Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Продвинутая модель ко-культуры барьера крови и спинномозговой жидкости человека для отдельного анализа эпителия и эндотела хомероидного сплетения

430 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/69275

⸱

28 ноября 2025 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Pediatric Infectious Diseases, Department of Pediatrics, Medical Faculty Mannheim, Heidelberg University, 2European Center for Angioscience, Medical Faculty Mannheim, Heidelberg University, 3Department of Medical Statistics, Biomathematics and Information Processing, Medical Faculty Mannheim, Heidelberg University, 4Laboratory of Clinical Regenerative Medicine, Department of Neurosurgery, Faculty of Medicine, University of Tsukuba

В этой статье

Краткое содержание

Была установлена кокультура человеческих эпителиальных и эндотелиальных клеток хореоидного сплетения для создания продвинутой in vitro модели барьера крови и спинномозговой жидкости. Мы описываем отдельную изоляцию эпителия и эндотела для последующего приготовления РНК и транскрипционного анализа в отдельных условиях.

Аннотация

Высокоперфузионное хореоидальное сплетение (КП), расположенное в желудочковой системе мозга, состоит из нескольких структурных компонентов, включая кубоидный эпителий и фенестрированный эндотелий, и является местом расположения барьера кровоспинномозговой жидкости (BCSFB). Для исследования CP in vitro возможны различные схемы клеточных культур. Наша лаборатория создала инвертированную модель фильтра с сильной барьерной функцией, основанную на клетках эпителиальной CP папилломы человека (HIBCPP), которая широко используется. Недавно нам удалось сформировать стабильную бессмертную линию эндотелиальной клеточной линии человеческого CP (iHCPEnC). Объединив обе клеточные линии, мы собрали продвинутую функциональную модель двухклеточного типа, которая развила более высокую барьерную функцию по сравнению с только клетками HIBCPP. Поскольку эта модель представляет как эпителий CP, так и эндотелий, она позволяет исследовать взаимодействие между двумя типами клеток при определённых условиях, таких как инфекция, воспаление или другие. В этом протоколе мы описываем методы создания этой двухклеточной модели с последующим разделением эпителиальных и эндотелиальных клеток для транскрипционного анализа. Мы описываем ПЦР-праймеры, специфичные для эпителия и эндотелия, которые служат для выявления возможного перекрёстного загрязнения между двумя типами клеток. Для изучения возможного влияния эндотелия CP на эпителий в этой модели при воспалительных условиях были проанализированы уровни экспрессии выбранных генов в контексте лечения липополисахаридами (LPS) в клеточной фракции HIBCPP. Продвинутая модель CP in vitro и возможность отдельного анализа эпителиальных и эндотелиальных ответов представляют значительный интерес для исследований клеточных процессов, связанных с биологическими и патологическими функциями CP.

Введение

Хореоидальное сплетение (КП) — это сильно васкуляризованный конгломерат различных популяций клеток, расположенных во всех четырёх желудочках мозга. Среди прочих функций он служит физиологическим барьером — так называемым барьером крови и спинномозговой жидкости (BCSFB) между центральной нервной системой (ЦНС) и кровью, препятствуя мозгу, например, циркуляции инфекционных веществ в крови. CP состоит из различных типов клеток, включая поляризованные эпителиальные клетки, содержащие плотные и адгезионные соединения, а также десмосомы, расположенные на базальной мембране. Поверхность эпителиальных клеток увеличивается за счёт наличия микроворсинок на поверхности света. Фенестрированные эндотелиальные капилляры, окружённые соединительной тканью, такой как фибробласты и иммунные клетки, расположены под базальной мембраной 1,2,3. Недавно было сообщено, что эндотелиальные клетки CP способны улучшать целостность BCSFB вместе с эпителиальными клетками и, следовательно, играть роль в защите мозга во время воспалительныхпроцессов 4,5.

