Методическая статья

Высокоплексная визуализация с использованием спектральной конфокальной микроскопии для минимизации неспецифической флуоресценции тканей

DOI:

10.3791/68644

⸱

28 октября 2025 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1McMaster Immunology Research Centre, Department of Medicine, Faculty of Health Sciences, McMaster University, 2Schroeder Allergy and Immunology Research Institute, Faculty of Health Sciences, McMaster University, 3Carl Zeiss Canada MicroImaging, 4Division of Otolaryngology, Department of Surgery, McMaster University Medical Centre, McMaster University Medical Centre

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Спектральное итеративное отбеливание расширяет мультиплексность (IBEX) основано на базовом методе IBEX путем добавления блокировки гепарина для минимизации неспецифического связывания и использования спектрального детектирования с вычислительным размешиванием для подавления автофлуоресценции. Такой подход ускоряет получение изображений при одновременном уменьшении количества источников фона, обеспечивая надежный многораундовый пространственный протеомный анализ с высокими параметрами.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Высокомультиплексная визуализация позволяет изучать функционально разнообразные клетки и их ниши в их естественной тканевой среде. Итеративное отбеливание продлевает мультиплексность (IBEX) — это метод циклического иммуномечения и инактивации флуорофоров, который позволяет визуализировать несколько маркеров на одном и том же участке ткани. Полученные изображения могут быть впоследствии проанализированы для получения данных об отдельных клетках для определения кластеров клеток, их локализации и типов соседних клеток. Интерпретация этих данных основана на способности отличать истинную экспрессию маркеров от источников фона, присущих флуоресцентной микроскопии. Spectral IBEX, адаптация протокола IBEX, объединяет спектральное конфокальное детектирование с вычислительным размешиванием и включает блокирование гепарина для уменьшения связывания вне мишени на основе заряда. Эта комбинация улучшает отношение сигнал/фон, подавляет автофлуоресценцию тканей и сводит к минимуму просвечивание, а также сокращает время сбора данных по сравнению с обычной многодорожечной конфокальной визуализацией. Применение к ткани носовых полипов человека, модель, характеризующаяся высоким содержанием эозинофилов и сильной аутофлуоресценцией, продемонстрировала надежную визуализацию 26 маркеров в структурных, иммунных и клеточных компартментах в течение шести раундов визуализации. В результате рабочего процесса генерируется многомерная протеомная информация с пространственным разрешением, которая охватывает сложную архитектуру тканей и клеточные ниши. В совокупности этот оптимизированный подход обеспечивает надежную и широко применимую стратегию мультиплексной визуализации, особенно подходящую для тканей, где автофлуоресценция и неспецифическое окрашивание ограничивают традиционные подходы.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ткани состоят из разнообразного набора клеток со специализированными функциями, которые организуются в трехмерные структуры и, взаимодействуя, координируют биологические процессы, необходимые для жизни. Патология возникает, когда нарушения клеточного состава или архитектуры тканей препятствуют этим взаимодействиям и нарушают гомеостаз тканей1. Знание того, как многочисленные специализированные типы клеток локализуются и взаимодействуют в наших тканях, необходимо для того, чтобы понять биологию, лежащую в основе здоровья и болезней человека.

Достижения в технологиях профилирования одиночных клеток на транскриптомном, эпигеномном и протеомном уровнях выявили исключительное разнообразие специализированных типов клеток. 2,3 Такие технологии, как секвенирование РНК одиночных клеток и спектральная проточная цитометрия, позволяют измерить количество параметров, необходимых для характеристики этих гетерогенных популяций. Однако в этих подходах отсутствует пространственная информация, так как клетки должны быть диссоциированы от их нативной тканевой среды в одиночные клеточные суспензии 4,5. Таким образом, типы клеток, связанные с различными контекстами заболевания, были идентифицированы, но их взаимодействие в ткани и их вклад в продолжение болезни остаются неясными.

Чтобы устранить некоторые из этих ограничений, было разработано несколько пространственно-омиксных технологий, позволяющих улавливать клеточную гетерогенность в ткани с сохранением положениякаждой клетки. Например, транскрипцию генов можно измерить либо путем амплификации РНК в растеризованных точках на участке ткани (например, Visium), либо с помощью зондов гибридизации РНК, нацеленных на панель специфических генов, которые визуализируются с разрешением одной клетки (например, ксений)7,8. Эти методы эффективны для отслеживания транскрипционных паттернов и регуляторных механизмов в тканях. Тем не менее, транскрипционные профили часто плохо коррелируют с экспрессией белка, которая более непосредственно отражает функциональныевозможности клетки9. Экспрессия белка может быть идентифицирована с помощью специфических антител, конъюгированных с флуорофорами, которые могут быть обнаружены с помощью флуоресцентной микроскопии10,11. Использование традиционной флуоресцентной микроскопии может позволить получить дискретную визуализацию более шести таких флуорофоров, конъюгированных антителами. Однако перекрывающиеся профили возбуждения и излучения этих флуорофоров приводят к неопределенности в отношении происхождения сигнала флуоресценции в любом заданном канале12.

Итеративное обесцвечивание расширяет множественность (IBEX) — это метод визуализации с высоким содержанием жидкости, который был разработан для преодоления этого ограничения флуоресцентной микроскопии 13,14,15. IBEX использует борогидрид лития (LiBH4) для химической инактивации флуорофоров после визуализации, что позволяет повторно окрашивать тот же образец ткани последующим раундом флуорофор-конъюгированных антител перед повторной визуализацией. IBEX сохраняет целостность тканей, что позволяет визуализировать теоретически неограниченное количество маркеров на одном и том же участке ткани. Вычислительное выравнивание полученных изображений обеспечивает характеристику на уровне омиксов при разрешении одной клетки, сохраняя при этом пространственные данные для выявления клеточных ниш. Эти данные также могут выявить предполагаемые клеточные взаимодействия, хотя они должны быть проверены с помощьюдругих методов. IBEX — это метод с открытым исходным кодом, совместимый с коммерчески доступными флуорофорами и поддерживаемый международным сообществом исследователей, которые проверили реагенты и публично обмениваются данными для обеспечения доступности, быстрого внедрения и получения высококачественных данных17,18.

В данной работе модифицированный протокол IBEX был разработан для решения двух основных проблем метода: тканевой автофлуоресценции и неспецифического связывания зондов флуорофор-конъюгированных антител (совместно именуемых фоновыми). Автофлуоресценция возникает, когда возбуждение флуоресцентных молекул, эндогенных по отношению к ткани, испускает свет, который перекрывается с полезным сигналом, полученным от флуорофоров, конъюгированных антителами19,20. Нецелевое или неспецифическое связывание флуорофор-конъюгированных антител приводит к флуоресценции клеток или структур, которые не экспрессируют целевой белок21,22. Эти артефакты могут привести к неточному выводу о том, что клетка экспрессирует маркер, который она на самом деле не экспрессирует, что усложняет вычислительный анализ и точное распределение типов клеток. Сочетая нейтрализацию заряда на основе гепарина для нецелевого сигнала с полноспектральным регистрацией и вычислительным размешиванием, спектральный IBEX заметно снижает просачивание, улучшает отношение сигнал/фон (SBR) и вдвое сокращает время сбора данных за раунд.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ткани носовых полипов, использованные в этом исследовании, были собраны во время хирургии носовых пазух в Hamilton Health Sciences с этическим одобрением Совета по этике интегрированных исследований Гамильтона. Информированное согласие было получено от всех участников.

1. Забор образцов

  1. Получение образцов во время рутинных процедур полипэктомии, выполняемых пациентам с хроническим риносинуситом. После хирургического удаления поместите образцы во флакон с медицинским физиологическим раствором на лед для транспортировки и немедленно обработайте их для визуализации, чтобы сохранить целостность тканей.

2. Подготовка реагентов

  1. Раствор для фиксации и пермеабилизации готовят путем разведения полученного раствора для фиксации и пермеабилизации в соотношении 1:4 в PBS. Приготовьте раствор криоконсервации в виде 30% сахарозы в PBS. Приготовьте разбавляющий буфер в виде 0,1% v/v Triton X-100 в PBS.
  2. Приготовьте реагент для блокировки BSA в виде 1% w/v сывороточного альбумина крупного рогатого скота в буфере для разведения. Приготовьте реагент гепаринового блока в виде 10KU гепариновой натриевой соли в 1 мл PBS. Приготовьте блокирующий буфер, смешав блок-реагент гепарин (1:50) с блок-реагентом Fc (1:100) в блок-реагенте BSA.
  3. Приготовьте красящую смесь в виде антител, титруемых при соответствующих разведениях в блокирующем буфере. Приготовьте отбеливающий раствор, добавив 10 мг LiBH4 в 10 мл ультрачистой воды.

3. Обработка тканей и гроссинг

  1. Осмотрите ткань под микроскопом для вскрытия (обычно с увеличением ~15x, хотя это может варьироваться в зависимости от образца и микроскопа) и удалите жир и кости с помощью щипцов и скальпеля. Чтобы наилучшим образом сохранить ткани, используйте чистые инструменты, работайте на холодной и влажной поверхности, и минимизируйте продолжительность обработки.
  2. Грубые ткани толщиной > 0,5 см на срезы по 4-5 мм скальпелем23. Погрузите срезы в раствор для фиксации и пермеабилизации и вращайте при °C в течение 16 часов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Объем этого раствора и других растворов на шаге 3.3 должен быть примерно в 20 раз больше объема образца в пробирке соответствующего размера.
  3. Переместите салфетку в PBS и прополощите в течение 5 минут. Погрузите ткань в раствор для криоконсервации и инкубируйте при °C в течение 16 часов. Не мойтесь после этого шага, так как это приведет к повторному попаданию воды в ткань.

4. Замораживание тканей

  1. Наклейте этикетку на 6-луночный планшет с информацией об эксперименте и образце над каждой лункой и поместите его в морозильную камеру при температуре -20 °C для охлаждения не менее чем на 20 минут.
  2. Заполните криомолд соответствующего размера составом для оптимальной температуры резки (OCT). Избегайте образования пузырей в ОКТ. Перетащите крупные пузыри к краям криомолда с помощью иглы или наконечника пипетки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Криомолд может быть изготовлен с использованием алюминиевой фольги, обернутой вокруг небольшого флакона или пробирки с плоским дном.
  3. Извлеките ткань из раствора для криоконсервации. Аккуратно промокните салфетку безворсовой салфеткой, чтобы удалить лишнюю жидкость, так как это может нарушить замерзание.
  4. Наполните стакан объемом 250 мл примерно 100-150 мл изопентана в вытяжном шкафу и поместите его в пенопластовую коробку или холодильник, частично заполненный жидким азотом.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Изопентан испаряется, если оставить его открытым более чем на 2 ч; Используйте сразу после вскрытия. Изопентан способствует равномерному и быстрому замораживанию тканей. Изопентан может медленно замерзать с течением времени. Если он застыл в твердом состоянии, снимите стакан с жидким азотом и дайте ему оттаять. Изопентан можно налить в стеклянную бутылку с крышкой для повторного использования до 5 раз. Уровень изопентана должен быть выше, чем жидкого азота, чтобы предотвратить всплытие или опрокидывание стакана.
  5. Отрегулируйте ориентацию ткани в пределах ОКТ по желанию под микроскопом для вскрытия.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для тканей носовых полипов мы обычно ориентируем образец вдоль его длинной оси, чтобы получить симметричные срезы, которые захватывают максимально возможную площадь поперечного сечения. Обратитесь к руководствам по гистологии для интересующей ткани для оптимальной ориентации встраивания.
  6. Опустите дно криомолда в изопентан. Удалите криомолд из изопентана, когда центр ткани станет полностью белым и непрозрачным. Избегайте полного погружения криоформы в воду; Блок может треснуть, что нарушит секционирование.
  7. Аккуратно вытащите блок из криомолда, надавливая на заднюю часть, и поместите его в предварительно охлажденную 6-луночную пластину при температуре -20 °C. После заморозки всех образцов перенесите тарелку в морозильную камеру при температуре -80 °C для длительного хранения.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это точка паузы. Ткани могут храниться при температуре -80 °C в течение многих лет.

5. Подготовка стекла и криосекция

  1. Пипетка 10-1 мкл хромового квасцоволатинового клея на предметные стекла; Равномерно распределите и высушите на воздухе в течение 15 минут. Для оптимальной адгезии нанесите хромированный квасцово-желатиновый клей на камерные защитные стекла в 2-3 раза, добавляя 5 μL за одно применение (всего 15 μL).
  2. После высыхания поместите предметные стекла в духовку при температуре 80 °C на 1 час, чтобы обеспечить полное высыхание. Если вы используете камерное защитное стекло, оставьте его сохнуть при температуре 37 °C на ночь, так как пластик может расплавиться при 80 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: После того, как предметные стекла покрыты и высушены, их можно хранить при комнатной температуре в течение нескольких дней, пока они не будут использованы. Они должны быть накрыты во избежание попадания пыли.
  3. Перенесите ткани с температуры от −80 °C до −20 °C (или в криостат при температуре резки) до равновесия и предварительно охладите в течение 1 часа перед разделением. Вырежьте на криостате 10-2 мкм срезы24.
    1. При разрезании на камерное покровное стекло аккуратно поднимите срез с помощью щипцов после подъема пластины подавления крена. С помощью кисти положите его плашмя на стекло внутри камеры. Надавите большим пальцем под образцом на дне покровного стекла, чтобы расплавить срез на стекле.
  4. Сушите предметные стекла при температуре 3 °C в течение 1 часа или при комнатной температуре в течение 24 часов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если предметные стекла используются немедленно, их можно временно хранить при комнатной температуре в коробке для слайдов, чтобы защитить их от пыли во время подготовки к окрашиванию. Однако, если они не используются сразу, храните их при температуре -80°C, чтобы сохранить целостность тканей. Это точка паузы. Если предметные стекла хранятся при температуре -80 °C, процесс здесь можно приостановить.

6. Блокирование и иммуномаркировка антителами

  1. Нарисуйте круг на стекле вокруг ткани с помощью ПАП-ручки, чтобы создать гидрофобный барьер, который удерживает жидкость во время окрашивания или других этапов. Не проводите поверх ОКТ, так как гидрофобные чернила смоются при растворении ОКТ.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг не требуется для камерного защитного стекла, так как стенки удерживают жидкость в колодце.
  2. Добавьте ~100 μL PBS в каждую ткань и инкубируйте в течение ~2 мин при комнатной температуре, чтобы регидратировать ткани и смыть OCT. Используйте ~1 мл PBS для камерного защитного стекла.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Во избежание отрыва ткани от стекла не впрыскивайте жидкость пипеткой непосредственно на образец.
  3. Отсадите PBS и добавьте 100 мкл блокирующего буфера. Выдерживать при комнатной температуре в закрытой камере с влажностью в течение 1 ч. Используйте ~400 мкл блокирующего буфера для камерного покровного стекла.
  4. Отсадите блокирующий буфер и добавьте 100 мкл красящей смеси. Инкубировать в закрытой влажностной камере, помещенной в холодильник (4 °C) на ночь. Используйте ~400 мкл красящей смеси для камерного покровного стекла. Подготовьте срезы, окрашенные только одним из флуорофоров на панели, и отрицательный контроль без каких-либо пятен, чтобы определить спектр флуорофоров и автофлуоресценцию тканей.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Разведения антител следует оптимизировать экспериментально путем титрования до 1:50, 1:100 и 1:200 или другого разведения по мере необходимости. Выберите минимальное количество антител, которое даст оптимальный сигнал. Стремитесь к тому, чтобы интенсивность всех антител на панели была примерно одинаковой, чтобы максимизировать эффективность спектрального несмешивания. Защищайте образцы от света после этого шага, чтобы свести к минимуму фотообесцвечивание флуорофоров.
  5. Окрашивающее вещество аспират смешайте и промойте 3 раза PBS (10 μл, 2 мин каждый), отсасывая жидкость между каждым мытьем. Используйте ~1 мл PBS для камерного защитного стекла.
  6. Добавьте ~10 μL монтажного материала в каждую секцию. Делайте пипетку медленно, чтобы избежать образования пузырьков воздуха, которые могут создавать оптические аберрации во время визуализации. Отсадите образующиеся пузырьки с помощью пипетки. Для камерного покровного стекла добавьте 1 мл монтажного материала в каждую лунку.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие шаги, 6.7 и 6.8, не требуются для камерного защитного стекла.
  7. Аккуратно наложите на образец покровное стекло No 1 22 мм x 50 мм.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Образование пузырьков можно свести к минимуму, плотно прижав один конец защитного стекла к монтажному материалу и позволив стеклу упасть на образец, равномерно распределив среду. Толщина покровного стекла должна соответствовать техническим характеристикам объектива (например, покровное стекло #1.5 для большинства объективов с большой числовой апертурой). Если линза объектива оснащена корректирующим кольцом, убедитесь, что оно отрегулировано в соответствии с правильным размером покровного стекла. Использование неправильной настройки толщины или воротника может привести к сферической аберрации и привести к размытию или искажению изображения.
  8. Переверните ползунок и осторожно нажмите на безворсовую салфетку, чтобы вытолкнуть излишки монтажной среды.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте нажатия на слайд со слишком большим усилием. Чрезмерное усилие может повредить или деформировать ткань, что может повлиять на выравнивание между раундами визуализации.

7. Настройка микроскопа и визуализация

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол относится конкретно к ZEISS LSM980 и другим системам ZEISS. В других системах эти шаги могут отличаться. Подробно описаны два рабочих процесса: традиционный конфокальный + разъединение (многодорожечное сканирование с вычислительным спектральным разъединением после специальности), который можно использовать, когда спектральный детектор недоступен, но который имеет более длительное время сбора данных и некоторое остаточное просвечивание; и полное спектральное детектирование (однопроходный, 34-канальный спектральный захват), наш предпочтительный метод, поскольку он обеспечивает наилучший SBR, почти нулевые перекрестные помехи и самое быстрое время визуализации.

