Индуцирование целевой умеренной гипертермии на моделях опухолей мышей путем фототермического преобразования ближнего инфракрасного света внутриопухолевыми золотыми наностержнями

Краткое содержание

В этом протоколе представлены методы и методология, необходимые для таргетной гипертермической терапии на моделях солидных опухолей. Этот подход использует фототермическое преобразование ближнего инфракрасного света с помощью внутриопухолевых золотых наностержней, чтобы вызвать локализованный нагрев в микроокружении опухоли.

Аннотация

Легкая гипертермия (42-48 °C) является хорошо зарекомендовавшим себя терапевтическим методом, который может вызывать контролируемую гибель опухолевых клеток и стимулировать противораковые иммунные реакции. Тем не менее, точная подача тепла в опухолевую ткань при сохранении окружающих здоровых тканей остается серьезной проблемой. Традиционные методы гипертермии, такие как изолированная перфузия конечностей, требуют сложных инвазивных процедур и несут значительный риск местной токсичности и заболеваемости пациентов. Напротив, фототермическая терапия с использованием наночастиц золота, активированных ближним инфракрасным (NIR) светом, стала многообещающей, менее инвазивной стратегией для достижения локализованной гипертермии. Золотые наностержни (ГНР), в частности, демонстрируют настраиваемые оптические свойства и высокую эффективность фототермического преобразования, что делает их идеальными кандидатами для точной термической модуляции опухолевых участков. Несмотря на то, что этот метод показал значительные перспективы, особенно для поверхностных и доступных опухолей, воспроизводимая доставка, пространственное удержание и безопасность остаются активными областями совершенствования. В этом протоколе мы представляем наш валидированный и оптимизированный метод достижения локализованной легкой гипертермии с использованием внутриопухолевого введения биосовместимых GNR с последующим кратковременным целенаправленным лазерным воздействием NIR. Этот подход обеспечивает быстрый, контролируемый нагрев в терапевтическом диапазоне, способствуя гибели иммуногенных опухолевых клеток и стимулируя врожденные иммунные реакции, механизмы, особенно актуальные для иммунологически «холодных» опухолей. Мониторинг температуры в режиме реального времени и локальная доставка обеспечивают воспроизводимость, безопасность и минимальное системное воздействие. Этот оптимизированный протокол предлагает надежную и доступную платформу для доклинических исследований, поддерживая более широкие усилия по использованию легкой гипертермии в иммунотерапии рака.

Введение

В лечении рака остаются значительные проблемы, включая устойчивость к лекарствам, уклонение от иммунитета и нецелевую токсичность, что подрывает долгосрочный успех традиционных методов лечения. Эти ограничения привели к разработке дополнительных терапевтических стратегий, направленных на преодоление механизмов резистентности при минимизации сопутствующего повреждения здоровых тканей. Легкая гипертермия, определяемая как повышение температуры тканей до 42-48 °C, уже давно признана эффективным дополнением к^{стандартным} методам лечения рака. Исторически сложилось так, что легкая гипертермия использовалась в сочетании с хирургией, химиотерапией или лучевой терапией для повышения эффективности этих методов лечения за счет увеличения перфузии опухоли, нарушения стромальной архитектуры и сенсибилизации злокачественных клеток к цитотоксическим^{агентам}. В последнее время, с ростом успеха иммунотерапии в онкологии, растет интерес к использованию иммуномодулирующего потенциала легкой гипертермии для улучшения противоопухолевого иммунного ответа ^1,2,3.

Несмотря на продемонстрированные клинические преимущества, более широкое применение опухолевой гипертермии остается ограниченным из-за проблем с достижением локализованного, контролируемого и воспроизводимого нагрева опухолей при одновременном предотвращении повреждения тканей вне мишени⁴. Современные клинические и экспериментальные методы гипертермии, такие как регионарная перфузия конечностей или системно доставляемые подходы на основе наночастиц, часто страдают от ограниченной пространственной точности, переменного поглощения опухоли и потенциальной системной токсичности 2,5,6,7,8,9 . Таргетная гипертермическая терапия является новым методом в этой области лечения рака, предназначенным для избирательного повышения температуры опухоли при минимизации повреждения окружающих здоровых тканей. В частности, адресная доставка золотых наностержней (ГНР) является перспективным методом преодоления существующих ограничений точности и токсичности легкой гипертермии опухолей. GNR особенно хорошо подходят для фототермических применений благодаря их настраиваемому поверхностному плазмонному резонансу в области NIR, высокой эффективности фототермического преобразования и благоприятным профилям биораспределения по сравнению с другими наноструктурами золота ^10,11. Их чувствительность к длинам волн ближнего ИК-диапазона обеспечивает эффективное поглощение света и локализованный нагрев даже в более глубоких тканях с минимальным повреждением окружающих структур. Таким образом, GNR могут обеспечить повышенную эффективность, нацеливание и безопасность при гипертермической терапии.

Целью данного метода является создание высокоэффективного, малоресурсоемкого и воспроизводимого протокола для достижения мягкой гипертермии, опосредованной золотыми наностержнями, при солидных опухолях. Этот метод, называемый GNR-опосредованной таргетной гипертермической терапией (THT), устраняет ключевые ограничения традиционных подходов к гипертермии, сочетая прямое внутриопухолевое введение GNR с внешней активацией NIR света. Это обеспечивает высокую концентрацию локальных наночастиц, улучшая воспроизводимость и безопасность, особенно для небольших или слабоваскуляризированных опухолей, которые могут неэффективно накапливать системно доставляемые агенты. Кроме того, использование прямого внутриопухолевого введения GNR с последующим воздействием ближнего инфракрасного (NIR) света обеспечивает точный, контролируемый и локализованный нагрев опухолей, сводя к минимуму системное воздействие, токсичность и побочные эффекты, связанные с традиционными методами региональной гипертермии.