На сегодняшний день инвертированная культура клеток человеческой эпителиальной CP папилломы (HIBCPP) является наиболее часто используемой in vitro моделью для имитации человеческого BCSFB с высоким показателем трансэпителиального электрического сопротивления (TEER) и сильной барьерной функцией. Чтобы лучше понять функции клеток и одновременно избежать экспериментов на животных, важно извлекать как можно больше информации из экспериментов in vitro. Недавно в нашей лаборатории была создана первая стабильная увековечённая человеческая линейка эндотелиальной клеток CP (iHCPEnC) 6,7. С помощью клеток HIBCPP и iHCPEnC мы можем собрать ко-культурную модель in vitro, имитирующую BCSFB более продвинутойспособностью 8. Используя эту двухклеточную модель, мы могли продемонстрировать, что совместное выращивание клеток HIBCPP и iHCPEnC приводит к увеличению значений TEER по сравнению с клетками HIBCPP одними по отдельности. Важно отметить, что только iHCPEnC не развиваетTEER 7,8. Отдельная подготовка и последующий анализ двух типов клеток, используемых в этой модели, позволили бы нам исследовать их взаимодействие в здоровых и больных условиях.

Здесь мы описываем два разных подхода для достижения этой цели. Основой в том, что в обоих случаях подход основан на инвертированной модели клеточной культуры клеток HIBCPP (см. рисунок 1). Метод 1, метод «прямой совместной культуры», включает обе ячейки на одной вставке фильтра. Клетки HIBCPP выращиваются инвертированным образом перед посевом iHCPEnC постандартному порядку 7,8. Метод 2 — культура «мембрана в вставке» — здесь мы добавили отдельную мембрану с такими же свойствами, как и в фильтрующих вставках. Эта дополнительная мембрана помещается в фильтрующую вставку, где клетки HIBCPP уже растут в инвертированной культуре. iHCPEnC посеиваются на дополнительную мембрану в стандартном виде культуры.

Последующее разделение клеток для анализа РНК позволяет получить представление о транскрипционной реакции CP эпителия и эндотела при определённых условиях. Мы описываем ПЦР-праймеры, специфичные для клеток HIBCPP и iHCPEnC, которые позволяют подтвердить успешное и чистое разделение обоих типов клеток. После лечения липополисахаридом (ЛПС) мы используем описанные модели для изучения различных ответов эпителия CP в присутствии эндотела при воспалительных условиях.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Ячейки HIBCPP

ПРИМЕЧАНИЕ: Далее мы описываем культивирование и поддержание клеток HIBCPP, а также подготовку инвертированных клеточных фильтрующих вставок с использованием клеток HIBCPP. Этот протокол предназначен для роста клеток HIBCPP на 12-луночных фильтрующих вставках для клеточной культуры. Ранее публиковался подробный протокол с сопроводительным видео для культивирования клеток HIBCPP на фильтрах с 24 лунками9.

