сгенерировать функцию точечного спреда (PSF), используйте плагин генератора PSF с использованием встроенной микрографической информации. Перейти к плагинам | PSF Generator для открытия плагина. Кроме того, перейдите в раздел Изображение | Показать информацию... или нажмите I, чтобы открыть информацию об изображении, и прокрутите вниз. Используя размер и глубину воксела, в информационном окне отображения измените Pixelsize XY на 166,1 нм и Z-step на 200 нм. Измените длину волны на 568 нм, размер XYZ , чтобы соответствовать разрешению изображения 512 x 512, и Z-стек из 10 Z-срезов (дополнительный рисунок S2).
    2. Перейти к плагинам | Макросы | Править | Deconvolution_time_lapse_mine.ijm макросы.
    3. Отредактируйте входные и выходные строки и нажмите кнопку run (дополнительный рисунок S3).
  3. Повышение контрастности и размытие изображения
    1. Перейти к плагинам | Макросы | Править | Предварительная обработка.ijm.
    2. В макросах Preprocessing.ijm используйте фоновое вычитание с радиусом катящегося шара , равным 6. Установите Sigma Filter Plus таким образом, чтобы радиус был равен 1, используемые пиксели были равны 2, а минимальная доля пикселя была равна 0.2, при этом плагин должен учитывать выбросы. Настройте CLAHE таким образом, чтобы размер блока был равен 64; Установите бины гистограммы на 256, максимальный наклон на 2.5 и Гамму на 0.8.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Все эти настройки были оптимизированы для наших наборов данных, и значения должны быть оптимизированы для альтернативных наборов данных перед применением. Сигма-фильтрация применяется для сглаживания изображения и эффективного смешивания соседних пикселей для обеспечения однородности структур. Локальный контраст применяется для увеличения контраста между светлыми и темными пикселями и в сочетании с изменением гаммы усиливает присутствие митохондриальных структур при минимизации фоновых пикселей.
    3. Измените строку ввода на папку, содержащую микрофотографии, подвергшиеся деконволюции (дополнительный рисунок S4).
    4. Нажмите кнопку Выполнить.
  4. Пороговое определение изображений
    ПРИМЕЧАНИЕ: Несмотря на то, что пользователи могут использовать любой инструмент для определения пороговых значений, мы рекомендуем плагин адаптивного порогового значения от Qingzong Tseng (https://sites.google.com/site/qingzongtseng/adaptivethreshold).
    1. Откройте интересующий вас файл, который был изменен макросами Preprocessed.ijm в ImageJ.
    2. Перейдите в раздел Плагины | adaptiveThr.
    3. Установите локальное пороговое значение «Взвешенное среднее» и размер блока в пикселях в соответствии с предпочтениями пользователя.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Размер блока пикселей должен быть постоянным между клетками, так как это значение влияет на оценку митохондриальных размеров, таких как объем или соотношение сторон.
    4. Чтобы оптимизировать время, нажмите на кнопку предварительного просмотра и отрегулируйте размер блока таким образом, чтобы в него было включено как можно больше митохондрий. Также отрегулируйте значение вычитания для каждой ячейки, чтобы удалить ненужный фон. Сохраняйте файлы микрофотографий в папках, связанных со значением вычитания (дополнительный рисунок S5).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Макросы Threshold.ijm включают фильтр по размеру для удаления более мелких частиц.
    5. Выберите плагины | Макросы | Править | Threshold.ijm.
    6. Отредактируйте строки input_path и output_path, а также blockSize и вычтите строки в скрипте макросов (дополнительный рисунок S6).
    7. Нажмите кнопку Выполнить.
  5. Обнаружение событий деления и слияния с помощью плагина локализатора митохондриальных событий (MEL)
    ПРИМЕЧАНИЕ: MEL предназначен для обработки покадровой последовательности z-стеков, состоящих из одного канала, сохраняемых как один Tiff за раз. Хотя это можно сделать, изменив строку ввода на интересующий нас файл Tiff с пороговым значением, мы также продемонстрируем метод одновременной обработки нескольких файлов Tiff с помощью функции concatenate в ImageJ.
    1. Откройте до 10 пороговых микрофотографий, которые относятся к одним и тем же условиям лечения.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Микрофотографии должны иметь одинаковое количество z-срезов, чтобы это работало.
    2. Перейти к изображению | Стеки |Инструменты | Сцепите и нажмите клавишу Ok.
    3. Чтобы удалить оставшиеся мелкие пункты, оставленные пороговым уровнем, перейдите в раздел Плагины | Интегральные файловые файлы изображений | Удалите выбросы. Используйте предварительный просмотр , чтобы установить размеры X и Y для удаления необходимых фрагментов.
    4. Сохраните объединенный файл в формате Tiff.
