Методическая статья

Обнаружение таргетируемых изменений при немелкоклеточном раке легкого с помощью секвенирования нового поколения

DOI:

10.3791/69091

⸱

10 октября 2025 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pathology, State Key Laboratory of Molecular Oncology, National Cancer Center/National Clinical Research Center for Cancer/Cancer Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, 2Department of Education, National Cancer Center/National Clinical Research Center for Cancer/Cancer Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол описывает автоматизированный, аккредитованный ISO15189 рабочий процесс секвенирования нового поколения для обнаружения целевых геномных изменений в тканях, не связанных с формалином и залитым парафином при немелкоклеточном раке легкого (НМРЛ).

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Успех таргетной терапии при немелкоклеточном раке легкого (НМРЛ) зависит от точной идентификации драйверных изменений, включая мутации, слияние генов и амплификацию. Секвенирование нового поколения (NGS) стало комплексным инструментом молекулярной диагностики, способным обнаруживать как известные, так и новые геномные аберрации, обеспечивая критически важную поддержку для персонализированного лечения НМРЛ. Тем не менее, NGS остается сложным и технически сложным методом. Несмотря на широкое распространение, NGS по-прежнему сталкивается с некоторыми проблемами, включая техническую сложность и длительное время выполнения. Здесь внедряется ISO15189-сертифицированный рабочий процесс NGS, реализованный в клинической лаборатории. Стандартизированный протокол включал в себя оценку клеточности опухоли (≥20 %), экстракцию ДНК из фиксированных формалином тканей парафином (FFPE) (вход ДНК ≥ 50 нг), автоматизированную подготовку библиотеки и биоинформатический анализ. Благодаря интеграции строгих мер контроля качества (QC) на каждом этапе рабочий процесс обеспечивает высокую надежность данных. Кроме того, ключевым нововведением в документообороте стала автоматизация построения библиотек NGS. Автоматизированная система построения библиотеки NGS включала в себя конечный ремонт, А-образное хвостохранилище, лигирование адаптера, гибридизационный захват и очистку, что позволило свести к минимуму человеческие ошибки, повысить воспроизводимость экспериментов, сократить время работы и, таким образом, повысить эффективность. В совокупности опыт показывает, что строгий контроль качества и автоматизированная подготовка библиотеки имеют важное значение для поддержания точности и масштабируемости при клиническом тестировании NGS. Этот оптимизированный подход не только обеспечивает соответствие стандартам ISO15189, но и поддерживает растущий спрос на прецизионную онкологию в лечении НМРЛ.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Немелкоклеточный рак легкого (НМРЛ) составляет 75–85% всех случаев рака легких, представляя собой как клинический приоритет, так и терапевтическую проблему 1,2,3. В последние годы, с успешной разработкой и клиническим применением молекулярно-таргетных препаратов, таких как ингибиторы тирозинкиназы эпидермального фактора роста (EGFR-TKIs), лечение прогрессирующего НМРЛ вступило в эру персонализированной прецизионной терапии 4,5,6. Таргетная терапия обеспечивает точную эффективность, высокую специфичность и минимальные побочные эффекты 7,8. Этот сдвиг в лечении одновременно увеличил спрос на технологии молекулярной диагностики.

В настоящее время комплексное таргетное тестирование опухолей стало незаменимым компонентом клинической практики, который может помочь выяснить точные профили генетических мутаций и, таким образом, обеспечить надежную основу для последующего таргетного применения лекарственных средств, мониторинга лекарственной устойчивости и оценки прогноза для пациентов. В частности, мультигенное тестирование на основе NGS, использующее высокую пропускную способность и высокую чувствительность технических преимуществ, уже было рекомендовано для клинического применения 9,10,11,12.

