Методическая статья

Достижения в метаболическом профилировании трехмерных сфероидов опухолей головного мозга для скрининга лекарственных препаратов

759 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/68833

⸱

5 сентября 2025 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Medical Innovation and Research, Peking University Third Hospital, 2Cancer Center of Peking University Third Hospital, 3Biobank, Peking University Third Hospital

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Здесь мы создаем платформу метаболического профилирования, объединяющую трехмерные (3D) сфероиды глиомы и нормализацию на основе визуализации с помощью анализа внеклеточного потока. Этот подход позволяет более точно оценить метаболические реакции опухоли на медикаментозное лечение и дает представление о потенциальных механизмах резистентности.

Аннотация

Опухоли головного мозга, особенно глиомы, трудно поддаются лечению из-за их агрессивной природы, сложного микроокружения опухоли и устойчивости к традиционным методам лечения. Традиционные двумерные (2D) клеточные культуры часто не могут воспроизвести истинную опухолевую среду, что приводит к неточным прогнозам эффективности лекарств. Технология анализа внеклеточного потока, обычно используемая для метаболического анализа в 2D-культурах в режиме реального времени, измеряет ключевые метаболические параметры, такие как скорость внеклеточного закисления (ECAR) и скорость потребления кислорода (OCR), что дает представление о клеточном метаболизме. Использование 3D-моделей представляет собой значительный прогресс, поскольку они более точно имитируют опухолевую среду in vivo . Анализатор внеклеточного потока был адаптирован к трехмерным (3D) моделям клеток глиомы, что позволило анализировать критические метаболические пути, включая гликолиз и окислительное фосфорилирование, в более физиологически значимом контексте.

Клетки U87 высевали с соответствующей плотностью в 96-луночный планшет с низким уровнем прикрепления и культивировали в течение 5 дней. На 5-й день формирование 3D-сфероидов наблюдалось с помощью изображений с высоким содержанием материала. Успешно сформированные сфероиды затем переносили в метаболическую пластину, покрытую поли-L-лизином для метаболического анализа. Чтобы повысить точность этих измерений, системы визуализации с высоким содержанием оценивают размер 3D-клеток, что позволяет точно нормализовать данные о внеклеточном потоке и свести к минимуму метаболические вариации из-за различий в размерах клеток. Такой комплексный подход обеспечивает более надежный анализ метаболических реакций клеток глиомы на медикаментозное лечение, выявляя потенциальные механизмы лекарственной устойчивости. В конечном счете, эта методология дает ценную информацию о метаболической динамике глиом и поддерживает разработку новых, клинически значимых терапевтических стратегий.

Введение

Глиомы, распространенная и агрессивная форма опухоли головного мозга, представляют значительные клинические проблемы из-за их быстрого прогрессирования, крайне неоднородного микроокружения опухоли и выраженной устойчивости к традиционнымметодам лечения. Эти сложности требуют более физиологически значимых экспериментальных моделей для повышения точности терапевтических оценок. Традиционные двумерные (2D) системы клеточных культур не в состоянии воспроизвести архитектуру опухоли in vivo и межклеточные взаимодействия2, что часто приводит к вводящим в заблуждение выводам относительно эффективности лекарств и биологии опухоли3.

Чтобы устранить эти ограничения, трехмерные (3D) модели опухолей стали превосходной альтернативой, предлагающей повышенную биологическую значимость за счет имитации структурных и функциональных характеристик опухолей in vivo 4,5. В то же время, метаболическое перепрограммирование все чаще признается признаком прогрессирования глиомы и резистентности к лечению 6,7,8. Анализ внеклеточного потока стал широко используемым методом измерения в режиме реального времени ключевых метаболических параметров, таких как скорость внеклеточного закисления (ECAR, измеряющий отток протонов в основном от производства гликолитического лактата) и скорость потребления кислорода (OCR, количественная оценка использования кислорода митохондриями при окислительном фосфорилировании), что позволяет получить важнейшее представление о путях гликолитического и окислительного фосфорилирования 9,10,11.

В этом исследовании анализ внеклеточного потока был адаптирован для анализа сфероидов 3D-глиомы, что позволило исследовать метаболические пути в контексте, который очень напоминает опухолевые состояния in vivo . Клетки глиомы U87 высевали с плотностью 1500 клеток на лунку в прозрачные 96-луночные планшеты с круглым дном и сверхнизким прикреплением и культивировали в течение 5 дней при 37 °C с 5%CO2 для облегчения образования сфероидов. Для подтверждения морфологии сфероида и оценки размера клеток была использована визуализация с высоким содержанием. Перед метаболическим анализом плотные и круглые сфероиды 3D-клеток диаметром около 220 мкм переносили на пластины для анализа, предварительно покрытые поли-L-лизином для обеспечения адгезии и стабильности измерения. Важно отметить, что нормализация метаболических данных на основе размера сфероида проводилась с помощью интегрированной визуализации с высоким содержанием информации, что снижает вариабельность и повышает надежность данных.

Эта интегрированная платформа, сочетающая в себе 3D-культуру, технологию анализа внеклеточного потока и нормализацию на основе визуализации, позволяет более точно оценить метаболические реакции глиомы на терапевтические вмешательства. Это исследование обеспечивает надежную основу для изучения метаболических основ лекарственной устойчивости и способствует разработке более эффективных, клинически переносимых стратегий лечения глиом.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Полные характеристики всех реагентов и расходных материалов подробно описаны в Таблице материалов.

1. 2D культура клеток

  1. Поддерживайте клетки U87 в минимально необходимой среде (MEM) с добавлением 10% (v/v) фетальной бычьей сыворотки (FBS) в стерильных условиях. Выполняйте стандартные процедуры пассирования, как только клетки достигнут 80% слияния.
    Примечание: На протяжении всего процесса культивирования внимательно следите за состоянием клеток и исключайте из последующих экспериментов клетки, демонстрирующие аномальный рост или морфологические изменения.
  2. Высейте клетки U87 в 10-сантиметровые чашки для клеточных культур и инкубируйте в стерильном инкубаторе для клеточных культур при температуре 37 °C с 5% (v/v)CO2 и относительной влажности 90-95%.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Среду следует регулярно заменять для поддержания оптимальных условий роста.

2. 3D формирование сфероидов клеток

  1. Подготовка к эксперименту
    1. Просмотрите весь рабочий процесс, показанный на рисунке 1 , прежде чем приступать к экспериментальным процедурам.
      ВНИМАНИЕ: Строго придерживайтесь асептических методов на протяжении всего эксперимента, чтобы обеспечить здоровье клеток и предотвратить заражение.
  2. Диссоциация и подсчет клеток
    1. Извлеките отработанную среду из чашки для культивирования клеток и трижды промойте клетки U87 9 мл фосфатно-солевого буфера (PBS) (3 мл на промывку). Утилизируйте использованные реагенты в растворе отбеливателя 20-25% (v/v) для инактивации всех биологически активных веществ.
    2. Добавьте в чашку 1 мл раствора трипсина и выдерживайте при 37 °C в течение 2-3 минут. Нейтрализуйте трипсин 2 мл DMEM, содержащего 10% FBS, предварительно нагретого до 37 °C после того, как все клетки будут отделены под микроскопическим наблюдением.
    3. Перенесите клеточную суспензию в центрифужную пробирку объемом 15 мл и центрифугируйте при 200 × г в течение 3 минут. Выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клеточную гранулу в 1 мл DMEM с добавлением 10% FBS. Аккуратно пипетируйте клетки, чтобы обеспечить равномерную клеточную суспензию. Затем подсчитайте с помощью гемоцитометра или автоматического счетчика клеток и запишите начальное количество клеток.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Осторожно обращайтесь с элементами во время промывки и добавления фильтрующего материала, чтобы избежать механических повреждений. Усилие пипетирования можно контролировать, чтобы предотвратить образование пузырьков, которые могут повлиять на жизнеспособность клеток и точность подсчета.
  3. Разведение клеточной суспензии
    1. Разогрейте неиспользованную среду до 37 °C. Выдерживать клеточные суспензии при комнатной температуре (RT; 25 ± 2 °C) в течение 30 минут.
    2. На основании исходного количества клеток разбавляют клеточную суспензию DMEM, содержащим 10% FBS, до конечного объема 20 мл, обеспечивая примерно 200 000 клеток.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Перед окончательным разведением аккуратно пипетируйте клеточную суспензию, чтобы предотвратить осаждение. Неиспользованную среду поддерживали при 37 °С, а клеточные суспензии инкубировали при ОТ. Если было засеяно 96 скважин с 1500 ячейками в каждой скважине, то общий объем составил 22 мл для учета избытка. Разведенную клеточную суспензию перекладывали в стерильную центрифужную пробирку объемом 50 мл и тщательно перемешивали.
  4. Посев ячеек в 96-луночные планшеты со сверхнизким вложением
    1. Тщательно перемешайте окончательную клеточную суспензию с помощью пипетки объемом 200 мкл. Медленно добавьте 200 мкл суспензии (1500 клеток/лунку) в каждую лунку прозрачного 96-луночного планшета со сверхнизким уровнем крепления с круглым дном по краю.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для повышения эффективности рассмотрите возможность использования многоканального дозатора.
    2. Выбросьте остатки суспензии после заполнения всех лунок, чтобы предотвратить загрязнение.
  5. Центрифугирование
    1. Плотно закройте пластину парапленкой, чтобы предотвратить утечку во время центрифугирования. Центрифугируйте смесь при 200 × г в течение 2 мин, чтобы гранулировать ячейки на дне каждой лунки.
    2. Снимите планшет с центрифуги, осторожно снимите парапленку и поместите планшет в инкубатор с температурой 37 °C, 5% CO2 .

3. Поли-D-лизиновое покрытие метаболических аналитических пластин

ПРИМЕЧАНИЕ: Микропланшет для метаболического анализа - это специализированный микропланшет, предназначенный для адгезии сфероидов клеток при анализе внеклеточного потока.

  1. Приготовьте раствор для покрытия, растворив 5 мг поли-D-лизина в 50 мл стерильной воды. Тщательно перемешиваем.
  2. Добавьте по 30 мкл раствора покрытия в каждую лунку метаболической аналитической пластины. Обеспечьте отсутствие пузырьков, осторожно встряхивая или отсасывая излишки раствора.
  3. Инкубируйте планшет и накройте его на 20 минут RT. Отсадите раствор для покрытия и дважды промойте лунки 200 μл стерильной воды.
  4. Высушите пластину на воздухе не менее 30 минут, а затем нагрейте до 37 °C безCO2 в течение 30 минут для стабилизации покрытия.
  5. Добавьте 175 μL предварительно нагретой среды в каждую лунку и поддерживайте температуру планшета при температуре 37 °C в инкубаторе, не содержащемCO2, до тех пор, пока он не будет готов к переносу сфероидов клеток.

4. Мониторинг роста сфероидов

  1. Перенесите сфероидальные пластины в систему визуализации с высоким содержанием после 5 дней культивирования.
  2. Параметры конфигурационной визуализации: установите температуру 37 °C и CO2 на 5%, а также отрегулируйте тип пластины, каналы и диапазон фокусировки.
  3. Получение сфероидальных изображений с помощью конфокального микроскопа с 10-кратным объективом и программным обеспечением для визуализации.
  4. Определите скважины, содержащие неповрежденные сфероиды (например, рисунок 2A-C), и запишите их положение для переноса. Исключите скважины с неправильными сфероидами (например, на рисунке 2D)».

5. Сфероидальная обработка

Примечание: Медикаментозное лечение проводили на зрелых 3D-сфероидах для оценки метаболических реакций.