    5. Перейти к плагинам | Макросы | Править | Quicktest_new.ijm и при необходимости отредактируйте входной и выходной пути (дополнительный рисунок S7).
      ПРИМЕЧАНИЕ: После завершения в выходной папке будет найдена папка с именем "MEL_results" со всеми результатами MEL. Они отображаются в виде событий деления и синтеза, обнаруженных в каждой временной точке, и последняя временная точка всегда должна быть удалена из-за того, как работает MEL18.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Выбор подходящих ячеек
Пользователи должны знать, что митохондриальная сеть изменяется в зависимости от митотического состояния клетки. Если ядро выглядит гантельным или U-образным, или если рядом с ядром есть пространство с недостатком сигнала флуоресценции, то это может свидетельствовать о том, что клетка приближается к митозу. В этом состоянии митохондрии, вероятно, подвергаются делению из-за деления клеток, а не из-за лечебного вмешательства и его влияния на сеть (дополнительный рисунок S8...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Несмотря на растущее число подходов к описанию морфологии митохондрий, существуют ограниченные методы для адекватного учета митохондриальной динамики в количественном отношении. Кроме того, следует отметить, что морфология митохондриальной сети, а также механизмы, управляющие этой морфологией, разнообразны по своей природе. Это приводит к созданию сетей, которые связаны с потребностями клетки, начиная от разветвленного образования для увеличения выхода энергии и заканчивая различными во ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

У авторов нет конфликта интересов, о котором можно было бы заявить.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Это исследование финансировалось Стелленбошским университетом, Южная Африка, Южноафриканским советом медицинских исследований (SAMRC) и Национальным исследовательским фондом (NRF) Южной Африки, а также Канадским институтом исследований в области здравоохранения (CIHR) и Советом по естественным наукам и инженерным исследованиям Канады (NSERC).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
8 камерных блюдТермоФишер#Z734853
Скорректированный порогhttps://sites.google.com/site/qingzongtseng/adaptivethreshold
Бафиломицин А1Лаборатории LKT#B0026
Карбонильцианистый хлорфенилгидразон (КХХХ)Мерк#C2759
Конфокальный микроскопКарл Цейсс АГПлатформа сверхвысокого разрешения LSM780 ELYRA PS.1
Модифицированная среда Dulbecco Eagle (DMEM)ТермоФишер#341956062
Фетальная бычья сыворотка (FBS)Сигма-Олдрич#F0679
Ссылка на githubhttps://github.com/rensutheart/MEL-Fiji-Plugin
ГрафПад Призма v7.06
Элементы GT1-7АТКССКК116
ХёкштСигма-ОлдричН6024
ImageJ v1.53tФиджи
Макросыhttps://github.com/rensutheart/FMPP/tree/master/Sections
МетформинЕвропейская фармакопеяM06050000
Пенициллин/стрептомицин (PenStrep)Сигма-Олдрич#P4333
Т25сБио-Смарт Научный#70025
ТМРЭТермоФишер#T669
ТрипсинСигма-Олдрич#T4049

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sancak, Y., et al. Ragulator-rag complex targets mTORC1 to the lysosomal surface and is necessary for its activation by amino acids. Cell. 141 (2), 290-303 (2010).
  2. Bhabha, G., Johnson, G. T., Schroeder, C. M., Vale, R. D. How dynein moves along microtubules. Trends Biochem Sci. 41 (1), 94-105 (2016).
  3. Twig, G., et al. Fission and selective fusion govern mitochondrial segregation and elimination by autophagy. EMBO J. 27 (2), 433-446 (2008).
  4. Rana, A., et al. Promoting Drp1-mediated mitochondrial fission in midlife prolongs healthy lifespan of Drosophila melanogaster. Nat Commun. 8 (1), 1-14 (2017).
  5. Rolland, S. G., et al. Impaired complex IV activity in response to loss of LRPPRC function can be compensated by mitochondrial hyperfusion. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (32), E2967-E2976 (2013).
  6. Sgarbi, G., et al. Mitochondria hyperfusion and elevated autophagic activity are key mechanisms for cellular bioenergetic preservation in centenarians. Aging. 6 (4), 296-310 (2014).
  7. Mourier, A., et al. Mitofusin 2 is required to maintain mitochondrial coenzyme Q levels. J Cell Biol. 208 (4), 429-442 (2015).
  8. Ramos, E. S., et al. Mitochondrial fusion is required for regulation of mitochondrial DNA replication. PLoS Genet. 15 (6), e1008085(2019).
  9. Santos, D., Esteves, A. R., Silva, D. F., Januário, C., Cardoso, S. M. The impact of mitochondrial fusion and fission modulation in sporadic Parkinson's disease. Mol Neurobiol. 52 (1), 573-586 (2015).
  10. Joshi, A. U., Saw, N. L., Shamloo, M., Mochly-Rosen, D. Drp1/fis1 interaction mediates mitochondrial dysfunction, bioenergetic failure and cognitive decline in Alzheimer's disease. Oncotarget. 9 (5), 6128-6143 (2018).
