Этот протокол описывает автоматизированный, аккредитованный ISO15189 рабочий процесс секвенирования нового поколения для обнаружения целевых геномных изменений в тканях, не связанных с формалином и залитым парафином при немелкоклеточном раке легкого (НМРЛ).
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Обнаружение таргетируемых изменений при немелкоклеточном раке легкого с помощью секвенирования нового поколения
* These authors contributed equally
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Успех таргетной терапии при немелкоклеточном раке легкого (НМРЛ) зависит от точной идентификации драйверных изменений, включая мутации, слияние генов и амплификацию. Секвенирование нового поколения (NGS) стало комплексным инструментом молекулярной диагностики, способным обнаруживать как известные, так и новые геномные аберрации, обеспечивая критически важную поддержку для персонализированного лечения НМРЛ. Тем не менее, NGS остается сложным и технически сложным методом. Несмотря на широкое распространение, NGS по-прежнему сталкивается с некоторыми проблемами, включая техническую сложность и длительное время выполнения. Здесь внедряется ISO15189-сертифицированный рабочий процесс NGS, реализованный в клинической лаборатории. Стандартизированный протокол включал в себя оценку клеточности опухоли (≥20 %), экстракцию ДНК из фиксированных формалином тканей парафином (FFPE) (вход ДНК ≥ 50 нг), автоматизированную подготовку библиотеки и биоинформатический анализ. Благодаря интеграции строгих мер контроля качества (QC) на каждом этапе рабочий процесс обеспечивает высокую надежность данных. Кроме того, ключевым нововведением в документообороте стала автоматизация построения библиотек NGS. Автоматизированная система построения библиотеки NGS включала в себя конечный ремонт, А-образное хвостохранилище, лигирование адаптера, гибридизационный захват и очистку, что позволило свести к минимуму человеческие ошибки, повысить воспроизводимость экспериментов, сократить время работы и, таким образом, повысить эффективность. В совокупности опыт показывает, что строгий контроль качества и автоматизированная подготовка библиотеки имеют важное значение для поддержания точности и масштабируемости при клиническом тестировании NGS. Этот оптимизированный подход не только обеспечивает соответствие стандартам ISO15189, но и поддерживает растущий спрос на прецизионную онкологию в лечении НМРЛ.
Введение
Немелкоклеточный рак легкого (НМРЛ) составляет 75–85% всех случаев рака легких, представляя собой как клинический приоритет, так и терапевтическую проблему 1,2,3. В последние годы, с успешной разработкой и клиническим применением молекулярно-таргетных препаратов, таких как ингибиторы тирозинкиназы эпидермального фактора роста (EGFR-TKIs), лечение прогрессирующего НМРЛ вступило в эру персонализированной прецизионной терапии 4,5,6. Таргетная т....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Протокол получил разрешение IRB на анонимизированные архивные образцы.
1. Этапы предварительного тестирования и контроля качества
- Зарегистрируйте информацию об образце в системе управления лабораторной информацией (таблица 1). Заполните форму информированного согласия на тестирование на мутацию гена.
- Получите образец FFPE НМРЛ. Убедитесь, что образец, используемый для тестирования, является образцом парафиновой ткани, который хранился не более 2 лет. Убедитесь, что образцы обрабатываются и хранятся в соответствии со стандартными патологическими методам....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Используя автоматизированный рабочий процесс анализа NGS со строгим контролем качества, лаборатория провела комплексное геномное профилирование образцов NSCLC. Оптимизированный рабочий процесс обнаружения (Рисунок 2) позволил надежно идентифицировать несколько клинически значимых геномных изменений в репрезентативных образцах опухолей (Рисунок 3).
Результаты секвенирования продемонстрировали высокочас.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Каждый квалифицированный отчет NGS лежит в основе строгого процесса, который остается сложным и трудоемким28. Для решения этих проблем в лаборатории была разработана полностью автоматизированная система NGS. Эта операция значительно сокращает ручное вмешательство, сводит к минимуму экспериментальные ошибки и значительно сокращает время выполнения работ. Таким образом, эта система обеспечила более надежную и эффективную стратегию для NGS, создав новую идею о качест.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
У авторов нет конфликта интересов, который можно было бы раскрыть.
Благодарности
Это исследование было поддержано грантами Пекинского фонда естественных наук Китайской Народной Республики (7252122), Пекинского исследовательского фонда клинической онкологии Китайской Народной Республики Xisike (Y-HS202402-0021), Исследовательского фонда обучения в ординатуре Онкологической больницы, Китайской академии медицинских наук и Пекинского объединенного медицинского колледжа (E2025004), а также Национального финансирования клинических исследований больницы высокого уровня (2025-LYZX-R-B03).
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Agilent Набор ДНК высокой чувствительности | Agilent | 5067-4626 | Для использования с the Биоанализаторная система Agilent 2100 |
| Набор реагентов Agilent DNA 1000 | Agilent | 5067-1504 | Для использования с the Биоанализаторная система Agilent 2100 |
| Биоанализатор Agilent 2100 | Agilent | G2939A | Оценить размер фрагмента библиотеки и наличие адаптеров. |
| Concert Полностью автоматический инструмент для очистки нуклеиновых кислот | КОНЦЕРТ | MC1002 | Используется для экстракции ДНК |
| Эквалбит 1 и раз; Набор для анализа dsDNA HS | Вазиме | EQ121-02-AA | Для использования с the Флюорметр Кубит 3.0 |
| Комбинированный набор для обнаружения мета гена EGRR/KRAS/BRAF/ALK | Горящая скала | BR-LC00102 | Строительство библиотеки |
| Magnis BR | Agilent Technologies | G7595AA | Автоматизированная подготовка библиотек NGS |
| Фокусированный ультразвуковой аппарат ME220 | Коварис | 500396 | ультразвуковая обработка |
| NanoDrop One/OneC | Термо Фишер | ND-ONE-W | Полноволновое УФ-спектрофотометрическое обнаружение |
| NextSeq 550Dx | Illumina | 20005715 | последовательность |
| NSQ 500/550 Hi Output KT v2.5 (300CYS) | Illumina | 20024908 | Для использования с NextSeq 550Dx |
| Реагент для экстракции нуклеиновых кислот | КОНЦЕРТ | RC1102 | Используется для экстракции ДНК |
| Флюорметр Кубит 3.0 | Жизнь | Q33216 | Используется для определения концентрации нуклеиновых кислот или библиотек |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Жизнь | Q32851 | Для использования с the Флюорметр Кубит 3.0 |
Ссылки
- Feng, R. M., Zong, Y. N., Cao, S. M., Xu, R. H. Current cancer situation in China: Good or bad news from the 2018 global cancer statistics. Cancer Commun (Lond). 39 (1), 22(2019).
- Siegel, R. L., Kratzer, T. B., Giaquinto, A. N., Sung, H., Jemal, A. Cancer statistics, 2025. CA....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
