Методическая статья

Анализ конкурирующей эндогенной сети РНК у крыс с окклюзией средней мозговой артерии на основе экспрессии некодирующих РНК, микроРНК и мРНК

668 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/68876

⸱

7 октября 2025 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pharmacy, The First Affiliated Hospital of Anhui University of Chinese Medicine, 2School of Pharmacy, Anhui University of Chinese Medicine, 3School of Medical Economics Management, Anhui University of Chinese Medicine, 4Xin'an Medical Research Institute, 5Key Laboratory of Xin'An Medicine, Ministry of Education, 6Anhui Province Key Laboratory of Chinese Medicinal Formula

В этой статье

Краткое содержание

В этом исследовании использовался биоинформатический анализ и экспериментальная валидация для систематического изучения регуляторной роли и основных механизмов длинных некодирующих РНК (днРНК), функционирующих в качестве конкурентных эндогенных РНК (цеРНК) при ишемическом инсульте.

Аннотация

Данное исследование направлено на изучение регуляторной роли и основных механизмов некодирующих РНК, действующих как цеРНК при ишемическом инсульте. Основываясь на гипотезе цеРНК, некодирующие РНК, микроРНК и мРНК были идентифицированы как компоненты регуляторной сети, участвующей в инсульте. Для детального анализа были выбраны ключевые некодирующие РНК из полученной подсети. Анализ функционального обогащения с использованием Gene Ontology и картирование путей с помощью Киотской энциклопедии генов и геномов выявили критические взаимодействия внутри сети цеРНК, связанной с lncRNA. Ключевые пути, включая передачу сигналов кальция, передачу сигналов щелевого соединения и взаимодействие нейроактивных лигандных рецепторов, были дополнительно проверены с помощью вестерн-блоттинга. Сконструированная сеть цеРНК состояла из 334 некодирующих РНК, микроРНК и мРНК, при этом анализ функционального обогащения предсказывал их биологическую роль. Для создания репрезентативной подсети цеРНК были выбраны три некодирующие РНК с высокой степенью центральности. Вестерн-блоттинг показал, что по сравнению с фиктивной группой, уровни экспрессии ключевых белков - CaMKII, кальмодулина, CX36, PKC, CX43, GRIA3, GABRA6 и NPY1R были значительно снижены в модельной группе, в то время как экспрессия CaN была значительно повышена (P < 0,05). Эти данные свидетельствуют о том, что некодирующие РНК в значительной степени участвуют в патогенезе инсульта. В заключение следует отметить, что некодирующие РНК, действующие как цеРНК, играют важнейшую регуляторную роль в патогенезе ишемического инсульта.

Введение

Ишемический инсульт, распространенное неврологическое расстройство, приводит к необратимому повреждению головного мозга, долгосрочной инвалидности или смерти 1,2,3,4. МикроРНК (микроРНК или miR), длинные некодирующие РНК (lncRNAs) и матричные РНК (мРНК) образуют РНК-опосредованные регуляторные сети 5,6,7,8. Эти молекулы регулируют клеточные функции с помощью различных сложных механизмов 9,10 все чаще признаются участниками патофизиологии ишемического инсульта. Однако, несмотря на их растущую связь с этим заболеванием, точная роль этих некодирующих РНК остается неясной. Дальнейшее исследование новых некодирующих РНК имеет важное значение для выяснения молекулярных механизмов, лежащих в основе ишемического инсульта.

Некодирующие РНК действуют как ключевые регуляторы экспрессии генов во время инициации и прогрессирования различных патологических состояний. Выступая в качестве конкурирующих эндогенных РНК (цеРНК), некодирующие РНК связываются с микроРНК, оказывая специфические регуляторные эффекты11. Wei et al. сообщают, что lncRNA AK038897 действует как цеРНК, нацеливаясь на miR-26a-5p, тем самым модулируя связанную со смертью протеинкиназу 1 (DAPK1) для усугубления церебрального ишемия-реперфузионного повреждения12. Исследования показывают, что длинная некодирующая РНК SNHG1 (lncRNA SNHG1) функционирует как цеРНК для регуляции цереброваскулярных заболеваний путем модуляции сигнального пути HIF-1α/VEGF через взаимодействие с miR-18a13. Дополнительные исследования показывают, что длинная некодирующая РНК, экспрессируемая по материнской линии геном 3 (lncRNA MEG3), модулирует апоптоз нейронов через сигнальный каскад miR-21/PDCD414. В то время как многочисленные некодирующие РНК, микроРНК и мРНК были идентифицированы с помощью высокопроизводительного секвенирования или анализа микрочипов, функции этих молекул при инсульте остаются неясными, и срочно необходимо систематическое создание РНК-опосредованных регуляторных сетей.

Таким образом, данное исследование направлено на создание всеобъемлющей сети некодирующих РНК-микроРНК на основе гипотезы цеРНК с использованием ранее собранных данных, а также на анализ выбранных подсетей цеРНК с помощью обогащения Gene Ontology (GO) и Киотской энциклопедии генов и геномов (KEGG) для лучшего понимания функций некодирующих РНК. Результаты могут показать, что некоторые некодирующие РНК функционируют как цеРНК, потенциально регулируя специфические микроРНК и их целевые мРНК. Обогащение ГО может выявить ключевые биологические процессы, такие как клеточное развитие, передача сигналов и регуляция клеточного цикла, в то время как обогащение путями может выявить их участие в путях, связанных с инсультом, иммунных реакциях и метаболизме. Эти результаты могут подчеркнуть потенциальную роль некодирующих РНК в различных клеточных процессах и механизмах заболевания.

Предлагается несколько ключевых улучшений по сравнению с существующими методами анализа сети цеРНК в исследованиях ишемического инсульта, что подтверждается сравнениями с аналогичными исследованиями: во-первых, интеграция многоуровневой валидации путем сочетания построения сети с проверкой функциональных путей; в отличие от Li et al.15, которые сосредоточены в основном на биоинформатическом профилировании иммунно-ассоциированных сетей цеРНК с использованием общедоступных транскриптомных данных, конструируют сеть цеРНК, состоящую из 334 некодирующих РНК, микроРНК и мРНК, и проверяют критические сигнальные пути (кальциевая сигнализация, сигнализация щелевого соединения и нейроактивное взаимодействие лиганд-рецепторов) с помощью вестерн-блот-анализа, устраняя ограничение чрезмерной зависимости от прогнозов in silico, как видно из Fan et al.16, которая конструирует циркРНК-ассоциированную сеть цеРНК, но не имеет экспериментальной валидации нисходящих путей, и подтверждает функциональную значимость предсказанной сети путем количественной оценки экспрессии белков (например, CaMKII, CX36, GRIA3) как в модельной, так и в фиктивной группе; фокус на основных некодирующих РНК с высокой топологической значимостью, повышающий специфичность результатов; в отличие от Cheng et al.17, которые конструируют сеть некодирующих РНК-микроРНК-мРНК цеРНК с 3 некодирующими РНК, 2 микроРНК и 24 мРНК, но не отдают приоритет ключевым регуляторам, идентифицируют 3 некодирующие РНК с высокой степенью центральности для построения репрезентативной подсети, обеспечивая привязку механистических идей к наиболее влиятельным узлам и улучшая интерпретируемость по сравнению с более широкими, менее сфокусированными сетями, подобными описанным в Li et al.18, который включает 62 некодирующие РНК, но не имеет целевого подсетевого анализа; предоставить подробные экспериментальные параметры для улучшения воспроизводимости: использовать 500 нг-1 мкг общей РНК, выделенной из тканей мозга (6 крыс в группе: 20 моделей MCAO и 20 фиктивных контрольных моделей) для подготовки библиотеки, с числом целостности РНК (RIN) > 8,0 для обеспечения качества, детали, не указанная в Wang et al.19, который проверяет биомаркеры циркулярной РНК, но опускает спецификации ввода РНК; использовать самцов крыс с SPF SD (220 ± 30 г) с широко используемой моделью MCAO, но явно отметить ее ограничения, она не полностью воспроизводит сосудистую сложность или иммунные реакции ишемического инсульта человека, как подчеркивается в Li et al. -- и смягчить это путем стратификации крыс по неврологическим баллам (1-3) для стандартизации тяжести инфаркта; признать ограничения исследования: сеть цеРНК может не захватывать посттрансляционные модификации, и размер выборки для валидации вестерн-блоттинга (n = 6 на группу) может быть расширен, а в будущем работа будет включать более крупные когорты и протеомные анализы для устранения этих пробелов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Эксперименты на животных были одобрены Комитетом по экспериментальной этике Аньхойского университета китайской медицины (номер лицензии: AHUCM-rats-2024006) и проводились в соответствии с институциональными рекомендациями и стандартами использования животных JoVE. В этом исследовании были использованы сорок самцов крыс с SPF SD (220 г ± 30 г). Используемые реагенты и оборудование перечислены в Таблице материалов.

1. Подопытные животные

  1. Размещение животных в Экспериментальном центре для животных в стандартных экспериментальных условиях. Поддерживайте 12-часовой цикл освещения/темноты, ежедневно меняйте постельное белье и обеспечьте свободный доступ к еде и воде.
  2. Усыпляйте животных в конце эксперимента путем введения 150 мг/кг пентобарбитала натрия путем внутрибрюшинной инъекции для вызова глубокого обезболивающего состояния (в соответствии с утвержденными в учреждении протоколами). Подтвердите глубокую анестезию отсутствием рефлекторной реакции на щипывание лапы, контролируйте дыхание для обеспечения полной потери жизненных показателей, а затем приступайте к обезглавливанию.

2. Модель индукции окклюзии средней мозговой артерии (MCAO) у крыс

  1. Вызвать анестезию путем внутрибрюшинного введения 1% пентобарбитала натрия в дозе 40 мг/кг20 (в соответствии с утвержденными в учреждении протоколами). Оценивайте глубину анестезии с помощью щипки пальцев ног и роговичных рефлексов.
    1. Непрерывно контролируйте дыхание и частоту сердечных сокращений на протяжении всей процедуры. Наносить стерильную глазную мазь на основе минерального масла сразу после индукции анестезии для защиты глаз21.
  2. После полного обезболивания сделайте разрез по средней линии шеи и осторожно обнажите правую общую сонную артерию (CCA), внутреннюю сонную артерию (ICA) и наружную сонную артерию (ECA). При прямой визуализации используйте соответствующие микрохирургические инструменты (например, щипцы и ножницы), чтобы аккуратно отделить окружающую соединительную ткань и полностью обнажить каждую артерию.
    1. После обнажения артерий перевязать ЭКА и ОСА с помощью хирургических швов. Завяжите надежные хирургические узлы, чтобы перекрыть кровоток и свести к минимуму кровотечение во время последующих процедур. Обеспечьте надлежащее натяжение, чтобы создать стабильное поле для наложения швов.
    2. Сделайте небольшой разрез в месте разветвления ЭКА и ВСА с помощью офтальмологических ножниц для подготовки к наложению швов. Выберите нейлоновый шов диаметром 0,25 мм и длиной 18 мм от кончика закругленного (шарообразного) конца. Введите шов через место разреза на стыке ЭХА-ВСА и аккуратно продвигайте его вдоль ВСА на глубину примерно 18,5 мм ± 0,5 мм, чтобы окклюзировать среднюю мозговую артерию и вызвать очаговую ишемию головного мозга.
    3. Закрепите вставленный нейлоновый шов на окружающих тканях или кровеносных сосудах с помощью хирургических швов для предотвращения смещения. После поддержания MCAO в течение 2 ч вызвать ишемию/реперфузионное повреждение. С помощью тонких хирургических щипцов аккуратно захватите нейлоновый шов и медленно отведите примерно 5 мм, чтобы частично восстановить мозговой кровоток и вызвать реперфузионное повреждение. В фиктивной группе перевязывают только сонную артерию без введения нитевого эмболиса22.
  3. Через неделю после успешного создания модели MCAO, глубоко обезболите крыс. Как только нет реакции на щипки лапой, быстро обезглавливают и собирают мозги. Промойте ткани мозга обычным физиологическим раствором, затем храните их в холодильнике при температуре −80 °C длякриоконсервации.
  4. Оценка неврологических функций
    1. Оцените неврологические функции с помощью скорингового метода Лонга для определения успешности модели MCAO24. Через 24 ч после реперфузии оцените неврологические функции у каждой крысы и присвойте балл на основе следующих критериев: 0 баллов: отсутствие наблюдаемого неврологического дефицита; 1 балл: сгибание левой передней конечности во время подвешивания хвоста, передняя конечность не полностью выпрямлена; 2 балла: сгибание левой передней конечности во время подвешивания хвоста с заметно сниженным сопротивлением на пораженной (левой) стороне при размещении на ровной поверхности; Оценка 3: то же, что и оценка 2, с добавлением круговых или непроизвольных поворотных движений во время ползания; 4 балла: потеря сознания или смерть в течение 24 часов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Более высокий балл указывает на более серьезное поведенческое расстройство и большие неврологические нарушения.
  5. Рассчитать объем инфаркта головного мозга с помощью окрашивания 2,3,5-трифенилтетразолием хлорида (ТТХ)
    1. Разрежьте мозг каждой крысы ex vivo вдоль корональной плоскости на пять срезов одинаковой толщины. Убедитесь, что толщина каждого ломтика составляет от 2,0 мм ± 0,1 мм. Полностью погрузите срезы в свежеприготовленный 2% (w/v) раствор для окрашивания TTC.
      1. Оберните контейнер для окрашивания в алюминиевую фольгу, чтобы защитить раствор от света, и инкубируйте образцы в инкубаторе с постоянной температурой при температуре 37 °C ± 0,5 °C в течение 30 минут. После окрашивания наблюдайте розово-красное окрашивание в нормальной ткани мозга, в то время как участки ишемического инфаркта остаются неокрашенными (белыми) из-за потери активности дегидрогеназы.
    2. Перенесите окрашенные ТТС срезы мозга в 4% (масс./об.) раствор параформальдегида и зафиксируйте при 4 °C в течение 24 ч для сохранения морфологии тканей. После фиксации сделайте цифровые снимки срезов с помощью системы обработки изображений с высоким разрешением. Запись и архивирование данных через 24 ч после фиксации.
    3. Используйте программное обеспечение ImageJ для количественной оценки объема инфаркта и общего объема мозговой ткани для каждой группы крыс после окрашивания TTC. Рассчитайте процент скорректированного объема инфаркта по следующей формуле25:
      Скорректированный объем инфаркта (%) = {[общий объем поражения − (объем левого полушария − объем правого полушария)] / объем правого полушария} × 100%.
    4. Используйте программное обеспечение GraphPad Prism для визуализации и статистического анализа скорректированных объемов инфаркта с помощью непарного t-критерия. Определите статистическую значимость как P < 0,05.

3. Высокопроизводительное секвенирование РНК

  1. Выберите ткани мозга у трех крыс в каждой группе. Удалите рибосомную РНК (рРНК) из общих образцов РНК с помощью набора для удаления рРНК Ribo-Zero в соответствии с инструкциями производителя.
    1. Создание библиотек комплементарной ДНК (кДНК) с помощью набора для подготовки библиотеки РНК TruSeq в соответствии со стандартным протоколом. Используйте очищенные библиотеки кДНК для генерации кластеров и секвенирования.
  2. Используйтеранее сгенерированные основные данные, которые предоставили все библиотеки секвенирования и наборы данных для данного исследования, не полагаясь на вновь созданные библиотеки. Сосредоточьте текущую работу на интегрированном анализе слияния этих существующих наборов данных без создания новых библиотек RNA-seq или данных секвенирования.
    1. Подтвердите одобрение предыдущего исследования со стороны соответствующих институциональных комитетов по этике. Проведите высокопроизводительное секвенирование для систематической оценки профиля экспрессии микроРНК у крыс с MCAO, придерживаясь стандартизированных протоколов, описанных ранее27.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Данные контроля качества для библиотеки секвенирования РНК представлены в Дополнительном файле 1.

4. Дифференциальный анализ экспрессии длинных некодирующих РНК, микроРНК и матричных РНК

  1. Получите аннотации для генов, кодирующих белки, микроРНК и некодирующие РНК из Ensembl (https://www.ensembl.org/index.html), miRBase (https://www.mirbase.org/) и NONCODE (http://www.noncode.org/), в зависимости от обстоятельств 28,29,30. Количественная оценка экспрессии генов с помощью StringTie31 (https://ccb.jhu.edu/software/stringtie/).
    1. Соберите выровненные чтения из каждого образца в транскриптомы с помощью ассемблера StringTie. Используйте модуль слияния StringTie для интеграции сборок транскриптома из всех образцов, создавая единый набор транскриптов, согласованных по всей когорте. Используйте этот объединенный транскриптом для оценки распространенности транскрипта32.
    2. Выполните количественное определение генов, кодирующих белки, и некодирующих РНК путем применения нормализации усеченного среднего M-значений (TMM) и вычисления фрагментов на килобазу транскрипта на миллион картированных прочтений (FPKM) для каждого транскрипта 33,34.
  2. Выполните анализ дифференциальной экспрессии с использованием пакета edgeR (https://bioconductor.org/) для идентификации дифференциально экспрессируемых некодирующих РНК (DEL), микроРНК (DEM) и мРНК (DEM) между MCAO и контрольной группами. Преобразуйте отфильтрованную необработанную матрицу подсчета в объект edgeR DGEList. Оцените общую дисперсию и присвойте одинаковое значение дисперсии каждому гену или микроРНК.
    1. Проведите точный тест для сравнения экспрессии генов между группами. Получите log2-кратное изменение (log2FC), логарифмическое количество на миллион (logCPM), P-значения и P-значения, скорректированные на частоту ложных обнаружений (FDR), для каждого дифференциально экспрессируемого гена35. Определите статистическую значимость как P < 0,05 с порогом кратного изменения |log2(FC)| > 1.

5. Предсказание длинных некодирующих РНК и матричных РНК-мишеней дифференциально экспрессируемых микроРНК

  1. Получение последовательностей DEMis и DEL из соответствующих баз данных. Используйте инструменты прогнозирования взаимодействия miRNA-lncRNA miRanda36 и RNAhybrid37 для определения потенциальных взаимодействий между DEMis и DEL. Получение пар взаимодействия микроРНК-мРНК из базы данных miRWalk 3.0 (http://mirwalk.umm.uni-heidelberg.de/)38

6. Построение длинной некодирующей РНК - микроРНК - регуляторной сети матричной РНК

  1. Построить регуляторную сеть lncRNA-miRNA-mRNA на основе гипотезы цеРНК39,40.
    1. Рассчитайте коэффициент корреляции Пирсона (PCC) между DEL и DEM. Выберите пары lncRNA-мРНК для дальнейшего анализа, если PCC > 0,99 и P < 0,01.
    2. Для каждой пары ко-экспрессируемой lncRNA-мРНК определите общие микроРНК, нацеленные на оба транскрипта. Используйте эти общие микроРНК для создания сети коэкспрессии микроРНК-lncRNA.
    3. Использование Cytoscape (https://cytoscape.org/) для построения и визуализации сети взаимодействия lncRNA-miRNA-mRNA41,42. Выполните следующие действия:
      1. Используйте плагин CytoNCA для вычисления центральности между центральностью (BC), центральностью близости (CC) и центральностью степени (DC) для каждого узла.
      2. Выберите гены с показателями центральности, превышающими медианные значения всех трех метрик, для построения окончательной ключевой подсети.
      3. Используйте плагин CytoHubba для определения 10 основных генов-хабов в сети белок-белковых взаимодействий и извлечения ключевых узлов, определенных на шаге 2.
      4. Рассчитайте степень узла для каждого компонента сети цеРНК.

7. Анализ функционального обогащения

  1. Выполнение анализа обогащения путей GO и KEGG для дальнейшего изучения функции РНК43. Использование пакета clusterProfiler (https://bioconductor.org/) для визуализации результатов обогащения44.

8. Вестерн-блоттинг для определения уровней экспрессии ключевых белков, участвующих в lncRNA - цеРНК-связанных путях

  1. Под глубоким наркозом быстро удаляют весь мозг. После тщательного удаления мозговых оболочек и кровеносных сосудов изолируйте корковую ткань в области инфаркта крысы45. С помощью тонких ножниц разрежьте ткань на небольшие кусочки, следя за тем, чтобы каждый кусочек весил от 50 мг до 100 мг. Перенесите взвешенные образцы тканей в предварительно охлажденные гомогенизационные пробирки.
    1. Приготовьте буфер для лизиса белка при объемном соотношении PMSF к буферу для лизиса RIPA 1:100 (конечная концентрация 1 мМ PMSF). Добавьте буфер для лизиса в соотношении 200 мкл на 20 мг ткани. Тщательно гомогенизируйте образцы с помощью термостерилизованного гомогенизатора стекла до тех пор, пока ткань не будет тонко разрушена.
    2. Инкубируйте гомогенаты на льду в течение 30 минут, осторожно перемешивая каждые 10 минут, чтобы способствовать полному лизису. Центрифугируйте образцы при 28 656,6 × г в течение 15 мин при 4 °C. Осторожно аспирируйте надосадочную жидкость, содержащую общий белок, не нарушая гранулы.
  2. Добавьте в образец белка загрузочный буфер 5× додецилсульфат-полиакриламид гель электрофорез (SDS-PAGE) в соотношении 1:4 (1 объем 5× буфера на 4 объема образца белка). После разбавления конечная рабочая концентрация буфера загрузки SDS-PAGE составляет 1×.
    1. Тщательно перемешайте и нагревайте на кипящей водяной бане в течение 10 минут для полного денатурирования белков. Дайте образцам остыть до комнатной температуры. Загрузите по 30 мкг каждого образца в гелевые лунки SDS-PAGE.
    2. Проводите электрофорез в два этапа: подайте 80 В в течение 30 минут для растворения белков через стекирующий гель, затем увеличьте до 120 В в течение 1 часа для разделения белков в разрешающем геле.
  3. Подготовьте предварительно нарезанную фильтровальную бумагу и мембраны из поливинилидендифторида (ПВДФ) в соответствии с размером геля. Замочите мембрану PVDF в метаноле на 3 минуты, чтобы активировать ее. Погрузите мембрану из ПВДФ и фильтровальную бумагу в буфер для переноса на 5 минут.
    1. Соберите передаточный сэндвич в следующем порядке (сверху вниз): анодная пластина, три слоя фильтровальной бумаги, мембрана из ПВДФ, гель, три слоя фильтровальной бумаги, катодная пластина. Обеспечьте правильное выравнивание слоев геля, мембраны и фильтровальной бумаги. Удаляйте все пузырьки воздуха на каждом шагу, чтобы обеспечить равномерный перенос.
  4. Сразу после переноса белка промойте мембрану PVDF в промывочном буфере Western в течение 5 минут, чтобы удалить остаточный буфер для переноса. Заблокируйте мембрану при комнатной температуре на 2 ч с легким встряхиванием в западном блокирующем буфере, содержащем 5% сухого обезжиренного молока, или используйте 5% BSA при обнаружении фосфорилированных белков.
  5. После блокировки инкубировать мембрану с первичным антителом (1:1000) при температуре 4 °C в течение ночи с легким встряхиванием. На следующий день инкубируйте мембрану со вторичным антителом (1:10 000) в течение 2 ч при комнатной температуре.
  6. Выполняйте хемилюминесцентное обнаружение в темном помещении, чтобы предотвратить световые помехи. Поместите белковую сторону мембраны PVDF в центр экспонированной пластины в автоматической системе визуализации.
    1. Смешайте равные объемы реагента ECL A и ECL реагента B в чистой центрифужной пробирке непосредственно перед использованием. Равномерно нанесите смешанный раствор ECL на поверхность мембраны, чтобы инициировать люминесцентную реакцию.
    2. После 1-2 мин инкубации при комнатной температуре аккуратно удалить лишнюю жидкость, не нарушая поверхность мембраны. Регулируйте параметры экспозиции на системе визуализации в соответствии с интенсивностью люминесценции для оптимизации захвата сигнала.

9. Статистический анализ

  1. Проанализируйте результаты вестерн-блоттинга с помощью программного обеспечения ImageJ для количественной оценки значений серого канала. Используйте GraphPad Prism для статистического анализа экспериментальных данных. Выразите все данные в виде среднего значения ± стандартного отклонения (x ± SD). Оцените статистические различия между группами с помощью непарного t-критерия.
    1. Введите данные из двух независимых групп выборок в таблицу данных программного обеспечения, где каждая группа соответствует отдельному столбцу, а выборки независимы друг от друга. Проверьте нормальность, выбрав «Тесты нормальности и симметрии» в функции «Анализ» и применив тест Шапиро-Уилка к обеим группам.
    2. Если P > 0,05 для обеих групп, учитывайте данные в нормальном распределении. Исходя из этого, выберите Непарный t-критерий в разделе t-критерий в функции Анализ, чтобы выполнить анализ. Определите статистическую значимость как P < 0,05.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Экспериментальные результаты проверки коэффициента успешности каждой группы моделей крыс показаны на рисунке 1. После моделирования на крысах была проведена оценка неврологических функций (рис. 1A). Модельная группа продемонстрировала тяжелый неврологический дефицит, и те, кто набрал от 1 до 3 баллов, были включены в последующие эксперименты. На рисунках 1B и C показаны результаты окрашивания TTC, где красный цвет представляет норма...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Для изучения молекулярных механизмов, лежащих в основе патогенеза инсульта, и выявления потенциальных диагностических и терапевтических мишеней были проведены анализы РНК-Seq и малых РНК-Seq (sRNA-Seq) на тканях головного мозга крыс после MCAO. Это исследование в первую очередь направлено на изучение сложных регуляторных сетей, включающих некодирующие РНК, микроРНК и мРНК. Был проведен всесторонний анализ наборов данных RNA-Seq и sRNA-Seq из индуцированных MCAO тканей мозга крыс с целью ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы констатируют, что конкурирующих интересов нет.

Благодарности

Эта рукопись была поддержана Проектом финансирования резерва академических лидеров провинции Аньхой (No.2022H287), Ключевым проектом исследований в области здравоохранения провинции Аньхой (Ссылка: AHWJ2022a013), Ключевым проектом естественнонаучных исследований Провинциального колледжа провинции Аньхой (NO.2023AH050745) и Проектом выдающихся талантов в области гигиены и здравоохранения провинции Аньхой (NO. ahsjhmypygc20230074).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
2% (мас./об.) раствор для окрашивания TTCПекин Кангл Клон Биотехнология Ко., Лтд. 20230805Окрашивание TTC
4% (мас./об.) раствор параформальдегидаБейотимП0099Неподвижная мозговая ткань
40 самцов крыс класса SPF SDХагчжоу Цзыюань Лаборатория Животноводство Ко., ЛтдSCXK [zhe] 2024-0004лабораторное животное
5% сухого обезжиренного молокаНаучный PhygeneРН1519ВБ
Система агарозного электрофорезаBeijing Liuyi Biotechnology Co., Ltd.ДСКФ-44ПВБ
Прибор автоматического экспонированияШанхайская компания «Пейцин Технолоджи Ко., Лтд.»ИС-М6ПВБ
Автоматический экспонометрШанхай Пейцин Технолоджи Ко., ЛтдИС-М6ПВБ
Автоматический льдогенераторГород Чаншу Сюэке Электрик Прибор Ко., ЛтдИСУ-20ВБ
КальмодулинСходство49В2443ВБ
CamKIIСходство14Г0796ВБ
центрифугаХаймэнь Цилинбейер Приборостроение Ко., Лтд.ЛК 300ВБ
Пакет clusterProfilerБиопроводникclusterProfiler_4.17Анализ обогащения
СХ36ЗЕНБИОN24AP24ВБ
СХ43ЗЕНБИОM08NO01ВБ
Сверхчувствительный набор для хемилюминесценции ECLБиошарпБЛ520БВБ
Электрическая термостатическая воздушная сушильная печьШанхайская компания Sanfa Scientific Instrument Co., LtdDHG-9070ВБ
Аппарат для электрофорезаШанхай Тяненг Технолоджи Ко., Лтд. (Танон)Пенополистирол 300ВБ
аппарат для электрофорезаШанхайский танон Наука и Технология Ко., Лтд.Пенополистирол 300ВБ
Бак для электрофорезаШанхайский танон Наука и Технология Ко., Лтд.ВЭ-180ВБ
ГАБРА6Сходство46В5371ВБ
Козий антимышиный IgGЗС-БИО142637ВБ
Козий антикроличий IgGЗС-БИО139931ВБ
ГРИА3Сходство0К33051ВБ
Высокоскоростная рефрижераторная центрифугаАньхой Цзявэнь Инструментальное оборудование Ко., ЛтдJW-3021HRВБ
Система HiSeq 2500Иллюмина/Высокопроизводительное секвенирование РНК
Программное обеспечение ImageJНациональные институты здравоохраненияИзображениеJ 1.54kОкрашивание TTC
Магнитная нагревательная мешалкаГород Чанчжоу и инструментальный заводЖЖ-79-1ВБ
МикропипеткаГермания Eppendorf/ВБ
Микроцентрифуга с нормальной температуройHaimen Qi Limber Instrument Manufacturing Co., LTD. LX300ЛХ300ВБ
NPY1RСходство2Д38248ВБ
пипеткаЭппендорф0,5-10 мклВБ
ПКЦСходство17Э3745ВБ
предварительно окрашенный белковый маркерБиошарпBL712CВБ
Мембрана из ПВДФМногородностьIPVH00010ВБ
Набор для удаления рРНК Ribo-ZeroIllumina, Сан-Диего, Калифорния, США/Экстракция РНК
Лизат RIPAБиошарпБЛ504АВБ
Пентобарбитал натрияПекин Think-Far Technology Co., Ltd.МЕРКанестезирующий
Инструмент для переносной мембраныШанхайский танон Наука и Технология Ко., Лтд.ВЕ-186ВБ
Трансмембранный аппаратШанхай Тяненг Технолоджи Ко., Лтд. (Танон)ВЕ-186ВБ
&бета;-актинЗС-БИО19АВ0505ВБ

Ссылки

  1. Marquez-Ortiz, R. A., et al. Neuroimmune support of neuronal regeneration and neuroplasticity following cerebral ischemia in juvenile mice. Brain Sci. 13 (9), 1337(2023).
  2. Han, M., Ma, B., She, R., Xing, Y., Li, X. Correlations between serum cxcl9/12 and the severity of acute ischemic stroke, a retrospective observational study. Neuropsychiatr Dis Treat. 19, 283-292 (2023).
  3. Wang, J., Shan, A., Shi, F., Zheng, Q. Molecular and clinical characterization of ang expression in gliomas and its association with tumor-related immune response. Front Med (Lausanne). 10, 1044402(2023).
  4. Ma, W., et al. Effects of ischemic postconditioning and long noncoding RNAs in ischemic stroke. Bioengineered. 13 (6), 14799-14814 (2022).
  5. Deng, Y., et al. High-throughput sequencing to investigate lncRNA-circRNA-miRNA-mRNA networks underlying the effects of beta-amyloid peptide and senescence on astrocytes. Front Genet. 13, 868856(2022).
  6. Li, R. B., Yang, X. H., Zhang, J. D., Cui, W. Gas6-as1, a long noncoding RNA, functions as a key candidate gene in atrial fibrillation-related stroke determined by ceRNA network analysis and WGCNA. BMC Med Genomics. 16 (1), 51(2023).
  7. Shu, J., Yang, L., Wei, W., Zhang, L. Identification of programmed cell death-related gene signature and associated regulatory axis in cerebral ischemia/reperfusion injury. Front Genet. 13, 934154(2022).
  8. Zou, J. B., et al. Reconstruction of the lncRNA-miRNA-mRNA network based on competitive endogenous RNA reveal functional lncRNAs in cerebral infarction. Sci Rep. 9 (1), 12176(2019).
  9. Zheng, H. Y., et al. Longitudinal transcriptome analyses show robust T cell immunity during recovery from COVID-19. Signal Transduct Target Ther. 5 (1), 294(2020).
  10. Lu, Z., Deng, M., Ma, G., Chen, L. Trim38 protects h9c2 cells from hypoxia/reoxygenation injury via the traf6/tak1/nf-κb signalling pathway. PeerJ. 10, e13815(2022).
  11. Zhang, C., et al. Long noncoding RNAs in intracerebral hemorrhage. Front Mol Neurosci. 16, 1119275(2023).
  12. Wei, R., Zhang, L., Hu, W., Wu, J., Zhang, W. Long noncoding RNA ak038897 aggravates cerebral ischemia/reperfusion injury via acting as a cerna for mir-26a-5p to target dapk1. Exp Neurol. 314, 100-110 (2019).
  13. Retraction: LncRNA snhg1 regulates cerebrovascular pathologies as a competing endogenous RNA through hif-1α/vegf signaling in ischemic stroke. J Cell Biochem. 126 (4), e70017(2025).
  14. Yu, Z., et al. Tnf-α stimulation enhances the neuroprotective effects of gingival MSCs-derived exosomes in retinal ischemia-reperfusion injury via the meg3/mir-21a-5p axis. Biomaterials. 284, 121484(2022).
  15. Li, Y., et al. Profiling immune cell-related gene features and immunoregulatory ceRNA in ischemic stroke. Mol Biomed. 5 (1), 72(2024).
  16. Fan, R., et al. Integrated analysis of circRNA-associated ceRNA network in ischemic stroke. Front Genet. 14, 1153518(2023).
  17. Cheng, L., Zhao, Y., Ke, H. Comprehensive analysis of lncRNA-miRNA-mRNA cerna network in ischemic stroke. Heliyon. 10 (9), e29651(2024).
  18. Li, S., et al. Construction of lncRNA-mediated ceRNA network for investigating immune pathogenesis of ischemic stroke. Mol Neurobiol. 58 (9), 4758-4769 (2021).
  19. Wang, X. Z., et al. Construction of circRNA-mediated immune-related ceRNA network and identification of circulating circRNAs as diagnostic biomarkers in acute ischemic stroke. J Inflamm Res. 15, 4087-4104 (2022).
  20. Movassaghi, S., et al. Effect of pentoxifylline on ischemia-induced brain damage and spatial memory impairment in rats. Iran J Basic Med Sci. 15 (5), 1083-1090 (2012).
  21. Saund, J., Dautan, D., Rostron, C., Urcelay, G. P., Gerdjikov, T. V. Thalamic inputs to dorsomedial striatum are involved in inhibitory control: Evidence from the five-choice serial reaction time task in rats. Psychopharmacology (Berl). 234 (16), 2399-2407 (2017).
  22. Fei, C., et al. Effects of tao hong si wu decoction on circular rna expression profiles in rats with middle cerebral artery occlusion. Chinese Pharmacological Bulletin. 40 (05), 954-963 (2024).
  23. Ma, R., et al. Correlation of thrombin and lc3II/I expression in different ischemic phases and different brain regions in the MCAO model rats. J Hunan Univ Chinese Med. 42 (06), 899-905 (2022).
  24. Li, S., et al. Regulation of nr4a1 by taohong siwu decoction inhibits endothelial cell apoptosis in cerebral ischemia-reperfusion injury. J Ethnopharmacol. 353 (Pt A), 120285(2025).
  25. Ji, Z. J., et al. Neuroprotective effect of taohong siwu decoction on cerebral ischemia/reperfusion injury via mitophagy-NLRP3 inflammasome pathway. Front Pharmacol. 13, 910217(2022).
  26. Duan, X., et al. RNA sequencing for gene expression profiles in a rat model of middle cerebral artery occlusion. Biomed Res Int. 2018, 2465481(2018).
  27. Duan, X., et al. Identification and functional analysis of microRNAs in rats following focal cerebral ischemia injury. Mol Med Rep. 19 (5), 4175-4184 (2019).
  28. Zerbino, D. R., et al. Ensembl 2018. Nucleic Acids Res. 46 (D1), D754-D761 (2018).
  29. Ji, X., et al. A comprehensive rat transcriptome built from large-scale RNA-seq-based annotation. Nucleic Acids Res. 48 (15), 8320-8331 (2020).
  30. Zheng, Y., et al. Npinter v5.0: NcRNA interaction database in a new era. Nucleic Acids Res. 51 (D1), D232-D239 (2023).
  31. Oliveira, L. A., et al. The widespread misuse of stringtie's gene identifier tags as de facto gene symbols does not allow consistent gene identification in published research. Gene. 954, 149440(2025).
  32. Pertea, M., et al. Stringtie enables improved reconstruction of a transcriptome from RNA-seq reads. Nat Biotechnol. 33 (3), 290-295 (2015).
  33. Zaghlool, A., et al. Characterization of the nuclear and cytosolic transcriptomes in human brain tissue reveals new insights into the subcellular distribution of RNA transcripts. Sci Rep. 11 (1), 4076(2021).
  34. Zhang, W., et al. Transcriptomic data of peach varieties with different chilling requirement levels. BMC Genom Data. 25 (1), 99(2024).
  35. Chamorro Petronacci, C. M., et al. Identification of prognosis-associated microRNAs in HNSCC subtypes based on the TCGA dataset. Medicina (Kaunas). 56 (10), 535(2020).
  36. Wang, X., et al. Exosomes activate hippocampal microglia in atrial fibrillation through long-distance heart-brain communication. BMC Cardiovasc Disord. 24 (1), 627(2024).
  37. Jiang, P., et al. Circrna-phf21a_0002 promotes pyroptosis to aggravate hepatic ischemia/ reperfusion injury by sponging let-7b-5p. Heliyon. 10 (16), e34385(2024).
  38. Faraldi, M., et al. Circulating biomarkers associated with walking performance in elderly subjects: Exploring miRNAs, metabolic and inflammatory biomarkers. Geroscience. 47 (3), 3977-3996 (2025).
  39. Jiang, H., et al. Reconstruction and analysis of the lncRNA-miRNA-mRNA network based on competitive endogenous RNA reveal functional lncRNAs in rheumatoid arthritis. Mol Biosyst. 13 (6), 1182-1192 (2017).
  40. Alipour, S., et al. Innovative targets of the lncRNA-miRNA-mRNA network in response to low-dose aspirin in breast cancer patients. Sci Rep. 12 (1), 12054(2022).
  41. Ono, K., et al. Cytoscape web: Bringing network biology to the browser. Nucleic Acids Res. 53 (W1), W203-W212 (2025).
  42. Shannon, P., et al. Cytoscape: A software environment for integrated models of biomolecular interaction networks. Genome Res. 13 (11), 2498-2504 (2003).
  43. Huckvale, E. D., Moseley, H. N. B. Predicting the pathway involvement of all pathway and associated compound entries defined in the Kyoto Encyclopedia of genes and genomes. Metabolites. 14 (11), (2024).
  44. Yu, G., Wang, L. G., Han, Y., He, Q. Y. Clusterprofiler: An R package for comparing biological themes among gene clusters. Omics. 16 (5), 284-287 (2012).
  45. Ueno, Y., et al. Axonal outgrowth and dendritic plasticity in the cortical peri-infarct area after experimental stroke. Stroke. 43 (8), 2221-2228 (2012).
  46. Arkelius, K., et al. Lox-1 and mmp-9 inhibition attenuates the detrimental effects of delayed rt-PA therapy and improves outcomes after acute ischemic stroke. Circ Res. 134 (8), 954-969 (2024).
  47. Hou, L., et al. Itgam is a critical gene in ischemic stroke. Aging (Albany, NY). 16 (8), 6852-6867 (2024).
  48. Miao, M., Lyu, M., Zhong, C., Liu, Y. Correlation between mmp9 promoter methylation and transient ischemic attack/mild ischemic stroke with early cognitive impairment. Clin Interv Aging. 18, 1221-1232 (2023).
  49. Li, W., et al. Clec7a knockdown alleviates ischemic stroke by inhibiting pyroptosis and microglia activation. J Integr Neurosci. 23 (12), 219(2024).
  50. Shi, Y., et al. C5ar1 mediates the progression of inflammatory responses in the brain of rats in the early stage after ischemia and reperfusion. ACS Chem Neurosci. 12 (21), 3994-4006 (2021).
  51. Yan, Y., Chen, L., Zhou, J., Xie, L. Snhg12 inhibits oxygen-glucose deprivation-induced neuronal apoptosis via the mir-181a-5p/negr1 axis. Mol Med Rep. 22 (5), 3886-3894 (2020).
  52. Wei, X. Y., et al. Long noncoding RNA RPL34-AS1 ameliorates oxygen-glucose deprivation-induced neuronal injury via modulating miR-223-3p/igf1r axis. Hum Cell. 35 (6), 1785-1796 (2022).
  53. Zhou, X., et al. Long noncoding RNA norad protects against cerebral ischemia/reperfusion injury-induced brain damage, cell apoptosis, oxidative stress, and inflammation by regulating miR-30a-5p/ywhag. Bioengineered. 12 (2), 9174-9188 (2021).
  54. Gao, H., et al. Long noncoding RNA Peg13 alleviates hypoxic-ischemic brain damage in neonatal mice via mir-20a-5p/xiap axis. Neurochem Res. 47 (3), 656-666 (2022).
  55. Fluri, F., Schuhmann, M. K., Kleinschnitz, C. Animal models of ischemic stroke and their application in clinical research. Drug Des Devel Ther. 9, 3445-3454 (2015).
  56. Zhao, W., et al. Comparison of RNA-seq by poly (a) capture, ribosomal RNA depletion, and DNA microarray for expression profiling. BMC Genomics. 15 (1), 419(2014).
  57. Wang, C., et al. The construction and analysis of lncRNA-miRNA-mRNA competing endogenous RNA network of Schwann cells in diabetic peripheral neuropathy. Front Bioeng Biotechnol. 8, 490(2020).
  58. Pillai-Kastoori, L., et al. Antibody validation for Western blot: By the user, for the user. J Biol Chem. 295 (4), 926-939 (2020).
  59. Liu, Q., et al. Mir-190a potentially ameliorates postoperative cognitive dysfunction by regulating tiam1. BMC Genomics. 20 (1), 670(2019).
  60. Vella, D., Zoppis, I., Mauri, G., Mauri, P., Di Silvestre, D. From protein-protein interactions to protein co-expression networks: A new perspective to evaluate large-scale proteomic data. EURASIP J Bioinform Syst Biol. 2017 (1), 6(2017).
  61. Panfil, K., Deavours, A., Kirkpatrick, K. Effects of the estrous cycle on impulsive choice and interval timing in female rats. Horm Behav. 149, 105315(2023).
  62. Ouyang, S., et al. Comprehensive bioinformatics analysis to reveal key RNA targets and hub competitive endogenous RNA network of keratoconus. Front Genet. 13, 896780(2022).
  63. Chen, X., et al. Cx3cl1/cx3cr1 axis attenuates early brain injury via promoting the delivery of exosomal microRNA-124 from neuron to microglia after subarachnoid hemorrhage. J Neuroinflammation. 17 (1), 209(2020).
  64. Karim, M. R., et al. Explainable AI for bioinformatics: Methods, tools and applications. Brief Bioinform. 24 (5), bbad236(2023).
  65. Shainer, I., et al. Transcriptomic neuron types vary topographically in function and morphology. Nature. 638 (8052), 1023-1033 (2025).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

lncRNAmiRNAceRNA

Похожие статьи