  1. Взятие клеток HIBCPP в культуру
    1. Разморозить флакон клеток HIBCPP при комнатной температуре (RT).
    2. Восстановите содержимое флакона с помощью 10 мл среды DMEM/HAMS-F12, содержащей 10% сыворотки плода телята (FCS) и 5 мкг инсулина/мл предварительно нагретой среды (10% среды HIBCPP).
    3. Поместите вновь суспензированные клетки HIBCPP в колбу для культуры T75 и инкубировать 24 часа при 37 °C с 5%CO2.
    4. Измените среду колбы, чтобы удалить DMSO через 24 часа после засева клеток.
    5. Культивируйте клетки до 90% слияния, этот этап занимает около 2 недель. Меняйте среду два раза в неделю.
  2. Непрерывная культура клеток HIBCPP
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для непрерывной культуры разделите клетки HIBCPP в соотношении 1:3 на новые колбы для культуры T75.
    1. Удалите посевную среду из колбы T75.
    2. Промыйте клетки один раз 10 мл PBS.
    3. Удалите PBS.
    4. Отдельте клетки HIBCPP с помощью 3 мл трипсина-ЭДТА с объёмом 3 мл. Этот этап занимает около 10-20 минут при 37 °C. Пока покрутите колбу, чтобы полностью покрыть клеточный слой трипсином-EDTA.
    5. Добавьте 7 мл среды HIBCPP и центрифугу при 50 х г на 10 минут при RT.
    6. Суспензировать клеточную гранулу в 30 мл среды 10% HIBCPP и распределить на 3 новых колбы T75.
    7. Культивировать клетки до 90% совпадения; Клетки достигнут слияния примерно через неделю.
    8. Меняйте среду два раза в неделю.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки HIBCPP не ингибируют рост; Поэтому колба станет слияющейся, и клетки будут продолжать расти и образовывать многослойные слои.
  3. Посев клеток HIBCPP в инвертированной культуре
    1. Удалите посевную среду из колбы T75.
    2. Промыйте клетки один раз 10 мл PBS.
    3. Удалите PBS.
    4. Отдельте клетки HIBCPP с помощью 3 мл трипсина-ЭДТА с объёмом 3 мл. Этот этап занимает около 10-20 минут при 37 °C. Пока покрутите колбу, чтобы полностью покрыть клеточный слой трипсином-EDTA.
    5. Тем временем подготовьте фильтрующие вставки. С помощью щипцов превратите 12-ядровые фильтрующие вставки в перевёрнутую форму в 6-ячечную клеточную культурную пластину и заполните их предварительно нагретой 10% HIBCPP средой. Предварительно смочите мембрану каплей среды поверх каждого фильтратора.
    6. Суспендировать трипсинизированные клетки с 17 мл среды 10% HIBCPP.
    7. Центрифугировать при 50 г в течение 10 минут при RT и отрегулировать концентрацию HIBCPP до 1 × 106 клеток/мл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки HIBCPP склонны образовывать небольшие агломераты. Не обязательно полностью растворять их перед посевом на фильтрующие вставки. Убедитесь, что 90% клеток одиночные.
    8. Семена клеток HIBCPP в инвертированной форме на фильтрующих вставках с 12 лунками и плотностью 4 × 105 клеток на вставку.
    9. Подождите, пока мембрана не поглотит суспензия клетки. Закройте крышку пластины с 6-колодцевой клеточной культурой.
    10. Положите пластины с перевёрнутыми вставками в инкубатор.
    11. Через 24 часа после посева с помощью щипцев переведите вставки в правильную ориентацию в новую 12-луночную клеточную культивационную пластину. Наложите 2 мл среды 10% HIBCPP в нижний отсек и 1 мл в верхний отсек.
    12. Оставьте клетки на 5–6 дней без изменения среды, начните определение TEER и установку совместной культуры.

2. Определение TEER

ПРИМЕЧАНИЕ: Определение значений TEER проводится с помощью электрода MilliCell ERS2 и электрода для еды. Для расчёта требуется пустое измерение из вставок клеточного фильтра в среде без клеток (Ом-бланк).

  1. Храните электрод для палочки сухим. Перед началом измерения поместите электрод в 80% этанол на 10 минут для дезинфекции.
  2. После этого прополосните электрод PBS.
  3. Начало измерения: Вставьте длинный конец электрода в яму, а короткий — в фильтр, содержащий засеянные элементы.
  4. Запишите значение Ом вставки фильтра с 12-яческим фильтром (образец Ома).
  5. Вычислите TEER следующим образом: Ом·см2 = (Ом-образец -Ом-пусто) × 1,1 см2.
  6. После завершения измерения промывайте электрод 80% этанолом, а затем храните в сухом состоянии.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Между измерениями различных экспериментальных условий или измерениями различных клеточных линий электрод для еды необходимо продезинфекцировать и промыть PBS для предотвращения перекрёстного загрязнения.

3. iHCPEnC

  1. Внедрение iHCPEnC в культуру
    1. Разморозьте флакон iHCPEnC в RT.
    2. Суспензируйте содержимое флакона с предварительно нагретым 5 мл Complete Classic Endothelial Medium (iHCPEnC).
    3. Центрифуга при 500 г в течение 5 минут на RT.
    4. Тем временем покрыть колбу с культурой T25 2 мл коэффициента прикрепления примерно на 1 минуту. Аспирируйте фактор прикрепления и оставьте колбу до засея iHCPEnC.
    5. Суспензируйте клеточную гранулу с 5 мл среды iHCPEnC и поместите её в подготовленную колбу для культуры T25.
    6. Инкубировать при 37 °C с 5%CO2 в течение недели без изменения среды.
  2. Непрерывная культура iHCPEnC
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для непрерывной культуры разделите iHCPEnC 1:4 на новые колбы для культуры T25.
    1. Удалите медиум iHCPEnC и промыйте клетки один раз 3 мл PBS. Будьте осторожны, чтобы не отслоить клетки.
    2. Аспирируйте PBS.
    3. Отдельте конфлюент iHCPEnC с помощью 1 мл трипсина-ЭДТА. Этот этап занимает около 3-5 минут на RT.
    4. Суспензировать клетки в 5 мл среды iHCPEnC.
    5. Центрифуга при 500 г в течение 5 минут на RT.
    6. Тем временем нанесите покрытие на 4 новых колбы T25 с коэффициентом прикрепления по 2 мл на каждую.
    7. Суспензировать клеточную гранулу с помощью 20 мл среды iHCPEnC.
    8. Распределите 5 мл суспензии ячейки на каждую из 4 подготовленных колбок.
    9. Опять же, выращивайте клетки в течение недели без изменения среды. Они достигнут слияния через неделю.
      ПРИМЕЧАНИЕ: iHCPEnC клетки ингибируют рост; Поэтому колба становится слияющейся, а оставшиеся ячейки будут плавать.

4. Подготовка к экспериментам по совместной культуре

  1. Метод 1: Для «прямой совместной культуры» (культивирование эпителия и эндотелиальных клеток по обе стороны одной вставки) не готовьте дополнительных материалов.
  2. Метод 2: Для метода «мембрана вставить» выполните следующие шаги:
    1. Выделить мембраны размером с вставку клеточной культуры с 12 лунок с помощью перфорирующего железа No11 (диаметром 11 мм) из отдельной мембраны Din-A-4.
    2. Вставьте выбитые мембраны в чашку Петри.
    3. Стерилизуйте пробитые мембраны в течение 60 минут с помощью ультрафиолетового (УФ) света (UV-C, 254 нм).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Мембраны размером с вставки клеточных культур с 12 лунками можно заранее подготовить и хранить в стерильных условиях.

5. Создание совместной культуры

ПРИМЕЧАНИЕ: На данном этапе клетки HIBCPP уже подготовлены к модели культуры с двумя клетками in vitro . Клетки HIBCPP выращивались в течение 5–6 дней (сравните шаги 1.3.8–1.3.12). Клетки HIBCPP должны начать развивать TEER (около 20 Ом·см2).

  1. Для обоих методов — Метод 1 («прямое совместное выращивание») и Метод 2 («мембрана в-вставку») — 10% среду HIBCPP заменяют на 1% HIBCPP среду. Для этого поместите 2 мл среды 1% HIBCPP в скважину 12-колодной клеточной культивной пластины.
  2. Опорожните инвертированную культуру с фильтром с помощью пипетки и щипца и поставьте фильтровую вставку в стандартное положение в подготовленную 12-колодцу.
  3. Для Метода 2 («мембрана в-вставка») подготовьте фильтрующие вставки следующим образом:
    1. Поместите пробиванную и стерилизированную мембрану в подготовленный фильтр на 12 лунок с клетками HIBCPP в инвертированной культуре с помощью щипцов.
  4. Поместите пластины для культивирования клеток обратно в инкубатор для трипсинизации iHCPEnC (описанного в шаге 6).

6. Посев и выращивание iHCPEnC в совместном выращивании

ПРИМЕЧАНИЕ: В следующем разделе описано установление совместной культуры клеток HIBCPP и iHCPEnC на 12-луночных фильтровых вставках. Подробный протокол совместного культивирования клеток HIBCPP и iHCPEnC на фильтрах с 24 лунками был описанранее 8. Перед отсоединением iHCPEnC рассчитайте, сколько клеток необходимо для проведения совместной культуры. Одна фляга с культурой T25 обеспечивает примерно 5 ×10 5 клеток.

  1. Удалите среду из колбы T25 с iHCPEnC.
  2. Промывайте iHCPEnC 3 мл PBS. Избегайте отделения клеток.
  3. Удалите PBS.
  4. Отдельте конфлюент iHCPEnC с помощью 1 мл трипсина-ЭДТА. Этот этап занимает около 3-5 минут на RT.
  5. Суспензировать клетки в колбе 5 мл/T25 с средой iHCPEnC.
  6. Посчитайте ячейки в камере Нойбауэра.
  7. Центрифуга при 500 × г в течение 5 минут на RT.
  8. Ресуспензировать клеточную гранулу до конечной концентрации 1 × 105 клеток/мл в среде iHCPEnC.
  9. Оба метода («прямая совместная культура»), и метод 2 («мембрана вставлена»): семена 700 мкл iHCPEnC (7x105 клеток) в фильтре на 12 ячей.
  10. Впервые контролировать значения TEER в совместной культуре и контролях (то есть только с клетками HIBCPP и iHCPEnC) впервые через 24 часа после посева iHCPEnC и далее ежедневно.

7. Лечение ЛПС

ПРИМЕЧАНИЕ: Ко-культуры должны иметь более высокие значения TEER по сравнению с HIBCPP только клеточными культурами (рекомендуемый коэффициент: 1,5 или выше).

  1. Измерять и записывать значения TEER вставок для клеточной культуры, установленных для экспериментов.
  2. Приготовьте мастер-смесь с 5 мкг/мл LPS в среде 1% HIBCPP.
  3. Подготовьте новые пластины с 12 колодцами, содержащие 2 мл 1% среды HIBCPP на каждую скважину.
  4. Опустошите вставки с помощью щипцов и пипетки.
  5. Положите вставки в подготовленные колодцы.
  6. Добавьте 1 мл мастер-микса LPS или 1% среды HIBCPP соответственно (отрицательный контроль).
  7. Инкубировать 4 часа при 37 °C.
  8. Измерьте и запишите значения TEER перед переходом к разделу 8.

8. Отдельное выделение РНК из клеток HIBCPP и iHCPEnC для последующего транскрипционного анализа

ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы получить две отдельные клеточные дроби и избежать перекрёстного загрязнения клеток, культивируемых в модели совместной культуры, клеточные фракции аккуратно соскребают отдельно с вставки. Выполняйте все этапы изоляции РНК для каждого фильтра без прерываний (вставки не должны исчерпаться).

