Эта процедура демонстрирует поперечный транспорт коры большеберцовой кости у крыс, позволяя визуализировать и анализировать реваскуляризацию при ишемии конечностей.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Модель поперечного транспорта большеберцовой коры у крыс для лечения ишемии нижней конечности
* These authors contributed equally
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Поперечный транспорт коры большеберцовой кости (TTT) — это новая хирургическая техника, используемая для стимулирования реваскуляризации ишемических нижних конечностей. В этом видео демонстрируется воспроизводимая модель TTT у крыс, подробно описывающая хирургическое создание кортикального костного фрагмента, протокол транспорта и послеоперационные оценки. Процедура позволяет контролируемо транспортировать фрагмент кости вверх и вниз для стимуляции ангиогенных реакций. Репрезентативные рентгеновские снимки, полученные на 1, 7 и 12 дни после операции, а также микрососудистая перфузионная визуализация, проведённая на 19-й день после эвтаназии, показывают чистое движение костных фрагментов и улучшение перфузии конечностей после ТТТ.
Эта модель предоставляет практическую и воспроизводимую платформу для изучения молекулярных механизмов, лежащих в основе ангиогенеза, индуцированного ТТТ, и оценки потенциальных терапевтических стратегий ишемических заболеваний. Для построения этой модели мы смоделировали клиническую процедуру TTT у крыс Спрага-Доули, включающую три основных хирургических этапа: перевязку поверхностной бедренной артерии, создание и мобилизацию фрагмента корковой кости, а также применение индивидуального внешнего фиксатора. В течение 12 дней осколок постепенно транспортировался вперёд, затем назад. Перфузионная визуализация подтвердила усиление васкуляризации ишемической конечности после завершения транспортного цикла. В целом, эта стандартизированная модель крыс близко имитирует клинические процедуры TTT и предлагает ценную экспериментальную систему для изучения механотрансдукции, ангиогенеза и сосудистой регенерации при ишемических заболеваниях конечностей.
Введение
Ишемические заболевания нижних конечностей, такие как облитерированный артериоз (ASO), тромбоангиит облитеранс (TAO) и диабетическая стопа (DF), характеризуются ограничением кровотока к нижнимконечностям 1,2. На ранних стадиях пациенты обычно сталкиваются с периодическим клаудикацией и болью в покое. По мере прогрессирования заболевания продолжительная ишемия может привести к некрозу тканей, инфекциям и, в тяжёлых случаях, ампутацииконечности 1. Современные стандартные методы лечения — включая фармакологическую терапию, эндоваскулярные вмешательства и открытые хирургические процедуры — часто дают ограниченную эффективность, особенно на поздних стадиях заболевания3.
Поперечный транспорт коры большеберцовой кости (TTT) — это инновационная терапевтическая стратегия для лечения различных ишемических заболеваний нижнихконечностей 4. Основанная на методе Илизарова и «правиле напряжения-напряжения»5,6, эта техника предполагает создание подвижного фрагмента кортикального лоскута кости в большеберцовой кости посредством остеотомии. Затем применяется постоянная, медленная и контролируемая сила отвлечения, стимулирующая регенерацию костей, кровеносных сосудов и окружающих мягких тканей. Этот регенеративный процесс способствует восстановлению микроциркуляции и помогает восстановить баланс кислорода в поражённой конечности. В конечном итоге ТТТ приводит к улучшению кровопрохождения и функциональному восстановлению ишемическихтканей 7.
Традиционные методы сосудистой реконструкции при ишемии нижних конечностей могут восстановить кровоток в крупных артериях икры, но часто неэффективны для реваскуляризации мелких артерий стопы или стимулирования восстановления и регенерации повреждённых микрососудов, ограничивая их способность полностью разрешатьишемию 8. TTT постоянно оказывает тягу к кости и окружающим мягким тканям, тем самым вызывая устойчивое высвобождение хемотаксических факторов ицитокинов 9. Эти хемотаксические факторы регулируют различные функции стволовых клеток и при ишемических условиях обильно выделяются в кровообращение. Они активно привлекают эндогенные стволовые клетки к местам повреждения, тем самым облегчая сосудистую регенерацию и регенерацию без необходимости прямой трансплантации стволовых клеток. Благодаря этим преимуществам TTT стал перспективной терапевтической стратегией при ишемии нижних конечностей и всё чаще применяется для лечения различных ишемических состояний, поражающих нижниеконечности 7,9,10.
Хотя кролики и собаки часто используются в фундаментальных исследованиях TTT, отсутствие подходящих аналитических инструментов для этих видов ограничивает механистические исследования. В отличие от этого, модель TTT крыс обеспечивает большую совместимость с доступными молекулярными и визуализационными методами, сохраняя при этом практичность и меньшую стоимость, что делает её более доступной и воспроизводимой платформой для механистических исследований. Однако на сегодняшний день ни одно исследование систематически не описывало или оценивало эффективность TTT в модели ишемии нижних конечностей у крыс.
Модель TTT у крыс требует усовершенствованных микрохирургических навыков из-за небольшого размера большеберцовой кости и тонкой коры, а диапазон отвлечения ограничен толщиной коры. Эти практические ограничения следует учитывать при оценке пригодности модели для конкретных исследовательских сред.
В этом исследовании мы разработали специфическую для крыс модель TTT, воспроизведя основную структуру и операционные принципы клинического поперечного транспортного аппарата большеберцовой кости. Процедура была усовершенствована на основе клинически валидированных протоколов для обеспечения осуществимости и стабильности у мелких животных. Наша цель — создать и подтвердить стандартизированную и воспроизводимую модель TTT у крыс, подходящую для изучения ангиогенеза и механотрансдукции при ишемическом заболевании конечностей.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Все эксперименты на животных были одобрены Комитетом по этике животных Первой аффилированной больницы Гуансийского медицинского университета (утвержден No 2025-E0642). Самцы крыс Спраг-Доули (300-350 г) содержались в Центре исследований животных Гуанси медицинского университета в стандартизированных условиях. Крысам предоставляли нормальной едой и чистой питьевой водой ad libitum, а также поддерживали по 12-часовому искусственному циклу света и темноты. Животноводческое хозяйство содержалось при контролируемой температуре 20-26 °C с относительной влажностью 40%-70%. Все хирургические инструменты были тщательно стерилизованы перед использованием. Подробная информация обо всех реагентах и материалах, использованных в данном исследовании, приведена в таблице 1.
Эвтаназия проводилась путём внутрибрюшинной инъекции передозировки пентобарбитала натрия. Смерть была подтверждена постоянным прекращением сердцебиения и дыхания, расширением зрачков и отсутствием реакции на вредные стимулы. Все процедуры проводились обученным персоналом для минимизации стресса животных, а протокол эвтаназии был предварительно рассмотрен и одобрен Институциональным комитетом по уходу и использованию животных.
1. Внешний фиксатор для TTT
- Используйте уменьшенную, специально разработанную версию клинического внешнего фиксатора поперечного транспорта коры большеберцовой кости (TTT-EF), состоящую из блока для тяги костных фрагментов и внешней фиксационной системы.
- Обеспечить вертикальную мобилизацию обоих компонентов за счёт встроенного механизма винтовой резьбы (рисунок 1).
- Просверлите по два сквозных отверстия с каждой стороны от сечений как тягового блока, так и фиксационной рамы, чтобы позволить вставить провода Киршнера.
- Провставьте провода Киршнера через назначенные отверстия и закрепите их сбоку шестиугольными винтами для стабилизации.
- Соедините тяговую компоненту TTT-EF с костным фрагментом с помощью проводов Киршнера толщиной 0,8 мм.
- Закрепить фиксационный компонент к проксимальному и дистальному концам большеберцовой кости с помощью проводов Киршнера толщиной 1,0 мм.
2. Хирургическое вмешательство
- Проведите процедуру TTT на 8-недельных самцах крыс Sprague-Dawley (SD). Анестезия крыс с помощью внутрибрюшинной инъекции 0,35 мг/кг пентобарбитала натрия и 0,3 мг/кг хлоралгирата.
- Оцените эффект анестетика, проверив рефлекс отмены педалей и роговицу. Постоянно следите за жизненными показателями и глубиной анестезии на протяжении всей процедуры. Перед операцией нанесите глазную мазь на глаза крысы для защиты роговицы, следуя Рекомендациям по использованию лабораторных животных.
- Побрить область операции и ввести 0,5% лидокаина, чтобы минимизировать послеоперационную боль.
- Сделайте разрез кожи диаметром 10 мм в правой паховой области с помощью скальпеля No11.
- Грубо вскрыть фасцию, чтобы обнажить поверхностную бедренную артерию.
- Изолировать артерию между бедренным нервом и поверхностной бедренной веной с помощью офтальмологических щипцов. Перевязывайте и пересечьте оба конца артерии.
- Зашивайте разрез с помощью впитывающегося шва 4-0.
- Сделайте вертикальный разрез 15 мм на верхней верхней медиальной кости с помощью скальпеля No11.
- Аккуратно разделяйте подкожную ткань и подлежащие мышцы, чтобы избежать повреждения периостальной области. Аккуратно вскрытие мягких тканей, чтобы полностью обнажить медиальную большеберцовую поверхность.
- Обведите область костного фрагмента (8 мм × 4 мм) на медиальной большеберцовой поверхности хирургическим лезвием. Сверлите плотно расположенные перфорации вдоль отмеченной границы с помощью сверла диаметром 0,6 мм. Создайте фрагмент окна кости (8 мм × 4 мм) на верхней медиальной большеберцовой кости.
- Имплантируйте две проволоки Киршнера диаметром 0,8 мм в костный фрагмент, расположенные на расстоянии 0,5 мм друг от друга, для облегчения транспортировки. Подключите провода Киршнера к TTT-EF и закрепите их.
- Вставьте по две проволоки Киршнера диаметром 1,0 мм по обе стороны фрагмента, проникая в заднюю кору большеберцовой кости.
- Соберите и установите TTT-EF.
- Проводите остеотомию по отмеченным линиям с помощью офтальмологических ножниц.
- Аккуратно поднимите костный фрагмент для обеспечения вертикальной подвижности, избегая повреждений костного мозга.
- Промывайте место операции 10% повидон-йода, затем стерильным физиологическим раствором.
- Зашивайте разрез слоями с помощью впитывающегося шва 4-0.
- Вводите бупренорфин (0,05 мг/кг) подкожно сразу после операции. Продолжайте принимать дозу каждые 12 часов до 3 дней для эффективного обезболивания.
3. Послеоперационный мониторинг
- Внимательно следите за животными после операции, чтобы обеспечить правильное восстановление и выявить возможные осложнения на ранней стадии. Осматривайте животных каждые 6-8 часов в первые 48 часов после операции. Оцените общую активность, осанку, поведение при уходе, потребление пищи и воды, а также состояние хирургического разреза.
- Проводите мониторинг как минимум один раз в день с третьего дня после операции и до фаз отвлечения и консолидации. Подтвердите достаточное восстановление, проверив нормальную ходьбу, стабильный вес тела, регулярное потребление пищи и воды, а также отсутствие выделений из раны, чрезмерного отёка или поведенческих признаков боли.
- Продолжайте обезболивание по мере необходимости в соответствии с институциональными рекомендациями.
- Лечите рановые инфекции (например, эритему, отёк, гнойные выделения) с помощью местного ухода за ранами и системных антибиотиков, следуя рекомендациям ветеринара.
- Исправьте любое ослабление или смещение внешнего фиксатора немедленно под кратковременным наркозом, чтобы сохранить выравнивание и обеспечить точное отвлечение.
- Оперативно оценивайте и контролируйте возможные осложнения. Оценивайте животных с серьёзными осложнениями, влияющими на подвижность, кормление или заживление ран, в консультации с ветеринарным персоналом.
- Усыпить животных гуманно, если они соответствуют заранее определённым гуманным критериям конечной цели.
4. Протокол переноса костных фрагментов
- Используйте внешнего фиксатора поперечного транспорта большеберцовой коры (TTT-EF) для послеоперационного транспорта костных фрагментов.
- Назначьте первый день после операции как период задержки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Не манипулируйте костным фрагментом в этот период. - Запустите фазу транспортировки вверх на второй день. Продвигайте костный фрагмент со скоростью 0,5 мм каждые 12 часов в течение 5 последовательных дней (2-й день — 6-й день). Приостановите процесс транспортировки на 7-й день, чтобы обеспечить стабилизацию.
- Начните фазу транспортировки вниз на 8-й день.
- Втягивайте костный фрагмент с той же скоростью — 0,5 мм каждые 12 часов в течение 5 дней (день 8 — день 12). Убедитесь, что костный фрагмент вернулся в исходное положение к концу 12-го дня.
- Продолжайте двухдневной фазу консолидации (13-14 дней), без дальнейших транспортировок.
- Удалите внешний фиксатор в конце фазы консолидации.
ПРИМЕЧАНИЕ: См. рисунок 2 для визуальной хронологии процедуры транспортировки TTT и графика оценки.
5. Оценка
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте методы визуализации для оценки положения костного фрагмента и восстановления кровотока.
- Проведите рентгеновскую съёмку нижних конечностей на 1, 7 и 12 дня, чтобы отслеживать прогрессирование и окончательное положение транспортируемого фрагмента кости.
- Анестезиируйте крыс в определённые моменты визуализации с использованием 2,0% изофлурана в кислороде.
- Каждую крысу поместите на платформу для визуализации с поддержанием температуры и обогревающую подушечку, чтобы предотвратить гипотермию во время процедуры.
- Контролируйте глубину анестезии, оценивая частоту дыхания и педальный рефлекс, чтобы обеспечить стабильную иммобилизацию.
- Расположить конечности и внешний фиксатор в стандартизированном положении по всем животным, чтобы минимизировать вариабельность рентгеновского срабатывания.
- Получите рентгеновские снимки для подтверждения смещения и перестановки костного фрагмента.
- Проведите сосудистую перфузионную визуализацию на 19-й день после операции для оценки микроваскулярной перфузии в нижней конечности.
- Эвтаназируйте крыс и пропустите контрастное вещество через бедренную артерию, чтобы визуализировать сосудистую систему.
- Поместите эвтаназированных крыс в стандартизированное положение на спине для стабильной установки визуализации.
- Обеспечить полное заполнение сосудистых органов, проникая контрастным веществом через бедренную артерию при устойчивой комнатной температуре.
- Проведите сосудистую визуализацию для оценки архитектуры и перфузии микроваскулярной системы. Убедитесь, что все образцы согласованы с одинаковой ориентацией конечностей и фиксатором, чтобы обеспечить воспроизводимость во время сеансов визуализации.
- Используйте полученные изображения для оценки восстановления кровотока и сосудистой архитектуры в нижних конечностях.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Рисунок 3 иллюстрирует процедуру построения модели животных с ишемией нижней конечности, обработанной с помощью TTT. В наших руках процедура показала успех хирургического вмешательства примерно на 90%. Ограниченное количество отказов в основном объяснялось техническими проблемами, такими как ослабление внешнего фиксатора или внутриоперативный перелом костного фрагмента, что делало последующее отвлечение невозможным. Модель была создана путём обнажения и перев...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Все процедуры, связанные с анестезией и хирургическим вмешательством, проводились с тщательным вниманием к безопасности животных и институциональным рекомендациям по уходу за ними. Глубина анестезии была подтверждена до разреза с помощью теста на отмену педалей или теста на роговицу, и регулярно контролировалась на протяжении всей процедуры. Для предотвращения гипотермии была обеспечена адекватная термическая поддержка (например, грелка), а также нанесена офтальмологическая мазь для защи...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
У авторов нет конкурирующих интересов, которые можно было бы заявить.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Микропоперечный ретрактор | Тяньцзинь Синьчжун Медицинская Оборудование Ко., Лтд | A61B17/66 | Проведите тракцию костного фрагмента |
| Малый ортопедический дрель | Yancheng Ruiao Technology Co. LTD | RA-II | Для остеотомии сверления большеберцовой кости |
| 0,6 мм сверло из нержавеющей стали | Changzhou Borche Medical Equipment Co., Ltd | - | Для остеотомии сверления большеберцовой кости |
| Проволока Киршнера с резьбой 0,8 мм | Changzhou Borche Medical Equipment Co., Ltd | - | Для крепления костных лоскутов и ретрактора |
| Проволока Киршнера с резьбой 1,0 мм | Changzhou Borche Medical Equipment Co., Ltd | - | Для фиксации ретрактора |
| Пентобарбитал натрий | Shanghai Pharmaceuticals Holding Co., Ltd | - | Для анестезии животных |
| Шестистеночный ключ | Changzhou Borche Medical Equipment Co., Ltd | - | Для крепления винтов |
| Бупренорфин | Shanghai Pharmaceuticals Holding Co., Ltd | Для анальгезии животных | |
| MICROFIL | Flow Tech, Inc Co., Ltd | Ангиография животных | |
| Изофлуран | Hebei Yipin Pharmaceutical Co., Ltd. | Для индукции и поддержания ингаляционной анестезии | |
| Гидрохлорид лидокаина (0,5%) | Hebei Yipin Pharmaceutical Co., Ltd. | Используется для локальной инфильтрации, чтобы уменьшить послеоперационную боль и минимизировать раздражение тканей во время хирургических процедур |
Ссылки
- Jones, D. W., Farber, A. Review of the global vascular guidelines on the management of chronic limb-threatening ischemia. JAMA Surg. 155 (2), 161(2020).
- Levin, S. R., Arinze, N., Siracuse, J. J. Lower extremity critical limb ischemia: a review of clinical features and management. Trends Cardiovasc Med. 30 (3), 125-130 (2020).
- Aboyans, V., Chastaingt, L. What LEADs to the under-treatment of patients with lower-extremity artery disease. Eur J Prev Cardiol. 30 (11), 1090-1091 (2023).
- Liu, Z., Xu, C., Yu, Y., Tu, D., Peng, Y., Zhang, B. Twenty years development of tibial cortex transverse transport surgery in PR China. Orthop Surg. 14 (6), 1034-1048 (2022).
- Ilizarov, G. A. The tension-stress effect on the genesis and growth of tissues: part II. The influence of the rate and frequency of distraction. Clin Orthop Relat Res. 239, 263-285 (1989).
- Ilizarov, G. A. The tension-stress effect on the genesis and growth of tissues: part I. The influence of stability of fixation and soft-tissue preservation. Clin Orthop Relat Res. 238, 249-281 (1989).
- Chen, Y., et al. Proximal tibial cortex transverse distraction facilitating healing and limb salvage in severe and recalcitrant diabetic foot ulcers. Clin Orthop Relat Res. 478 (4), 836-851 (2020).
- Beckman, J. A., Schneider, P. A., Conte, M. S. Advances in revascularization for peripheral artery disease: revascularization in PAD. Circ Res. 128 (12), 1885-1912 (2021).
- Zhu, Y. L., Qu, L., Ye, Z. M. Tibial cortex transverse distraction for primary lymphoedema in the lower limb: a case report. J Orthop Transl. 25, 25-27 (2020).
- Yang, Y., et al. Tibial cortex transverse transport accelerates wound healing via enhanced angiogenesis and immunomodulation. Bone Joint Res. 11 (4), 189-199 (2022).
- Hasanpour, M., Mitricheva, E., Logothetis, N., Noori, H. R. Intensive longitudinal characterization of multidimensional biobehavioral dynamics in laboratory rats. Cell Rep. 35 (2), 108987(2021).
- Modlinska, K., Pisula, W. The Norway rat, from an obnoxious pest to a laboratory pet. eLife. 9, e50651(2020).
- Su, H., et al. Finite element analysis safety of tibial cortex transverse transport. Bone Joint Res. 14 (4), 281-291 (2025).
- Zhen, P., et al. Finite element analysis of biomechanical effects in rat tibia during tibial cortex transverse transport. Front Bioeng Biotechnol. 13, 1670040(2025).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
