Методическая статья

Простой и быстрый метод одновременного выделения первичных островков и первичных ацинарных клеток поджелудочной железы у мышей

DOI:

10.3791/68960

⸱

9 января 2026 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Clinical Medical College, Yangzhou University, 2Department of Gastroenterology, Shanghai Institute of Pancreatic Diseases, Changhai Hospital, National Key Laboratory of Immunity and Inflammation, Naval Medical University, 3Department of Gastroenterology. Affiliated Yueqing Hospital, Wenzhou Medical University

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этом исследовании был разработан упрощённый метод эффективного извлечения функциональных первичных островков и ацинарных клеток из поджелудочной железы мышей, предоставляя ценный инструмент для изучения межклеточной коммуникации в патогенезе острого диабета, вызванного панкреатитом.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В исследованиях патогенеза постострого панкреатита сахарного диабета (PPDM-A) ключевым акцентом является аномальная двусторонняя коммуникация между ацинарными клетками поджелудочной железы (PACs) и островковыми клетками. Однако увековеченные клеточные линии не могут воспроизвести патофизиологические условия, поэтому извлечение высококачественных первичных клеток крайне важно. Современные методы извлечения первичных островков из мышей в основном основаны на перфузии поджелудочной железы in vivo через каннуляцию желчных протоков, что имеет высокий технический барьер и не способствует эксплуатации исследователями без опыта.

Это исследование модифицировало метод, устранив необходимость сложной перфузии in vivo . Мыши класса SPF C57BL/6J (6-8 недель) были анестезиированы и усыплены, после чего проводили изоляцию поджелудочной железы. Поджелудочная железа переваривалась in vitro с помощью коллагеназы P; Первичные островки были разделены с помощью центрифугации с градиентом плотности Фиколла, а ацинарные клетки получались с помощью фильтрации и центрифугирования клеткавого сита. Жизнеспособность и функция клеток оценивались с помощью окрашивания кальцеина/йодида пропидия (кальцеин/ПИ), анализа секреции инсулина, стимулируемого глюкозой, и обнаружения активности амилазы.

Результаты показали, что модифицированный метод прост в использовании: выход на мышь составлял (120 ± 5) первичных островков и 1,6–1,95 × 10⁷ ацинарных ячеек; Показатели жизнеспособности островков и ацинарных клеток составляли (97,52 ± 0,16%) % и (96,55 ± 0,95)% соответственно. Кроме того, островки проявляли нормальную способность секреции инсулина, а ацинарные клетки были чувствительны к стимуляции церулеином. Этот метод прост и надёжен, предоставляя реалистичную основу для изучения экзокрино-эндокринных взаимодействий поджелудочной железы и PPDM-A. Однако у него есть ограничения, например, невалидированное применение у крыс.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Острый панкреатит (АП) может нарушать эндокринную функцию поджелудочной железы через несколько путей, таких как повреждение паренхимы поджелудочной железы и воспалительные каскады, вызывая тем самым постострый панкреатит — сахарный диабет (PPDM-A)1,2. В настоящее время основной патогенез PPDM-A остаётся неясным, а аномальная двунаправленная коммуникация между эндокринной и экзокриновой отделами поджелудочной железы является ключевым направлениемисследований 3. Хотя существующие увековеченные β-клеточные линии (например, INS-1, MIN6) часто используются для моделей диабетических клеток in vitro, их опухолевой природа приводит к значительным отличиям от обычных первичных островочных клеток по отзывчивости глюкозы и клеточной гетерогенности. В результате они не могут полностью воспроизвести патофизиологическое состояние в микросреде острого панкреатита 4,5. Таким образом, получение высококачественных первичных островков и ацинарных клеток стало основой технической основы для разъяснения механизма их взаимодействия.

Современные методы выделения первичных островков от мышей в основном основаны на технологии каннулирования протоков, которая включает точную локализацию и каннуляцию желчного протока для введения раствора коллагеназы в паренхиму поджелудочной железы для перфузии in vivo 6,7. Однако для выделения первичных островков у новорождённых мышей Хуанг и др.8 добились отличных результатов с помощью экстракорпорального пищеварения без ин-виво перфузии поджелудочной железы. Основываясь на практическом опыте нашей исследовательской группы, оптимальное перфузию поджелудочной железы с помощью канюляции желчных протоков сложно выполнить быстро и эффективно без специализированной подготовки. Вдохновившись методом изоляции первичных островков от неонатальных мышей, наша команда модифицировала протокол экстракции, сделав его более простым и доступным для исследователей без опыта перфузии. Этот модифицированный подход также предлагает более простую альтернативу для выделения первичных островков от молодых мышей или тех, у кого чувствительные желчные протоки. Кроме того, этот метод обладает преимуществами как по эффективности изоляции (количестве), так и в чистоте (качестве) островков и ацинарных ячеек. Она позволяет исследователям проводить эксперименты в одном патологическом и физиологическом контексте, облегчая углубленный анализ механизма взаимодействия между островками и ацинарными клетками.