  1. Промывайте фильтры один раз с помощью PBS. Для этой цели подготовьте 12-колодочные клеточные культивные пластины, содержащие 1,5 мл PBS/скважину.
  2. Опустошите фильтр клеточной культуры с помощью пипетки и щипцета. Поместите вставки в 12-ядровую клеточную культивационную пластину, заполненную PBS.
  3. Добавьте 1 мл PBS в вставки.
  4. Для подготовки клеток iHCPEnC и HIBCPP к Методу 1 («прямая совместная культура») выполните следующие шаги:
    1. Снимите PBS из вставки и поместите его в пустую и сухую 12-луночную клеточную культурную пластину.
    2. С помощью наконечника пипетки и пипета вверх и вниз 10-20 мкл PBS, iHCPEnC отделяются от вставки посредством соскребания.
    3. Поместите эту фракцию клетки в пробирку объёмом 1,5 мл, содержащую 350 мкл буфера лизиса РНК. Пипетки вверх и вниз, чтобы правильно смешать клетки с буфером лизиса РНК.
    4. После завершения сбора фракции iHCPEnC переверните вставку вверх ногами в крышку клеточной культурной пластины.
    5. Извлеките клетки HIBCPP с мембраны, как и iHCPEnC, и поместите их в подготовленную трубку объёмом 1,5 мл, содержащую 350 мкл RLT-β-меркаптоэтанола.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если для одного состояния готовят несколько совместных культур, возьмите 350 мкл буфера лизиса РНК на одну вставку и долю клетки. Отдельные подготовленные клеточные части одного конкретного состояния последовательно очищаются на одной колонке.
  5. Для подготовки клеток iHCPEnC и HIBCPP к Методу 2 («мембрана в-вставку») выполните следующие шаги:
    1. Вынимите дополнительную мембрану с помощью щипцов и поместите её в сухую крышку 12-луночной клеточной культивной пластины. Пипетка 100 мкл буфера лизиса РНК на мембране для лизиса iHCPEnC.
    2. Поместите этот лизат с 100 мкл в пробирку объёмом 1,5 мл, содержащую 250 мкл буфера лизиса РНК, и хорошо перемешайте.
    3. Снимите PBS из фильтрующей вставки и положите его вниз в крышку 12-луночной клеточной культивной пластины. Добавьте 100 мкл буфера лизиса РНК на мембрану вставки и лизируйте фракцию клеток HIBCPP.
    4. Поместите этот лизат с 100 мкл в пробирку объёмом 1,5 мл, содержащую 250 мкл буфера лизиса РНК.
  6. Проводите изоляцию РНК согласно протоколу производителя.
  7. Измерьте количество РНК с помощью спектрофотометра.
  8. Проведите обратную транскрипцию и qPCR-анализ образцов РНК, как описано производителем.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку кокультуры содержат меньше iHCPEnC по сравнению с клетками HIBCPP, для выделения достаточной РНК из iHCPEnC требуется несколько 12-луночных фильтрующих вставок, в зависимости от последующих анализов. РНК-лизаты отдельных фильтрующих вставок необходимо объединить. Обратная транскрипция и qPCR могут выполняться как описановыше 6.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

В этом протоколе мы описываем пошаговую генерацию двухклеточной модели человеческого ЦП, состоящей из эпителия (клеток HIBCPP) и эндотела (iHCPEnC) на вставках для фильтра клеточной культуры, как схематически показано на рисунке 1. В этой модельной системе клетки HIBCPP выращиваются в инвертированном виде на нижней стороне фильтра, тогда как iHCPEnC посеяются либо на верхней стороне фильтра вставки, либо на втором фильтре, размещённом поверх мембраны вставки...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Человеческий CP состоит из нескольких типов клеток, включая барьерообразующий эпителий и эндотелий расширеннойсосудистой системы 3. Хотя эндотелиальные клетки CP фенестрационированы, недавние исследования показали их вклад в функцию барьера при BCSFB 4,7. Для изучения сложных взаимодействий между эндотелием и эпителием в органах при КП необходимы современные модели in vitro, позволяющие анализиров...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
0,25% трипсин-ЭДТАLife Technologies 25200056
12-скважинная клеточная культивная пластина StarLabCC7682-7512
12 вставок для фильтров скважин (3 и микро; М-поры)Greiner Bio One665631
24-скважинная клеточная культивная пластина StarLabCC7672-7524
вставка фильтра с 24 скважинами  (0.4 и микро; М-поры)Greiner Bio One662641
Вставка фильтра с 24 скважинами (3 и микро; М-поры)Greiner Bio One662631
6-скважинная клеточная культивная пластина StarLabCC7682-7506
Набор для синтеза cDNA AffinityScript (синтез cDNA)Agilent600559
Фактор привязанностиСотовые системы4ZO-500Часть комплекта Complete Classic Endothelial Medium.
Brilliant II SYBR Green qPCR Master Mix (ПЦР в реальном времени)Agilent600828
Электрод для палочкиМиллипорMERSSTX01Этот продукт снят с производства.
Полная классическая эндотелиальная среда (iHCPEnC среда)Сотовые системы4ZO-500Набор, содержащий материал, добавки и фактор прикрепления для покрытия.
DMEM/F-12 (1:1) с фенолредом (10% средней HIBCPP)Термо Фишер31330-038
DMEM/F-12 (1:1) без фенолреда (1% HIBCPP среды)Термо Фишер11039-021
Фетальная сыворотка для телята (FCS) (1% и 10% средней HIBCPP)Термо Фишер10270-106
Инсулин (1% и 10% среды HIBCPP)SigmaI9278
Липополисахарид (LPS)SigmaL3024
MilliCell ERS2 МиллипорMERS00002Этот продукт снят с производства.
Нанодроп (спектрофотометр)Thermo ScientificND1000Этот продукт снят с производства.
Перфорирующее железо No 11Wü rth880223211
PBSLife Technologies 14190169
Инструмент для проектирования грунтовNCBIhttps://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/
Буквары SigmaVC00021
Qiagen RNeasy microЦягэн74004
RLT+b-ME (часть микронабора Qiagen Rneasy)Цягэн74004
Фляжка с культурой клеток T25Sarstedt AG & Рота KG83,39,10,002
Колба с культурой клеток T75Sarstedt AG & Рота KG83,39,11,002
TRAKETCH PET 3.0 cc (отдельная мембрана)СабеуSK4580
УФ-светКарл РотH469.1

Ссылки

  1. Damkier, H. H., Brown, P. D., Praetorius, J. Cerebrospinal fluid secretion by the choroid plexus. Physiol Rev. 93 (4), 1847-1892 (2013).
  2. Schwerk, C., Schroten, H. In vitro models of the choroid plexus and the blood-cerebrospinal fluid barrier: advances, applications, and perspectives. Hum Cell. 37 (5), 1235-1242 (2024).
  3. Ghersi-Egea, J. F., et al. Molecular anatomy and functions of the choroidal blood-cerebrospinal fluid barrier in health and disease. Acta Neuropathol. 135 (3), 337-361 (2018).
  4. Carloni, S., et al. Identification of a choroid plexus vascular barrier closing during intestinal inflammation. Science. 374 (6566), 439-448 (2021).
  5. Carloni, S., Rescigno, M. Unveiling the gut-brain axis:structural and functional analogies between the gut and the choroid plexus vascular and immune barriers. Semin Immunopathol. 44 (6), 869-882 (2022).
  6. Denzer, L., et al. Transcriptome and functional comparison of primary and immortalized endothelial cells of the human choroid plexus at the blood-cerebrospinal fluid barrier. Int J Mol Sci. 26 (4), 1779(2025).
  7. Muranyi, W., et al. Immortalized human choroid plexus endothelial cells enable an advanced endothelial-epithelial two-cell type in vitro model of the choroid plexus. iScience. 25 (6), 104383(2022).
  8. Herold, R., et al. Protocol for the setup and use of a human choroid plexus endothelial-epithelial two-cell-type in vitro model. STAR Protoc. 3 (4), 101816(2022).
  9. Dinner, S., et al. A choroid plexus epithelial cell-based model of the human blood-cerebrospinal fluid barrier to study bacterial infection from the basolateral side. J Vis Exp. (111), e54061(2016).
  10. Herold, R., et al. Capsule-dependent impact of MAPK signalling on host cell invasion and immune response during infection of the choroid plexus epithelium by Neisseria meningitidis. Fluids Barriers CNS. 18 (1), 53(2021).
  11. Bernd, A., et al. Characterization of efflux transport proteins of the human choroid plexus papilloma cell line HIBCPP, a functional in vitro model of the blood-cerebrospinal fluid barrier. Pharm Res. 32 (9), 2973-2982 (2015).
  12. Dabbagh, F., Schroten, H., Schwerk, C. In vitro models of the blood-cerebrospinal fluid barrier and their applications in the development and research of (neuro)pharmaceuticals. Pharmaceutics. 14 (8), 1729(2022).
  13. Lun, M. P., Monuki, E. S., Lehtinen, M. K. Development and functions of the choroid plexus-cerebrospinal fluid system. Nat Rev Neurosci. 16 (8), 445-457 (2015).
  14. Zhang, W. Y., Liu, Y., Zhang, H. Extracellular matrix: an important regulator of cell functions and skeletal muscle development. Cell Biosci. 11 (1), 65(2021).
  15. Clark, A. J., et al. Functional imaging in microfluidic chambers reveals sensory neuron sensitivity is differentially regulated between neuronal regions. Pain. 159 (7), 1413-1425 (2018).
  16. Kim, J., Koo, B. K., Knoblich, J. A. Human organoids: model systems for human biology and medicine. Nat Rev Mol Cell Biol. 21 (10), 571-584 (2020).
  17. Augustin, H. G., Koh, G. Y. Organotypic vasculature: from descriptive heterogeneity to functional pathophysiology. Science. 357 (6353), eaal2379(2017).
  18. Furtado, A., et al. Circadian rhythmicity of amyloid-beta-related molecules is disrupted in the choroid plexus of a female Alzheimer's disease mouse model. J Neurosci Res. 101 (4), 524-540 (2023).
  19. Borkowski, J. Neisseria meningitidis elicits a pro-inflammatory response involving IκBζ in a human blood-cerebrospinal fluid barrier model. J Neuroinflammation. 11, 163(2014).
  20. Wiatr, M., et al. Distinct migratory pattern of naive and effector T cells through the blood-CSF barrier following Echovirus 30 infection. J Neuroinflammation. 16 (1), 232(2019).
  21. Speidel, A., et al. Transmigration of Trypanosoma brucei across an in vitro blood-cerebrospinal fluid barrier. iScience. 25 (4), 104014(2022).
  22. Haas, J., et al. The choroid plexus is permissive for a preactivated antigen-experienced memory B-cell subset in multiple sclerosis. Front Immunol. 11, 618544(2020).
  23. Nishihara, H., et al. Human CD4+ T cell subsets differ in their abilities to cross endothelial and epithelial brain barriers in vitro. Fluids Barriers CNS. 17 (1), 3(2020).
  24. Erb, U., Schwerk, C., Schroten, H., Karremann, M. Review of functional in vitro models of the blood-cerebrospinal fluid barrier in leukaemia research. J Neurosci Methods. 329, 108478(2020).
  25. Ho, K. H., et al. Activation of Wnt/β-catenin signaling is critical for the tumorigenesis of choroid plexus. Neuro Oncol. 27 (1), 106-122 (2025).
  26. Wagenaars, F., et al. Characterization of thyroid hormone transport in a human choroid plexus papilloma cell line (HIBCPP) as an in vitro blood-cerebrospinal fluid barrier model. Mol Cell Endocrinol. 597, 112449(2025).
  27. Di Tommaso, N., Santopaolo, F., Gasbarrini, A., Ponziani, F. R. The gut-vascular barrier as a new protagonist in intestinal and extraintestinal diseases. Int J Mol Sci. 24 (2), 1470(2023).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Больше статей

Эндотелий сосудистого сплетения хориоидаклетки HIBCPPиммортализованные эндотелиальные клеткибарьерная функциямодель in vitroанализ экспрессии геновобработка липополисахаридом
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.