  1. Традиционная конфокальная микроскопия
    1. Включите систему микроскопа (включая лазеры, детекторы и компьютер) примерно за 30 минут до получения изображения.
    2. На экране управления микроскопом, который можно открыть, щелкнув « Микроскоп» > «Объективы», выберите подходящий объектив (например, 20x 0,8 NA) и при необходимости очистите его салфеткой, безопасной для линз.
    3. Надежно закрепите образец на сцене. Попытайтесь выровнять стеклянную камеру или камеру крышного стекла по одному и тому же углу/концу держателя предметной затвора, чтобы облегчить выравнивание последовательных раундов по X-Y. Это будет зависеть от установленного держателя.
    4. Сфокусируйтесь на образце с помощью окуляров на подсветке GFP, YFP или RFP, затем переключитесь на вкладку «Съемка» на экране компьютера.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не используйте фильтр DAPI при фокусировке образца с помощью окуляров, так как воздействие на пятно DAPI ультрафиолетового света (с помощью куба фильтра DAPI) приведет к его фотопревращению в зелено-флуоресцентную молекулу (дополнительный рисунок 1A).
    5. Настройте треки визуализации, которые сводят к минимуму перекрытие и перекрестное лазерное возбуждение (в дополнительной таблице 1, в дополнительной таблице 2 приведены настройки сбора данных для традиционных экспериментов с конфокальной микроскопией, показанных здесь).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Идеальные комбинации включают в себя различные пики возбуждения и излучения, такие как DAPI или AF488, вместе с AF594, AF647 или AF700.
      1. Назначьте оптимальные лазеры возбуждения для каждой дорожки. Отрегулируйте размер точечного отверстия до 1 а.е. или Airy Unit для каждой дорожки для оптимального оптического сечения.
      2. Отрегулируйте диапазон длин волн регистрации для каждого настраиваемого детектора на дорожке отдельно, в соответствии с флуорофорами для дорожки.
      3. Настройте мощность лазера и коэффициент усиления детектора, чтобы максимизировать SBR. Убедитесь, что очень небольшое количество пикселей, если таковые имеются, достигает максимальной интенсивности.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы избежать фотообесцвечивания и/или передержки детекторов, держите мощность лазера как можно ниже. Оптимизируйте разведение антител таким образом, чтобы сильный сигнал обнаруживался над фоном.
    6. Нажмите кнопку Режим непрерывного сканирования для предварительного просмотра образца и установки параметров сканирования (скорость сканирования, разрешение и усреднение при необходимости).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для небольших плиток и для минимизации фона рекомендуется время выдержки от 0,2 до 0,3 μс с 1-2 усредняющими раундами. Чтобы максимизировать скорость сканирования с сохранением сегментации и разрешения для отдельных ячеек, используйте самую высокую скорость сканирования без усреднения и размер пикселя 0,2-0 мкм/пиксель. Например, изображение с разрешением 2048 x 2048 пикселей на тайл с объективом 20x/0,80 NA дает 0,20 мкм/пиксель на поле размером 424,26 x 424,2мкм2.
    7. Выполните тестовое сканирование для каждой дорожки, чтобы проверить наличие перекрестных помех или просвечивания.
      1. На предметном стекле, испачканном всеми маркерами, в режиме непрерывного сканирования запускайте каждый лазер на малой мощности и поднимайте его только до тех пор, пока маркер не станет хорошо виден без насыщения (используйте индикатор LUT/насыщенности).
        ПРИМЕЧАНИЕ: По возможности рекомендуется использовать повторяющийся образец или нежелательную область для оптимизации настроек микроскопа перед получением изображения экспериментального образца. Это особенно важно при окрашивании DAPI (чтобы избежать риска фотоконверсии) или флуорофорами, которые быстро отбеливаются (например, PE).
      2. Перейдите к элементу управления с одним пятном для этого флуорофора. Отрегулируйте мощность лазера и усиление детектора, чтобы сигнал был ярким и ненасыщенным.
      3. На том же предметном стекле с одним пятном отсканируйте все остальные каналы обнаружения. Если внеканальная интенсивность превышает фоновую интенсивность, сузьте окно обнаружения и/или уменьшите возбуждение/усиление.
      4. Повторите пункты 7.1.7.1-7.1.7.2 для каждого флуорофора. После любой корректировки кратко проверьте ранее оптимизированные пятна, чтобы сохранить сопоставимость интенсивности, особенно для маркеров, которые совпадают.
    8. Включите функцию Мозаики и определите область сбора плиток.
      1. Оптимизируйте фокус для области захвата плитки в центре ткани. Найдите уникальный признак (набор ячеек в определенном распорядке) в качестве ориентира для выравнивания в последующих раундах.
    9. Включите функцию Z-стека и перейдите на вкладку Z-стек. Перейдите на вкладку «Центр». Установите количество срезов в Z-стеке не менее 6 с интервалом не менее 1 мкм между срезами. Затем нажмите кнопку « По центру », чтобы расположить текущую точку фокусировки (определенную на шаге 6.1.8.1) в качестве среднего среза стопки.
    10. Нажмите кнопку Начать эксперимент , чтобы начать получение изображений. Сохраните настройки съемки и создайте резервную копию данных изображения, щелкнув правой кнопкой мыши миниатюру изображения и выбрав «Сохранить как». Затем выберите расположение файла и присвойте изображению имя.
    11. Восстановите микширование изображения, используя те же оптимизированные настройки, что и при съемке мозаичной области, сделайте снимок с каждого элемента управления с одним пятном для получения истинного спектра сигнала и с неокрашенного элемента управления для захвата фона/автофлуоресценции, подготовленного на шаге 6.4.
      1. Эти изображения используются для спектрального расмешивания; Не выбирайте истинный сигнал из мультиплексированных сэмплов. Убедитесь, что выбранная область действительно представляет сигнал, сначала убедившись, что интенсивность/морфология отсутствует или эквивалентна фону в неокрашенном контроле, а затем сопоставьте ожидаемую локализацию маркера (например, мембранный vs ядерный, цитоплазматический или секретируемый паттерны).
      2. Откройте изображение снимка. Перейдите на вкладку «Размножение ». Используйте один из инструментов выбора региона на вкладке Инструменты для восстановления смешивания, чтобы нарисовать ROI вокруг положительного сигнала (появится спектр этой области). Повторите это для каждого снимка каждого флуорофора, чтобы создать эталонные спектры для несмешивания.
        1. Сравните этот спектр с теоретическим спектром флуорофора, чтобы убедиться, что выбранная область является репрезентативной для истинного сигнала. Назовите спектр в соответствии с каждым флуорофором и сохраните его в спектральной базе данных.
          ПРИМЕЧАНИЕ: Спектр для автофлуоресценции может быть идентифицирован и обработан как отдельный флуорофор, чтобы отделить его от других сигналов. После полной оптимизации панели получение новых ссылок не требуется, так как можно повторно использовать те же настройки, если используется тот же протокол и тип ткани.
      3. Загрузите мозаичное изображение и перейдите к инструменту «Отмена смешивания». Используйте кнопку +, чтобы добавить эталонные спектры для каждого флуорофора в список восстановления смешивания, затем нажмите кнопку Линейное расмешивание .
    12. Сохраните несмешанное изображение для последующего анализа.
      ПРИМЕЧАНИЕ: На выходе получается изображение с несколькими плитками и каналом для каждого маркера. Здесь эксперимент можно поставить на паузу, прежде чем продолжить.
    13. Получение эталонного изображения затенения
      1. Используя ту же настройку, которая использовалась для изображения образца, получите изображение калибровочного предметного стекла DAPI. Сохраните изображение, а затем извлеките только канал DAPI, который будет использоваться в качестве эталона затенения. На выходе получается изображение плоского поля (дополнительный рисунок 1B).
        ПРИМЕЧАНИЕ: Эталонное изображение не обязательно должно быть получено для каждого образца. Если используется один и тот же инструмент с теми же настройками, референс должен быть одним и тем же. В этой ссылке нет необходимости, если полученные изображения не имеют артефактов затенения, как показано на дополнительном рисунке 1C.
  2. Спектральная конфокальная микроскопия
    1. Включите систему микроскопа (включая лазеры, детекторы и компьютер). Выберите подходящий объектив (например, 20x 0,8 NA или любой другой объектив) и при необходимости очистите.
    2. Надежно закрепите образец на сцене. Убедитесь, что чехол направлен на цель.
    3. Сфокусируйтесь на образце с помощью светлого поля или DIC, затем переключитесь в режим флуоресценции. Настройка спектрального захвата. В дополнительной таблице 3 приведены настройки сбора данных для экспериментов спектральной конфокальной микроскопии, показанных здесь.
      1. Назначьте правильные лазеры.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Некоторые лазеры могут возбуждать несколько флуорофоров. Таким образом, может не быть необходимости иметь уникальный лазер для каждого флуорофора.
      2. Выберите светоделитель, подходящий для используемых лазерных линий. Позвольте всем детекторам захватывать как можно большую часть спектра. Отрегулируйте размер точечного отверстия до 1 а.е. для оптимальной оптической секции.
    4. Оптимизируйте настройку лазера
      1. Используя участок, окрашенный всеми маркерами, запустите режим непрерывного сканирования лазерами на малой мощности. Настраивайте интенсивность для каждого лазера до тех пор, пока маркеры не будут идентифицированы при хорошем SBR.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Хотя это не позволит точно настроить спектрально перекрывающиеся флуорофоры, это поможет свести к минимуму количество переключений одинарных стекол на микроскопе.
      2. Используйте секции с одним окрашиванием для точной настройки интенсивности лазера для каждого флуорофора. Итеративно переключайтесь с участков с одним пятном обратно на участок со всеми маркерами до тех пор, пока сигнал каждого маркера не будет визуализирован без перенасыщения.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Каждый раз при регулировке интенсивности или усиления лазера возвращайтесь к ранее оптимизированным предметным стеклам с одним пятном, чтобы убедиться, что сигнал остается оптимальным. Для наиболее оптимального несмешивания уровни интенсивности сигнала должны быть как можно более схожими между маркерами, особенно среди маркеров, которые колокализуются. По возможности рекомендуется использовать повторяющийся образец или нежелательную область для оптимизации настроек микроскопа перед получением изображения экспериментального образца. Это особенно важно при окрашивании DAPI (чтобы избежать риска фотоконверсии) или флуорофорами, которые быстро отбеливаются (например, PE).
    5. Выполните шаги 7.1.8 - 7.1.14.