По сравнению с традиционными методами молекулярной диагностики, NGS демонстрирует революционные преимущества. Основное преимущество секвенарного генератора секвенирования заключается в его высокой пропускной способности. Это позволяет одновременно обнаруживать множество генов, включая как известные, так и неизвестные генетические изменения13,14. Между тем, NGS обеспечивает комплексное тестирование за один прогон, что относительно снижает стоимость, расход образцов и время выполнения испытаний15,16. Учитывая эти преимущества, NGS все чаще применяется в клинической практике. Тем не менее, процессы NGS сложны, включая оценку клеточности опухоли, экстракцию нуклеиновых кислот, автоматизированную подготовку библиотеки и биоинформатический анализ. Качество первичной обработки образцов напрямую влияет на выполнение последующих биоинформатических анализов17. В частности, подготовка библиотеки включает в себя ряд этапов для преобразования образцов сырых нуклеиновых кислот в стандартизированные библиотеки, совместимые с инструментами секвенирования. Подготовка библиотеки включает фрагментацию, восстановление концов, лигирование адаптера и амплификацию ПЦР18. Этот сложный процесс часто приводит к различным техническим искажениям: например, фрагментация может привести к недопредставленности гетерохроматиновых областей; Предпочтение субстрата лигазы во время лигирования адаптера может привести к потере определенных последовательностей; а амплификация ПЦР имеет тенденцию вызывать неравномерный охват в регионах с экстремальным содержанием GC19. Эти системные смещения не только снижают качество данных секвенирования, но и могут привести к ошибочным выводам при последующих биоинформатических анализах. Таким образом, создание строгой системы контроля качества имеет важное значение для обеспечения надежности и согласованности экспериментальных результатов.

Для решения этих давних технических проблем лаборатория внедрила полностью автоматизированную систему NGS. Система предназначена для сокращения времени ручной обработки и сокращения общих сроков выполнения работ. Он включает в себя программируемые протоколы для обеспечения операционной гибкости и точности обработки, а также использует интегрированные модули и блоки для эффективной минимизации потенциальных технических ошибок на каждом этапе. Кроме того, это автоматизированное решение не только улучшает воспроизводимость и пропускную способность подготовки библиотеки, но и, что более важно, гарантирует, что данные секвенирования более точно отражают молекулярный состав исходных образцов. Здесь лаборатория хотела бы внедрить систему через обнаружение изменений водителя с помощью NGS на основе ДНК.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Протокол получил разрешение IRB на анонимизированные архивные образцы.

1. Этапы предварительного тестирования и контроля качества

  1. Зарегистрируйте информацию об образце в системе управления лабораторной информацией (таблица 1). Заполните форму информированного согласия на тестирование на мутацию гена.
  2. Получите образец FFPE НМРЛ. Убедитесь, что образец, используемый для тестирования, является образцом парафиновой ткани, который хранился не более 2 лет. Убедитесь, что образцы обрабатываются и хранятся в соответствии со стандартными патологическими методами.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Данное исследование в первую очередь сосредоточено на методологическом процессе, а не на проведении масштабного клинического анализа. Таким образом, для этого этапа исследования не было установлено никаких конкретных требований к количеству образцов.
  3. Срезайте срезы с помощью одноразовых лезвий для микротомов. Меняйте лезвия, щипцы и микропробирки объемом 1,5 мл между образцами, чтобы предотвратить перекрестное загрязнение и избежать попадания загрязнителей, полученных оператором (например, волос, клеток кожи, слюны).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Большой размер образца (≥ 0,5 см х 0,5 см) 6-10 мкл, пять листов; небольшие образцы (< 0,5 см х 0,5 см) и проколы, 6-10 мкл, 10 листов.
  4. Проведите рутинное окрашивание гематоксилин-эозином (ПЭ) для оценки содержания опухолевых клеток.
  5. Отбирайте образцы, содержащие ≥20% клеток злокачественных опухолей, для последующего анализа. Содержание опухоли оценивается патологоанатомами на HE предметных стеклах20.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если содержание опухоли составляет менее 20%, под руководством отмеченных участков опухоли на предметном стекле соскребите соответствующий участок опухолевой ткани. Этот процесс позволяет добиться обогащения опухолевой ткани за счет эффективного удаления окружающих неопухозрелых компонентов, тем самым значительно увеличивая процент опухолевых клеток в собранном материале.
  6. Проводите экстракцию нуклеиновых кислот с помощью автоматизированной системы очистки, как описано ниже.
    1. Разрежьте блок FFPE с помощью микротома для получения ленты. Поместите ленту в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл. Переместите ленту в указанное место ввода образца на автоматическом приборе для экстракции.
    2. Используйте инструмент для автоматической экстракции с набором для автоматической экстракции и замените ручное пипетирование автоматической системой экстракции нуклеиновых кислот с магнитными шариками.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Автоматизация этого шага помогает обеспечить автоматическую экстракцию для обеспечения высокоточного и воспроизводимого производства ДНК для последующих приложений секвенирования нового поколения.
    3. Обратитесь к инструкциям к полностью автоматическому очистителю нуклеиновых кислот и реагенту для экстракции нуклеиновых кислот для экстракции нуклеиновых кислот.
    4. Затем выберите программу C1102, выберите время инкубации образца для депарафинизации 16 часов и объем элюирования 100 μл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если экстрагированный раствор ДНК не был немедленно протестирован, его необходимо хранить при температуре -20 °C не более 6 месяцев.
  7. Оцените качество нуклеиновых кислот (Таблица 2), как описано ниже.
    1. Используйте электрофорез в агарозном геле для определения размера фрагмента ДНК. Используйте Agilent2100 и другие системы анализа микрофлюидного капиллярного электрофореза для образцов с низким уровнем входа.
    2. Растворите 1 г агарозы в 100 мл раствора ТАЕ. Нагрейте смесь на водяной бане до прозрачности. Охладите раствор примерно до 60 °C.
    3. Подсоедините к положительному электроду (красный) на приборе для электрофореза. Выполнить отрицательный полюс (черный) до напряжения 180 В, проработать 15 мин21,22.
    4. По результатам электрофореза в агарозном геле классифицируют размеры фрагментов на четыре уровня (A-D; табл. 3) и выбрать нуклеиновую кислоту уровней А-С для последующих операций.
    5. Используйте спектрофотометрию для проверки чистоты. Убедитесь, что OD260/OD280 > 1,8; OD260/OD230 > 2.0 для обозначения допустимых уровней загрязнения23,24.
    6. Используйте набор для детектирования (Table of Materials) на основе последовательно-специфичных флуоресцентных красителей для флуориметрического анализа для точного измерения концентрации ДНК.
    7. Добавьте 1 мкл тестируемой ДНК в 199 мкл рабочего раствора, затем перемешайте, кратковременно центрифугируйте и измерьте ее концентрацию с помощью флуориметра (Таблица материалов).