  11. Torres, A., Rivera, B., Polanco, C., Jara, C., Tapia-Rojas, C. Phosphorylated tau as a toxic agent in synaptic mitochondria: Implications in aging and Alzheimer's disease. Neural Regen Res. 17 (8), 1645-1651 (2022).
  12. Yu, B., et al. Mitochondrial phosphatase PGAM5 modulates cellular senescence by regulating mitochondrial dynamics. Nat Commun. 11 (1), 2549(2020).
  13. Baek, M. L., et al. Mitochondrial structure and function adaptation in residual triple negative breast cancer cells surviving chemotherapy treatment. Oncogene. 42 (14), 1117-1131 (2023).
  14. Nag, S., et al. PGAM5 is an MFN2 phosphatase that plays an essential role in the regulation of mitochondrial dynamics. Cell Rep. 42 (8), 112895-112895 (2023).
  15. Robertson, G. L., et al. DRP1 mutations associated with EMPF1 encephalopathy alter mitochondrial membrane potential and metabolic programs. J Cell Sci. 136 (3), jcs260370(2023).
  16. Chaudhry, A., Shi, R., Luciani, D. S. A pipeline for multidimensional confocal analysis of mitochondrial morphology, function, and dynamics in pancreatic β-cells. Am J Physiol Endocrinol Metab. 318 (2), E87-E101 (2020).
  17. Bernhardt, D., Müller, M., Reichert, A. S., Osiewacz, H. D. Simultaneous impairment of mitochondrial fission and fusion reduces mitophagy and shortens replicative lifespan. Sci Rep. 5, 7885(2015).
  18. Theart, R. P., Kriel, J., Du Toit, A., Loos, B., Niesler, T. R. Mitochondrial event localiser (mel) to quantitatively describe fission, fusion and depolarisation in the three-dimensional space. PLoS ONE. 15 (12), e0229634(2020).
  19. McCarron, J. G., et al. From structure to function: Mitochondrial morphology, motion and shaping in vascular smooth muscle. J Vasc Res. 50 (5), 357-371 (2013).
  20. Peng, K., et al. The interaction of mitochondrial biogenesis and fission/fusion mediated by PGC-1α regulates rotenone-induced dopaminergic neurotoxicity. Mol Neurobiol. 54 (5), 3783-3797 (2017).
  21. Huang, Y. C., et al. Reduced mitochondria membrane potential and lysosomal acidification are associated with decreased oligomeric Aβ degradation induced by hyperglycemia: A study of mixed glia cultures. PLoS ONE. 17 (1), e0260966(2022).
  22. Martín-Maestro, P., et al. Slower dynamics and aged mitochondria in sporadic Alzheimer's disease. Oxidat Med Cell Longev. 2017, 9302761(2017).
  23. De Wet, S., et al. The highs and lows of memantine-an autophagy and mitophagy inducing agent that protects mitochondria. Cells. 12 (13), 1726-1726 (2023).
  24. Kleele, T., et al. Distinct fission signatures predict mitochondrial degradation or biogenesis. Nature. 593 (7859), 435-439 (2021).
  25. Jenkins, B. C., et al. Mitochondria in disease: Changes in shapes and dynamics. Trends Biochem Sci. 49 (4), 346-360 (2024).
  26. Izzo, A., et al. Metformin restores the mitochondrial network and reverses mitochondrial dysfunction in down syndrome cells. Hum Mol Genet. 26 (6), 1056-1069 (2017).
  27. Buchanan, E., et al. Propionic acid induces alterations in mitochondrial morphology and dynamics in SH-SY5Y cells. Sci Rep. 13 (1), 13248(2023).
  28. Rohani, A., Kashatus, J. A., Sessions, D. T., Sharmin, S., Kashatus, D. F. Mito hacker: A set of tools to enable high-throughput analysis of mitochondrial network morphology. Sci Rep. 10 (1), 18941(2020).
  29. Qiao, C., et al. Rationalized deep learning super-resolution microscopy for sustained live imaging of rapid subcellular processes. Nat Biotechnol. 41 (3), 367-377 (2023).
  30. Ding, Y., et al. Mitochondrial segmentation and function prediction in live-cell images with deep learning. Nat Commun. 16 (1), 743(2025).
  31. Ezzahoini, H., et al. SIRT4 interacts with OPA1 and regulates mitochondrial quality control and mitophagy. Aging. 10 (9), 2536-2536 (2017).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Mitochondrial MorphologyMitochondrial DynamicsFluorescence MicrographsMitochondrial FissionMitochondrial FusionThree Dimensional ImagingImageJ AnalysisMitochondrial NetworkDeconvolution MicroscopyMitochondrial Event Localizer

Related Articles