Метод требует строгого контроля времени пищеварения поджелудочной железы; Измельчение поджелудочной железы перед пищеварением также является важным этапом. Кроме того, следует уделять внимание интенсивности механической дисперсии тканей поджелудочной железы после пищеварения. Все эти факторы влияют на количество и качество изолированных островков и ацинарных клеток. Этот метод не был проверен на крысах и в настоящее время не может быть увеличен для производства.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Процедуры с участием животных одобрены Этическим комитетом или Этическим комитетом Центра лабораторных животных больницы Чанхай (Одобрение No CHEC (A.E)-2025-026). Мыши класса SPF C57BL/6J (6-8 недель, вес 18-25 г, самцы или самки, n = 3) содержались в 12-часовом цикле свет/темнота с свободным доступом к корму (поддерживающая диета) и воде.

Отходы, такие как шприцы и иглы, собираются в специализированные контейнеры лаборатории и утилизируются квалифицированными профессиональными организациями. В соответствии с Руководящими принципами этического поведения при уходе и использовании нечеловеческих животных в исследованиях, туши мышей должны помещаться в специализированный морозильник лаборатории и сжигаться профессиональными организациями.

1. Подготовка реагентов

ПРИМЕЧАНИЕ: Растворы, такие как среда с градиентом плотности стерильной плотности, будут собраны в лабораторном «Барабане для сбора химических отходов». Все химические отходы должны утилизироваться квалифицированными профессиональными организациями в соответствии с лабораторией.

  1. Подготовка раствора коллагеназы P
    1. В центрифугной трубке объемом 50 мл последовательно весят 25 мг коллагеназы P, 42 мг безводного хлорида кальция и 0,02 г ингибитора трипсина. Добавьте 45,5 мл сбалансированного солевого раствора Хэнка и 500 мкл раствора HEPES, затем используйте вихрь до полного растворения. Стерилизуйте раствор фильтром через фильтр диаметром 0,22 мкм и переведите фильтрованный раствор в новую стерильную центрифугную трубку объемом 50 мл. В результате получается раствор коллагеназы P с концентрацией 0,5 мг/мл, который используется для последующего переваривания тканей поджелудочной железы.
  2. Обработка раствора с градиентом плотности стерильной плотности
    1. Фильтруйте раствор градиента плотности стерильной плотности через фильтр диаметром 0,22 мкм для стерилизации, затем переведите его в новую стерильную центрифугную трубку объёмом 50 мл. Чётко маркируйте информацию о растворе и храните его при 4 °C для последующего использования. Далее он называется «Фиколл».
  3. Подготовка стоп-буфера и полного материала
    1. Добавьте 10% сыворотки плода (FBS) и 1% раствора пенициллина-стрептомицина в пустую среду DMEM и среду RPMI-1640 соответственно, чтобы получить полную среду DMEM и полную среду RPMI-1640 (также буфер стопа для пищеварения поджелудочной железы). Чётко маркируйте информацию о растворе и храните при 4 °C для последующего использования.
  4. Приготовление растворов глюкозы с разными концентрациями
    1. В центрифугной трубке объемом 50 мл добавьте 50 мл буфера Krebs-Ringer бикарбоната HEPES (KRBH) и 0,25 г бычьей сыворотки альбумина (BSA)-V, чтобы получить раствор KRBH, содержащий 0,5% BSA. Затем в 28,33 мл раствора KRBH, содержащего 0,5% BSA, добавьте 168 мкл глюкозы (1 м) и 1,5 мл раствора хлорида кальция (50 мМ), чтобы получить раствор глюкозы объемом 5,6 мм. В 9,28 мл раствора KRBH, содержащего 0,5% BSA, добавьте 220 мкл глюкозы (1 м) и 500 мкл раствора хлорида кальция (50 мМ) для получения раствора глюкозы объемом 22 мм.

2. Изоляция островков поджелудочной железы и ацинарных клеток поджелудочной железы (PACs)

ПРИМЕЧАНИЕ: Все хирургические инструменты должны пройти стерилизацию автоклавом.

  1. Добавьте сбалансированный сольный раствор Хэнка и раствор коллагеназы P в пластину на 12 лунок. И добавьте 3 мл раствора коллагеназы P в центрифуговую трубку на 50 мл для последующего переваривания.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Добавьте 2 мл сбалансированного соляного раствора Хэнка в три скважины и 2 мл раствора коллагеназы P в одну скважину.
  2. Перед операцией взвесьте и анестезируйте мышь с помощью внутрибрюшнической инъекции 1,25% триброметанола при дозе 0,025 мл/г, проверьте анестезию, защемнив подушечку стопы: глубина анестезии определяется постепенным снижением частоты дыхания и отсутствием реакции на защемление подушечки стопы. После подтверждения глубокой анестезии усыпьте мышей путем вывиха шейки матки. Погрузите мышей в 75% этанол на 5 минут для дезинфекции, затем переместите их в биобезопасный шкаф для изоляции поджелудочной железы.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Трибромеэтанол (1,25%) предоставляется в виде предварительно подготовленного раствора при покупке; Ручная подготовка не требуется. Исследователи должны носить перчатки и маски на протяжении всего эксперимента. Если во время инъекции триброметанола 1,25% происходит контакт кожи, немедленно протрите остаточный реагент безводным этанолом, прополосните проточной водой в течение 5 минут и нанесите увлажняющий крем для снятия сухости. В этом исследовании не участвуют коррозионные химикаты. Химические реагенты отходов, такие как триброметанол 1,25%, должны собираться в специальные герметичные контейнеры с маркировкой «Опасные химические отходы».
  3. Сделайте разрез в форме буквы «V», чтобы открыть брюшную полость мыши. Тёмно-красный лимфоидный орган в левой ипохондрической области — это селезёнка, а белый орган, прикреплённый к селезёнке, — поджелудочная железа. Аккуратно проведите тупую диссекцию поджелудочной железы вдоль нижнего края желудка и в панкреатикодуоденальном соединении.
  4. Промыйте изолированную ткань поджелудочной железы в сбалансированном солевом растворе Хэнка и удалите остаточные прикрепления брыжей, селезёнку и перипанкреатическую жировую ткань.
  5. Переместить предварительно обработанную поджелудочную железу в пластину с 12 лунками, содержащую 2 мл раствора коллагеназы P. Удерживайте поджелудочную железу пинцетом левой рукой, а правой рукой вводите раствор коллагеназы P в паренхиму поджелудочной железы до тех пор, пока ткань поджелудочной железы не станет прозрачной и отёчной.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Объём раствора коллагеназы P для перфузии составляет 600–800 мкл.
  6. Быстро разрежьте поджелудочную железу на части ткани 1-2 мм³ хирургическими ножницами.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Размер кусочков ткани примерно равен внутреннему диаметру стандартного наконечника пипетки объёмом 200 мкл.
  7. Отрежьте дистальный 1-1,5 см наконечника пипетки объёмом 1 мл (чтобы увеличить отверстие) и используйте этот модифицированный наконечник, чтобы переместить части ткани поджелудочной железы вместе с 2 мл раствора коллагеназы P в 50 мл центрифугной трубки, предварительно загруженную 3 мл раствора коллагеназы P.
  8. Инкубировать центрифугу в водяной бане при температуре 37 °C в течение 12 минут, аккуратно встряхивая трубку каждые 5-6 минут в этот период.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Цель встряхивания центрифугной трубки — обеспечить полный контакт между тканью поджелудочной железы и раствором коллагеназы P.
  9. Добавьте 10 мл полной среды RPMI-1640, чтобы прекратить пищеварительный эффект раствора коллагеназы P.
  10. Пипетить гранулу многократно пипеткой пипеткой Пастера объёмом 5 мл (15–20 движений вверх-вниз), пока не останется заметных крупных сгустков тканей.
  11. Добавьте 10 мл полной среды RPMI-1640, затем центрифугуйте при 180 × г в течение 2 минут при 4 °C и выбросьте супернатант.
  12. Подвесьте гранулу с помощью 20 мл полной среды RPMI-1640. Фильтруйте суспензию через решето на 40 сеток, затем центрифугите при 180 × г в течение 2 минут при 4 °C.
  13. Аккуратно сбросьте супернатант, добавьте 20 мл раствора Ficoll для повторного суспензирования гранулы и медленно добавьте 15 мл полной среды RPMI-1640.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В этот момент можно наблюдать прозрачный жидкий интерфейс.
  14. Аккуратно центрифугуйте при 640 × г в течение 20 минут при 25 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте сильных тряски во время центрифуга, чтобы предотвратить нарушение интерфейса.
  15. Аккуратно снимите центрифугную трубку и аспирируйте верхний красный средний слой пипеткой Пастера объемом 5 мл. Затем аккуратно аспирируйте жидкость с островками на границе жидкого слоя и переместите её в новую 50-мл-центрифугную трубку. Добавьте 20 мл полной среды RPMI-1640, центрифугуйте при 180 × г на 2 минуты при 4 °C и выбросьте супернатант.
  16. Суспензируйте гранулу с 20 мл полной среды RPMI-1640, центрифугу при 180 × г на 2 минуты при 4 °C и выбросьте супернатант.
  17. Восстановите суспензию гранулы с 10 мл полной среды RPMI-1640 и перенесите её в контейнер для клеточной культуры диаметром 60 мм.
  18. Под инвертированным биологическим микроскопом (увеличение в 100 раз) вручную выбирайте островки с помощью пипетки объемом 20 мкл. Перенесите выбранные островки на 24-ядровую клеточную культивационную пластину, предварительно загруженную 500 мкл полной среды RPMI-1640 на каждую яму.
  19. Сбросьте слой раствора Ficoll, суспензируйте гранулу (с шага 2.15) с помощью 10 мл полной среды DMEM, профильтруйте через сито 100 мкм ячейки, центрифугу при 180 × г в течение 2 минут при 4 °C и сбросьте супернатант.
  20. Суспензируйте гранулу с помощью 10 мл полной среды DMEM, центрифугите при 180 × г на 2 минуты при 4 °C и сбросьте супернатант. Затем взвешивают гранулу 5 мл полной среды DMEM для последующих экспериментов.

3. Диагностика жизнеспособности островков поджелудочной железы и ацинарных клеток

  1. Переместить изолированные островки и соответствующее количество ацинарных клеток на 12-ямочные/24-луночные культивные пластины, содержащие 1 мл полной среды RPMI-1640 и 1 мл полной среды DMEM соответственно. Поставьте пластины в инкубатор с температурой 37 °C, 5% CO₂, на 15 минут для уравновесия.
  2. Центрифугуйте плиты клеточной культуры с 12 и 24 лунками при 180 × г в течение 30 секунд при 25 °C. Тем временем подготовьте реагент для окрашивания в соответствии с инструкциями Набора для анализа жизнеспособности и цитотоксичности клеток кальцеина/пропидия йодида (кальцеин/PI) (защита от света во время подготовки).
  3. Аккуратно сбросьте среду, промыйте островки и ацинарные клетки один раз солевым раствором с фосфатным буфером (PBS), затем центрифугуйте при тех же условиях, что и шаг 3.2.
  4. Отбросьте PBS и подвесьте островки и ацинарные клетки с помощью подготовленного окрашивающего реагента. Оберните посевную пластину алюминиевой фольгой (для защиты от света) и инкубуйте в инкубаторе с концентрацией CO₂ при температуре 37 °C, 5% CO₂ в течение 30 минут.
  5. В защищённой светом среде делайте снимки с помощью флуоресцентного микроскопа (увеличение в 100 раз) и проводите анализ жизнеспособности клетки с помощью ImageJ.

4. Ацинарамилазный анализ

  1. Засейте ацинарные клетки в пластину на 12 лунок плотностью 1,5 × 106 клеток на колодцу с 1 мл среды. Настройте управляющие (Ctrl) и клетки, стимулированные церулеином (10 нМ, 20 нМ, 50 нМ; маркируются как C10, C20, C50). После 30 минут стимуляции соберите супернатанты для обнаружения активности амилазы согласно инструкции производителя.

5. Глюкозостимулируемый анализ высвобождения инсулина

  1. Посейте по 10 островков на колодец в пластине на 24 колодца. Стабилизируйте островки в полном среде RPMI-1640 на 2 часа, затем отбросьте среду.
  2. Инкубировать островки в 1 мл раствора глюкозы объёмом 5,6 мМ в течение 1 часа. После этого заберите супернатант.
  3. Помой островки буфером KRBH. Затем инкубировать островки в растворе глюкозы объёмом 22 мМ в течение 1 часа и снова собирать супернатант.
  4. Определите концентрации инсулина в двух супернатантах (при условиях с низким уровнем глюкозы и высокого уровня глюкозы) с помощью набора ELISA для мыши INS (инсулин). Рассчитайте индекс инсулина, стимулируемого глюкозой (GSI):
    GSI = концентрация инсулина в среде с высоким содержанием глюкозы / концентрация инсулина в среде с низким содержанием глюкозы

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

После центрифугирования по градиенту плотности раствора Фиколла были обнаружены островки возле границы между прозрачным бесцветным слоем жидкости и средой, при этом PACs присутствовали в виде осадка на дне трубки (см. рисунок 1).

Под оптическим микроскопом островки обычно были круглыми или овальными и золотисто-коричневого цвета, со стабильным выходом (120 ± 5) островков на мышь (рисунок 2A,B). Свежеизолированные PAC были сферическими и в основном распределены кластерами (3–8 ацинарных клеток в кластере). Апикальные концы ацинарных клеток были темнее по цвету, с чётко видимыми гранулами зимогена; Вокруг клеток не было обнаружено гранул или везикулярных структур, а фон раствора был очевиден. Выход ацинарных ячеек варьировался от 1,6 до 1,95 × 10⁷ ячеек на мышь [(1,77 × 107) ± (1,75 × 106)] (рисунок 2C,D).

Результаты окрашивания островков и ацинарных клеток кальцеином/ПИ показаны на рисунке 3A: Клетки, окрашенные кальцеином (зелёные), составляли большинство, тогда как клетки с PI (красные) были редкими. Количественный анализ изображений живых/мёртвых окрашиваний был проведён с помощью ImageJ. Результаты показали, что показатели жизнеспособности изолированных островков и ацинарных клеток составляли (97,52 ± 0,16%) % и (96,55 ± 0,95%) % соответственно (рисунок 3B).

Базальная амилазная активность выделенных ацинарных клеток поджелудочной железы составляла (0,79 ± 0,01) U/mL. После стимуляции целулеином при концентрациях 10 нМ, 20 нМ и 50 нМ активность ацинарных клеток на амилазу составила (1,45 ± 0,03) Ед/мл (1,65 ± 0,05) Ед/мл и (1,39 ± 0,02) Ед/мл соответственно. Односторонние результаты ANOVA показали, что по сравнению с контрольной (Ctrl) группой все группы, стимулированные церулеином, демонстрировали значительные различия в активности амилазы (все P < 0,001). Кроме того, была отмечена значительная разница в активности амилазы между группами церулеина 20 нМ и 10 нМ (P < 0,001) (рисунок 4A).

При стимуляции раствором глюкозы 5,6 мМ секреция инсулина изолированных островков составляла (0,27 ± 0,04) нг/мл/островок/ч. При стимуляции раствором глюкозы 22 мМ секреция инсулина изолированных островков составляла (0,94 ± 0,04) нг/мл/островка/ч, при ГСИ 3,44. Результаты показывают, что изолированные островки демонстрируют типичный и эффективный ответ на секрецию инсулина при стимуляции растворами глюкозы различных концентраций (рисунок 4B).

Члены нашей исследовательской группы отметили, что количество и качество изолированных островков и ацинарных клеток тесно связаны со временем пищеварения, которое требует строгого контроля во время работы и меньше зависит от разных операторов. В то же время колебания выхода и жизнеспособности тесно связаны с полным рассечением поджелудочной железы и механическим отделением ткани поджелудочной железы, что требует внимания во время операции.

figure-results-1
Рисунок 1: Результаты центрифугации градиента плотности раствора Фиколла. Слой островка расположен на границе между бесцветным прозрачным жидким слоем и культурной средой. Осадок на дне центрифугной трубки — это PAC. Сокращение: PACs: ацинарные клетки поджелудочной железы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

figure-results-2
Рисунок 2: Морфологические и количественные характеристики островков и PAC. (A) Морфология островков, выделенных из ткани поджелудочной железы мышей. Шкала = 100 мкм. (B) Количественный анализ количества островков, выделенных из ткани поджелудочной железы мышей (n = 3). (C) Морфология PACs, выделенных из ткани поджелудочной железы мышей. Шкала = 100 мкм. (D) Количественный анализ количества PAC, выделенных из ткани поджелудочной железы мышей (n = 3). Все данные экспрессировались в среднем ± SD. Сокращение: PACs: ацинарные клетки поджелудочной железы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

figure-results-3
Рисунок 3: Оценка жизнеспособности островков и PAC. (A) Кальцеин/йодид-флуоресцентное окрашивание для оценки жизнеспособности мышиных островков и PAC. Зелёный: живые клетки. Красные: мёртвые клетки. Шкала = 100 мкм. (B) Количественный анализ жизнеспособности островков и PAC (n = 3). Все данные экспрессировались в среднем ± SD. Сокращения: PACs: ацинарные клетки поджелудочной железы; PI = йодид пропидия. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

figure-results-4
Рисунок 4: Оценка активности амилазы у ПАК и способности островков к секреции инсулина. (A) Активность амилазы ПАК под стимуляцией с разными концентрациями церулеина (Ctrl: контрольная группа; C10, C20 и C50: концентрации церулеина составляли 10 нМ, 20 нМ и 50 нМ (n = 3). (B) Количественный анализ концентраций секреции инсулина, вызванных глюкозой (n = 3). Все данные были выражены как средние ± SD. ***P < 0,001. Сокращения: GSI = индекс инсулина, стимулируемый глюкозой; PACs: ацинарные клетки поджелудочной железы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В последние годы постпанкреатитный сахарный диабет (PPDM) получил широкое внимание 1,9,10. Исследование молекулярных механизмов, с помощью которых ПАК влияют на секрецию гормонов островков в контексте АП, имеет большое значение.

Патогенез АП в основном связан с чрезмерной активацией ферментов поджелудочной железы в ацинарных клетках, что приводит к аутодигражанию тканиподжелудочной железы 11,12. Хотя в настоящее время доступны клеточные линии, такие как AR42J, 266-6 (ацинарные клеточные линии) и MIN6, INS-1 (β-клеточные линии), эти модели in vitro не могут полностью воспроизвести физиологическую сложность первичных ацинарных клеток иостровков 4,5. Поэтому выделение первичных ацинарных клеток и островков крайне важно для глубоких исследований взаимодействия между экзокриновым и эндокринным отделениями поджелудочной железы. В настоящее время методы изоляции островков хорошо зарекомендованы; Однако большинство из них не удовлетворяют исследовательские потребности для изучения взаимодействия между островками и ацинарными клеткамиподжелудочной железы 6,7,8.

Этот экспериментальный протокол оптимизирует процедуру перфузии поджелудочной железы, снижая технический барьер и тем самым позволяя исследователям без специальной подготовки в области каннуляции желчных протоков проводить эксперименты. В то же время он обеспечивает количество и качество изолированных островков и ацинарных клеток, обеспечивая простой и быстрый метод одновременного выделения первичных мышиных островков и первичных ацинарных клеток поджелудочной железы.

Хотя этот метод упрощает процесс изоляции островков, ключевые шаги всё равно требуют строгого контроля для обеспечения высокой урожайности и эффективного разделения островков и ацинарных клеток поджелудочной железы. К этим этапам относятся адекватная перфузия поджелудочной железы, правильное нарушение тканей (обеспечение тщательного измельчения), пищеварение поджелудочной железы (точный контроль времени пищеварения и ручного встряхивания во время пищеварения) и механическое пипетирование (контроль количества и интенсивности пипетных ударов). Перед выбором островков ресуспензированные островки должны быть стабилизированы в клеточном инкубаторе примерно на 10 минут для более эффективного отбора островков.

Важно отметить, что при перфузии поджелудочной железы лучшие результаты достигаются при введении более прозрачных везикул жидкости; Вся ткань поджелудочной железы должна быть полностью перфузионирована, но время перфузии должно контролироваться в течение 1-2 минут. Если обнаружена низкая жизнеспособность клеток, корректируйте время контакта между тканью поджелудочной железы и коллагеназой P (включая время перфузии и время пварения в водяной бане). Кроме того, обращайте внимание на механические повреждения во время изоляции — например, избегайте чрезмерного давления при рассеивании тканей поджелудочной железы. Асептическая техника должна сохраняться на протяжении всей изоляции островков и ацинарных клеток, чтобы предотвратить загрязнение. Подготовленные реагенты следует фильтровать через фильтр 0,22 мкм. Процесс изоляции должен проводиться в шкафу для биобезопасности, а все инструменты и расходники, используемые во время изоляции, должны быть стерильными. Два подготовленных полного материала также содержат 1% раствора пенициллина-стрептомицина.

Для анестезии у мышей: фиксируйте кожу на шее левой и указательной пальцев, поддерживайте живот безымянными и мизинцами (поддерживая голову вниз, живот вверх, чтобы открыть брюшную полость). Держите шприц правой рукой, вводите его под углом 30° в кожу нижней левой части живота мыши (1 см от паха и 0,5 см от середины), медленно вводите анестетик и прижимайте место инъекции стерильной ватной палочкой в течение 10 секунд после снятия иглы, чтобы предотвратить утечку. Эвтаназия делает мышь при вывихе шейки только после полной анестезии.

Если вас уколют загрязнённой иглой (подвергнут контакту с кровью или тканями мыши) или укус мыши, немедленно сжать область вокруг раны у ближайшей раковины (сжать от проксимального до дистального конца раны, чтобы вывести небольшое количество крови), промывайте рану проточной водой в течение 15 минут, затем дезинфицируйте её 75% этанолом или 0,5% повидон-йодом.

Результаты тестов активности ацинарных клеток амилазы показали, что изолированные клетки ацинарной железы имели низкий уровень базальной активации и были чувствительны к стимуляции церулеином: активность амилазы постепенно увеличивалась с повышением концентрации церулеина, достигала наивысшего уровня при 20 нМ церулеина и немного снижалась при концентрации церулеина 50 нм. Результаты анализа секреции инсулина, стимулируемого глюкозой, показали, что изолированные островки демонстрировали типичный и эффективный ответ на секрецию инсулина при стимуляции растворами глюкозы разных концентраций. Эти результаты свидетельствуют о том, что ацинарные клетки и островки, извлеченные по этому протоколу, подходят для последующих экспериментов in vitro .

Процедура изоляции островков и ацинарных клеток в этом экспериментальном протоколе очень проста. Экспериментальные результаты показывают, что островки и ацинарные клетки, выделенные по этому протоколу, демонстрируют отличное количество и жизнеспособность. Кроме того, несколько членов нашей команды проверяли этот протокол с помощью нескольких мышей; Результаты валидации показывают хорошую воспроизводимость, надёжные данные и минимальные колебания в выходе клеток. Однако у этого протокола есть и определённые ограничения. Хотя она минимально зависит от технических навыков оператора, для полного вскрытия поджелудочной железы требуется базовое знание анатомии мыши — это обязательное условие для всего процесса изоляции. При одновременной изоляции тканей поджелудочной железы от нескольких мышей необходимо соответственно скорректировать количество раствора коллагеназы P и других реагентов. Кроме того, одновременная изоляция более двух мышей не рекомендуется: разница во времени между обработкой тканей поджелудочной железы разных мышей во время вскрытия, перфузии и измельчения влияет на время контакта между тканями поджелудочной железы и коллагеназой P, тем самым снижая эффективность и жизнеспособность выделения клеток. Таким образом, его масштабное применение может быть ограничено. Кроме того, этот протокол не был подтверждён у крыс. Если изолировать островки и ацинарные клетки у крыс, дозировка некоторых реагентов и время пищеварения могут потребовать дополнительной корректировки.

В заключение, этот экспериментальный протокол предлагает простой и быстрый метод одновременного выделения первичных мышиных островков и первичных ацинарных клеток поджелудочной железы. Для неопытных исследователей лучше проводить изоляцию островков и ацинарных клеток, а также предоставлять практическую экспериментальную основу для экстракорпоральных исследований экзокрино-эндокринных взаимодействий поджелудочной железы.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

У авторов нет конфликтов интересов, которые нужно раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

X.T., H.C. и J.L. также внесли вклад в эту работу. Работа была поддержана Национальным фондом естественных наук Китая (гранты No 82370658, 82170657, 82370655 и 82400760) и Фондом естественных наук провинции Чжэцзян (грант No LGF22H030014). Авторы благодарят bioRender (www.biorender.com) за помощь в создании изображений.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
0,22 и мю; m-фильтрMillexSLGPR33RBФильтруйте подготовленный раствор коллагеназы P
0,25 м хлорида кальция (стерильный)BeyotimeST365Кальций-зависимый сигнальный путь для активации секреции инсулина
1 мл шприцЦзьеруй10084692516405Используется для перфузии коллагеназы P в ткани поджелудочной железы.
1,25% раствор трибромеэтанолаBeijing Yosida Biotechnology Co., Ltd.JT0781Анестезия
Центрифуга на 1,5 млЭппендорф30121589Соберите супернатант клетки для центрифугирования и хранения.
1x Хэнк' s-балансный сольный растворBiosharpBL561AПриготовьте раствор коллагеназы P и прополосните ткань поджелудочной железы
12-ячественная клеточная культивная пластинаСАРШТЕДТ83.3921Задержите ткань поджелудочной железы и извлеченный ацинар из культуры
Центрифуга на 15 млBeijing Labgic Technology Co., Ltd.CT-002-15AУдержание растворов во время эксперимента
24-ячественная клеточная культивная пластинаСАРШТЕДТ83.3922Выращивание извлекаемых островков
40-mesh  РешетоWeidan InstrumentsН/ДФильтрация ткани поджелудочной железы
5 мл пипетки ПастераBiosharpBS-XG-03LПипетирование жидкостей и физическое нарушение тканей поджелудочной железы
Центрифугная трубка объемом 50 млBeijing Labgic Technology Co., Ltd.CT-002-50AУдержание растворов во время эксперимента, содержание тканей и центрифугирование
60-мм антенны для культивирования клетокBeijing Labgic Technology Co., Ltd.12211Контейнер для хранения островков с культурной средой для удобного сбора
75% раствор этанолаHYNAUTН/ДЗамочите мышей для дезинфекции.
Adobe Photoshop 2023Adobe Inc.Н/ДГенерируйте изображения.
Центрифуга Beckman Allegra X-12/X-12RБЕКМАНAllegra X-12/X-12RЦентрифуга
Бычий сывороточный альбумин (BSA)-VSolarbioA8020Поддерживайте нормальную физиологическую функцию островков и используйте (это/это) для приготовления растворов глюкозы разных концентраций.
Мыши C57BL/6J, класса SPF, 6– 8 недель, вес 18 и недели; 25 гЦентр лабораторных животных Военно-морского медицинского университета 
Набор для анализа жизнеспособности и цитотоксичности клеток кальцеина/ПИBeyotimeC2015LОпределить жизнеспособность клеток и цитотоксичность животных клеток на основе двойного флуоресцентного окрашивания жизнеспособных и мёртвых клеток кальцеином-AM (Calcein AM) и йодида пропидия (PI) одновременно.
Хлорид кальция (безводный)Sangon Biotech10043-52-4Приготовьте раствор коллагеназы P
Клеточное сито (100 & mu; m)BiosharpBS-100-XBSФильтрация ацинарных клеток
КоллагеназаSigma11213857001Переварить ткань поджелудочной железы
D-(+)-раствор глюкозы (20%, стерильный)BeyotimeST491Стимулируйте секрецию инсулина с островков.
DMEM basic (1x) (Dulbecco' модифицированный орел среднего калибра)GibcoC11995500BTКультурные ацинарные клетки
Сыворотка плода крупного рогатого скота (FBS)BiowestS140B-500Подготовьте культурный материал
Ficoll-Paque PREMIUM стерильное решениеЦитива17544203Среда градиента плотности для стратификации градиента плотности
GraphPad Prism 8.0.1GraphPad Software, LLCН/ДСоздавайте изображения и проводите статистический анализ.
Раствор HEPES (1 М)BiosharpBL1061AПриготовьте раствор коллагеназы P
Высокоскоростная/рефрижераторная центрифугаSigma3K15Центрифуга
ImageJЛаборатория оптических и вычислительных приборов Национального института здоровья (LOCI)Н/ДАнализируйте изображения флуоресценции клеток и рассчитывайте жизнеспособность клетки.
Инвертированный биологический микроскопLeicaН/ДНаблюдайте морфологию клеток и выбирайте островки.
Инвертированный флуоресцентный микроскопОЛИМПIX73Наблюдайте клеточные флуоресцентные сигналы и делайте флуоресцентные изображения.
Бикарбонатный буфер Кребса-Рингера HEPESLEAGENECZ0103Поддерживайте нормальную физиологическую функцию островков и используйте (это/это) для приготовления растворов глюкозы разных концентраций.
Набор для мыши INS (инсулин) ELISAWuhan Fine Biotech Co., Ltd.EM0260Определите уровень секреции инсулина на островках.
Офтальмологические щипцы (10 см, изогнутые с крючком)Медицинские устройства ЦинъиН/ДПомощь в вскрытии
Офтальмологические щипцы (10 см, прямые с зубом)Медицинские устройства ЦинъиН/ДПомогать в рассечении и внезапном отделении поджелудочной железы и удалении её
Раствор пенициллина стрептомицинаGibco15140-122Подготовьте культурную среду для предотвращения загрязнения
RPMI-1640 средний,KeyGEN BioTECHKGL1501-500Прекратите пищеварительные растворы коллагеназы P и культивируйте островки
Ингибитор трипсина из Glycine max (соя)SigmaT6522Приготовьте раствор коллагеназы P
Ургические ножницы (10 см, прямозастроенные)Медицинские устройства ЦинъиН/ДПомощь в анатомии и разрезании ткани поджелудочной железы на мелкие куски
Водяная баняOAICLABOW-HFПоддерживайте температуру пищеварения.
Набор для анализа активности α-амилазы и β-амилазыElabscienceE-BC-K006-MВыявить уровни амилазы, выделяемые ацинарными клетками при различных условиях

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Manrai, M., et al. Diabetes mellitus as a consequence of acute severe pancreatitis: unraveling the mystery. World J Diabetes. 14 (8), 1212-1225 (2023).
  2. García-Compeán, D., et al. Post-acute pancreatitis diabetes: a complication waiting for more recognition and understanding. World J Gastroenterol. 29 (28), 4405-4415 (2023).
  3. Shen, H. N., Yang, C. C., Chang, Y. H., Lu, C. L., Li, C. Y. Risk of diabetes mellitus after first-attack acute pancreatitis: a national population-based study. Am J Gastroenterol. 110 (12), 1698-1706 (2015).
  4. Hohmeier, H. E., et al. Isolation of INS-1-derived cell lines with robust ATP-sensitive K⁺ channel-dependent and -independent glucose-stimulated insulin secretion. Diabetes. 49 (3), 424-430 (2000).
  5. Hohmeier, H. E., Newgard, C. B. Cell lines derived from pancreatic islets. Mol Cell Endocrinol. 228 (1-2), 121-128 (2004).
  6. Neuman, J. C., Truchan, N. A., Joseph, J. W., Kimple, M. E. A method for mouse pancreatic islet isolation and intracellular cAMP determination. J Vis Exp. (88), e50374(2014).
  7. Villarreal, D., et al. A simple high-efficiency protocol for pancreatic islet isolation from mice. J Vis Exp. (150), e57048(2019).
  8. Huang, C., Gu, G. Effective isolation of functional islets from neonatal mouse pancreas. J Vis Exp. (119), e55160(2017).
  9. Petrov, M. S., Yadav, D. Global epidemiology and holistic prevention of pancreatitis. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 16 (3), 175-184 (2019).
  10. Xiao, A. Y., et al. Global incidence and mortality of pancreatic diseases: a systematic review, meta-analysis, and meta-regression of population-based cohort studies. Lancet Gastroenterol Hepatol. 1 (1), 45-55 (2016).
  11. Sendler, M., Weiss, F. U., Golchert, J., et al. Cathepsin B-mediated activation of trypsinogen in endocytosing macrophages increases severity of pancreatitis in mice. Gastroenterology. 154 (3), 704-718.e10 (2018).
  12. Modenbach, J. M., Möller, C., Asgarbeik, S., et al. Biochemical analyses of cystatin-C dimers and cathepsin-B reveals a trypsin-driven feedback mechanism in acute pancreatitis. Nat Commun. 16 (1), 1702(2025).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

FicollP

Похожие статьи