8. Снятие покровного стекла (относится только к предметным стеклам, а не к камерному покровному стеклу)

  1. Погрузите предметное стекло в PBS и дайте покровному стеклу отсоединиться. Не пытайтесь с силой снять покровное стекло, так как это может привести к деформации ткани, что приведет к проблемам с выравниванием в последующих раундах визуализации или полному отслоению от предметного стекла. Используйте контейнер, достаточно большой, чтобы вместить предметное стекло, и убедитесь, что он может быть полностью погружен в PBS.

9. Отбеливание флуорофорами и циклирование

  1. Только для камерного покровного стекла: Отберите как можно больше монтажной среды с помощью пипетки, стараясь не повредить ткань.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Наклон камеры в сторону может облегчить аспирацию.
  2. Промойте PBS 3 раза ~1 мл (камерное защитное стекло) или ~100 мкл (предметные стекла) PBS в течение 2 минут, пока монтажный материал не будет полностью удален.
  3. Приготовьте отбеливающий раствор в вытяжном шкафу. Взвесьте 10 мг LiBH4 непосредственно в сухой стакан с помощью микрошпателя. Осторожно добавьте 10 мл сверхчистой воды непосредственно в стакан, содержащий LiBH4 , и перемешайте до полного растворения, чтобы получить отбеливающий раствор.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте непосредственно перед использованием для максимальной реакционной способности.
    ВНИМАНИЕ: LiBH4 чрезвычайно легко воспламеняется, поэтому этот шаг требует особой осторожности - убедитесь, что вытяжной шкаф используется правильно (т.е. створка на соответствующей высоте, подходящие СИЗ и т.д.) и работайте только с <10 мг LiBH4 за раз. Убедитесь, что стакан полностью высох, прежде чем добавлять LiBH4 - невыполнение этого требования может привести к возгоранию.
  4. Добавьте ~100 мкл отбеливающего раствора с помощью стеклянной пастеровской пипетки в каждый участок ткани и инкубируйте при комнатной температуре в вытяжном шкафу в течение 15 минут. Используйте 2 мл отбеливающего раствора для предметных стекол камеры.
  5. При отбеливании красителями BV (например, BV421, BV510 и т.д.) осторожно переместите лунку в эпифлуоресцентный микроскоп. Выберите фильтр DAPI, сфокусируйте образец и подсветите его на полную мощность.
    1. Используйте объектив с 5-кратным увеличением для большего поля освещения. Опустите ступень как можно ниже, чтобы предотвратить повреждение целей и корпуса.
  6. Сцедите раствор LiBH4 из лунки с помощью стеклянной пастеровской пипетки и добавьте его обратно в стакан с раствором LiBH4 .
    ПРИМЕЧАНИЕ: Теперь это отходы LiBH4; Раствор не может быть сохранен для использования в будущем.
  7. Промойте предметные стекла 3 раза с буфером для разбавления и инкубируйте ~3 минуты. Общий объем составляет 2 мл для предметных стекол камеры.
  8. Добавьте смесь антител и окрашивайте в соответствии с обычным протоколом (шаги 6.3 - 6.8).
  9. Добавьте 2N H2SO4 по каплям в отработанный LiBH4 в вытяжном шкафу, регулярно перемешивая.
    ВНИМАНИЕ: LiBH4 будет агрессивно пузыриться. Эти пузырьки представляют собой газH2 , высвобождаемый из LiBH4; H2 очень легко воспламеняется, поэтому будьте предельно осторожны на этом этапе и добавляйте H2SO4 очень медленно.
  10. Налейте его в впитывающую пеленку, когда раствор перестанет пузыриться. Промойте стакан сверхчистой водой и вылейте его в впитывающую пеленку.
    ВНИМАНИЕ: Положите впитывающую пеленку в пакет с химическими/биологически опасными веществами, закрепите его и утилизируйте в соответствии с местными рекомендациями по химической опасности.

10. Обработка изображений после получения

  1. Откройте эталонное изображение (из шага 7.1.14) в программе Zen, нажав Файл > Открыть > Выбрать эталонное изображение.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы этапы обработки изображений после получения изображений могут быть выполнены в программных пакетах с открытым исходным кодом. (например, ImageJ).
  2. Отрегулируйте яркость и контрастность для оптимизации динамического диапазона, нажав «Обработка > «Интенсивность» > «Контрастность», «Растянуть» > «Авто» > «Применить».
  3. Измените тип пикселя на 32-битный, нажав Обработка > Изображение > Преобразовать тип пикселя > 32 бит (Float).
  4. Нормализуйте эталонное изображение, нажав Обработка > интенсивность > Нормализовать (насыщенные пиксели = 0%) > Применить.
  5. Сгладьте исходное изображение, нажав Обработка > Сгладить > Гауссов > ввести радиус (например, 2-5 пикселей) > Применить (Дополнительный рисунок 1B).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Оптимизируйте радиус размытия по Гауссу, пробуя разные значения. Чтобы узнать правильное значение, разделите (Process > Image calculator) необработанное эталонное изображение на обработанное изображение и результирующее изображение должно иметь одинаковую интенсивность (все пиксели примерно одинакового значения).
  6. Откройте изображение с несколькими плитками, которое нужно исправить, нажав Файл > Открыть > выберите изображение с несколькими плитками.
  7. Примените сшивку и коррекцию затенения по обработанному образцу, щелкнув Обработка > Сшивка со следующими параметрами.
    1. Поставьте галочку в окошке смешивания. Отметьте галочкой правильное затенение и в выпадающем меню выберите обработанное эталонное изображение (шаг 10.5). Все остальные параметры оставьте прежними.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Параметры могут нуждаться в настройке для получения наилучших результатов.
    2. В меню «Ввод/вывод» выберите изображение с несколькими фрагментами в качестве входных данных и ссылку на затенение в качестве эталона.
    3. Нажмите кнопку «Применить » вверху, и будет сгенерировано новое изображение со сшивкой и коррекцией затенения (Дополнительный рисунок 1D).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Коррекция сшивки (Дополнительный рисунок 1I-J) необходима для обеспечения точности выравнивания изображения на более поздних этапах процесса.
    4. Сохраните исправленное изображение, нажав «Файл» > «Сохранить» > выбрать папку.

11. Выравнивание изображения

  1. Конвертируйте обработанные изображения из любого формата (.czs, .tif и т. д.) в формат Imaris с помощью инструмента Конвертер файлов Imaris.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Инструмент можно загрузить и установить, следуя инструкциям на этом веб-сайте (https://imaris.oxinst.com/microscopy-imaging-software-free-trial#file-converter).
  2. Запустите инструмент регистрации расширений Imaris, чтобы зарегистрировать (выровнять) изображения из всех раундов в одно изображение со всеми каналами.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы установить инструмент и успешно выровнять изображения, следуйте инструкциям на следующем веб-сайте (https://github.com/niaid/imaris_extensions).
  3. Нажмите кнопку « Расширения Имариса ». Выберите SimpleITK Utilities > Экспорт настроек канала в CSV.
  4. Нажмите «Обзор», перейдите к изображению .ims (из одного из раундов), выберите его и нажмите «Открыть».
  5. Нажмите «Экспорт» и выберите место для сохранения файла CSV. Введите имя и нажмите Сохранить.
  6. Откройте сохраненный CSV-файл и убедитесь, что названия каналов указаны правильно. При необходимости отредактируйте.
  7. Если изменения были внесены, перейдите в Расширения Imaris > Утилиты SimpleITK > Пакетная настройка параметров канала.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг не нужен, если на предыдущем шаге не вносились изменения.
  8. Нажмите «Обзор», перейдите к файлу CSV, выберите его и нажмите «Открыть». Нажмите «Далее», затем «Обзор» еще раз, чтобы выбрать то же изображение .ims, и нажмите «Открыть».
  9. Нажмите кнопку Настроить, чтобы применить изменения. Повторите шаги 11.3-11.8 для всех изображений из разных раундов.
  10. После того, как каналы будут правильно названы, перейдите к разделу Расширения Imaris > алгоритмы SimpleITK > аффинной регистрации z-стеков с использованием общего канала.
  11. Нажмите «Обзор», перейдите в папку со всеми раундами, выберите все изображения и нажмите «Открыть».
  12. Нажмите Далее, выберите канал регистрации (реперный канал). Для этого протокола использовался канал DAPI. Затем выберите фиксированное изображение.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Выберите канал/маркер, который остается неизменным на протяжении всего раунда и устойчив к химическому или фотообесцвечиванию (например, ядерные красители, такие как DAPI). Затем выберите фиксированное изображение.
  13. Нажмите «Дополнительные настройки регистрации», отметьте все флажки, кроме «Автомаска», и установите сигму сглаживания Гаусса на 5.0.
  14. Нажмите «Готово», затем «Зарегистрироваться», чтобы выполнить выравнивание. После завершения регистрации нажмите «Изменить образец» и «Сохранить объединенное изображение».
  15. После повторной выборки выберите реперный канал и нажмите кнопку Рассчитать корреляцию. Выходные файлы включают в себя выровненное изображение output.ims, два PDF-файла, показывающих качество выравнивания до и после регистрации, файл JSON, содержащий настройки, использованные для регистрации, и файл TXT с журналом всего процесса.

12. Выравнивание изображения

  1. Сегментация ячеек/объектов с помощью CellPose (v2.5)25
  2. Для каждого набора данных с одним пятном создайте одну маску сегментации из собственного канала обнаружения маркера (Пример: для одиночного пятна CD20 создайте маску из канала обнаружения AF488 (предназначенного канала для CD20)).
  3. Примените маску сегментации из шага 2 к каждому каналу в одном и том же наборе данных (в примере CD20 маска, производная от AF488, применяется к AF488 для измерения истинного сигнала и ко всем другим каналам обнаружения для измерения утечки).
  4. Извлекайте интенсивность и площади для каждого объекта в Python с помощью scikit-image (regionprops_table) и NumPy.
  5. Отношение сигнал/фон (SBR)
    1. Вычисление средней интенсивности объекта по всем сегментированным ROI в предполагаемом канале обнаружения маркера.
    2. Определите интенсивность фона как среднюю интенсивность всех пикселей за пределами ROI в одном поле зрения, за исключением отступов с нулевым значением или пикселей за пределами поля.
      Рассчитайте SBR следующим образом:
      figure-protocol-1
    3. Визуализируйте распределения SBR с помощью графиков скрипки, отображая значения для каждого объекта в виде точек (или значения для каждого поля, если указано).
  6. Количественная оценка сквозной утечки
    1. Для каждого непредусмотренного канала выполните вычисление фильтрации (%) с использованием тех же ROI из маски на шаге 12.2:
      figure-protocol-2
    2. ПРИМЕЧАНИЕ: диагональные входы равны 100%, так как в предполагаемом канале однопятнистого изображения числитель и знаменатель идентичны (истинный сигнал маркера измеряется в своем собственном канале).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Двумя фундаментальными проблемами, с которыми сталкиваются методы иммунофлуоресцентной визуализации, являются неспецифическое связывание зондов флуорофор-конъюгированных антител и тканевая аутофлуоресценция. Этот протокол разработан для того, чтобы помочь отличить истинный сигнал от фонового для оптимизации методов мультиплексной иммунофлуоресценции.

Блокирование гепарина снижает связыва...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Spectral IBEX, адаптация протокола IBEX, успешно решает две ключевые проблемы иммунофлуоресцентной визуализации: неспецифическое связывание и автофлуоресценция. Обработка высокоэозинофильных тканей гепарином и использование спектрального расмешивания для устранения автофлуоресценции и спектрального перекрытия между каналами значительно увеличили обнаружение истинного сигнала над фоном. Захват всех маркеров за один проход сокращает время захвата, что может увеличить скорость циклирования ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

JFEK, MJ получают финансирование от ALK Abello A/S. JFEK получает гонорары за консультации от Merida Biosciences.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы благодарим докторов Андреа Радтке и Зива Янива за их поддержку во время адаптации и итерации IBEX. Мы благодарим докторов Жуана Бронзе де Фирмино и Муханада Баби за поддержку в области микроскопии и устранение неполадок, а также Центр передовой световой микроскопии в Макмастере за доступ к их микроскопам. Благодарим Тину Уолкер (Tina Walker), Цзяньпин Вэнь (Jianping Wen) и Рангана Талпе Гуруге (Rangana Talpe Guruge) за техническую поддержку. Эта работа поддержана рецензируемым грантом на исследования пищевой аллергии, совместно финансируемым Институтом инфекций и иммунитета CIHR (CIHR-III), Институтом сердечно-сосудистого и респираторного здоровья CIHR (CIHR-ICRH) и Канадским фондом аллергии, астмы и иммунологии (CAAIF). Эта работа финансировалась Канадским институтом исследований в области здравоохранения (PJT-198169; JFEK), J.P. Bickell Foundation Medical Research Grant (JFEK), Канадский фонд аллергической астмы и иммунологии (JFEK, MJ), Канадское общество аллергии и клинической иммунологии (VO, MJ), Фонд Шредера (JFEK, SW, MJ), Food Allergy Canada (JFEK, SW, MJ), ALK Abello A/S (JFEK, MJ), Zych Family (SW, MJ), Buckrell Family (JFEK), Ontario Graduate Scholarship (SD) и программа бакалавриата медицинских наук в Университете Макмастера (VO).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
2N раствор серной кислоты (H2SO4)Н/ДН/ДВсё, что доступно или используется в лаборатории
Стакан объёмом 500 млН/ДН/ДВсё, что доступно или используется в лаборатории
Пластина с 6 колодцямиН/ДН/ДВсё, что доступно или используется в лаборатории
Bcl-6 — Alexa Fluor 647BD Biosciences561525Коэффициент разбавления 1:100
Набор для фиксации цитофикса/цитопермы BDBD Biosciences554722
Настольный микроскоп для диссекцииН/ДН/ДВсё, что доступно или используется в лаборатории
Бычий сывороточный альбумин (BSA)СИГМА-ОЛДРИЧA4503
CD11c - Alexa Fluor 700BD Biosciences561352Коэффициент разбавления 1:100
CD138/Syndecan-1 - PEBioLegend356503Коэффициент разбавления 1:200
CD20 - Alexa Fluor 488Инвитроген53020282Коэффициент разбавления 1:100
CD21 - Alexa Fluor 532NovusBioNBP2-60733AF532Коэффициент разбавления 1:100
CD23 - физкультураBioLegend338507Коэффициент разбавления 1:200
CD3 — iFluor 594AAT Bioquest100320C0Коэффициент разбавления 1:100
CD31 - Alexa Fluor 700BioLegend303134Коэффициент разбавления 1:100
CD34 - iFluor 594AAT Bioquest103400C0Коэффициент разбавления 1:100
CD38 - Alexa Fluor 700BioLegend303523Коэффициент разбавления 1:100
CD4 - Alexa Fluor 647BioLegend300520Коэффициент разбавления 1:100
CD45 - Alexa Fluor 532ThermoFisher Scientific58045942Коэффициент разбавления 1:100
CD54/ICAM-1 - Alexa Fluor 647BioLegend353113Коэффициент разбавления 1:100
Хромовый алюм-желатиновый клейСнабжение новичков1033A
КриомолдFisher Scientific NC9511236Также есть каталог No50-465-347 для крупных образцов
Слайд калибровки DAPIAgar ScientificAG2273
Раствор DAPI, 1 мг/млThermoFisher Scientific62248Коэффициент разбавления 1:3000
E-cadherin/CD324 - Alexa Fluor 647BioLegend147307Коэффициент разбавления 1:100
EpCAM/CD326 - Alexa Fluor 594BioLegend324228Коэффициент разбавления 1:100
Трубы Эппендорфа/ФальконаН/ДН/ДВсё, что доступно или используется в лаборатории
Флуоромонт-GSouthernBiotech0100-01
ЩипцыН/ДН/ДВсё, что доступно или используется в лаборатории
FoxP3 - eFluor 660ThermoFisher Scientific50577382Коэффициент разбавления 1:100
Матовые конечные стекли микроскопаХимическая наукаGEW45-2575-W
GL7 - Alexa Fluor 488ThermoFisher Scientific53590282Коэффициент разбавления 1:100
Соль натрия гепаринаСИГМА-ОЛДРИЧH339310KU
HLA-DR - PENovusBioNB100-77855PEКоэффициент разбавления 1:200
Human TruStain FcX (раствор блокировки FC-рецепторов)BioLegend422302Коэффициент разбавления 1:100
Камера влажностиН/ДН/ДВсё, что доступно или используется в лаборатории
Ведро для льда с крышкойН/ДН/ДВсё, что доступно или используется в лаборатории
IgD - Alexa Fluor 488BioLegend348215Коэффициент разбавления 1:100
IL4Ra/CD124 - PEBioLegend144803Коэффициент разбавления 1:200
Конвертер файлов ImarisИнструменты OXFORDН/ДПокрытие любого формата изображения в формате .ims (https://imaris.oxinst.com/microscopy-imaging-software-free-trial#file-converter)
Изопентан (2-метилбутан)Н/ДН/ДВсё, что доступно или используется в лаборатории
Ki-67 — Alexa Fluor 488BD Biosciences558616Коэффициент разбавления 1:100
Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipers, 1-слойныйКимтех Сайънс06-666
Крупные (то есть 25 см длиной) щипцыН/ДН/ДВсё, что доступно или используется в лаборатории
Жидкий азотН/ДН/ДВсё, что доступно или используется в лаборатории
Литий-борогидрид (LiBH4)СИГМА-ОЛДРИЧ222356
MECA-79 - Alexa Fluor 488Инвитроген53603680Коэффициент разбавления 1:100
Стекло крышки микроскопа No1 22x50 ммFisher Scientific 12-542A
Вода Milli-QН/ДН/ДВсё, что доступно или используется в лаборатории
MUC2 - Alexa Fluor 488NovusBioNB120-11197AF488Коэффициент разбавления 1:100
Камерное стекло Nunc Lab-TekThermoFisher Scientific155380
PAP ручкаAbcamAB2601
Раствор с фосфатным буфером (PBS)Н/ДН/ДВсё, что доступно или используется в лаборатории
СкальпельН/ДН/ДВсё, что доступно или используется в лаборатории
Расширения SimpleITK ImarisН/ДН/ДПрограммное обеспечение, используемое для выравнивания изображений из разных раундов (https://github.com/niaid/imaris_extensions)
СахарозаСИГМА-ОЛДРИЧS0389
Tissue-Tek O.C.T. CompoundСакура Финетек США4583
Triton X-100СИГМА-ОЛДРИЧX100
Zeiss LSM 980Микроскопия ZEISSН/ДСистема визуализации, использованная в этом исследовании
Zen BlueМикроскопия ZEISSН/ДПрограммное обеспечение, используемое для обработки изображений после получения

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hagios, C., Lochter, A., Bissell, M. J. Tissue architecture: The ultimate regulator of epithelial function. Philosoph Trans Royal Soc B: Biol Sci. 353 (1370), (1998).
  2. Mincarelli, L., Lister, A., Lipscombe, J., Macaulay, I. C. Defining Cell Identity with Single-Cell Omics. Proteomics. 18 (18), (2018).
  3. Macaulay, I. C., Voet, T. Single Cell Genomics: Advances and Future Perspectives. PLoS Genet. 10 (1), (2014).
  4. de Vries, N. L., Mahfouz, A., Koning, F., de Miranda, N. F. C. C. Unraveling the Complexity of the Cancer Microenvironment With Multidimensional Genomic and Cytometric Technologies. Front Oncol. , 10(2020).
  5. van Dam, S., Baars, M. J. D., Vercoulen, Y. Multiplex Tissue Imaging: Spatial Revelations in the Tumor Microenvironment. Cancers. 14 (13), (2022).
  6. Bressan, D., Battistoni, G., Hannon, G. J. The dawn of spatial omics. Science. 381 (6657), (2023).
  7. Williams, C. G., Lee, H. J., Asatsuma, T., Vento-Tormo, R., Haque, A. An introduction to spatial transcriptomics for biomedical research. Gen Med. 14 (1), (2022).
  8. Ståhl, P. L., et al. Visualization and analysis of gene expression in tissue sections by spatial transcriptomics. Science. 353 (6294), (2016).
  9. Pascal, L. E., et al. Correlation of mRNA and protein levels: Cell type-specific gene expression of cluster designation antigens in the prostate. BMC Genom. 9, (2008).
  10. Patel, S. S., Rodig, S. J. Overview of Tissue Imaging Methods. Methods Mol Biol. 2055, (2020).
  11. Ohno, M., Karagiannis, P., Taniguchi, Y. Protein expression analyses at the single cell level. Molecules. 19 (9), (2014).
  12. Zimmermann, T., Marrison, J., Hogg, K., O’Toole, P. Clearing up the signal: Spectral imaging and linear unmixing in fluorescence microscopy. Methods Mol Biol. , 1075(2014).
  13. Radtke, A. J., et al. IBEX: an iterative immunolabeling and chemical bleaching method for high-content imaging of diverse tissues. Nat Protoc. 17 (2), (2022).
  14. Radtke, A. J., et al. IBEX: A versatile multiplex optical imaging approach for deep phenotyping and spatial analysis of cells in complex tissues. Proc Natl Aca Sci U S A. 117 (52), (2020).
  15. Kothurkar, A. A., et al. ’Iterative Bleaching Extends Multiplexity’ facilitates simultaneous identification of all major retinal cell types. J Cell Sci. 137 (23), (2024).
  16. Cohn, D. E., et al. Delineating spatial cell-cell interactions in the solid tumour microenvironment through the lens of highly multiplexed imaging. Front Immunol. 14, (2023).
  17. Radtke, A. J., et al. IBEX: An open and extensible method for high content multiplex imaging of diverse tissues. arXiv. , (2021).
  18. Radtke, A. J., et al. The IBEX Knowledge-Base: A central resource for multiplexed imaging techniques. PLoS Biol. 23 (3), e3003070(2025).
  19. Croce, A. C. Light and Autofluorescence, Multitasking Features in Living Organisms. Photochem. 1 (2), (2021).
  20. Wizenty, J., et al. Autofluorescence: A potential pitfall in immunofluorescence-based inflammation grading. J Immunol Methods. 456, (2018).
  21. Donaldson, J. G. Immunofluorescence Staining. Curr Protoc Cell Biol. 69 (1), 4.3.1-4.3.7 (2015).
  22. Sicherre, E., Favier, A. L., Riccobono, D., Nikovics, K. Non-specific binding, a limitation of the immunofluorescence method to study macrophages in situ. Genes. 12 (5), (2021).
  23. Monique Hartlen Histotechnology Lab Manual. , NSCC. (2022).
  24. Stephen Peters Frozen Section Technique. , Pathology Innovations, LLC. https://pathology-innovations.squarespace.com/frozen-section-technique (2023).
  25. Stringer, C., Wang, T., Michaelos, M., Pachitariu, M. Cellpose: a generalist algorithm for cellular segmentation. Nat Methods. 18 (1), (2021).
  26. Mayeno, A. N., Hamann, K. J., Gleich, G. J. Granule-associated flavin adenine dinucleotide (FAD) is responsible for eosinophil autofluorescence. J Leukocyte Biol. 51 (2), (1992).
  27. Jenvey, C. J., Stabel, J. R. Autofluorescence and Nonspecific Immunofluorescent Labeling in Frozen Bovine Intestinal Tissue Sections: Solutions for Multicolor Immunofluorescence Experiments. J Histochem Cytochem. 65 (9), (2017).
  28. Vlaminck, S., et al. The importance of local eosinophilia in the surgical outcome of chronic rhinosinusitis: A 3-year prospective observational study. Am J Rhinol Allergy. 28 (3), (2014).
  29. Skinner, B. M., Johnson, E. E. P. Nuclear morphologies: their diversity and functional relevance. Chromosoma. 126 (2), (2017).
  30. Duhamel, R. C., Johnson, D. A. Use of nonfat dry milk to block nonspecific nuclear and membrane staining by avidin conjugates. J Histochem Cytochem. 33 (7), (1985).
  31. Valnes, K., Brandtzaeg, P. Selective inhibition of nonspecific eosinophil staining or identification of eosinophilic granulocytes by paired counterstaining in immunofluorescence studies. J Histochem Cytochem. 29 (5), (1981).
  32. Panchuk-Voloshina, N., et al. Alexa dyes, a series of new fluorescent dyes that yield exceptionally bright, photostable conjugates. J Histochem Cytochem. 47 (9), (1999).
  33. Bystrom, J., Amin, K., Bishop-Bailey, D. Analysing the eosinophil cationic protein - a clue to the function of the eosinophil granulocyte. Respiratory Res. , 12(2011).
  34. Rahman, A. H., Tordesillas, L., Berin, M. C. Heparin reduces nonspecific eosinophil staining artifacts in mass cytometry experiments. Cyt Part A. 89 (6), (2016).
  35. Saitou, T., et al. Tissue intrinsic fluorescence spectra-based digital pathology of liver fibrosis by marker-controlled segmentation. Front Med. 5 (DEC), (2018).
  36. Acuña-Rodriguez, J. P., Mena-Vega, J. P., Argüello-Miranda, O. Live-cell fluorescence spectral imaging as a data science challenge. Biophys Rev. 14 (2), (2022).
  37. Constantinou, P., Dacosta, R. S., Wilson, B. C. Extending immunofluorescence detection limits in whole paraffin-embedded formalin fixed tissues using hyperspectral confocal fluorescence imaging. J Microscopy. 234 (2), (2009).
  38. Enninful, A., Baysoy, A., Fan, R. Unmixing for ultra-high-plex fluorescence imaging. Nat Comm. 13 (1), (2022).
  39. Chang, Q., et al. Imaging Mass Cytometry. Cyt Part A. 91 (2), (2017).
  40. Angelo, M., et al. Multiplexed ion beam imaging of human breast tumors. Nat Med. 20 (4), (2014).
  41. Baharlou, H., Canete, N. P., Cunningham, A. L., Harman, A. N., Patrick, E. Mass Cytometry Imaging for the Study of Human Diseases—Applications and Data Analysis Strategies. Front Immunol. 10, (2019).
  42. Goltsev, Y., Nolan, G. CODEX multiplexed tissue imaging. Nat Rev Immunol. 23 (10), 613-613 (2023).
  43. Black, S., et al. CODEX multiplexed tissue imaging with DNA-conjugated antibodies. Nat Protoc. 16 (8), (2021).
  44. Vorobjev, I. A., Kussanova, A., Barteneva, N. S. Development of Spectral Imaging Cytometry. Methods Mol Biol. 2635, (2023).
  45. Hernandez, S., et al. Multiplex Immunofluorescence Tyramide Signal Amplification for Immune Cell Profiling of Paraffin-Embedded Tumor Tissues. Front Mol Biosci. 8, (2021).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи