Method Article

Интегрированная молекулярная система обнаружения на основе ПЦР для одновременного обнаружения четырех зоонозных кишечных паразитов из нескольких источников

DOI:

10.3791/69180

⸱

October 28th, 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Key Laboratory of Public Health Molecular Biology, Yancheng Center for Disease Control and Prevention, 2Clinical Laboratory, Yancheng Maternal and Child Health Care Hospital Affiliated to Yangzhou University, 3Jiangsu Provincial Center for Disease Control and Prevention

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В данной работе мы представляем протокол для одновременного обнаружения четырех зоонозных кишечных паразитов из нескольких источников на основе комбинации интегрированной молекулярной системы обнаружения на основе полимеразной цепной реакции (ПЦР).

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Инфекционные заболевания являются важнейшими факторами, влияющими на здоровье человека, экономическое развитие и социальную стабильность. Среди них зоонозные кишечные паразитарные заболевания все чаще становятся предметом глобальной озабоченности в качестве возникающих, вновь возникающих инфекционных заболеваний, в частности Cryptosporidium, Enterocytozoon bieneusi, Blastocystis и Giardia. Было опубликовано лишь несколько исследований по эпидемиологии вышеупомянутых паразитов, сопровождавшихся такими проблемами, как одиночные цели обнаружения, низкие показатели обнаружения и высокие показатели недостающего обнаружения. Данное исследование направлено на создание интегрированной молекулярной системы обнаружения, основанной на комбинации ПЦР-тестов, для одновременного обнаружения вышеупомянутых четырех зоонозных кишечных паразитов в образцах, собранных у диких мышей, домашних животных-компаньонов и домашнего скота (крупного рогатого скота и овец), чтобы обеспечить эффективную техническую поддержку для рутинного обнаружения паразитов в различных сценариях, включая взаимодействие животного и окружающей среды, особенно в местных учреждениях эпиднадзора.

В этом исследовании, в котором в качестве основного теста было взято обнаружение Enterocytozoon bieneusi в фекалиях 95 диких мышей и 30 кошек и собак (25 у кошек и 5 у собак), когда для амплификации гена ITS использовались два набора праймеров, положительные результаты каждой ПЦР были точно такими же (5,26%), но комбинация из 2 наборов тестов полимеразной цепной реакции (ПЦР) привела к более высокому проценту положительных результатов (6,32%) для Enterocytozoon bieneusi. Для лямблий было обнаружено 9 положительных образцов с использованием гена бета-гиардина (BG), в то время как для генов глутаматдегидрогеназы (GDH) и триозфосфатизомеразы (TPI) не было обнаружено ни одного положительного. Приведенные выше результаты показали, что комбинация ПЦР-тестов для нескольких целевых генетических сегментов повышает способность к обнаружению обозначенных патогенов по сравнению с любым одним ПЦР-тестом. Целевые последовательности были подтверждены секвенированием по Сэнгеру. Эта система была разработана для улучшения и облегчения эпиднадзора за инфекционным статусом, распространением и филогенетической эволюцией зоонозных кишечных паразитов из нескольких источников, обеспечивая основу для точных и чувствительных предупреждений на ранней стадии. Это направлено на создание технического моста для достижения цели «Единое здоровье» между взаимодействием человек-животное-окружающая среда.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cryptosporidium, Enterocytozoon bieneusi, Blastocystis и Giardia являются распространенными и легко игнорируемыми простейшими патогенами с глобальной распространенностью. В последние годы, в связи с такими факторами, как мелиорация и вторжение в экологические ниши природных очагов, популярность разведения животных-компаньонов, а также развитие животноводства и птицеводства, распространенность зоонозных кишечных паразитарных заболеваний из нескольких источников у грызунов, животных-компаньонов (кошек и собак), а также домашнего скота (крупного рогатого скота и овец) все чаще становится центром внимания, вспышки и рецидивирующие инфекционные заболевания в домашних и сельских районах, что создает серьезную угрозу здоровью человека и глобальной безопасности в области общественного здравоохранения 1,2,3,4.

Эти паразиты обладают сложными внутриродовыми видами и обширной приспособляемостью хозяина. Они могут заражать не только грызунов, домашних животных, жвачных животных, домашнюю птицу и птиц, но и зоонозные виды, которые могут заражать людей, вызывая клинические симптомы, такие как боль в животе, диарея и рвота. Они особенно восприимчивы среди детей, пожилых людей, беременных женщин и населения с ослабленным иммунитетом и могут передаваться через воду, пищу и воздух, создавая значительные зоонозные риски для здоровья населения 3,5,6.

В настоящее время идентификация вышеупомянутых четырех паразитов в первую очередь опирается на морфологию, которая подвержена ошибочной идентификации из-за морфологического сходства внутри родов и субъективных факторов, особенно при различении видов и генотипов. Методы молекулярной биологии широко используются для идентификации видов, родов и генотипов этих паразитов. Для Blastocystis и Cryptosporidium обнаружение в основном сосредоточено на малой субъединице рибосомальной рибонуклеиновой кислоты (SSU рРНК) гена 3,7,8; для Enterocytozoon bieneusi — ген внутреннего транскрибируемого спейсера (ITS) 4,9; а для лямблий — гены бета-гиардина (BG), глутаматдегидрогеназы (GDH) и триозфосфатизомеразы (TPI)10,11. Несмотря на то, что традиционная полимеразная цепная реакция (ПЦР) значительно улучшила возможности идентификации и типирования этих четырех паразитов, она недостаточна для выявления пропущенных случаев и идентификации новых видов или квазивидов со значительными генетическими характеристиками. Это часто влияет на эффективность эпидемиологического расследования, передачи инфекции и борьбы с болезнями среди людей, животных и других хозяев, создавая серьезные проблемы для безопасности общественного здравоохранения людей, животных и окружающей среды.

Из-за сходства симптомов, путей передачи и диапазона хозяев этих четырех паразитов, до сих пор не существует интегрированной молекулярной системы для эффективного обнаружения, избегая при этом пропущенных обнаружений и точно идентифицируя новые виды или квазивиды со значительными генетическими различиями. В этом исследовании была создана зрелая интегрированная молекулярная система обнаружения, основанная на технологии высокопроизводительного секвенирования ПЦР путем обзора литературы, для одновременного обнаружения четырех зоонозных кишечных паразитов в образцах из нескольких источников (дикие мыши, животные-компаньоны, крупный рогатый скот и овцы). В сочетании с биоинформатическим анализом эта система была применена для выявления зоонозных кишечных паразитов из нескольких источников, мониторинга эпидемиологических факторов, таких как распространение инфекции и филогенетическая эволюция, а также раннего предупреждения инфекций человека и животных и загрязнения окружающей среды.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Исследование было одобрено и проведено комитетом по этике животных Центра по контролю и профилактике заболеваний провинции Цзянсу. Данное исследование проводилось в соответствии с Рекомендациями Американской ветеринарной медицинской ассоциации по эвтаназии животных издания 2020 года, руководящими принципами Правил обращения с экспериментальными животными (Приказ No 2 Государственной комиссии по науке и технологиям Китайской Народной Республики, 1988 г.) и Руководящими принципами гуманного обращения с животными, выпущенными Министерством науки и технологий Китайской Народной Республики.

1. Приготовление свежих фекалий от диких мышей, животных-компаньонов и домашнего скота (крупного рогатого скота и овец)

  1. Обезболивайте мышей путем вдыхания углекислого газа из консервированного сжатого источника углекислого газа в прозрачном герметичном пластиковом ящике, со скоростью замены 30%-70% от объема контейнера в минуту. После полного обезболивания и комы провести шейный вывих мышам.
  2. Сбор свежих образцов кала: Соберите образцы кала у собак, кошек, крупного рогатого скота и овец в течение 1 часа после дефекации, используя одну пробирку на каждый кал животного, и избегайте перекрестного загрязнения.
    1. Отлавливайте грызунов с помощью клеток-приманок с выпускающими устройствами в разных диких местах обитания. Поместите пойманных мышей в мешки для мышей и быстро перевезите их в лабораторию. В стерильном режиме в шкафу биобезопасности препарируйте мышей, чтобы собрать прямую кишку, содержащую фекалии, поместите ее в криопробирку объемом 2 мл и храните при температуре -80 °C для последующего обнаружения.
    2. Выберите собак и кошек из зоомагазинов в разных регионах в качестве объектов исследования. Немедленно соберите свежевыведенные каловые массы в криопробирки объемом 5 мл, помеченные полной информацией об образце, и немедленно транспортируйте их в лабораторию для хранения при температуре -80 °C.
    3. Выберите крупный рогатый скот и овец с животноводческих ферм (интенсивных или на свободном выгуле) в качестве объектов исследования. Немедленно соберите свежевыведенные фекалии в криопробирки объемом 50 мл, помеченные полной информацией об образце, и немедленно транспортируйте их в лабораторию для хранения при температуре -80 °C.

2. Извлечение общей ДНК из свежих фекалий диких мышей, животных-компаньонов и домашнего скота (крупного рогатого скота и овец)

  1. Предварительная обработка кала:
    ПРИМЕЧАНИЕ: Использовался мини-набор QIAamp Fast DNA Stool.
    1. При стерильном использовании в шкафу биобезопасности добавьте примерно 200 мг фекалий из разных источников в буфер с фосфатно-солевым буфером (PBS), добавьте стальные шарики и тщательно гомогенизируйте с помощью измельчителя тканей.
    2. Нагрейте его до 70 °C в течение 5 минут и центрифугируйте при 10 000 × г в течение 10 минут при комнатной температуре (15-25 °C).
    3. Добавьте 600 мкл надосадочной жидкости в центрифужную пробирку объемом 2 мл, содержащую 25 мкл протеиназы К, добавьте 600 мкл буфера AL, и сделайте вортекс в течение 15 с.
    4. Выдерживать при температуре 70 °C в течение 10 минут. Добавьте 600 μл 100% безводного этанола в лизат и перемешайте.
  2. Осторожно добавьте 600 мкл лизата в спин-колонку, центрифугируйте при 14000 × г в течение 1 мин и поместите спиновую колонку в новую пробирку для сбора объемом 2 мл. Повторите этот шаг еще раз.
  3. Осторожно откройте спиновую колонку, добавьте 500 μл буфера AW1, центрифугируйте на максимальной скорости в течение 1 минуты и поместите спиновую колонку в новую пробирку для сбора объемом 2 мл. Осторожно откройте спиновую колонку, добавьте 500 μL Buffer AW2 и центрифугируйте на максимальной скорости в течение 3 минут.
  4. Поместите спиновую колонку в новую сборную пробирку объемом 2 мл (подготовленную отдельно) и центрифугируйте при температуре 14000 × г в течение 3 минут. Поместите спиновую колонку в новую пробирку центрифуги объемом 1,5 мл с маркировкой и добавьте 100 мкл элюирующего буфера непосредственно на мембрану спиновой колонки.
  5. Инкубировать при комнатной температуре (15-25 °C) в течение 1 минуты, а центрифугировать при 14000 × г в течение 1 минуты для элюирования ДНК.
  6. Определить концентрацию и чистоту ДНК можно с помощью ультрамикроспектрофотометра. Используйте извлеченную ДНК для последующего обнаружения или храните ее при температуре -20 °C для долгосрочного сохранения.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Соотношение A260/A280 должно составлять 1,8-2,0 для обеспечения целостности и чистоты экстрагированной ДНК.

3. Вложенное конвенциональное ПЦР-детектирование Cryptosporidium и Blastocystis , нацеленное на малую субъединичную рибосомальную РНК (SSU рРНК)

ПРИМЕЧАНИЕ: Для этого этапа был использован Dream Taq Green PCR Mix.

  1. Приготовьте реакционную систему ПЦР на льду с использованием смеси для ПЦР: 25 мкл 2× Taq-буфера, по 2 мкл прямого и обратного праймеров, 16 мкл ddH2O и 5 мкл матрицы, общим объемом 50 мкл.
  2. Для Cryptosporidium выполните шаги 3.2.1-3.2.2.
    1. Используйте F1R11 и F-1R1-1 8,11 в качестве реакционных праймеров первого раунда. Задайте программу реакции: начальная денатурация при 94 °C в течение 5 мин, 30 циклов денатурации при 94 °C в течение 40 с, отжиг при 55 °C в течение 40 с и удлинение при 72 °C в течение 90 с, с окончательным удлинением при 72 °C в течение 7 мин.
    2. В качестве грунтовок второго цикла используют F2R21 и F-1R2-1 8,11 со следующей программой реакции: начальная денатурация при 94 °C в течение 5 мин, 30 циклов денатурации при 94 °C в течение 40 с, отжиг при 55 °C в течение 40 с и удлинение при 72 °C в течение 1 мин с окончательным удлинением при 72 °C в течение 7 мин.
  3. Для Blastocystis выполните шаги 3.3.1-3.3.4.
    1. Используйте F1R13 и F1-1R-1 3,12 в качестве реакционных праймеров первого раунда. Установите программу реакции для F1R1 следующим образом: начальная денатурация при 94 °C в течение 5 мин, 30 циклов денатурации при 94 °C в течение 40 с, отжиг при 60 °C в течение 40 с и удлинение при 72 °C в течение 100 с, с окончательным удлинением при 72 °C в течение 7 мин.
    2. Установите программу реакции для F1-1R-1 следующим образом: начальная денатурация при 94 °C в течение 5 мин, 30 циклов денатурации при 94 °C в течение 40 с, отжиг при 55 °C в течение 40 с и удлинение при 72 °C в течение 1 мин, с окончательным удлинением при 72 °C в течение 7 мин.
    3. Используйте F2R23 и F2-1R-1 3,12 в качестве капсюлей второго раунда. Установите программу реакции для F2R2 следующим образом: начальная денатурация при 94 °C в течение 5 мин, 30 циклов денатурации при 94 °C в течение 40 с, отжиг при 60 °C в течение 40 с и удлинение при 72 °C в течение 1 мин, с окончательным удлинением при 72 °C в течение 7 мин.
    4. Установите программу реакции для F2-1R-1 следующим образом: начальная денатурация при 94 °C в течение 5 мин, 30 циклов денатурации при 94 °C в течение 40 с, отжиг при 55 °C в течение 40 с и удлинение при 72 °C в течение 50 с, с окончательным удлинением при 72 °C в течение 7 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Последовательности праймеров показаны в таблице 1 1,3,8,11,12.
ПатогенОжидаемый размер продукта (.о.)Последовательности праймеров (5′-3′)Ссылки
Криптоспоридии830Формула-1: CCATTTCCTTCGAAACAGGA1
R1: TTCTAGAGCTAATACATGCG
Формула-2: AAGGAGTAAGGAACAACCTCCA
R2: GGAAGGGTTGTATTTATTAGATAAAG
607F-1: GACATATCATTCAAGTTTCTGACC8,11
R1-1: CTGAAGGAGTAAGGAACAACC
R2-1: TCTAAGAATTTCACCTCTGACTG
Бластоцистис600Формула-1: GGGATCCTGATCCTTCCGCAGGTTCACCTAC3
R1: GGAAGC TTATCTGGTTGATCCTGCCAGTA
F2: ATCTGGTTGATCCTGCCAGT
R2: GAGCTTTTTTTAACTGCAACAACG
460F1-1: TGCTTTCGCACTTGTTCATC3,12
F2-1: GATTTATTGTCACTACCTCC
R-1: ATCTGGTTGATCCTGCCAGT

Таблица 1: Последовательности праймеров для SSU рРНК Cryptosporidium и Blastocystis.

4. Вложенное конвенциональное ПЦР-детектирование гена ITS Enterocytozoon bieneusi и генов Giardia BG, GDH и TPI

ПРИМЕЧАНИЕ: Для этого этапа был использован Dream Taq Green PCR Mix.

  1. Приготовьте реакционную систему ПЦР на льду с использованием ПЦР-смеси: 25 мкл 2× Taq-буфера, по 2 мкл прямого и обратного праймеров, 16 мкл ddH2O и 5 мкл матрицы, общим объемом 50 мкл.
  2. Для Enterocytozoon bieneusi выполните шаги 4.2.1-4.2.2.
    1. Используйте F1R19 и F1-1R1-12 в качестве реакционных праймеров первого раунда. Установите программу реакции следующим образом: начальная денатурация при 94 °C в течение 5 мин, 30 циклов денатурации при 94 °C в течение 40 с, отжиг при 55 °C в течение 40 с и удлинение при 72 °C в течение 50 с, с окончательным удлинением при 72 °C в течение 7 мин.
    2. В качестве грунтовок второго цикла используют F2R29 и F2-1R2-12 с программой реакции следующим образом: начальная денатурация при 94 °C в течение 5 мин, 30 циклов денатурации при 94 °C в течение 40 с, отжиг при 55 °C в течение 40 с и удлинение при 72 °C в течение 50 с, с окончательным удлинением при 72 °C в течение 7 мин.
  3. Для лямблий выполните шаги 4.3.1-4.3.3.
    1. Используйте BG-F1R1, GDH-F1R1 и TPI-F1R1 2,10 в качестве праймеров первого раунда реакции для трех генов-мишеней. Установите программу реакции первого цикла для всех следующим образом: начальная денатурация при 94 °C в течение 5 мин, 30 циклов денатурации при 94 °C в течение 40 с, отжиг при 50 °C в течение 40 с и удлинение при 72 °C в течение 1 мин с окончательным удлинением при 72 °C в течение 7 мин.
    2. Установите программу реакции второго цикла для BG-F2R2 2,10 и TPI-F2R2 2,10 следующим образом: начальная денатурация при 94 °C в течение 5 мин, 30 циклов денатурации при 94 °C в течение 40 с, отжиг при 55 °C в течение 40 с и удлинение при 72 °C в течение 50 с, с окончательным удлинением при 72 °C в течение 7 мин.
    3. Установите программу реакции второго цикла для GDH-F2R2 2,10 следующим образом: начальная денатурация при 94 °C в течение 5 мин, 30 циклов денатурации при 94 °C в течение 40 с, отжиг при 60 °C в течение 40 с и удлинение при 72 °C в течение 50 с, с окончательным удлинением при 72 °C в течение 7 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Последовательности праймеров показаны в Таблице 2 2,9,10.
ПатогенОжидаемый размер продукта (.о.)Последовательности праймеров (5′-3′)Ссылки
Enterocytozoon bieneusi390Формула-1: GGTCATAGGGATGAAGAG9
R1: TTCGAGTTCTTTCGCGCTC
F2: GCTCTGAATATCTATGGCT
R2: ATCGCCGACGGATCCAAGTG
390F1-1: GATGGTCATAGGGATGAAGAGCTT2
R1-1: TATGCTTAAGTCCAGGGAG
F2-1: AGGGATGAAGAGCTTCGGCTG
R2-1: AGTGATCCTGTATTAGGGATATT
Лямблии511BG-F1: AAGCCCGACGACCTCACCCGCAGTGC2,10
BG-R1: GAGGCCGCCCTGGATCTTCGAGACGAC
BG-F2: GAACGAACGAGATCGAGGTCCG
BG-R2: CTCGACGAGCTTCGTT
530GDH-F1: TTCCGTRTYCAGTACAACTC2,10
GDH-R1: ACCTCGTTCTGRGTGGCGCA
GDH-F2: ATGACYGAGCTYCAGAGGCACGT
GDH-R2: GTGGCGCARGGCATGATGCA
530ТПИ-F1: AAATIATGCCTGCTCGTCG2,10
TPI-R1: CAAACCTTITCCGCAAACC
TPI-F2: CCCTTCATCGGIGGTAACTT
TPI-R2: GTGGCCACCACICCCGTGCC

Таблица 2: Последовательности праймеров для гена ITS Enterocytozoon bieneusi и генов Giardia BG, GDH и TPI.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Результаты ПЦР-тестирования мышей Cryptosporidium, гена рРНК Blastocystis SSU, гена ITS Enterocytozoon bieneusi и гена Giardia BG
Все 95 образцов ректального кала мышей были протестированы на ген ITS Enterocytozoon bieneusi с использованием двух наборов праймеров, в результате чего было получено 5 положительных образцов ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cryptosporidium, Enterocytozoon bieneusi, Blastocystis и Giardia являются распространенными зоонозными кишечными паразитами; первые два классифицируются как биологические патогены категории B Национальными институтами здравоохранения США (NIH), и все четыре включены Всемирной организацией здравоохранения (ВОЗ) в список 24 наиболее важных пищевых паразитов во всем мире. Они потенциально могут инфицировать людей, животных и загрязнять окружающую среду, ч...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Это исследование было поддержано Комиссией по здравоохранению провинции Цзянсу (грант No. Ym2023024), Муниципальный медицинский исследовательский проект Яньчэн (грант No. YK2023085) и Открытый фонд Ключевой лаборатории патогенной микробиологии новых и вновь возникающих инфекционных заболеваний (Центр по контролю и профилактике заболеваний провинции Цзянсу) (PM202402).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Agarose Цинкэ ТехTSJ001
Набор для экстракции геля QiaquickQiagen 28704Набор для экстракции ДНК-геля
Лестница ДНК с 100 б..TransGen  БиотехнологииBM311ДНК-лестница
Окраска с нуклеиновой кислотой 4S Green PlusBBIA616696-0500ДНК-окрашивание
10 раз; Буфер TBESolarbioT1051Буфер электрофореза
Кубит 4.0Термоhttps://www.thermofisher.com/in/en/home
/промышленная/спектроскопия-элементарная
-изотопный анализ/молекулярная спектроскопия/
fluorometers/qubit/models/qubit-4.html?
ef_id=:G:s& s_kwcid=AL!3652!10!77515
785702067!!!! 77516061528018!! 380468
453!1240249321530142& cid=bid_pca_
aqb_r01_co_cp1359_pjt0000_bid
00000_0se_bng_bt_pur_con		Флуоресцентный количественный прибор
MINI Space 1000Танонhttp://en.biotanon.com/PRODUCT/
PRODUCTLIST?ID=3040&
TYPE=DETAIL		Гель-имиджер
  Мини-набор для экстракции ДНК для экстракции ДНКQIAGEN51604Набор для экстракции нуклеиновых кислот
ProFlex BaseТермоhttps://www.thermofisher.com/
in/en/home/life-science/pcr/
thermal-cyclers-realtime-
instruments/thermal-cyclers
/proflex-pcr-system.html		ПЦР
Dream Taq Green ПЦР-миксТермоK1082ПЦР-усиление 

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zhao, Q., et al. Cryptosporidium spp. in large-scale sheep farms in China: prevalence and genetic diversity. Sci Rep. 14 (1), 11218(2024).
  2. Li, F., Wang, R., Guo, Y., Li, N., Feng, Y., Xiao, L. Zoonotic potential of Enterocytozoon bieneusi and Giardia duodenalis in horses and donkeys in northern China. Parasitol Res. 119 (3), 1101-1108 (2020).
  3. Jinatham, V., Maxamhud, S., Popluechai, S., Tsaousis, A. D., Gentekaki, E. Blastocystis One Health approach in a rural community of Northern Thailand: prevalence, subtypes and novel transmission routes. Front Microbiol. 12 (1), 746340(2021).
  4. Deng, L., et al. Occurrence and genetic characteristics of Cryptosporidium spp. and Enterocytozoon bieneusi in pet red squirrels (Sciurus vulgaris) in China. Sci Rep. 10 (1), 1026(2020).
  5. Zhao, W., Zhou, H. H., Ma, T. M., Cao, J., Lu, G., Shen, Y. J. PCR-based detection of Cryptosporidium spp. and Enterocytozoon bieneusi in farm-raised and free-ranging geese (Anser anser f. domestica) from Hainan Province of China: natural infection rate and the species or genotype distribution. Front Cell Infect Microbiol. 9 (1), 416(2019).
  6. Feng, Y., Xiao, L. Zoonotic potential and molecular epidemiology of Giardia species and giardiasis. Clin Microbiol Rev. 24 (1), 110-140 (2011).
  7. Zhao, G. H., et al. Genotyping Cryptosporidium andersoni in cattle in Shaanxi Province, Northwestern China. PLoS One. 8 (4), e60112(2013).
  8. Ryan, U., Xiao, L., Read, C., Zhou, L., Lal, A. A., Pavlasek, I. Identification of novel Cryptosporidium genotypes from the Czech Republic. Appl Environ Microbiol. 69 (7), 4302-4307 (2003).
  9. Gui, B. Z., et al. Novel genotypes and multilocus genotypes of Enterocytozoon bieneusi in two wild rat species in China: potential for zoonotic transmission. Parasitol Res. 119 (1), 283-290 (2020).
  10. Ye, J., et al. Occurrence of human-pathogenic Enterocytozoon bieneusi, Giardia duodenalis and Cryptosporidium genotypes in laboratory macaques in Guangxi, China. Parasitol Int. 63 (1), 132-137 (2014).
  11. Alves, M., Xiao, L., Sulaiman, I., Lal, A. A., Matos, O., Antunes, F. Subgenotype analysis of Cryptosporidium isolates from humans, cattle, and zoo ruminants in Portugal. J Clin Microbiol. 41 (6), 2744-2747 (2003).
  12. Santín, M., Gómez-Muñoz, M. T., Solano-Aguilar, G., Fayer, R. Development of a new PCR protocol to detect and subtype Blastocystis spp. from humans and animals. Parasitol Res. 109 (1), 205-212 (2011).
  13. Bouwknegt, M., et al. Prioritisation of food-borne parasites in Europe, 2016. Euro Surveill. 23 (9), 17(2018).
  14. Xiao, L., Fayer, R. Molecular characterisation of species and genotypes of Cryptosporidium and Giardia and assessment of zoonotic transmission. Int J Parasitol. 38 (11), 1239-1255 (2008).
  15. Cacciò, S. M., Beck, R., Lalle, M., Marinculic, A., Pozio, E. Multilocus genotyping of Giardia duodenalis reveals striking differences between assemblages A and B. Int J Parasitol. 38 (13), 1523-1531 (2008).
  16. Wawrzyniak, I., et al. Blastocystis, an unrecognized parasite: an overview of pathogenesis and diagnosis. Ther Adv Infect Dis. 1 (5), 167-178 (2013).
  17. Honigsbaum, M. Disease X and other unknowns. Lancet. 393 (10180), 1496-1497 (2019).
  18. A scientific framework for epidemic and pandemic research preparedness. , WHO. At https://cdn.who.int/media/docs/default-source/consultation-rdb/prioritization-pathogens-v6final.pdf?sfvrsn=c98effa7_7&download=true (2024).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

PCR DetectionZoonotic ParasitesIntestinal ParasitesMolecular DetectionCryptosporidium DetectionEnterocytozoon BieneusiBlastocystis DetectionGiardia DetectionSanger SequencingOne Health

Related Articles