Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Создание in vitro моделей культуры ганглиев дорсальных корешков: дополнительные подходы к исследованию перекрестных помех между раком и нервом

2.7K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/68552

⸱

11 июля 2025 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Cancer Biology and Genetics, Sinclair Cancer Research Institute, and Department of Pathology and Molecular Medicine, Queen's University, 2Laboratory of Mutagenesis and Oncogenetics, Department of General Biology - Center for Biological Science, State University of Londrina

В этой статье

Краткое содержание

В этом протоколе описаны методы создания целых и диссоциированных культур ганглиев дорсального корешка мыши (DRG) и их использование для оценки взаимодействия опухоли и нерва.

Аннотация

Вклад нервной системы в микроокружение опухоли и важность нейронной инвазии как пути распространения рака получают все большее признание. Взаимодействие раковых клеток с нейронами может способствовать их инвазии вокруг и внутрь нервов, что является особенностью многих видов рака с плохими клиническими исходами. Модели in vitro для изучения взаимных взаимодействий между нейронами и раковыми клетками предоставляют ценные инструменты для понимания распространения рака и определения подходов к его смягчению.

В данной статье мы описываем протокол выделения ганглиев дорсальных корешков мышей (DRG) и создания как целых, так и диссоциированных монослойных культур, которые могут быть использованы для визуализации морфологии нейронов и роста нейритов с течением времени. Целые DRG, установленные в Matrigel, сохраняют нервную архитектуру и реакцию на стимулы в гетерогенной среде, более похожей на нерв in vivo , в то время как диссоциированные нервные культуры позволяют более точно оценить прямые межклеточные взаимодействия. После создания культур DRG раковые клетки могут быть добавлены для создания кокультур, которые могут быть использованы для визуализации изменений в росте нейритов и морфологии нервов в ответ на раковые клетки. Можно оценить рост или подвижность раковых клеток в ответ на нервные сигналы с течением времени или в условиях стимуляции или ингибирования роста, а также визуализировать эффекты прямого контакта между раковыми клетками и нервными отростками.

Поскольку обе модели кокультуры могут быть сгенерированы одновременно, этот протокол обеспечивает более полное представление о влиянии взаимодействий рака и нейронов и облегчает сравнение условий лечения и интеграцию информации с клеточного уровня и целых ганглий. Этот протокол облегчит изучение нервно-опухолевых взаимодействий и может быть использован для широкого спектра приложений, включая исследования клеточной сигнализации, скрининг лекарств или изучение гетерогенности опухолево-нервной среды и механизмов диссеминации опухоли вдоль нервов.

Введение

Диссеминация опухоли в результате локальной инвазии и регионарного или отдаленного метастазирования является основной причиной смерти от рака. Несмотря на то, что исследования были сосредоточены на сосудистых или лимфатических путях распространения, нервная инвазия опухолевых клеток часто наблюдается во многих солидных опухолях, включая рак поджелудочной железы 1,2, предстательной железы 3, головы и шеи 4, молочной железы5 и колоректальныйрак 6. В последние годы многочисленные исследования подчеркивают растущую роль нервов в стимулировании роста и прогрессирования опухоли, а также в качестве путей диссеминации, стимулирующих развитие метастазов 7,8. В этом контексте нейробиология рака стала важной областью исследований, открывающей новые перспективы в онкологии путем выяснения взаимодействий между опухолевыми клетками и основными компонентами периферической нервной системы (ПНС), которые могут способствовать этим процессам 8,9.

ПНС состоит как из периферических нервов, так и из ганглий, которые представляют собой гетерогенные структуры, состоящие из различных типов клеток, включая нейроны различных размеров и функций, шванновские и другие глиальные клетки, фибробласты, макрофаги, тучные клетки, меланоциты и эндотелиальные клетки сосудов, образующие местную сосудистую сеть10. ПНС является важнейшим компонентом опухолевого микроокружения (ТМЭ), и взаимная связь между раковыми клетками и нервами, либо непосредственно через физический контакт, либо косвенно через высвобождение нейротрофических факторов, нейротрансмиттеров, факторов роста и других сигналов, может способствовать нейронной инвазии и способствовать более агрессивнымфенотипам.

Модели in vitro могут быть использованы для описания процессов, способствующих поддержанию и восстановлению нервов, и все чаще используются для изучения клеточных взаимодействий между нервами и раковыми клетками11,12. Часто используемая модель in vitro включает извлеченные ганглии заднего корня мыши (DRG), культивируемые совместно с опухолевыми клетками11. Эти модели часто используют двумерную (2D) монослойную культуру диссоциированных клеток DRG для изучения биологии нейронов in vitro и были использованы для моделирования клеточных взаимодействий в PNS13,14. Однако в 2D-культурах отсутствует сложность нервного микроокружения и они слабо представляют его архитектуру in vivo. Трехмерные (3D) целые массивы периферических нейронов или ганглиев предлагают альтернативу, которая более эффективно повторяет физиологию периферических нервов для более целостного представления взаимодействий между нервами и окружающей средой 15,16,17,18. Тем не менее, гетерогенность этой модели ограничивает возможность визуализации или количественной оценки межклеточных взаимодействий, и эти модели более эффективны для наблюдения за общими реакциями периферических нервов, чем для изучения специфических клеточных взаимодействий и механистических реакций на стимулы. Таким образом, очевидно, что диссоциированные и целые нейрональные культуры являются комплементарными, и что оценка 2D и 3D моделей параллельно является оптимальной для оценки как общих эффектов, так и индивидуальных реакций клеток на стимулы.