Многие виды рака характеризуются сложными и разнообразными механизмами ускользания от иммунитета, что позволяет им противостоять иммунотерапии различными способами, наиболее очевидным из которых является плохая инфильтрация иммунных клеток в микроокружении опухоли ^2,4,5. Легкая гипертермия предлагает синергетическое решение при использовании в сочетании с иммунотерапией. В дополнение к прямым цитотоксическим эффектам, легкая гипертермия преимущественно индуцирует иммуногенную гибель клеток (ИКД), что приводит к высвобождению опухолеассоциированных антигенов (TAA) и молекулярных паттернов, ассоциированных с повреждением (DMP)^1,2. Эти сигналы активируют врожденные иммунные пути, усиливают презентацию опухолевого антигена, способствуют созреванию дендритных клеток и усиливают прайминг Т-клеток, в конечном итоге увеличивая инфильтрацию иммунных клеток в микроокружение опухоли ^1,6,12. В наших собственных доклинических моделях этот ГНР-опосредованный метод ТГТ функционировал для активации местных иммунных реакций и усиления иммунной инфильтрации опухоли¹³. В сочетании с внутриопухолевой терапией интерлейкином-2 (IL-2) или системным ингибированием контрольных точек анти-PD1 этот GNR-опосредованный метод THT еще больше усилил противоопухолевый иммунитет и превзошел любую монотерапию в моделях рака молочной железы и меланомы¹³. Эти результаты согласуются с растущим объемом доказательств, подтверждающих синергию между гипертермией, опосредованной наночастицами, и иммунотерапией при солидных опухолях, включая рак молочной железы 14,15,16 и опухоли головного мозга ^17,18. Короче говоря, превращая иммунологически «холодные» опухоли в «горячие», ГНР-опосредованный ТГТ может улучшить реакцию на иммунотерапию, включая ингибиторы контрольных точек ^1,2,12.

Представленный здесь протокол GNR-опосредованной THT является малоресурсоемким, технически простым и в целом адаптируемым к подкожным или поверхностным опухолям. Этот метод особенно подходит для исследователей, работающих с мышиными моделями подкожных или поверхностных опухолей, включая меланому и рак молочной железы. Однако, с незначительными изменениями, он может быть распространен на другие типы опухолей и анатомические участки. Кроме того, этот метод предлагает универсальную платформу для интеграции пространственно контролируемой гипертермии в доклинические исследования рака, особенно в тех, которые изучают стратегии усиления иммунотерапии, и стремятся изучить легкую гипертермию для улучшения ответа на лечение или преодоления резистентности к иммунотерапии. Кроме того, знания и оборудование, необходимые для реализации этого метода, доступны и адаптируемы к различным медицинским учреждениям, что повышает его целесообразность в более широком клиническом использовании^.

В этой рукописи мы предоставляем подробные пошаговые инструкции по реализации нашего GNR-опосредованного протокола THT на мышиных моделях с использованием лазерной системы NIR, работающей на длине волны 860 нм. Успех этого протокола зависит от эффективной активации золотых наностержней в глубоких тканях с использованием соответствующей длины волны ближнего инфракрасного света. Мы также обращаем внимание на процедурные соображения для достижения последовательного, безопасного и эффективного умеренного гипертермического дозирования в моделях опухолей мышей, такие как точный мониторинг внутренней температуры опухоли в режиме реального времени на протяжении всей процедуры. Этот метод основан на ранее описанных подходах к гипертермии наночастиц и объединяет их, предлагая комплексную, валидированную, высокоточную и воспроизводимую альтернативу для доклинических исследований рака. В целом, этот протокол предлагает биологически безопасный, экономически эффективный и малотоксичный метод доставки локализованной гипертермии опухоли, обладающий большим потенциалом для повышения эффективности существующих иммунотерапий рака и расширения клинической применимости гипертермии в онкологии.

Протокол

Все протоколы экспериментов были одобрены Университетским комитетом по лабораторным животным при Университете Далхаузи в соответствии с руководящими принципами Канадского совета по уходу за животными. Были соблюдены все применимые международные, национальные и институциональные рекомендации по уходу за животными и их использованию. Смотрите Таблицу материалов для получения подробной информации обо всех материалах, используемых в этом протоколе.

1. Требования к лазеру и лечебному оборудованию

1. Безопасный доступ к полностью откалиброванной лазерной системе, способной доставлять свет на длине волны 860 ± 10 нм с интенсивностью до 4 000 мА. Убедитесь, что лазерная система имеет надлежащие механизмы отключения.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В этом исследовании мы использовали специально разработанный лазер. Модель, используемая в этом протоколе, имеет ключ включения лазера, кнопку аварийной остановки и перемычку блокировки (подключенная перемычка также может быть подключена к предохранительному выключателю, который используется для обеспечения безопасности, например, для доступа к двери в лазерную комнату класса 4).
2. Прикрепите вставной калиброванный датчик температуры для внутриопухолевого мониторинга температуры, способный передавать данные о температуре в реальном времени через соответствующее программное обеспечение для записи термопары.
3. Подготовьте специальную лазерную комнату, которая соответствует требуемым стандартам безопасности для класса лазеров. Убедитесь, что есть свободная рабочая зона с хорошей вентиляцией, правильным освещением и всеми отражающими поверхностями. Ограничьте доступ в помещение во время работы лазера, чтобы предотвратить непреднамеренное облучение. Убедитесь, что весь персонал, участвующий в исследовании, полностью обучен работе с лазером и протоколам безопасности, а также носит соответствующие СИЗ и средства защиты глаз.
4. Оборудуйте рабочее место в лазерной комнате, в котором в непосредственной близости от лазерной установки находится анестезиологический аппарат. Убедитесь, что лазер надежно закреплен, но регулируется, при этом испытуемый может располагаться на расстоянии примерно 1-2 см от источника лазерного луча, чтобы обеспечить точное нацеливание на место опухоли.
5. Используйте тепловизионную камеру на штативе, расположенном так, чтобы захватывать показания температуры с поверхности объекта на протяжении всего лазерного воздействия.