2. Подготовка библиотеки и контроль качества (Рисунок 1)

  1. Получите фрагмент геномной ДНК с помощью ультразвука (Таблица материалов), как описано ниже.
    1. Смешайте 200 нг геномной ДНК с 50 мкл буфера с низким содержанием Tris-EDTA (TE). Затем поместите пробирку с образцами в предварительно охлажденный (8 °C) штатив для образцов.
    2. Установите параметр инструмента в соответствии с таблицей 4. Затем инициируйте фрагментацию.
    3. Используйте электрофорез в агарозном геле для проверки эффекта фрагментации. На этом этапе генерируются фрагменты ДНК с поврежденными концами, которые требуют восстановления концов, чтобы превратить их в тупые концы для последующих этапов.
  2. Выполните окончательный ремонт и добавление А на 3 фута, как описано ниже.
    1. Восстановите поврежденные концы ДНК FFPE с помощью ферментов, чтобы сформировать плоские концы, обеспечивая 3'-OH и 5'-P. Добавьте А к сплющенным двухцепочечным 3'-концам.
    2. Приготовьте смесь ERA, добавив 7 μL буфера для восстановления концов и 3 μL фермента для восстановления концов, осторожно вручную переведите 3-5x и центрифугируйте в течение 1-3 с.
    3. Добавьте смесь ERA к 50 мкл разрушенного образца ДНК, аккуратно перемешайте и центрифугируйте в течение 1-3 с.
    4. Поместите его в прибор для ПЦР и выберите программу ERA (20 °C в течение 30 мин; 65 °C в течение 30 мин; 4 °C Hold; Крышка 85 °C). Следующую операцию выполните в течение 2 часов.
  3. Выполните перевязку адаптера, как описано ниже.
    1. Приготовьте смесь LIG в реакционной системе, добавив 30 мкл лигионного буфера, 10 мкл ДНК-лигазы и 10 мкл ДНК-адаптера. Затем слегка вручную щелкните 3x-5x и центрифугируйте в течение 1-3 с.
    2. Добавьте 50 μL смеси LIG к продукту объемом 60 μL на предыдущем этапе, аккуратно перемешайте, затем центрифугируйте в течение 1-3 с.
    3. Поместите смесь в прибор для ПЦР, затем выберите программу LIG (20 °C в течение 15 мин без нагрева крышки; 70 °C в течение 10 мин (нагревательная крышка); 4 °C Hold; Крышка 85 °C).
  4. Проведите магнитную очистку шариками.
    1. Возьмите 1,5 мл центрифужной пробирки с низкой адсорбцией и добавьте 88 мкл гомогенизированных магнитных шариков и 110 мкл продукта, лигированного адаптером. Перемешайте и хорошо перемешайте, и выдержите при комнатной температуре в течение 5 минут.
    2. Немедленно центрифугируйте инкубированный образец в течение 1-3 с и поместите пробирку центрифуги на магнитный штатив. Подождите, пока раствор рассеется (около 3-5 минут).
    3. Закрепив трубку на магните, откройте колпачок и осторожно отсасывайте очищенную надосадочную жидкость с помощью пипетки, не повреждая гранулы.
    4. Держите трубку на магните и добавьте в каждую трубку по 300 μл свежеприготовленного 75% этанола.
    5. Подождите 1 минуту, чтобы магнитные шарики полностью остыли. Медленно поверните трубку центрифуги по горизонтали один раз, чтобы впитать этанол.
    6. Повторите шаги 2.4.4 и 2.4.5 один раз, всего 2 раза.
    7. Проведите мгновенное центрифугирование в течение 1-3 с, верните пробирку на магнитную стойку и подождите 30 с. С помощью пипетки удалите остатки этанола и держите крышку трубки открытой.
    8. Высушите магнитные шарики при комнатной температуре в течение 2 минут, пока поверхность шариков не станет матовой и не покажет трещин.
    9. Разбавьте продукт лигирования 28 мкл элюирующего буфера (EB).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Магнитные шарики необходимо отбалансировать при комнатной температуре не менее 30 минут перед использованием.
  5. Увеличьте и очистите предварительную библиотеку, как описано ниже.
    1. Предварительно смешайте реакционную систему, добавив 10 мкл ПЦР-буфера, 10 мкл ПЦР-праймеров, 1,5 мкл смеси dNTP, 1 мкл фермента ПЦР. Аккуратно постукивайте вручную 3x-5x и центрифугируйте в течение 1-3 с.
    2. Добавьте 22,5 мкл предварительной смеси к 27,5 мкл очищенного продукта с предыдущего этапа, аккуратно перемешайте, затем центрифугируйте в течение 1-3 с.