Данный протокол описывает методы получения комплементарных диссоциированных (2D) и цельных (3D) культур нервов, которые могут быть использованы для оценки взаимодействий нервных и раковых клеток как на клеточном, так и на тканевом уровнях, обеспечивая более полное представление об этих взаимодействиях, чем методы, использующие только один тип культуры 1,13. Эти модели могут быть использованы для визуализации и оценки клеточных процессов, включая морфологию нервных клеток и рост нейритов, а также реакцию опухолевых клеток на секретируемые нервами хемотаксические агенты, такие как нейротрофические факторы, и перекрестные помехи между сенсорными нейронами и опухолевыми клетками. Это также позволяет исследовать потенциальные взаимодействия между опухолевыми клетками и другими компонентами нервного микроокружения, такими как иммунные клетки, фибробласты и глии. Мы выделяем применение этих моделей для изучения взаимодействий клеток нервной системы и рака с течением времени, визуализированных с помощью окрашивания живых клеток или иммунофлуоресценции, в качестве примеров подходов к оценке или количественной оценке клеточных взаимодействий и реакций. В совокупности результаты, полученные в результате использования этих методов, могут углубить наше понимание того, как нервная система способствует росту и распространению рака, помогая нам разработать стратегии для воздействия на эти механизмы.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все работы с мышами были рассмотрены и одобрены Офисом Университетского комитета по уходу за животными в Королевском университете (протокол No 2524). Животные содержались и усыплялись для сбора тканей в соответствии с этическими принципами Канадского совета по уходу за животными и Национального центра замены, уточнения и сокращения содержания животных в исследованиях (Великобритания). В этом протоколе мы использовали ткань, выделенную от животных C57BL/6, но также успешно использовали другие генотипы, включая животных Rag2IL2Rγc KO. Секции 1-6 могут выполняться в чистой среде на лабораторном столе, стерилизованном на поверхности (см. рисунок 1), в то время как секции 7-9 должны выполняться в шкафу биологической безопасности. Для лучшего понимания были созданы схематические изображения упомянутых шагов (рисунок 1).

1. Приготовление исходных растворов

  1. Приготовьте раствор папаина и раствор коллагеназы IV/диспаза II. Растворить папаин в стерильном PBS (фосфатно-солевом буфере) в концентрации 30 Ед/мл; хранить в 1 мл аликвот при -20 °C. Растворяют коллагеназу IV типа в концентрации 1,25 мг/мл и диспазу II в концентрации 2,5 мг/мл в PBS. Хранить в 1 мл аликвот при температуре -20 °C.
  2. Приготовьте нейробазальную питательную среду (F12) с добавлением 2% добавки B27 (50-кратный стоковый раствор), 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) и 1% пенициллин-стрептомицина (Pen-Strep) (100-кратный стоковый раствор).
  3. Приготовьте сбалансированный солевой раствор Хэнка (HBSS) с 1% пенициллин-стрептомицином (100x стоковый раствор).
    Примечание: Для поддержания первоначальной выживаемости и прикрепления клеток используется среда F12 с добавлением 10% FBS для улучшения укоренения культур. Тем не менее, FBS также способствует пролиферации ненейрональных клеток, включая фибробласты. Пониженные или бессывороточные среды (например, F12 с добавлением только B27) могут быть использованы для минимизации роста ненейрональных клеток в культуре DRG и кокультуре рака, но могут влиять на выживаемость, особенно культур диссоциированных нейронов. Не содержащие сыворотки среды также следует учитывать при сборе кондиционированных сред DRG для оценки их влияния на поведение раковых клеток.

2. Подготовка реактивов и материалов для вскрытия ДРГ (рисунок 1А)

  1. Автоклавные хирургические инструменты. Простерилизуйте препарирующий микроскоп 70% этанолом и установите на чистую верстак.
  2. Добавьте 6-8 мл HBSS-Pen-Strep (шаг 1.3) на две 10-сантиметровые культуральные пластины и выложите на лед.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эти пластины будут использоваться для сбора позвоночника после диссекции. В зависимости от количества рассекаемых спинных мозгов могут потребоваться дополнительные пластины.
  3. Добавьте 8-10 мл HBSS-Pen-Strep в коническую пробирку объемом 15 мл и положите на лед.
  4. Добавьте 3 мл HBSS-Pen-Strep в культуральную тарелку диаметром 3 см и положите на лед.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Пробирка объемом 15 мл, подготовленная на шаге 2.3, будет использоваться для сбора DRG для диссоциации, в то время как культуральная пластина объемом 3 см (шаг 2.4) будет использоваться для сбора DRG для модели с полным креплением.

3. Подготовка реагентов и материалов для культивирования ДРГ в полном объеме

ПРИМЕЧАНИЕ: Некоторые шаги в этом разделе могут потребовать ночной подготовки. Несмотря на то, что для культур DRG можно использовать любой тип планшета для культивирования тканей, объемы и инструкции в этом протоколе были оптимизированы для 8-луночных предметных стекол со стеклянным дном, что обеспечило оптимальное качество визуализации для наших анализов. Всегда держите на льду 8-луночное предметное стекло, наконечники для пипеток и матригель.

  1. Разморозьте раствор Матригеля при 4 °C в течение ночи (или не менее 3 часов) перед применением. Убедитесь, что Матригель всегда покрыт льдом.
  2. Охладите наконечники пипеток и 8-луночное стеклянное донное стекло при температуре -20 °C в течение ночи, чтобы свести к минимуму прилипание Matrigel к наконечникам и предотвратить преждевременную полимеризацию Matrigel в планшете.
  3. Подогреть дополненную среду (шаг 1.2) до 37 °C на водяной бане.

4. Подготовка реагентов и материалов для диссоциированной культуры DRG

  1. Разморозьте раствор папаина и раствор коллагеназы IV/Диспазы II (шаг 1.1) на водяной бане при температуре 37 °C до готовности к применению.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для каждой рассеченной мыши используйте по 1 аликвоте (1 мл) папаина и растворе коллагеназы IV/Dispase II.
  2. Теплые питательные среды с добавкой (шаг 1.2).

5. Забор материала из позвоночного столба (Рисунок 1Б) и рассечение ДРГ (Рисунок 1В)

  1. Усыпляют 4-8-недельных мышей передозировкой изофлурана с последующим вывихом шейки матки. Уложите усыпленное животное на живот и сбрейте его шерсть, уделяя особое внимание области над позвоночным столбом (рисунок 1Б, шаги 1,2).
  2. Сбрызните спину животного 70% этанолом и удалите выпавшую шерсть, протирая ее бумажными полотенцами от хвоста до черепа, чтобы мех не загрязнил вскрытие.
  3. С помощью стерилизованных ножниц сделайте прямой разрез вдоль выбритой спинной поверхности, от хвоста до черепа. Оттяните кожу с обеих сторон разреза с помощью тупых щипцов, чтобы обнажить позвоночный столб (рисунок 1B, шаг 3).
  4. С помощью свежих щипцов и ножниц для предотвращения загрязнения меха сделайте горизонтальный разрез у основания (хвостового конца) позвоночного столба (рисунок 1Б, шаг 4).
  5. Сделайте два параллельных продольных разреза с каждой стороны позвоночного столба, чтобы освободить его. С помощью щипцов аккуратно приподнимайте позвоночный столб, чтобы удалить окружающую соединительную ткань (Рисунок 1B, шаг 5).
  6. Чтобы полностью освободить позвоночный столб, сделайте разрез в верхней части позвоночного столба (проксимальнее черепа). Перенесите позвоночный столб на предварительно охлажденные 10-сантиметровые пластины, содержащие HBSS-Pen-Strep, на лед (шаг 2.2) (рисунок 1C, шаг 6).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Удобно собрать все позвоночные столбы в одну 10-сантиметровую пластину и перемещать отдельные столбики по одной в отдельную пластину для дальнейших этапов рассечения.

6. Рассечение ганглиев дорсальных корешков (ДРГ)

  1. С помощью пружинных ножниц удалите остатки соединительной ткани вокруг позвоночного столба, обнажив позвонки (Рисунок 1C, шаг 7). Это позволяет более четко визуализировать позвонок и облегчает разрез по средней линии. Соберите обрезанные столбики в свежую, предварительно охлажденную 10 см тарелку (шаг 2.2).
  2. По очереди перенесите обрезанный спинной мозг на предметный столик микроскопа для вскрытия. Аккуратно расщепите позвоночный столб в сагиттальной плоскости с помощью пружинных ножниц (рисунок 1D, шаг 8).
  3. С помощью щипцов с тонкими наконечниками удалите спинной мозг из позвоночного столба, обнажив DRG с обеих сторон вдоль корешков спинномозговых нервов (рисунок 1D, шаг 9).
    ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе следует проявлять особую осторожность, так как DRG могут быть удалены вместе со спинным мозгом, если с ними обращаться слишком грубо.
  4. Разрежьте спинномозговые нервы пружинными ножницами и удалите всю соединительную ткань вокруг DRG (Рисунок 1D, шаг 10).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Удаление соединительной ткани на этом этапе сводит к минимуму количество мусора в культурах DRG.
  5. С помощью щипцов с тонким наконечником аккуратно потяните за DRG, чтобы извлечь его из спинного корешка. Для культуры всего монтирования поместите DRG в 3-сантиметровую пластину (подготовленную на шаге 2.4) (Рисунок 1D, шаг 11). Объедините оставшиеся DRG в коническую пробирку объемом 15 мл (подготовленную на шаге 2.3) для использования для диссоциации.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Держите пластины и трубки на льду на протяжении всего процесса вскрытия.
  6. Повторяйте шаги с 6.4 по 6.5 до тех пор, пока не будут извлечены все DRG. Повторите все описанные выше шаги для любых дополнительных позвоночных столбов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Мыши имеют 30-31 пару DRG в зависимости от штамма, что позволит собрать до 60 DRG от каждого животного. При сборе DRG только из поясничного отдела спинного мозга можно извлечь 10 DRG. Использование DRG одного и того же животного для создания обеих моделей культур снижает внутриэкспериментальную изменчивость и обеспечивает согласованные и сопоставимые результаты между дополнительными экспериментами.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Все шаги, следующие за экстракцией DRG, должны выполняться в шкафу биологической безопасности.

7. Культура DRG с полным креплением (Рисунок 2)

  1. С помощью предварительно охлажденных наконечников (шаг 3.2) пипеткой в 2 мкл охлажденного Матригеля образуется капля в каждой лунке 8-луночного стеклянного предметного стекла, помещенного на лед (рисунок 2А, шаг 1). Чтобы предотвратить преждевременную полимеризацию Матригеля перед добавлением DRG, пипетируйте только по одной капле за раз. Чтобы предотвратить царапины на поверхности предметного стекла, перед тем как положить его на лед, поместите предметное стекло в пластину диаметром 10 см.
  2. С помощью щипцов с тонкими наконечниками перенесите одну DRG на сухую пластину и осторожно перемещайте ее, чтобы удалить избыток HBSS, предотвращая дальнейшее разведение Matrigel при добавлении DRG к капле Matrigel. Перенесите DRG в каплю Matrigel (рисунок 2A, шаг 2).
    ПРИМЕЧАНИЕ: С помощью щипцов с тонкими наконечниками аккуратно вставьте DRG в каплю Matrigel, убедившись, что DRG полностью погружена и расположена по центру капли.
  3. Повторите шаги с 7.1 по 7.2 для каждой DRG, добавленной в каплю Matrigel.
  4. Инкубируйте 8-луночное стеклянное предметное стекло при температуре 37 °C в течение 5 минут в увлажненном инкубаторе, чтобы дать Матригелю полимеризоваться (Рисунок 2A, шаг 3).
  5. Осторожно добавьте 200 мкл теплой питательной среды в каждую лунку и инкубируйте при 37 °C с 5%CO2 (рис. 2B, шаг 4). Заменяйте среду свежей добавленной питательной средой каждые 72 ч.
  6. Контролируйте DRG с помощью светлопольной микроскопии, чтобы оценить ее жизнеспособность и рост нейронов каждые 24 часа (рис. 2C и рис. 3).
    Примечание: Жизнеспособность может быть указана увеличением длины и плотности нейритов. Изображения могут быть получены с течением времени, чтобы продемонстрировать развитие расширений ячеек DRG (рис. 3).

8. Диссоциированная культура DRG (Рисунок 4)

ПРИМЕЧАНИЕ: Любая многолуночная пластина может быть использована для засеивания диссоциированных нейронов DRG. Тем не менее, в этом протоколе использовались 8-луночные предметные стекла со стеклянным дном, поскольку они обеспечивали лучшее слияние клеток и качество визуализации для иммунофлуоресцентного анализа.

  1. Покрытие культуральных планшетов коллагеном
    1. Приготовьте рабочий раствор подкисленного коллагена I в концентрации 50 мкг/мл в стерильном 0,01 М HCl в шкафу биологической безопасности.
    2. Пипеткой внесите 100 мкл раствора коллагена I в каждую лунку 8-луночного стеклянного предметного стекла. Наклоняйте и осторожно вращайте предметное стекло, чтобы раствор коллагена равномерно покрывал всю поверхность дна каждой лунки. Инкубируйте предметное стекло при температуре 37 °C в увлажненном инкубаторе в течение 1 ч, чтобы обеспечить полимеризацию коллагена I.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Во время инкубации приступайте к выполнению шагов 8.2 и 8.3.
    3. После инкубации аккуратно удалите пипеткой остатки неполимеризованного раствора коллагена I из каждой лунки. Промойте каждую лунку 100 μл PBS. Отпижите излишки PBS, оставив тонкий остаточный слой, чтобы предотвратить высыхание коллагена.
      ПРИМЕЧАНИЕ: 8-луночный стеклянный донный предметник может оставаться в шкафу биологической безопасности до тех пор, пока диссоциированные DRG не будут готовы к этапу посева.
  2. Ферментативное сбраживание
    1. Осторожно центрифугируйте пробирку объемом 15 мл, содержащую извлеченные DRG (шаг 6.5), в течение 5 минут при 200 × г при комнатной температуре, чтобы гранулировать DRG. Аккуратно извлеките HBSS с помощью пипетки.
    2. Промойте DRG в предварительно подогретой добавке, осторожно постукивая по пробирке, чтобы убедиться, что все содержимое промыто, и центрифугируйте в течение 5 минут при 200 × г , чтобы гранулировать DRG.
    3. Снимите пипетку со среды и добавьте 1 мл раствора папаина (рисунок 4A, шаг 1). Осторожно перемешайте и инкубируйте в течение 20 минут при 37 °C в инкубаторе для тканевых культур. Осторожно встряхивайте тюбик, чтобы взбалтывать его каждые 5 минут.
    4. Через 20 минут добавьте 4,5 мл добавленной среды и аккуратно перемешайте, чтобы нейтрализовать папаин. Центрифужную пробирку в течение 5 мин при 400 × г до гранулирования DRGs. Осторожно удалите надосадочную жидкость с помощью пипетки.
    5. Добавьте 1 мл раствора Collagenase IV/Dispase II и инкубируйте в инкубаторе в течение 20 минут при температуре 37 °C. Осторожно встряхивайте трубку каждые 5 минут (рисунок 4A, шаг 1).
    6. Через 20 минут добавьте 4,5 мл добавленной среды и аккуратно перемешайте, чтобы нейтрализовать раствор Collagenase IV/Dispase II. Центрифужную пробирку в течение 5 мин при 400 × г до гранулирования DRGs. Осторожно удалите надосадочную жидкость с помощью пипетки.
    7. Добавьте 2 мл добавленной среды и добавьте ДНКазу I до конечной концентрации 0,2 мг/мл. На этом этапе DRG тщательно перевариваются и могут выглядеть как рыхлый комок (рисунок 4A, шаг 2).
  3. Механическая диссоциация
    1. Осторожно растирайте DRG, пипетируя вверх и вниз 4–5 раз с помощью фильтрующего наконечника для дозатора объемом 1000 мкл (рис. 4A, шаг 2).
    2. Выполните второй этап растирания с помощью наконечника для дозатора объемом 200 мкл 4–5 раз. После этого шага образец выглядит мутным с некоторыми видимыми комками ткани (рисунок 4A, шаг 2).
    3. Отфильтруйте клеточную суспензию через клеточный фильтр 70 мкм в коническую пробирку объемом 50 мл. Постепенно промойте сетчатый фильтр 10 мл фильтрующего материала, чтобы обеспечить полную фильтрацию клеток через фильтр (рисунок 4A, шаг 3).
    4. Центрифужная пробирка в течение 5 мин при давлении 1 000 × г в пеллетные ячейки. Удалите среду из гранул и повторно суспендируйте в 500 мкл добавленной среды (рис. 4A, шаг 4).
    5. Удалите остатки PBS из лунок 8-луночного стеклянного донного предметного стекла. Распределите диссоциированную суспензию DRG между лунками, покрытыми коллагеном. Инкубируйте предметные стекла при температуре 37 °C в увлажненном инкубаторе с 5%CO2. При необходимости добавляйте больше среды и заменяйте среды свежими питательными средами каждые 48 ч (рис. 4B, шаг 5).
      Примечание: DRG-диссоциированные клетки могут быть подсчитаны с помощью гемоцитометра или камеры для подсчета клеток и окрашивания трипановым синим цветом для обеспечения постоянного количества клеток в лунке. Для этого протокола в каждую лунку засевали примерно 1 × 105 клеток.
    6. Мониторинг клеток, полученных из DRG, с помощью светлопольной микроскопии для оценки жизнеспособности и роста нейронов (рис. 4C и рис. 5).
      Примечание: Нейроны выглядят как округлые клеточные тела с определенными границами и могут занять 24 часа или более, чтобы прилипнуть, в то время как ненейрональные клетки обычно располагаются раньше нейронов. Некоторый рост нейритов может наблюдаться через 24 ч и увеличивается со временем до 7 дней в культуре. Диссоциированные клетки, полученные из DRG, и целые DRG предварительно инкубируются в течение 72 ч перед добавлением раковых клеток и созданием кокультур.

9. Приготовление суспензий раковых клеток и создание кокультур

ПРИМЕЧАНИЕ: Можно использовать адгезивные раковые клетки многих видов. Питательные среды и количество клеток для сокультур будут зависеть от клеточной линии. Мы рекомендуем предварительное тестирование перед экспериментом, чтобы определить время сбора клеток и оптимальное количество посева клеток. Описанный здесь протокол был основан на использовании клеточных линий рака поджелудочной железы человека PanC1 и MiaPaCa2, а также клеточной линии рака предстательной железы DU-145.

  1. Промойте клетки средой, не содержащей сыворотки, и трипсинизируйте их в течение примерно 3 минут с помощью 2 мл трипсина на 10-сантиметровую пластину.
  2. Нейтрализуйте трипсин, добавив 6 мл добавленной среды, и осторожно пипетируйте вверх и вниз, чтобы получить одноклеточную суспензию. Подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра и трипана синего цвета.
  3. Суспензию раковых клеток в концентрации от 2 × 10до 5 клеток/мл в дополненной среде (шаг 1.2).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Оптимальная плотность клеток может варьироваться в зависимости от размера клеток, времени удвоения и продолжительности совместного культивирования и может быть скорректирована по мере необходимости.
  4. Совместное культивирование DRG и раковых клеток в целом, как в целом (Рисунок 6B)
    1. Отсасывайте среду со всей установки культур DRG в 8-луночном стеклянном донном предметном стекле.
    2. Аккуратно нанесите пипеткой 200 мкл суспензии раковых клеток (шаг 9.3) поверх капли Matrigel, содержащей весь монт DRG.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это обеспечивает равномерное распределение раковых клеток вокруг капли. Будьте осторожны, чтобы не потревожить каплю Matrigel кончиком пипетки.
    3. Инкубируйте предметное стекло для совместной культуры в увлажненном инкубаторе при температуре 37 °C с 5%CO2. Ежедневно обновляйте фильтрующий материал, промывая его 200 μл подогретого дополнительного фильтрующего материала один раз, а затем добавляя по 300 μл дополнительного фильтрующего материала в каждую лунку.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Осторожно отсасывайте среду с помощью пипетки, чтобы не нарушать совместное культивирование DRG и раковых клеток. Со временем, по мере того как сокультуры становятся более сложными и организованными, они также становятся более восприимчивыми к нарушениям, которые могут повлиять на клеточные взаимодействия и целостность сокультур.
    4. Контролируйте кокультуру с помощью светлопольного или флуоресцентного микроскопа с интервалом в 24 часа для оценки поведения раковых клеток и нейронных взаимодействий (рис. 6B).
      Примечание: Частота наблюдений может быть скорректирована в зависимости от временной шкалы эксперимента и интересующих нас взаимодействий клеток.
  5. Кокультура диссоциированной DRG и раковых клеток (Рисунок 6C)
    1. Отсасывайте среду из диссоциированных культур в 8-луночном предметном стекле со стеклянным дном.
    2. Аккуратно распределите 200 мкл суспензии раковых клеток (шаг 9.3) в каждую лунку. Выполните те же действия по инкубации, обновлению среды и мониторингу, что и для целых сокультур (шаги 9.4.3 и 9.4.4).
      Примечание: Для лучшей визуализации клеточных процессов и взаимодействия раковых клеток и нейронов в культуру можно добавить флуоресцентные клеточные трекеры, следуя протоколу производителя.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Наш протокол описывает выделение первичных клеток, полученных из DRG мыши, и создание двух моделей комплементарных культур: диссоциированных DRG и целых культур DRG, которые позволяют нам исследовать взаимодействия клеток нерва и рака на разных уровнях сложности. Ключевым преимуществом этого протокола является то, что оба типа культур могут быть получены с использованием DRG, выделенных от одного и того же животного, что сводит к минимуму межживотную и межэкспериментальную изменчивость и ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Представленный здесь протокол описывает усовершенствованные методы создания 2D и 3D DRG первичных нервных культур и их применение в кокультуре с раковыми клетками. Этот протокол является усовершенствованием предыдущих методов, устанавливая две модели параллельно. Поскольку 2D и 3D модели создаются одновременно, с использованием первичных нервов, выделенных от одних и тех же животных, межживотные и межэкспериментальные вариации сведены к минимуму, а данные обеих моделей могут быть легче с...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

У авторов нет конфликта интересов, который можно было бы раскрыть.

Благодарности

Эта работа была поддержана операционными грантами от Канадского института исследований в области здравоохранения (PJT-178274) (LMM) и стипендией Онтарио для выпускников (LCBO), а также стипендией от Координации по улучшению качества кадров высшего образования - Бразилия (CAPES) - Финансовый код 001 (ERP). LMM является кафедрой генетики и молекулярной медицины Бракена в Королевском университете. Некоторые изображения были частично сгенерированы с помощью Biorender.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Tools
70 &микро; m Сетчатый фильтрПроген71-229483-УЛТИспользуется для фильтрации суспензии ячеек
8-луночные предметные стекла со стеклянным дномIBidi, Мюнхен, Германия80807
Dumont #5 - Тонкие щипцыFine Science Tools, Фостер-Сити, США11254-20
Щипцы Dumont #5Fine Science Tools, Фостер-Сити, США11252-20
Тонкие ножницыFine Science Tools, Фостер-Сити, США91460-11
Узорчатые щипцыFine Science Tools, Фостер-Сити, США91121-12
Пружинные ножницыFine Science Tools, Фостер-Сити, США91500-09
<сильно>реагенты
1x Фосфатный буферный растворSigma, Сент-Луис, СШАД8662-500МЛИспользуется для растворения ферментов
Дополнение к B-27 (50x)Thermo Fisher Scientific, Массачусетс, США17504044Используется в концентрации 2% в средах F12
Бычий коллаген I типаCorning Incorporated, Нью-Йорк, США354231Используется для нанесения покрытий на пластины, Рабочий раствор 50 & микро; г/мл в 0,01 М HCl
Коллагеназа IV типаSigma-Aldrich, Сент-Луис, СШАС4-БИОКРастворить в PBS при концентрации 1,25 мг/мл, аликвоте, хранить при температуре -20°С; C
Диспаза IIRoche, Базель, Швейцария4942078001Растворить в PBS при концентрации 2,5 мг/мл, аликвоте, хранить при -20°С; C
ДНКаза IRoche, Базель, Швейцария.11284932001Добавляется при окончательной концентрации  0,2 мг/мл при диссоциации
Фетальная бычья сыворотка (FBS)Sigma-Aldrich, Сент-Луис, СШАФ1051Используется в концентрации 10% в средах F12
HBSS (сбалансированный солевой раствор Хэнка)Sigma, Сент-Луис, СШАХ6648-500МЛПриготовлен с 1% пенициллин-стрептомицином
Снижение фактора роста МатригеляCorning Incorporated, Нью-Йорк, США356231Оттаивание при 4 градусах; C на ночь, держать на льду
Питательная смесь ветчины F-12Sigma-Aldrich, Сент-Луис, СШАН6658-500МЛБазальная среда для приготовления питательных сред с добавками
ПапаинRoche, Базель, Швейцария.10108014001Растворить в PBS при 30 Ед/мл, аликвоте, хранить при -20 °°С; C
Пенициллин-стрептомицин (100x)Sigma-Aldrich, Сент-Луис, СШАП4333-100МЛИспользуется в концентрации 1% в средах
Решение Trypan BlueSigma-Aldrich, Сент-Луис, СШАТ8154-100МЛДля оценки жизнеспособности клеток
ТрипLE ЭкспрессThermo Fisher Scientific, Массачусетс, США12605-028Для забора раковых клеток
<сильные>антитела
β-антитела к тубулину IIIAbcam (Кембридж, Великобритания)AB15568Разбавление 1:200
Алекса Флюор 488Thermo Fisher Scientific, Массачусетс, СШАА-11008Разбавление 1:2000
Алекса Флуор 594Thermo Fisher Scientific, Массачусетс, СШАА-21442Разбавление 1:2000
Алекса Флуор 647Thermo Fisher Scientific, Массачусетс, СШАА-21245Разбавление 1:2000
Антитела NeuNSigma-Aldrich, Сент-Луис, СШАМАБ377Разведение 1:100
<сильно>флуоресцентные красители и Щупы
ActinGreen 488 ReadyProbes Реагент (фаллоидин)Thermo Fisher Scientific, Массачусетс, СШАР37110Разбавление 1:40
CellTrace кальцеин красно-оранжевыйThermo Fisher Scientific, Массачусетс, СШАС34851Клеточный трекер используется для визуализации нейронов под флуоресцентным микроскопом
Hoechst 33342Thermo Fisher Scientific, Массачусетс, СШАН3570Разведение 1:5000

Ссылки

  1. Thiel, V., et al. Characterization of single neurons reprogrammed by pancreatic cancer. Nature. 640 (8060), 1042-1051 (2025).
  2. Zhu, M., Luo, F., Xu, B., Xu, J. Research progress of neural invasion in pancreatic cancer. Curr Cancer Drug Targets. 24 (4), 397-410 (2024).
  3. Zareba, P., et al. Perineural invasion and risk of lethal prostate cancer. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 26 (5), 719-726 (2017).
  4. Fu, Y., et al. Worst pattern of perineural invasion redefines the spatial localization of nerves in oral squamous cell carcinoma. Front Oncol. 11 (766902), (2021).
  5. Hu, J., Chen, W., Shen, L., Chen, Z., Huang, J. Crosstalk between the peripheral nervous system and breast cancer influences tumor progression. Biochim Biophys Acta Rev Cancer. 1877 (6), 188828(2022).
  6. Li, J., Mei, S., Zhou, S., Zhao, F., Liu, Q. Perineural invasion is a prognostic factor in stage ii colorectal cancer but not a treatment indicator for traditional chemotherapy: A retrospective cohort study. J Gastrointest Oncol. 13 (2), 710-721 (2022).
  7. Schmitd, L. B., Perez-Pacheco, C., D'silva, N. J. Nerve density in cancer: Less is better. FASEB Bioadv. 3 (10), 773-786 (2021).
  8. Zahalka, A. H., Frenette, P. S. Nerves in cancer. Nat Rev Cancer. 20 (3), 143-157 (2020).
  9. Winkler, F. Neuroscience and oncology: State-of-the-art and new perspectives. Curr Opin Neurol. 36 (6), 544-548 (2023).
  10. Lanigan, L. G., et al. Comparative pathology of the peripheral nervous system. Vet Pathol. 58 (1), 10-33 (2021).
  11. Jiang, S. -H., Zhang, S., Wang, H., Xue, J. -L., Zhang, Z. -G. Emerging experimental models for assessing perineural invasion in human cancers. Cancer Lett. 535 (215610), (2022).
  12. Moysidou, C. -M., Barberio, C., Owens, R. M. Advances in engineering human tissue models. Front. Bioeng. Biotechnol. 8 (620962), (2021).
  13. Bayat, F. K., et al. Adult mouse dorsal root ganglia neurons form aberrant glutamatergic connections in dissociated cultures. PloS ONE. 16 (3), e0246924(2021).
  14. Lin, Y. -T., Chen, J. -C. Dorsal root ganglia isolation and primary culture to study neurotransmitter release. J Vis Exp. (140), e57569(2018).
  15. Schmidt, H., Rathjen, F. G. Dii-labeling of drg neurons to study axonal branching in a whole mount preparation of mouse embryonic spinal cord. J Vis Exp. (58), e3667(2011).
  16. Klimovich, P., Rubina, K., Sysoeva, V., Semina, E. Three-dimensional model of dorsal root ganglion explant as a method of studying neurotrophic factors in regenerative medicine. Biomedicines. 8 (3), 49(2020).
  17. Neto, E., et al. Axonal outgrowth, neuropeptides expression and receptors tyrosine kinase phosphorylation in 3d organotypic cultures of adult dorsal root ganglia. PLoS ONE. 12 (7), e0181612(2017).
  18. Melli, G., Höke, A. Dorsal root ganglia sensory neuronal cultures: A tool for drug discovery for peripheral neuropathies. Expert Opin Drug Discov. 4 (10), 1035-1045 (2009).
  19. Du, J., Sudlow, L. C., Luzhansky, I. D., Berezin, M. Y. Drg explant model: Elucidating mechanisms of oxaliplatin-induced peripheral neuropathy and identifying potential therapeutic targets. bioRxiv. , (2023).
  20. Mo, Y. J., Kim, Y. -S., Kim, M. S., Lee, Y. -I. Advantages of adult mouse dorsal root ganglia explant culture in investigating myelination in an inherited neuropathic mice model. Methods Protoc. 5 (4), 66(2022).
  21. Nguyen, U. N., et al. Type i collagen concentration affects neurite outgrowth of adult rat drg explants by altering mechanical properties of hydrogels. J Biomater Sci Polym Ed. 35 (2), 164-189 (2024).
  22. Ito, K., et al. Histological effects of combined therapy involving scar resection, decellularized scaffolds, and human ipsc-ns/pcs transplantation in chronic complete spinal cord injury. Sci Rep. 14 (1), (2024).
  23. Aisenbrey, E. A., Murphy, W. L., Aisenbrey, E. A., Murphy, W. L. Synthetic alternatives to matrigel. Nat Rev Mater. 5 (7), 539-551 (2020).
  24. Berkovitch, Y., Seliktar, D. Semi-synthetic hydrogel composition and stiffness regulate neuronal morphogenesis - pubmed. Int J Pharm. 523 (2), 545-555 (2017).
  25. Carozzi, V. A., Salio, C., Rodriguez Menendez, V., Ciglieri, E., Ferrini, F. 2d vs 3d morphological analysis of dorsal root ganglia in health and painful neuropathy. Eur J Histochem. 65 (Suppl 1), 3276(2021).
  26. Smith, P. R., Meyer, A., Loerch, S., Campbell, Z. T. Protocol for the isolation and culture of mouse dorsal root ganglion neurons for imaging applications. STAR Protocols. 4 (4), (2023).
  27. Bunge, R. P. Expanding roles for the schwann cell: Ensheathment, myelination, trophism and regeneration - pubmed. Curr Opin Neurobiol. 3 (5), 805-809 (1993).
  28. Chen, Z., Fang, Y., Jiang, W. Important cells and factors from tumor microenvironment participated in perineural invasion. Cancers. 15 (5), 1360(2023).
  29. Jang, K., Garraway, S. M. A review of dorsal root ganglia and primary sensory neuron plasticity mediating inflammatory and chronic neuropathic pain. Neurobiol Pain. 15 (100151), (2024).
  30. Hanani, M., et al. Age-related changes in neurons and satellite glial cells in mouse dorsal root ganglia. Int J Mol Sci. 24 (3), 2677(2023).
  31. Martinelli, C., Sartori, P., Ledda, M., Pannese, E. Age-related quantitative changes in mitochondria of satellite cell sheaths enveloping spinal ganglion neurons in the rabbit. Brain Res Bull. 61 (2), 147-151 (2003).
  32. Niwa, H., et al. Differential age-dependent trophic responses of nodose, sensory, and sympathetic neurons to neurotrophins and gdnf: Potencies for neurite extension in explant culture. Neurochem Res. 27 (6), 485-496 (2002).
  33. Adler, J. E. Age-dependent differential regulation of sensory neuropeptides by glial cell line-derived neurotrophic factor. J Neurochem. 71 (1), 170-177 (1998).
  34. Podratz, J. L., et al. Neurotoxicity to drg neurons varies between rodent strains treated with cisplatin and bortezomib. J Neurol Sci. 362, 131-135 (2015).
  35. Lawson, S. N., Biscoe, T. J. Development of mouse dorsal root ganglia: An autoradiographic and quantitative study. J Neurocytol. 8 (3), 265-274 (1979).
  36. Monje, M., et al. Roadmap for the emerging field of cancer neuroscience. Cell. 181 (2), 219-222 (2020).
  37. Silverman, D. A., et al. Cancer-associated neurogenesis and nerve-cancer cross-talk. Cancer Res. 81 (6), 1431-1440 (2021).
  38. Vermeer, P. D., Restaino, A. C., Barr, J. L., Yaniv, D., Amit, M. Nerves at play: The peripheral nervous system in extracranial malignancies. Cancer Discov. 15 (1), 52-68 (2025).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Создание in vitro моделей культуры ганглиев дорсальных корешков: дополнительные подходы к исследованию перекрестных помех между раком и нервом
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.