2. Культивирование клеток и инокуляция (введение опухолевых клеток)

1. Выберите подходящие модели мышей в зависимости от интересующего типа опухоли, следуя стандартизированным методам подготовки и поддержания лабораторных клеточных культур. Чтобы следовать этому протоколу, выберите 6-8-недельных самок мышей BALB/c для инокуляции опухоли CT26.
   Примечание: В зависимости от требований исследования могут быть использованы иммунокомпетентные или иммунокомпрометированные мыши различного возраста и штамма.
2. Культивировали линию раковых клеток CT26 в среде RPMI 1640 с добавлением 10% инактивированной при нагревании фетальной бычьей сыворотки (FBS), 100 ЕД/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина и 2 мМ глутамина. Поддерживайте температуру в клетках при температуре 37 °C во влажной атмосфере с 5%_CO2. Обновляйте среду каждые 2-3 дня и субкультурируйте клетки при 70-80% конфлюенции с использованием соотношения расщепления от 1:4 до 1:10. Используйте клетки в ранних пассажах (например, ≤10 пассажей) для обеспечения стабильного роста и эффективности инокуляции. Расширяйте культуры по мере необходимости, чтобы получить необходимое количество клеток для инокуляции.
   Примечание: Количество клеток, необходимых для каждой мыши, будет варьироваться в зависимости от модели, например, для модели колоректального рака у мышей CT26 нам требовалось от 5 ×^{10 5} клеток на мышь.
3. Отсоедините адгезивные клетки с помощью трипсинизации и промойте 2x стерильным 1x PBS. Ресуспендировать в стерильном растворе 1x PBS до достижения желаемой концентрации 5 × 10⁶ клеток/мл. Храните клеточную суспензию в стерильной микроцентрифужной пробирке объемом 2 мл на льду не более 1 часа перед инъекцией.
4. Перед инъекцией мышей обезболивают с помощью индукционной камеры с 4% испаренным изофлураном со скоростью потока 0,8 л/мин. После обезболивания уменьшите изофлуран до 2% и поддерживайте анестезию с помощью носового конуса во время процедуры инокуляции. Подтвердите глубину анестезии с помощью теста с защемлением пальца ноги, чтобы убедиться в отсутствии болевой реакции. Нанесите глазную смазку на оба глаза, чтобы предотвратить высыхание и свести к минимуму потенциальное повреждение лазером.
5. Выбрейте место инъекции (например, левый бок для этой гетеротопической модели CT26) с помощью электробритвы и очистите область спиртовой салфеткой, чтобы удалить мусор и продезинфицировать кожу. Прищипните кожу в месте инъекции и введите 100 мкл клеточной суспензии со скоростью 5 × 10⁶ клеток/мл подкожно с помощью иглы 26 G и шприца 1 мл. После инъекции извлеките мышь из носового конуса и верните ее в клетку для восстановления на согревающем одеяле на 1 час.

3. Рост и измерение опухоли

1. Начните ежедневное измерение опухоли, обычно начиная с 7-го дня после инъекции, с помощью штангенциркуля для измерения опухоли. Измерьте размеры опухоли по трем осям: ширина, длина и высота и рассчитайте объемы опухоли с помощью формулы объема опухоли на эллипсоиде π×× ширины × высоты.
2. Планируйте начало ГНР-опосредованной ТГТ, как только опухоли достигнут приблизительного объема 50^мм3 (± 20^мм3).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для нашей модели CT26 этот объем опухоли был достигнут между 10 и 12 днями после инъекции опухолевых клеток.
3. Перед лазерным лечением обеспечьте случайное распределение мышей по контрольной и лечебной группам. Группа лечения получает внутриопухолевую инъекцию GNR с последующим лазерным облучением; и контрольная группа получит внутриопухолевую инъекцию PBS (того же объема, что и инъекция GNR) вместо GNR с последующим лазерным облучением.

4. Фототермическое преобразование ближнего инфракрасного излучения с использованием внутриопухолевых ГНР