    3. Выберите программу PRE: 98 °C 45 с; (98 °C 15 с, 60 °C 30 с, 72 °C 30 с) 12 циклов; 72 °C 2 мин; Удержание при 4 °C; Крышка 105 °C.
    4. После завершения программы ПЦР проведите магнитную очистку шариками с использованием свежеприготовленного 75% этанола. Разбавьте продукт 18 μL EB.
  6. Захватите гибрид, как описано ниже.
    1. Приготовьте реакционную систему А, добавив 15 мкл предварительной библиотеки и 4 мкл смеси блокаторов.
    2. Поместите на ПЦР и запустите программу ПЦР HYB (95 °C в течение 5 мин; 65 °C Hold); Крышка 105 °C).
    3. Приготовьте смесь реакционной системы B HYB, добавив 10 мкл гибридизационного буфера, 0,5 мкл блокатора ингибиторов РНКазы и 1 мкл зонда. Аккуратно переведите в 3-5 раз и центрифугируйте в течение 1-3 с.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Зонд называется LCOO1, а гены зонда включают EGFR, KRAS, BRAF, ALK и т. д.
    4. Когда температура ПЦР-прибора упадет до 65 °С, добавьте 11,5 мкл смеси HYB в реакционную систему А, аккуратно перемешайте, затем накройте крышкой ПЦР-инструмента и продолжайте инкубацию в течение 16-24 ч.
    5. Инкубировать промывочный буфер 2 в коническую пробирку объемом 15 мл с металлическим нагревателем при температуре 65 °C в дозировке 600 мкл на образец.
    6. Извлеките магнитные шарики SCB, инвертируйте и перемешайте 5 раз, сделайте вихрь в течение 10 секунд и уравновесьте при комнатной температуре в течение 30 минут. Вдохните в течение 10 с, перенесите 25 мкл в пробирку центрифуги с низкой адсорбцией объемом 1,5 мл, поместите на магнитный штатив на 3 мин и выбросьте надосадочную жидкость.
    7. Добавьте 200 мкл буфера для промывки шариков в 25 мкл магнитных шариков SCB, перемешайте и перемешайте в течение 3 с, мгновенно центрифугируйте в течение 1-3 с, дайте постоять на магнитном штативе в течение 3 минут и выбросьте надосадочную жидкость.
    8. Повторите шаг 2.6.7 2 раза, всего три раза.
    9. Добавьте 200 мкл буфера для промывки шариков в магнитные шарики, перемешайте и перемешайте в течение 3 с, повторно суспендируйте для последующего использования.
    10. Примерно 30 мкл гибридного образца переложить в ресуспендированные магнитные шарики SCB, сделать вихрь и перемешать, поместить на вращающийся смеситель, инкубировать при комнатной температуре в течение 30 мин и центрифугировать в течение 1-3 с.
    11. Поместите пробирку со смесью на магнитный штатив на 3 минуты, затем отасуньте примерно 230 мкл надосадочной жидкости. Добавьте 500 μL Wash buffer 1, встряхните в течение 5 с, поместите на ротационный смеситель, затем инкубируйте при комнатной температуре в течение 15 минут. Проточная центрифуга в течение 1-3 с.
    12. Поместите магнитную пробирку с образцом шариков на магнитную решетку и дайте ей постоять 3 минуты. Затем аспирируйте примерно 500 мкл надосадочной жидкости и остаточной жидкости.
    13. Разогрейте 150 μL промывочного буфера от 2 до 65 °C, вдохните в течение 10 с, поместите на миксер постоянной температуры, встряхните и инкубируйте при 65 °C в течение 10 минут со скоростью 600 об/мин. Выполните мгновенное центрифугирование в течение 1-3 с, поместите на магнитный штатив на 3 мин и отасуньте примерно 150 мкл надосадочной и остаточной жидкости.
    14. Повторите шаг 2.6.13 3 раза, всего четыре раза.
    15. Мгновенно центрифугируйте в течение 1-3 с, чтобы удалить остатки жидкости из пробирки для образца. Добавьте 20 μL EB, перемешайте вверх и вниз в 8-10 раз, хорошо перемешайте и положите на лед для последующего использования.
  7. Подготовка и очистка итоговой библиотеки.
    1. Приготовьте смесь POST в реакционной системе, добавив 25 мкл амплификационной смеси, 5 мкл индекса и 20 мкл магнитной библиотеки. Аккуратно постучите 3-5x и центрифугируйте в течение 1-3 с. Аккуратно перемешать, центрифугировать в течение 1-3 с.
    2. Выберите программу POST: 98 °C 45 с; (98 °C 15 с, 60 °C 30 с, 72 °C 30 с) 12 циклов; 72 °C 10 мин; Удержание при 4 °C; Крышка 105 °C.
    3. После завершения программы ПЦР проведите магнитную очистку шариками с использованием свежеприготовленного 75% этанола. Разбавьте конечную библиотеку 20 μл EB.