  1. Назначение сфероидальных групп
    1. Отнесите интактные сфероиды к двум группам:
      Контрольная группа: 6 повторяющихся скважин
      Группа обработки: 6 реплицированных лунок (обработанных фенофибратом)
  2. Приготовление раствора препарата
    1. Рабочий раствор фенофибрата готовят в свежей предварительно подогретой среде в оптимальной концентрации (например, 100 мкМ).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Группы обработки были восстановлены в 100% ДМСО для создания исходных растворов, которые впоследствии были разбавлены в свежей предварительно подогретой среде. Контрольным группам вводили ту же конечную концентрацию ДМСО (0,1% v/v), которая присутствовала в образцах, обработанных препаратом. Окончательную концентрацию определяли с помощью анализа «доза-реакция».
  3. Замена среды
    1. Медленно отсасывайте по 100 мкл среды из каждой лунки вдоль стенки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте контакта с дном скважины, чтобы предотвратить повреждение сфероида.
    2. Добавьте в контрольные лунки 100 μл свежей среды.
    3. Добавьте в очистные лунки 100 мкл рабочего раствора фенофибрата.
  4. Инкубация после обработки
    1. Осторожно верните планшет при температуре 37 °C в инкубаторе с 5% содержаниемCO2 . Культура за 72 ч.
  5. Морфологическая оценка
    1. Оцените целостность сфероидов после процедуры визуализации на шаге 4.

6. Перенос сфероидов клеток

  1. Осторожно извлеките содержащую сфероид пластину с низкой адгезией из системы визуализации и поместите ее на стерильную поверхность в шкафу биобезопасности. Поместите пластины для анализа, покрытые поли-L-лизином, рядом друг с другом для переноса.
  2. Обрежьте кончик пипетки объемом 20 мкл, чтобы обеспечить щадящую аспирацию сфероидов клеток без повреждения.
  3. Аккуратно отсасывайте каждый неповрежденный сфероид со дна лунки и перенесите его в соответствующую лунку клеточной пластины, дав ему отстояться в течение 20 с. Подтвердить адгезию можно по отсутствию плавающих фрагментов под микроскопией 10×.
  4. Повторите эти действия для всех сфероидов и проверьте эффективность переноса с помощью системы визуализации, описанной в шаге 4.

7. Метаболический анализ

  1. Дегазация проб
    1. Поместите обработанный препаратом сфероидальный планшет в предварительно уравновешенную камеру для гидратации при температуре 37 °C, лишенную CO2.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Непрерывная дегазация проводилась в течение 1 часа со строгим контролем окружающей среды для обеспечения метаболической точности измерения.
  2. Приготовление реагентов и введение препарата
    1. Параллельно готовят реагент и загружают препарат в течение 1-часового периода дегазации.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Основной целью этого эксперимента является оценка митохондриального стресса; Все процедуры должны быть тщательно согласованы с этой целью. Для различных типов экспериментов необходимо следовать определенным протоколам, чтобы гарантировать точность и надежность данных.
    2. Лекарственная подготовка: Используйте следующие составы:
      Олигомицин (ингибитор митохондриального комплекса V)
      Карбонилцианид-4 (трифторметокси) фенилгидразон (FCCP, развязка)
      Смесь ротенона (ингибитора комплекса I) и антимицина А (ингибитора комплекса III)
      Примечание: Препараты были получены из набора для митохондриального стресс-теста, используемого в этом исследовании. Некоторые соединения являются биологически опасными; Необходимо использовать строгие протоколы биобезопасности (средства индивидуальной защиты и готовность к чрезвычайным ситуациям).
    3. Лекарственная форма
      1. Приготовьте стоковые растворы порошкообразных препаратов так, как показано в таблице 1.
      2. Разбавляют исходные растворы до рабочих концентраций, указанных в таблице 2.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Растворы подвергаются вихревой обработке или тщательному перемешиванию для обеспечения однородности по градиентам концентрации.
  3. Загрузка компаундов в картриджи с зондами обнаружения
    ПРИМЕЧАНИЕ: Картридж с зондом обнаружения представляет собой одноразовый картридж, содержащий биосенсорные зонды для измерения кислорода и pH в режиме реального времени.
    1. Активация картриджа зонда (должна предшествовать загрузке компаунда):
      ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что датчик активирован, выполнив эти шаги не менее чем за 12 часов до использования:
      1. Добавьте по 200 мкл калибровочного раствора в каждую лунку гидратационной пластины.
      2. Осторожно расположите картридж зонда обнаружения на гидратационной пластине, обеспечивая полное погружение всех зондов в калибровочный раствор.
      3. Инкубируйте собранную установку в инкубаторе безCO2 при температуре 37 °C в течение 12-24 часов для активации датчиков.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Неполное погружение или недостаточная гидратация приводят к дрейфу измерения (погрешность OCR ±15%).
    2. Используйте многоканальные или электронные пипетки для подачи точных объемов в лунки, избегая попадания остаточных капель на краях лунок.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку острая стимуляция препаратом не требуется, следуйте стандартной последовательности нагрузки.
    3. Поместите пластину зонда на устойчивую поверхность после погрузки, чтобы предотвратить нарушения во время транспортировки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Точность загрузки значительно влияет на результаты.
  4. Конфигурация программного обеспечения
    1. Запустите программное обеспечение и выберите протокол анализа митохондриального нагрузочного теста.
    2. Распределите группы в соответствии с заранее определенной экспериментальной группировкой.
    3. Задайте имя файла и нажмите «Начать выполнение».
  5. Калибровка картриджей датчиков обнаружения.
    1. Аккуратно вставьте заряженную пластину щупа в слот для прибора в соответствии с подсказкой системы.
    2. Начните калибровку (15-20 минут). Поддерживать стабильные условия; Избегайте вибраций.
    3. Снимите гидратационную пластину сразу после калибровки (следуя инструкциям на экране).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Перед калибровкой снимите крышку пластины.
  6. Метаболическое профилирование 3D сфероидов
    1. Перенесите дегазированную 3D-сфероидную измерительную пластину в измерительный паз прибора. Обеспечьте точное совмещение с массивом щупов, подтвердив следующее: (i) Направляющие угловых пазов пластины; ii) скважина А1 совпадает с индексированной позицией; (iii) Отсутствие видимого зазора между пластиной и поверхностью прибора
    2. Нажмите «Пуск », чтобы начать анализ митохондриального стресса (продолжительность: ~1,5 часа). Контролируйте параметры прибора на всем протяжении.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Перед измерением снимите крышки 3D-сфероидных пробирных пластин.
  7. Анализ данных
    1. Визуальный анализ
      1. Перенос 3D-планшетов для анализа сфероидов в систему визуализации с высоким содержанием содержимого.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Изображения были получены, как описано в шаге 4. Визуализация показала, что большинство сфероидов остались неповрежденными, в то время как меньшинство получило повреждения в процессе переноса, как показано на рисунке 3.
      2. Проанализируйте морфологические данные (например, площадь, длину, ширину) сфероидов клеток с помощью программного обеспечения Harmony версии 5.2, следуя шагам 7.7.1.3-7.7.1.7.
      3. Примените модуль «Область текстуры » для отделения 3D-сфероидов от фона, разделив содержимое изображения на три кластера на основе особенностей текстуры объектов на изображениях.
      4. Примените модуль Найти область изображения для уточнения разделения предварительно выделенных 3D-сфероидов с помощью объемных размерных характеристик, чтобы удалить примеси и сохранить неповрежденные сфероиды.
      5. Измерьте морфологические параметры 3D-сфероидов с помощью модуля Морфологические свойства .
      6. Примените модуль Выбрать популяцию, чтобы в конечном итоге отфильтровать подлинные сфероиды 3D-клеток.
      7. Экспортируйте результаты морфологических данных, как показано в таблице 3.
    2. Обработка данных
      ПРИМЕЧАНИЕ: Нормализуйте данные о клетках с помощью параметров с выходных данных визуализации, чтобы свести к минимуму экспериментальные артефакты.
      1. Откройте необработанные метаболические данные с помощью программного обеспечения для анализа.
      2. Выберите опцию нормализации, чтобы получить доступ к интерфейсу редактирования режима нормализации.
      3. Введите площадь поперечного сечения сфероидов, содержащихся в каждой соответствующей лунке пробирной пластины, в поле «Значения нормализации ».
      4. Установите параметр коэффициента масштабирования равным 1 000 000.
      5. Нажмите кнопку Применить , чтобы завершить процесс нормализации. Окончательные результаты показаны на рисунке 4.

8. Утилизация отходов

  1. Утилизируйте все экспериментальные отходы (среды, реагенты, расходные материалы и клеточные суспензии) в соответствии с протоколами обращения с биологически опасными и лабораторными отходами. Проведите автоклавную или химическую дезинфекцию биологически активных отходов перед утилизацией, чтобы предотвратить загрязнение окружающей среды.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Тремя наиболее важными этапами в процессе детектирования сфероидов 3D-клеток являются культивирование сфероидов 3D-клеток, процесс переноса сфероидов, а также визуализация и количественное определение сфероидов после обнаружения (рис. 1). Кроме того, очень важно наблюдать за состоянием сфероидов клеток. При проведении экспериментов в соответствии с указанными выше экспериментальными методиками сфероиды были обнаружены на5-е сутки (рис. 2), а сфероиды ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Адаптация анализа внеклеточного потока к 3D-моделям глиомы представляет собой важнейший методологический прогресс в изучении метаболизма опухолевых клеток. В то время как традиционные 2D-культуры долгое время служили основой для экспериментов in vitro, они не смогли уловить пространственную архитектуру, межклеточные и межклеточные взаимодействия, а также градиенты кислорода и питательных веществ, характерные для опухолей in vivo. Эти особенности ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Данное исследование финансировалось Национальным фондом естественных наук Китая, гранты под номерами 82471329 и 82001248.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Блюдо 10 смКорнинг430167
Центрифужная пробирка 15 млКорнинг430791
Центрифужная пробирка объемом 50 млКорнинг430828
Кальцеин, AMИнвитрогенС1430
Графиня 3Термо ФишерАвтоматический счетчик ячеек
Фетальная бычья сывороткаGibcoA5669701
Гармония 5.2ПеркинЭлмерПрограммное обеспечение для обработки изображений
Hoechst 33342СоларбиоС0031
MEM EBSS MediumГиКлонSH30024.01
Оперетта CLSПеркинЭлмерСистема анализа изображений с высоким содержанием
ПБСГиКлонSH30256.01
Поли-Д лизина гидробромидСигма П7280
Сверхнизкое крепление с круглым дном 96-луночных планшетовКорнинг4515
Программное обеспечение Seahorse Wave DesktopAgilent
Морской конек XFe96AgilentМашина для экстракорпорального метаболического тестирования
Сорвалл ST8RТермо ФишерЦентрифуга
ТРИПСИН 0,25% ЭДТАGibco25200072
U87MG клеточная линия Национальная инфраструктура клеточного ресурса
XF 1.0 M раствор глюкозы, 50 млAgilent103577-100
XF 100 мМ раствор пирувата, 50 млAgilent103578-100
XF 200 мМ раствор глютамина, 50 млAgilent103579-100
XF Calibrant Solution 500 мл Agilent100840-000
XF Cell Mito Набор для стресс-тестовAgilent103015-100
XF DMEM Medium, pH 7,4, 500 млAgilent103575-100
XFe96/XF Pro Массив датчиков обнаружения флюкспакаAgilent103792-100
Пластины для метаболического анализа XFe96/XF Pro FluxpakAgilent103792-100

Ссылки

  1. Wu, W., et al. Glioblastoma multiforme (GBM): An overview of current therapies and mechanisms of resistance. Pharmacol Res. 171, 105780(2021).
  2. Crowley, A. E. 85th annual report on medical education in the United States. Executive summary. Jama. 254 (12), 1553-1554 (1985).
  3. Zhang, X., et al. Nutritionally physiological cell culture medium and 3D culture influence breast tumor proteomics and anticancer drug effectiveness. Pharmacol Res. 210, 107519(2024).
  4. Edmondson, R., Broglie, J. J., Adcock, A. F., Yang, L. Three-dimensional cell culture systems and their applications in drug discovery and cell-based biosensors. Assay Drug Dev Technol. 12 (4), 207-218 (2014).
  5. Bahl, R., et al. Growing desmoplastic three-dimensional pancreatic cancer spheroids from coculture. J Vis Exp. 211, e66625(2024).
  6. Faubert, B., Solmonson, A., Deberardinis, R. J. Metabolic reprogramming and cancer progression. Science. 368 (6487), eaaw5473(2020).
  7. Baksh, S. C., Finley, L. W. S. Metabolic diversity drives cancer cell invasion. Nature. 605 (7911), 627-628 (2022).
  8. Yoshida, G. J. Metabolic reprogramming: The emerging concept and associated therapeutic strategies. J Exp Clin Cancer Res. 34, 111(2015).
  9. Plitzko, B., Loesgen, S. Measurement of oxygen consumption rate (OCR) and extracellular acidification rate (ECAR) in culture cells for assessment of the energy metabolism. Bio Protoc. 8 (10), e2850(2018).
  10. Hong, X., Muñoz-Cánoves, P. Measuring oxygen consumption rate (OCR) and extracellular acidification rate (ECAR) in muscle stem cells using a Seahorse analyzer: Applicability for aging studies. Methods Mol Biol. 2640, 73-88 (2023).
  11. Yoo, I., Ahn, I., Lee, J., Lee, N. Extracellular flux assay (Seahorse assay): Diverse applications in metabolic research across biological disciplines. Mol Cells. 47 (8), 100095(2024).
  12. Kapałczyńska, M., et al. 2D and 3D cell cultures - a comparison of different types of cancer cell cultures. Arch Med Sci. 14 (4), 910-919 (2018).
  13. Rybkowska, P., et al. The metabolic changes between monolayer (2D) and three-dimensional (3D) culture conditions in human mesenchymal stem/stromal cells derived from adipose tissue. Cells. 12 (1), 178(2023).
  14. Białkowska, K., Komorowski, P., Bryszewska, M., Miłowska, K. Spheroids as a type of three-dimensional cell cultures-examples of methods of preparation and the most important application. Int J Mol Sci. 21 (17), 6225(2020).
  15. Pinto, B., Henriques, A. C., Silva, P. M. A., Bousbaa, H. Three-dimensional spheroids as in vitro preclinical models for cancer research. Pharmaceutics. 12 (12), 1186(2020).
  16. Juarez-Moreno, K., Chávez-García, D., Hirata, G., Vazquez-Duhalt, R. Monolayer (2D) or spheroids (3D) cell cultures for nanotoxicological studies? Comparison of cytotoxicity and cell internalization of nanoparticles. Toxicol In Vitro. 85, 105461(2022).
  17. Renner, H., et al. A fully automated high-throughput workflow for 3D-based chemical screening in human midbrain organoids. Elife. 9, e52904(2020).
  18. Beaufort, I. N., et al. Author commentary on Ilse N. Beaufort et al. Endoscopy. 56 (5), v6(2024).
  19. Liu, D., Chen, S., Win Naing, M. A review of manufacturing capabilities of cell spheroid generation technologies and future development. Biotechnol Bioeng. 118 (2), 542-554 (2021).
  20. Trettner, K. J., Hsieh, J., Xiao, W., Lee, J. S. H., Armani, A. M. Nondestructive, quantitative viability analysis of 3D tissue cultures using machine learning image segmentation. APL Bioeng. 8 (1), 016121(2024).
  21. Dominijanni, A. J., Devarasetty, M., Forsythe, S. D., Votanopoulos, K. I., Soker, S. Cell viability assays in three-dimensional hydrogels: A comparative study of accuracy. Tissue Eng Part C Methods. 27 (7), 401-410 (2021).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

D3D

Похожие статьи