1. В стерильном шкафу биологической безопасности используйте шприц объемом 0,3-1 мл с иглой 31 G для набора соответствующего объема GNR на основе объема каждой опухоли.
2. Обезболивайте мышь таким же образом, как и при инъекции раковых клеток (с помощью носового конуса, доставляющего 2% изофлуран со скоростью потока 0,8 л/мин, и подтвердите достаточную глубину анестезии с помощью теста с защемлением пальца ноги).
3. После обезболивания уменьшите изофлуран до 2% и поместите мышь в положение лежа на лазерной платформе, сохраняя анестезию с помощью носового конуса. Нанесите глазную смазку на оба глаза, чтобы предотвратить высыхание и свести к минимуму потенциальное повреждение лазером.
4. При необходимости сбрейте лишнюю шерсть вокруг опухоли, чтобы обеспечить воздействие лазера на поверхность кожи. Используйте этанол для дезинфекции поверхности опухоли, удаляя шерсть / мусор.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В этом исследовании мы использовали GNR, оптимизированные для поглощения при длине волны 860 нм. Если вы используете другой продукт GNR, убедитесь, что доставка длины волны лазера NIR оптимизирована в соответствии со спектром поглощения GNR.
5. Перед лазерным облучением ГНР вводят внутриопухолево в концентрации 1 мкг/^мм3 объема опухоли. При необходимости следует разделить инъекцию между двумя внутриопухолевыми участками, чтобы обеспечить эффективное распределение ГНР внутри опухоли.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В этом протокольном видео использовались GNR в концентрации 2 мкг/мкл; поэтому для опухоли размером 50^мм3 в опухоль вводили 25 мкл ГНР. Обязательно сотрите излишки GNR с поверхности кожи после соответствующих инъекций.
6. Мышам контрольной группы вводят внутриопухолевую инъекцию стерильного PBS в объеме, эквивалентном тому, который используется для инъекционной группы (групп) GNR (например, вводят 25 мкл PBS в случае опухоли размером 50^мм3).
7. Продезинфицируйте внутриопухолевый температурный зонд этанолом и аккуратно введите его в середину опухолевой массы.
8. Нанесите равномерный слой геля алоэ вера толщиной около 5 мм на поверхность опухоли, чтобы предотвратить изъязвление кожи и свести к минимуму риск термической травмы во время лечения.
9. Убедитесь, что лазер настроен так, чтобы он располагался непосредственно над серединой опухоли. Используйте таблицу поиска излучения (Таблица 1) для определения подходящей высоты лазера на основе необходимого диаметра лазерного луча для покрытия площади поверхности опухоли. Оптимизируйте высоту лазера в зависимости от диаметра опухоли для обеспечения стабильной доставки энергии.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В нашем эксперименте для опухоли диаметром 1,3 см требовалась высота лазера 1,5 см).
10. Включите лазер и источник электрического охлаждения термоса (TEC), затем подключите лазерную систему к источнику питания (адаптирован в соответствии с протоколом производителя). Включите источник электрического охлаждения термоса; дождаться включения синего светодиода, а температура ТЭО источника лазера стабилизируется на уровне 25 °C через 30 с.
11. Используйте таблицу поиска излучения (Таблица 1) для достижения целевой интенсивности излучения 1 Вт/^см2 ± 0,2 Вт/^см2 путем регулировки выходного тока лазера (поверните ручку лазерного источника в нужное заданное значение тока).
    Примечание: В нашем эксперименте высота лазера 1,5 см, диаметр луча 1,3 см и лазерный ток 1800 мА привели к значению излучения 0,82 Вт/^см2, которое было оптимизировано для данной модели опухоли.
    С этого момента убедитесь, что все люди в лазерной операционной носят сертифицированные лазерные защитные очки для используемой длины волны света.
12. Установите рядом с лазерной платформой термокамеру, направленную на мышь, чтобы контролировать температуру поверхности кожи во время лазерной процедуры.
13. В программном обеспечении для записи термопар создайте новый файл и нажмите кнопку записи . Убедитесь, что график зависимости внутренней температуры опухоли от времени отображается в режиме реального времени.
14. Поверните ключ безопасности, чтобы включить выход лазерного источника. Начните введение лазера, нажав на ножную педаль.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В этом протоколе контроллер Raspberry Pi является внутренним интерфейсом между ножной педалью и источником лазера.
15. Проверьте и убедитесь, что компьютерное программное обеспечение обнаруживает повышение температуры опухоли после того, как опухоль, введенная методом GNR, подвергается воздействию лазерного луча.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Внутренняя температура опухоли начнет увеличиваться во время запуска лазера, ей потребуется примерно от 15 с до 2 минут, чтобы войти в целевой диапазон гипертермии 42 °C, в зависимости от размера и типа модели опухоли.
16. Поддерживайте внутреннюю температуру опухоли в гипертермическом диапазоне (от 42 °C до 48 °C) в течение полных 5 минут. Постоянно контролируйте внутреннюю температуру опухоли, и если она приближается к 48 °C, уберите ногу с педали и дайте температуре снова снизиться. Ищите это падение температуры в режиме реального времени на графике зависимости температуры от времени. Как только внутренняя температура опухоли снизится до ~43 °C, снова включите лазерное введение, снова нажав на педаль. Продолжайте эту схему включения/выключения лазерной педали, чтобы поддерживать внутреннюю температуру опухоли в соответствующем гипертермическом диапазоне в течение полных 5 минут, и следите за графиком зависимости температуры от времени.
    1. Если температура опухоли опускается ниже 42 °C в любой момент в течение 5-минутного периода гипертермии, увеличьте время гипертермии, чтобы наверстать упущенное время. Например, если температура опускается ниже 42 °C в течение 20 с, добавьте 20 с к концу первоначального 5-минутного времени. Некоторые опухоли, введенные с помощью GNR, могут не достигать 48 °C, и циклическое включение/выключение лазера не потребуется.
       Примечание: У контрольных мышей, которым внутриопухолевое введение PBS вводили, опухоли не достигают гипертермического диапазона. При желании, циклическое включение и выключение лазера у контрольных мышей должно следовать той же схеме, что и для группы, получавшей ГНР, несмотря на ожидаемое отсутствие гипертермической реакции.
17. На протяжении всего периода поддержания гипертермии опухоли постоянно контролируйте температуру поверхности кожи, чтобы она оставалась ниже 50 °C. Независимо от внутренней температуры опухоли, если температура поверхности кожи достигает 50 °C, выключите лазер для охлаждения. Если внутренняя температура не может достичь желаемого диапазона гипертермии, не вызывая повышения температуры кожи выше 50 °C, уменьшите мощность лазера и/или нанесите дополнительное алоэ вера на место опухоли, чтобы помочь рассеять тепло. Через 5 минут в диапазоне гипертермии отпустите ножную педаль, чтобы остановить введение лазера и дать внутренней температуре опухоли упасть до ~37 °C, и выключите ключ безопасности лазера.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Важно свести к минимуму повреждение кожи, которое может привести к изъязвлению опухоли, поддерживая температуру кожи ниже 50 °C¹⁹.
18. Контролируйте внутренний датчик температуры опухоли, позволяя температуре опухоли снова упасть примерно до 37 °C. Аккуратно снимите температурный щуп с опухоли и сотрите остатки геля алоэ вера с поверхности опухоли.
19. Извлеките мышь из носового конуса с помощью обезболивающего средства и следите за возбуждением животного перед тем, как вернуть его в клетку. Поместите клетку частично на грелку с температурой 37 °C в период восстановления после процедуры, позволяя мышам перемещаться между более теплыми и более холодными зонами по мере необходимости для регулирования температуры их тела. Следите за каждой мышью, чтобы убедиться, что она вернулась к нормальному поведению, прежде чем возвращать ее в помещение.

Результаты

Целью этого GNR-опосредованного протокола THT является последовательный и надежный нагрев солидных опухолей до желаемого умеренного гипертермического диапазона 42-48 °C. Основные этапы этой процедуры описаны на рисунке 1. Успех этого протокола зависит от установления и поддержания контролируемой и воспроизводимой легкой гипертермии в рамках данной модели солидной опухоли. Используемые GNR были синтезированы с использованием запатентованного метода без CTAB, в котором соль золота была восстановлена в запатентованном растворе поверхностно-активного вещества для стимулирования роста палочек кристаллов. После синтеза нативные поверхностно-активные вещества были в значительной степени заменены на низкомолекулярные ПЭГ для повышения биосовместимости. Полученные ГНР были однородными по размеру (51,1 ± 10,8 нм на 12,2 ± 1,9 нм), имели оптимальную длину волны возбуждения 860 ± 10 нм и не содержали обнаруживаемых эндотоксинов.

Чтобы обеспечить надлежащий нагрев опухоли и точное отслеживание температуры, в центр опухоли необходимо ввести внутриопухолевый температурный зонд. Кроме того, крайне важно контролировать температуру поверхности кожи на протяжении всей процедуры с помощью тепловизора. Возможно, особенно для опухолей меньшего объема, что внутриопухолевые инъекционные ГНР могут диффундировать в периопухолевое и/или подкожное пространство вокруг опухоли. При воздействии ближнего ИК-излучения это может привести к нагреванию кожи выше основных физиологических уровней, а если температура кожи достигает выше умеренного гипертермического уровня (более 50 °C), это может привести к повреждению кожи, такому как образование струпьев и/или изъязвлений. Нанесение слоя геля алоэ вера на поверхность опухоли является важным мерой предосторожности, помогающим регулировать температуру поверхности кожи и предотвращать термическое повреждение во время воздействия лазера NIR. В любом случае, рекомендуется контролировать обработанную область на наличие признаков изъязвления в течение 48 часов после ТГТ. На рисунке 2 изображено визуальное представление предлагаемой конфигурации для оптимизации управления температурой опухоли, показывающее расположение внутреннего датчика температуры опухоли и слоя геля алоэ вера по отношению к лазерному зонду NIR.

Относительный успех этого экспериментального протокола можно определить по наблюдению за внутренней температурой опухоли в зависимости от времени на протяжении всей работы лазера. У мышей, которым внутриопухолево вводили GNR, ожидается, что опухоли нагреются до умеренного гипертермического диапазона (42-48 °C) в течение от 15 с до 2 минут. Как только внутренняя температура опухоли войдет в умеренный гипертермический диапазон, ожидается, что она либо выйдет на плато в соответствующем диапазоне, либо потребуется циклическое включение / выключение лазерного введения, чтобы гарантировать, что внутренняя температура опухоли не поднимется выше 48 °C (как показано на рисунке 3A). Успешное поддержание легкой гипертермии в течение 5 мин считается положительным результатом. У мышей, которым внутриопухолево вводили PBS, не ожидается, что опухоли нагреются до гипертермического диапазона. Воздействие ближнего инфракрасного излучения на длине волны 860 нм само по себе недостаточно для того, чтобы вызвать нагрев тканей до умеренного гипертермического диапазона, и ожидается, что контрольные опухоли выйдут на плато около 39-40 °C. На рисунке 3B показан график зависимости внутренней температуры опухоли от времени между GNR и контрольными мышами (PBS-инъекциями) в течение 5-минутной процедуры. Если опухоль, введенная с помощью ГНР, не может достичь гипертермического диапазона при воздействии ближнего ИК-диапазона или не может поддерживаться в соответствующем гипертермическом диапазоне в течение полных 5 минут, это считается отрицательным результатом.

Дополнительный последующий анализ для определения успешности этого GNR-опосредованного протокола THT включает в себя измерение изменений объема опухоли после процедуры. Успешно проведенная ГНР-опосредованная ТГТ вызывает целевую гибель опухолевых клеток и активацию противоопухолевых иммунных реакций, что приводит к регрессии опухоли и связанному с ней уменьшению объема опухоли¹³. На рисунке 4 показаны изменения объема опухоли после ГНР-опосредованной ТГТ для двух моделей подкожного рака боковой части мыши (модель B16-меланомы и CT26-гетеротопного колоректального рака) и одной модели мышиного рака жировой подушки молочной железы (4T1-рак молочной железы). В каждой модели очевидно значительное уменьшение объема опухоли по сравнению с контрольной группой через 48-72 ч после процедуры ГНР-опосредованной ТГТ. Ожидается, что сроки и величина уменьшения объема опухоли после процедуры будут варьироваться в зависимости от штамма мыши и модели рака. В дополнение к редукции опухоли мы наблюдали мощный врожденный иммунный ответ в течение 48 ч после GNR-опосредованного ТГТ, характеризующийся повышенной экспрессией генов, участвующих в пути STING-cGAS, а также повышением и активацией дендритных клеток, макрофагов и NK-клеток в моделях B16F10 и 4T1¹³. Примечательно, что в модели двусторонней опухоли 4T1 THT с поддержкой GNR индуцировал системный иммунный ответ, о чем свидетельствует повышенная инфильтрация CD8⁺ Т-клеток в нелеченные контралатеральные опухоли¹³. Эти результаты еще раз подтверждают потенциал данного подхода для выявления как прямых цитотоксических, так и более широких иммуномодулирующих противораковых эффектов.

Таблица 1: Таблица поиска излучения. Таблица со значениями излучения (Вт/см²) для различных настроек выходного тока лазера (мА) и рабочих расстояний (см). Таблица используется для определения подходящей высоты лазера на основе требуемого диаметра луча для покрытия поверхности опухоли и достижения целевой интенсивности излучения 1 Вт/^см2 ± 0,2 Вт/^см2. Значения, выделенные зеленым цветом, указывают на оптимальный уровень излучения около 1 Вт/^см2. Эта таблица излучения относится к LDX Laser и была предоставлена производителем. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Рисунок 1: Графическая схема процедуры GNR-опосредованной THT. Методология опосредованной золото-наностержневой таргетной гипертермической терапии подкожных опухолей фланга на мышиной модели. После создания пальпируемой опухоли (примерно 50^мм3) и обезболивания мыши, (1) ввести GNR внутриопухолево в концентрации 1 мкг/^мм3, (2) ввести внутриопухолевый температурный зонд в середину опухолевой массы, (3) нанести слой геля алоэ вера ~5 мм на поверхность опухоли, (4) начать введение лазера NIR и (5) поддерживать внутреннюю температуру опухоли в умеренном гипертермическом диапазоне (42 °C-48 °C) в течение 5 минут. Сокращения: GNR = золотой наностержень; ТГТ = таргетная гипертермическая терапия; NIR = ближний инфракрасный диапазон. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 2: Визуальное представление экспериментальной установки. Мышь BALB/c с гетеротопической колоректальной опухолью с центрально введенным внутриопухолевым температурным зондом и слоем геля алоэ вера, нанесенным непосредственно под воздействием лазерного луча ближнего инфракрасного диапазона. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 3: Графики внутренней температуры в реальном времени. Репрезентативный профиль внутренней температуры опухоли с течением времени (в мс), зарегистрированный внутренним температурным зондом на протяжении всего воздействия лазера ближнего ИК-диапазона опухоли. (A) Включение/выключение циклической схемы лазера NIR на мыши, введенной методом GNR, требуется для поддержания внутренней температуры опухоли в умеренном гипертермическом диапазоне (42 °C-48 °C) в течение 5 минут. Это подчеркивает важность тщательного мониторинга внутренней температуры опухоли и цикличности введения лазера для поддержания гипотермического диапазона на протяжении всей процедуры. (B) Средняя разница во внутренней температуре опухоли между мышами, получавшими ГНР (n = 15) и контрольными (ПБС) мышами (n = 8) в течение 5 минут лазерного облучения в ближнем ИК-диапазоне. Опухоли мышей, которым вводили PBS, не нагревались до умеренного гипотермического диапазона и плато около 39-40 °C, несмотря на то, что получали такую же продолжительность лазерного воздействия NIR, как и группа, получавшая GNR-инъекцию, опухоли которой достигали гипертермической температуры 42-48 °C. Сокращения: GNR = золотой наностержень; NIR = ближний инфракрасный диапазон. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 4: Графики объема опухоли после ГНР-опосредованной ТГТ. ГНР-опосредованная ТГТ индуцирует уменьшение объема опухоли на нескольких моделях рака мышей в течение 48-72 ч после лечения. (A) Измерение объема опухоли в модели 4T1 (рак молочной железы) после ГНР-опосредованной ТГТ (n = 24 PBS, n = 28 THT). (B) Измерение объема опухоли в модели B16-F10 (меланома) после GNR-опосредованной THT (n = 19 PBS, n = 23 THT). (C) Измерение объема опухоли в модели CT26 (колоректальный рак) после ГНР-опосредованной ТГТ (n = 9 PBS, n = 9 THT). Уменьшение или замедление роста объема опухоли в течение 48-72 ч после лечения свидетельствует о положительном результате. Данные об объеме опухоли для модели CT26 в момент времени «24 ч» не объединены — значения схожи и перекрываются. Полосы погрешностей представляют SEM. * p < 0,05. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Обсуждение

Критические шаги в рамках протокола
Разработка и реализация этой GNR-опосредованной методики THT обеспечивает возможность проведения целенаправленного, точного, малоресурсоемкого и воспроизводимого нагрева солидных опухолей in vivo. Ключевое преимущество этой системы заключается в ее пространственной точности и термоконтроле, что позволяет проводить локализованное лечение без повреждения окружающих тканей. Одним из важнейших шагов для успешного фототермического преобразования является обеспечение совместимости между используемыми GNR и источником света NIR. В этом исследовании мы использовали GNR, оптимизированные для поглощения при длине волны 860 нм. На этой длине волны свет эффективно проникает в ткани, а в опухолях, содержащих GNR, избирательно генерируется тепло, в то время как окружающие здоровые ткани остаются вблизи физиологической температуры²⁰. Кроме того, при выполнении этого протокола точный мониторинг внутренней температуры опухоли в режиме реального времени имеет решающее значение для подтверждения того, что достигнут умеренный диапазон гипертермии и что лечение проводится последовательно. Размещение внутриопухолевого температурного зонда, как показано на рисунке 2, позволяет осуществлять мониторинг тепловой дозы опухоли в режиме реального времени, как показано на рисунке 3B.

Поиск и устранение неисправностей техники
В зависимости от модели in vivo и типа опухоли могут потребоваться незначительные изменения в протоколе для оптимизации результатов. Например, в моделях меланомы мышей, колоректального рака и рака молочной железы, упомянутых на рисунке 4, мы оптимизировали объемную концентрацию ГНР к опухоли на уровне 1 г/^мм3. Мы также оптимизировали эффективность этого протокола, проведя лазерное воздействие NIR сразу после инъекции GNR, поскольку не наблюдалось различий в эффективности лечения при сравнении этой инъекции и времени лечения с более длительными интервалами 0,5, 1, 4, 18 или 24 часа. Для моделей опухолей, которые отличаются от наших моделей с точки зрения патофизиологии опухоли или локализации тела, другая концентрация GNR, введенная в другой момент времени, может быть оптимальной для достижения и/или пребывания в пределах гипертермического диапазона. После этой процедуры следует проводить ежедневные измерения объема опухоли, чтобы зафиксировать изменения объема опухоли. Регресс опухоли в течение 2-3 дней является положительным показателем успешности лечения.

Из-за особенностей лазерного протокола поверхностные ожоги кожи и изъязвления являются потенциальным фактором риска, особенно для пигментированной или чувствительной кожи. Корректировка выходного тока лазера может потребоваться для поддержания соответствующего баланса между поверхностью кожи и внутренней температурой опухоли, в зависимости от используемой модели in vivo . Например, мы обнаружили, что из-за различий в содержании воды и пигмента меланина в коже²¹, мышам C57Bl/6 требуется введение лазера NIR с меньшим током по сравнению с мышами BALB/c, чтобы поддерживать температуру кожи ниже 50°C. При изменении выходного тока лазера убедитесь, что высота лазера отрегулирована соответствующим образом, чтобы излучение цели оставалось на уровне 1 Вт/^см2 ± 0,2 Вт/^см2, при этом большая часть поверхности опухоли покрывалась диаметром лазерного луча. Кроме того, нанесение дополнительного геля алоэ вера может помочь снизить температуру кожи во время процедуры, не оказывая резкого влияния на внутреннюю температуру опухоли. Поддержание соответствующей температуры поверхности кожи с помощью необходимых модификаций важно для минимизации риска образования язв, которые наблюдаются как потенциальный побочный эффект этого лечения. При внесении изменений в слой геля алоэ вера обязательно на мгновение прекратите подачу лазерного луча NIR. В течение нескольких дней после лазерного протокола убедитесь, что мыши находятся под тщательным наблюдением на предмет потенциальных ожогов и/или изъязвлений.

Ограничения GNR-опосредованной THT
Основной проблемой безопасности, которую необходимо учитывать при выполнении этой процедуры, является использование сертифицированных лазерных защитных стекол для длины волны света, используемой во время работы лазера. Лазерная система должна включать в себя встроенные функции безопасности, такие как блокировка с ключом, для предотвращения случайного срабатывания. Тем не менее, для защиты от потенциального воздействия отраженных или рассеянных лучей требуются дополнительные средства индивидуальной защиты, особенно подходящие лазерные защитные очки. Глаз наиболее уязвим к травмам от лазерного луча, при этом ожоги сетчатки являются основной проблемой при использовании лазеров NIR²². Наконец, весь персонал, работающий с лазером, должен пройти соответствующую подготовку.

В этом протоколе предпочтение отдавалось внутриопухолевому введению GNR вместо системной инъекции, чтобы свести к минимуму токсичность системы, ограничить распределение наночастиц в нецелевых органах, таких как печень, селезенка и почки, а также повысить точность, эффективность и профиль безопасности гипертермического лечения. Однако, поскольку этот протокол требует внутриопухолевых инъекций GNR, его способность вызывать гипертермию в определенных моделях опухолей может быть ограничена. На сегодняшний день мы доказали эффективность этого метода при подкожных опухолях и опухолях жировых отложений молочных желез, которые находятся близко к поверхности кожи и легко доступны с точки зрения инъекции GNR и воздействия света ближнего ИК-диапазона. Логистические трудности могут возникнуть при нацеливании на опухоли, которые находятся внутри полостей тела, таких как брюшина, или при попытке нацелиться на метастатические участки первичной опухоли. Потенциальная модификация этого протокола может включать системную инъекцию GNR, при условии, что наночастицы сконструированы или модифицированы для обеспечения эффективного накопления в опухолевых участках до воздействия NIR²³. Кроме того, возможно, что внутриопухолевая инъекция GNR может привести к неравномерному распределению наночастиц в опухоли, что повлияет на однородность нагрева. Тем не менее, ожидается, что неравномерный нагревание опухоли не окажет большого влияния на степень эффективности лечения, учитывая, что основным результатом этого протокола ГНР-опосредованной ТГТ является индукция ИКД для активации противоракового иммунитета. Наконец, показания внутриопухолевой температуры зависят от расположения температурного зонда внутри опухоли. Середина опухоли является наиболее оптимальным местом для того, чтобы зонд точно отражал общую среднюю температуру опухоли. Однако, если из-за размера и/или формы опухоли трудно обеспечить и/или подтвердить введение центрального зонда, может потребоваться регистрация с помощью двух или более температурных зондов в разных местах.

Значимость по отношению к существующим методам
В данной рукописи представлен всесторонний, оптимизированный и воспроизводимый протокол ГНР-опосредованной ТГТ при солидных и поверхностно доступных опухолях. По сравнению с другими методами индуцирования гипертермии, этот метод имеет явные преимущества, а именно: он является низкоресурсоемким, пространственно точным и связан с минимальной системной токсичностью. Несмотря на то, что использование GNR для фототермической терапии хорошо задокументировано, в литературе сохраняются значительные различия в том, как эти протоколы реализуются. Ключевые процедурные элементы, такие как продолжительность NIR-излучения, выбор инструментов теплового мониторинга (термопарные зонды или тепловизионная камера), приготовление раствора GNR и методы инжекции GNR, часто различаются в зависимости от исследования.

Например, другие методы требовали более длительных (20 мин)²⁴ или многократных доз (4 x 15 мин)²⁵ БИК-воздействия для достижения результатов, аналогичных нашим. Кроме того, в большинстве протоколов используются либо датчики термопар, либо тепловизионные камеры, но редко сочетаются^{оба инструмента.} Кроме того, растворы GNR часто готовят с помощью CTAB 28,29,30, и способ их доставки варьируется между системными инъекциями ^24,30 и внутриопухолевыми инъекциями³¹, что может повлиять на их дисперсию/расположение в TME. Таким образом, всеобъемлющий и адаптируемый метод для GNR-опосредованной THT, который оптимизирует и улучшает существующие протоколы, еще не разработан.

Наш протокол устраняет эти недостатки путем интеграции наиболее эффективных и воспроизводимых компонентов из литературы в единый стандартизированный подход. В частности, мы используем двойной тепловой мониторинг (как термопары, так и тепловизионной камеры) для обеспечения точной и безопасной подачи тепла; мы применяем внутриопухолевое введение GNR без CTAB для максимальной локализации опухоли и минимизации токсичности; И мы используем гель алоэ вера для защиты от поверхностных ожогов кожи. Кроме того, GNR, используемые в этом протоколе, оптимизированы для эффективного фототермического преобразования при 860 нм ближнего ИК-диапазона, что позволяет быстро достичь умеренных гипертермических температур за считанные секунды. Как только этот температурный диапазон достигнут, его можно стабильно поддерживать в течение 5 минут лечения, что мы определили как достаточное для индуцирования иммуногенной гибели клеток и иммунной активации. Длина волны 860 нм в ближнем ИК-диапазоне сама по себе также обеспечивает благоприятный баланс между глубиной проникновения в ткани и безопасностью, что еще больше расширяет терапевтическое окно этого метода.

Таким образом, наш протокол предлагает консолидированную, проверенную и биологически эффективную альтернативу существующим подходам к гипертермии, опосредованной ГНР, и заполняет критический пробел в этой области, предоставляя полностью детализированный и адаптируемый метод, подходящий для доклинических исследований рака и разработки комбинированной терапии.

Будущее применение этого метода
Наконец, хотя этот протокол можно легко сочетать с различными методами лечения рака, он особенно хорошо подходит для повышения эффективности иммунотерапии, учитывая присущую ТГТ способность стимулировать противораковый иммунитет. Индуцируя иммуногенную гибель клеток, способствуя высвобождению опухолеспецифических антигенов и увеличивая количество клеток врожденного иммунитета, рекрутируемых в ТМЭ в течение 48 часов после лечения, ГНР-опосредованный ТГТ помогает «ресенсибилизировать» иммунологически холодные опухоли к обнаружению и атаке иммунной системой¹³. В результате, этот метод может быть использован для повышения эффективности иммунотерапии в лечении рака, у которого ранее могла развиться резистентность, предлагая потенциальную стратегию для преодоления барьеров в лечении рака и прогрессирования^{заболевания.}

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
0,25% Трипсин	Thermo Fisher Scientific	25200-056
10 мл полоска	Научный центр Фишера	7200574
Туба Falcon 15 мл	Корнинг	352095
1 мл шприца	BD Biosciences	3331431
Игла 28 г	BD Biosciences	1298811
Клеточная линия рака молочной железы 4T1	Коллекция американской типовой культуры	ЦРЛ-2539
5 мл Полоска	Научный центр Фишера	7200573
Пробирка Falcon 50 мл	Научный центр Фишера	14-432-22
70% этанол	Коммерческие спиртные напитки	36195
Гель алоэ вера	Бренд «Жизнь»	57800985495
B16-F10 клеточная линия меланомы	Коллекция американской типовой культуры	ЦРЛ-6475
Биорендер	Биорендер	Н/Д
Шкаф Bisafety	Нуайре	Н/Д
Лазерные защитные очки класса 4	Лазерное зрение	Ф22. П5П18.5000	Мы использовали раму P22 с фильтром P5P18
CO2 инкубатор (37° C, 5% CO2)	Нуайре	Н/Д
Corning 1-200 &микро; L Универсальная посадка Racked Pipet  Советы	Корнинг	4865
Пипетка с фильтром Corning  Советы, 30 & микро; L	Научный центр Фишера	07-200-265
CT26 мышиная колоректальная клеточная линия	Коллекция американской типовой культуры	ЦРЛ-2638
ДПБС	Thermo Fisher Scientific	10010-049
Трубки Eppendorf	Thermo Fisher Scientific	3451
Самки мышей BALB/c	Charles River Laboratories (Монреаль, Канада)	028
Внутренняя резьба C57Bl/6	Charles River Laboratories (Монреаль, Канада)	027
Фетальная бычья сыворотка	Научный инвитроген Thermo Fisher	12483020
НРГ	Сона Нанотек Инк	Н/Д
Внутриопухолевый температурный зонд	ОМЕГА	ГИП1-30-1/2-Т-Г-60-СМП-М	Зонд термопары модель HYP-1
IsoTip 1000 и микро; L Универсальный фильтрованный пипет  Советы	Корнинг	4809
Лазер LDX (модель: LDX-3520-860-HHLFC)	Миннетроникс	Н/Д	Лазерный ток с заданным максимум 4600 мА
Смазка для глаз Optixcare	Авентикс	Н/Д
Пенициллин-стрептомицин	Thermo Fisher Scientific	15140148
Призма 10.6.0	Графпэд	Н/Д
RPMI 1640 Средний	Thermo Fisher Scientific	11875119
TC-08 Программное обеспечение регистратора данных термопары	Технология Pico	PicoLog версии 5.25.3
Тепловизионная камера	ХИКмикро	ЭА-1086922
Чашка для культуры тканей 100 x 20 мм	Научный центр Фишера	877222
Раствор трипана синего 0,4%	Thermo Fisher Scientific	15250061
Штангенциркуль для измерения опухоли	Корпорация Giles scientificMitutoyo	500-321