3. Полностью автоматизированная подготовка библиотеки (табл. 5)

  1. Нажмите кнопку питания, чтобы активировать систему, и дождитесь инициализации. Перейдите в раздел «Настройки программы» и выберите «Запустить протокол», затем выберите «Протокол: Burning Rock HS».
  2. Установите параметры аликвотного контроля качества как Тип образца: ДНК высокого качества; Входное количество (нг): 50; Циклы до ПЦР: 12; Циклы после ПЦР: 12. Нажмите кнопку ВЫПОЛНИТЬ.
  3. Вставьте предварительно упакованный картридж с реагентами в указанный слот (автоматически проверяет размещение и состояние реагента).
  4. После загрузки образцов нажмите кнопку «Старт », чтобы система работала автономно. Следите за светодиодными индикаторами для отслеживания прогресса.
  5. После завершения работы программы нажмите OK и программа автоматически перенесет итоговую библиотеку в библиотечную трубку, завершив подготовку библиотеки.

4. Секвенирование и контроль качества

  1. Выполните количественную оценку библиотеки и контроль качества, как описано ниже.
    1. Измерьте предбиблиотечную и общую библиотечную концентрацию с помощью флуориметрии.
    2. Определение размера фрагментов библиотеки. Используйте набор для оценки размера фрагментов библиотеки и наличия адаптеров (Table of Materials).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если окончательная библиотека содержит димеры праймера, необходимо добавить дополнительный этап очистки перед смешиванием образцов на машине. Квалифицированный стандарт для вставки фрагментов составляет ≥ 150.о., а ожидаемая эффективность захвата составляет ≥ 40 %.
    3. Разбавьте библиотеку секвенирования до 1,6 пМ и 1300 мкл для операций секвенирования.
  2. Выполните мониторинг среды секвенирования, как описано ниже.
    1. Контролируйте условия секвенирования, включая температуру в помещении (19-25 °C), влажность в помещении (20%-80%).
    2. Полный контроль качества выходных данных прибора, включая базу выше Q30 и фильтр пропускания плотности кластера (PF).

5. Анализ данных секвенирования и контроль качества

  1. Выполните обработку исходных данных и молекулярное профилирование, как описано ниже.
    1. Используйте выравниватель Барроуза-Уилера (версия 0.7.10) для выравнивания данных секвенирования по hg19.
    2. Выполняйте локальное выравнивание, оптимизацию, маркировку дупликации и вызов вариантов с помощью Genome Analysis Tool Kit (версия 3.2) и Vardict (версия 1.5.1).
    3. Фильтруйте варианты с помощью конвейера fpfilter VarScan (версия 2.4.3) и удаляйте локусы с глубиной менее 50. Классифицируйте и исключайте варианты с популяционной частотой более 0,1% в базах данных ExAC, 1000 Genomes, dbSNP или ESP6500SI-V2 как однонуклеотидные полиморфизмы (SNP).
    4. Аннотируйте остальные варианты с помощью SnpEff (версия 3.6).
    5. Анализируйте структурные варианты (SV), включая большие геномные перестройки (LGR), с помощью MarkSV (алгоритм Burning Rock). Анализируйте варианты номеров копий (CNV) на основе данных глубины покрытия интервалов захвата.
    6. Корректные данные покрытия для погрешностей секвенирования, возникающих в результате содержания гуанина-цитозина и конструкции зонда.
  2. Оцените качество выборки, включая среднюю глубину, медианную глубину, уникальную глубину, размер вставки, сложность выборки, покрытие, коэффициент Q30 и коэффициент корреляции парной выборки, как описано впункте 25.
  3. Для создания отчета проверьте версию и параметры конвейера, чтобы завершить биоинформатический обзор. Используйте соответствующие рекомендации для оценки патогенности мутаций26,27. Выпуск итогового отчета.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Используя автоматизированный рабочий процесс анализа NGS со строгим контролем качества, лаборатория провела комплексное геномное профилирование образцов NSCLC. Оптимизированный рабочий процесс обнаружения (Рисунок 2) позволил надежно идентифицировать несколько клинически значимых геномных изменений в репрезентативных образцах опухолей (Рисунок 3).

Результаты секвенирования продемонстрировали высокочас...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Каждый квалифицированный отчет NGS лежит в основе строгого процесса, который остается сложным и трудоемким28. Для решения этих проблем в лаборатории была разработана полностью автоматизированная система NGS. Эта операция значительно сокращает ручное вмешательство, сводит к минимуму экспериментальные ошибки и значительно сокращает время выполнения работ. Таким образом, эта система обеспечила более надежную и эффективную стратегию для NGS, создав новую идею о качест...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

У авторов нет конфликта интересов, который можно было бы раскрыть.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Это исследование было поддержано грантами Пекинского фонда естественных наук Китайской Народной Республики (7252122), Пекинского исследовательского фонда клинической онкологии Китайской Народной Республики Xisike (Y-HS202402-0021), Исследовательского фонда обучения в ординатуре Онкологической больницы, Китайской академии медицинских наук и Пекинского объединенного медицинского колледжа (E2025004), а также Национального финансирования клинических исследований больницы высокого уровня (2025-LYZX-R-B03).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
  Agilent  Набор ДНК высокой чувствительности  Agilent5067-4626Для использования с the  Биоанализаторная система Agilent 2100
  Набор реагентов Agilent DNA 1000  Agilent5067-1504Для использования с the  Биоанализаторная система Agilent 2100
Биоанализатор Agilent 2100AgilentG2939AОценить размер фрагмента библиотеки и наличие адаптеров. 
Concert Полностью автоматический инструмент для очистки нуклеиновых кислотКОНЦЕРТMC1002Используется для экстракции ДНК
Эквалбит 1 и раз; Набор для анализа dsDNA HSВазимеEQ121-02-AAДля использования с the  Флюорметр Кубит 3.0
Комбинированный набор для обнаружения мета гена EGRR/KRAS/BRAF/ALKГорящая скалаBR-LC00102Строительство библиотеки
Magnis BRAgilent TechnologiesG7595AAАвтоматизированная подготовка библиотек NGS
Фокусированный ультразвуковой аппарат ME220Коварис500396ультразвуковая обработка
NanoDrop One/OneCТермо ФишерND-ONE-WПолноволновое УФ-спектрофотометрическое обнаружение
NextSeq 550DxIllumina20005715последовательность
NSQ 500/550 Hi Output KT v2.5 (300CYS)Illumina20024908Для использования с NextSeq 550Dx
Реагент для экстракции нуклеиновых кислотКОНЦЕРТRC1102Используется для экстракции ДНК
Флюорметр Кубит 3.0ЖизньQ33216Используется для определения концентрации нуклеиновых кислот или библиотек
Qubit dsDNA HS Assay KitЖизньQ32851Для использования с the  Флюорметр Кубит 3.0

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Feng, R. M., Zong, Y. N., Cao, S. M., Xu, R. H. Current cancer situation in China: Good or bad news from the 2018 global cancer statistics. Cancer Commun (Lond). 39 (1), 22(2019).
  2. Siegel, R. L., Kratzer, T. B., Giaquinto, A. N., Sung, H., Jemal, A. Cancer statistics, 2025. CA Cancer J Clin. 75 (1), 10-45 (2025).
  3. Sung, H., et al. Global cancer statistics 2020: Globocan estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA Cancer J Clin. 71 (3), 209-249 (2021).
  4. Fukuoka, M., et al. Multi-institutional randomized phase II trial of gefitinib for previously treated patients with advanced non-small-cell lung cancer. J Clin Oncol. 41 (6), 1162-1171 (2023).
  5. Kris, M. G., et al. Efficacy of gefitinib, an inhibitor of the epidermal growth factor receptor tyrosine kinase, in symptomatic patients with non-small cell lung cancer: A randomized trial. JAMA. 290 (16), 2149-2158 (2003).
  6. Zhou, C., et al. Erlotinib versus chemotherapy as first-line treatment for patients with advanced EGFR mutation-positive non-small-cell lung cancer (OPTIMAL, CTONG-0802): A multicentre, open-label, randomised, phase 3 study. Lancet Oncol. 12 (8), 735-742 (2011).
  7. Wu, K., House, L., Liu, W., Cho, W. C. Personalized targeted therapy for lung cancer. Zhongguo Fei Ai Za Zhi. 16 (8), C21-C34 (2013).
  8. Sharma, S. V., Settleman, J. Oncogenic shock: Turning an activated kinase against the tumor cell. Cell Cycle. 5 (24), 2878-2880 (2006).
  9. Kumar, S. S., et al. High early growth response 1 (EGR1) expression correlates with resistance to anti-EGFR treatment in vitro and with poorer outcome in metastatic colorectal cancer patients treated with cetuximab. Clin Transl Oncol. 19 (6), 718-726 (2017).
  10. Li, D., et al. Status of 10 targeted genes of non-small cell lung cancer in Eastern China: A study of 884 patients based on NGS in a single institution. Thorac Cancer. 11 (9), 2580-2589 (2020).
  11. Wen, S., et al. Genomic signature of driver genes identified by target next-generation sequencing in Chinese non-small cell lung cancer. Oncologist. 24 (11), e1070-e1081 (2019).
  12. Tan, N., Li, Y., Ying, J., Chen, W. Histological transformation in lung adenocarcinoma: Insights of mechanisms and therapeutic windows. J Transl Int Med. 12 (5), 452-465 (2024).
  13. Coco, S., et al. Next generation sequencing in non-small cell lung cancer: New avenues toward personalized medicine. Curr Drug Targets. 16 (1), 47-59 (2015).
  14. Yang, X., et al. The molecular and cellular choreography of early mammalian lung development. Med Rev. 4 (3), 192-206 (2024).
  15. Wang, R., Wang, G., Zhang, N., Li, X., Liu, Y. Clinical evaluation and cost-effectiveness analysis of serum tumor markers in lung cancer. Biomed Res Int. 2013, 195692(2013).
  16. McGinn, S., Gut, I. G. DNA sequencing-spanning the generations. Nat Biotechnol. 30 (4), 366-372 (2013).
  17. Larson, N. B., Oberg, A. L., Adjei, A. A., Wang, L. A clinician's guide to bioinformatics for next-generation sequencing. J Thorac Oncol. 18 (2), 143-157 (2023).
  18. McCombie, W. R., McPherson, J. D., Mardis, E. R. Next-generation sequencing technologies. Cold Spring Harb Perspect Med. 9 (11), a036798(2019).
  19. Van Dijk, E. L., Jaszczyszyn, Y., Thermes, C. Library preparation methods for next-generation sequencing: Tone down the bias. Exp Cell Res. 322 (1), 12-20 (2014).
  20. Rao, W., et al. Potential unreliability of ALK variant allele frequency in the efficacy prediction of targeted therapy in NSCLC. Front Med. 17 (3), 493-502 (2023).
  21. Koontz, L. Agarose gel electrophoresis. Methods Enzymol. 529, 35-45 (2013).
  22. Holmes, D. L., Stellwagen, N. C. Electrophoresis of DNA in oriented agarose gels. J Biomol Struct Dyn. 7 (2), 311-327 (1989).
  23. Liu, D., et al. Quality control of next-generation sequencing-based in vitro diagnostic test for onco-relevant mutations using multiplex reference materials in plasma. J Cancer. 9 (9), 1680-1688 (2018).
  24. Zhang, C., et al. An improved NGS library construction approach using DNA isolated from human cancer formalin-fixed paraffin-embedded samples. Anat Rec (Hoboken). 302 (6), 941-946 (2019).
  25. Wood, D. E. National comprehensive cancer network (NCCN) clinical practice guidelines for lung cancer screening. Thorac Surg Clin. 25 (2), 185-197 (2015).
  26. Chinese Society of Pathology Quality Control, Chinese Medical Association Chinese Society of Oncology, China Anti-Cancer Association Chinese Society of Lung Cancer, Chinese Thoracic Oncology Group. Guidelines on clinical practice of molecular tests in non-small cell lung cancer in China. Zhonghua Bing Li Xue Za Zhi. 50 (4), 323-332 (2021).
  27. Rao, W., et al. Developing an effective quality evaluation strategy of next-generation sequencing for accurate detecting non-small cell lung cancer samples with variable characteristics: A real-world clinical practice. J Cancer Res Clin Oncol. 149 (8), 4889-4897 (2023).
  28. Hutchins, R. J., et al. Practical guidance to implementing quality management systems in public health laboratories performing next-generation sequencing: Personnel, equipment, and process management (Phase 1). J Clin Microbiol. 57 (8), e00261-e00319 (2019).
  29. Haile, S., et al. Automated high throughput nucleic acid purification from formalin-fixed paraffin-embedded tissue samples for next generation sequence analysis. PLoS One. 12 (6), e0178706(2017).
  30. Larguinho, M., et al. Development of a fast and efficient ultrasonic-based strategy for DNA fragmentation. Talanta. 81 (3), 881-886 (2010).
  31. Xuan, J., Yu, Y., Qing, T., Guo, L., Shi, L. Next-generation sequencing in the clinic: Promises and challenges. Cancer Lett. 340 (2), 284-295 (2013).
  32. Senst, A., Bonsiepe, H., Kron, S., Schulz, I. Application of the Agilent 2100 bioanalyzer instrument as quality control for next-generation sequencing. J Forensic Sci. 69 (6), 2192-2196 (2024).
  33. Li, W., Qiu, T., Ling, Y., Gao, S., Ying, J. Subjecting appropriate lung adenocarcinoma samples to next-generation sequencing-based molecular testing: Challenges and possible solutions. Mol Oncol. 12 (5), 677-689 (2018).
  34. Li, W., et al. Potential unreliability of uncommon ALK, ROS1, and RET genomic breakpoints in predicting the efficacy of targeted therapy in NSCLC. J Thorac Oncol. 16 (3), 404-418 (2021).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи