Молекулярный механизм гидроксильного сафлора желтого А при остеоартрозе коленного сустава через модуляцию аутофагии через ингибирование пути HIF-1α/BNIP3

Остеоартрит коленного сустава (КОА) является распространенным хроническим ортопедическим заболеванием и поражает людей среднего и пожилого возраста, значительно влияя на качество их жизни ^1,2. Несмотря на его широкое распространение, точная этиология и патофизиологические механизмы, лежащие в основе КОА, остаются до конца неизученными. Кроме того, как для профилактики, так и для лечебного лечения подчеркивается настоятельная необходимость раскрытия сложных патологических основ этого состояния. Одной из областей, представляющих новый интерес, является роль аутофагии в хрящевом гомеостазе, при этом накапливаются данные, свидетельствующие о том, что сниженная аутофагия в хрящевой ткани способствует ее дегенерации при KOA ^3,4.

Аутофагия, процесс клеточной деградации, жизненно важный для поддержания клеточного гомеостаза, имеет большое значение для поддержания и восстановления хрящей. В гипоксическом микроокружении, преобладающем в суставном хряще, индуцируемый гипоксией сигнальный путь фактора 1α (HIF-1α)/аденовируса E1B 19 кДа, взаимодействующего белка 3 (BNIP3), выступает в качестве ключевого регулятора аутофагии. Повышенная экспрессия HIF-1α наблюдалась у пациентов с КОА, что позволяет предположить, что нарушение регуляции этого пути может способствовать нарушению аутофагии и последующей дегенерации хряща ^5,6,7.

Иглоукалывание, прижигание, травы и массаж – четыре классических метода традиционной китайской медицины для лечения артрита коленного сустава. Современные методы лечения, такие как нестероидные противовоспалительные препараты, инъекции гиалуроновой кислоты и эндопротезирование, доказали свою эффективность, но также связаны с определенными побочными эффектами. Более того, не существует рекомендуемого рутинного лечения остеоартроза коленного сустава. Со временем, в качестве распространенной дополнительной терапии КОА, традиционная китайская медицина (ТКМ) разработала множество растительных средств, которые показывают многообещающие результаты в лечении КОА⁹. Среди них гидроксильный сафлор желтый А привлек значительное внимание благодаря своим противовоспалительным и аутофагически модулирующим свойствам^10,11. Тем не менее, точные механизмы, с помощью которых HSYA оказывает свое терапевтическое влияние на остеоартрит коленного сустава (КОА), особенно с точки зрения регуляции аутофагии через путь HIF-1α/BNIP3, остаются неясными. Таким образом, мы исследуем механизм терапевтических эффектов HSYA при КОА, уделяя особое внимание его влиянию на аутофагию хондроцитов и его взаимодействию с путем HIF-1α/BNIP3. Мы предполагаем, что HSYA смягчает остеоартрит коленного сустава за счет усиления аутофагии и пролиферации хондроцитов при одновременном подавлении апоптоза и воспаления посредством ингибирования пути HIF-1α/BNIP3.

Все процедуры, связанные с человеческими образцами, были одобрены Комитетом по этике Центральной народной больницы Чжаньцзяна (Approval No. KY-YS-2021-09). Перед сбором проб было получено письменное информированное согласие от всех участников. Используемые реагенты и оборудование приведены в Таблице материалов.

1. Пациенты и дизайн исследования

В исследование были включены тридцать пациентов с диагнозом остеоартрит коленного сустава (КОА) и перенесших тотальное эндопротезирование коленного сустава. Когорта включала 14 мужчин и 16 женщин в возрасте 52-75 лет (среднее ± SD: 64,3 ± 12,6 лет), все они соответствовали критериям¹² Американского колледжа ревматологов KOA. Пациенты были исключены, если они получали нестероидные противовоспалительные препараты или стероиды в течение 2 недель до операции или внутрисуставные инъекции в течение 1 месяца.

2. Первичная культура хондроцитов

Суставной хрящ был собран в стерильных условиях сразу после операции и помещен в холодный PBS. С помощью стерильных скальпелей хрящ разрезали на фрагменты ~1 мм³ на ледяной стеклянной пластине и перенесли в центрифужную пробирку объемом 50 мл, содержащую 10 мл 0,25% трипсина-ЭДТА. Пробирку инкубировали на водяной бане при температуре 37 °C при 80 об/мин в течение 30 минут и осторожно переворачивали каждые 5 минут для облегчения пищеварения. Надосадочную жидкость отсасывали, а тканевую гранулу промывали один раз PBS и центрифугировали при 200 × г в течение 5 минут. Затем гранулу ресуспендировали в 10 мл 0,02% коллагеназы II типа и расщепляли при 37 °С в течение 4 ч с встряхиванием. Суспензию пипетировали вверх и вниз каждые 30 минут для стимулирования диссоциации, пропускали через ситечко 70 мкм и снова центрифугировали при 200 × g в течение 5 минут. Полученную гранулу ресуспендировали в DMEM с добавлением 10% FBS, 100 ЕД/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина и засевали в колбы T25. Клетки инкубировали при 37 °С с 5%_СО2, среду заменяли каждые 2-3 дня, а для экспериментов использовали клетки из ходов 1-2. Экспериментальные группы включали нормальный контроль, холостую модель, HSYA (100 мкмоль/л), ингибитор HIF-1α YC-1 (10 мкмоль/л), рапамицин (10 нмоль/л), HSYA + YC-1 и HSYA + рапамицин.

3. siRNA-опосредованный HIF-lα, нокдаун BNIP3

Первичные хондроциты высевали в 6-луночные планшеты с концентрацией 2-5 ×^10-5 клеток/лунку и культивировали при 37 °С до достижения ими 30%-50% конфлюенции. Для каждой лунки 5 мкл 20 мкМ миРНК разводили в 250 мкл Opti-MEM, а 5 мкл реагента для трансфекции на основе липидов разводили отдельно в 250 мкл Opti-MEM. Два раствора аккуратно перемешивали и инкубировали при комнатной температуре в течение 15-20 мин с образованием комплексов. Культуральную среду заменяли на 1,5 мл свежего DMEM с 10% FBS, а комплекс миРНК-липид (500 μл) добавляли по каплям вдоль стенки лунки с легким закручиванием. Клетки инкубировали в течение 6 ч, среду заменяли на полную среду, и культивирование продолжали в течение 48-72 ч. Эффективность нокдауна была проверена с помощью qRT-PCR и вестерн-блоттинга перед дальнейшим лечением.

4. ИФА

Супернатанты клеточных культур собирали, центрифугировали при 200 × г в течение 5 мин и при необходимости разводили в соотношении 1:2 в буфере для анализа. Наборы ИФА для ИЛ-1β, ФНО-α и ИЛ-6 использовались в соответствии с протоколом производителя. Стандарты, бланки и образцы были пропущены в трех экземплярах. После реакции на подложку абсорбцию измеряли при длине волны 450 нм с помощью считывателя микропланшетов в течение 15 минут.

5. Анализ МТТ

Хондроциты засеивали в 96-луночные планшеты со скоростью 5000 клеток/лунку в 100 мкл полной среды и инкубировали в течение 0 ч, 24 ч, 48 ч или 72 ч. В каждый момент времени 20 мкл раствора MTT (5 мг/мл в PBS) добавляли непосредственно в каждую лунку, и планшеты инкубировали при 37 °C в течение 30 мин до тех пор, пока на дне лунок не становились видимыми фиолетовые кристаллы формазана. Надосадочную жидкость осторожно отсасывали без нарушения кристаллов, добавляли 150 мкл ДМСО в каждую лунку и помещали пластины на шейкер при 100 об/мин на 10 мин для полного растворения кристаллов. Поглощение измеряли на длине волны 490 нм с помощью микропланшетного ридера. Короткое время инкубации было выбрано таким образом, чтобы избежать насыщения сигнала в высокометаболически активных клетках.

6. Проточная цитометрия

Клетки собирали методом трипсинизации, центрифугировали при 200 × г в течение 5 мин и дважды промывали холодным PBS. Их ресуспендировали в 500 мкл связывающего буфера при ~1 × 10⁶ клеток/мл, а также добавляли 5 мкл аннексина V-FITC и 5 мкл PI. После бережного перемешивания клетки инкубировали в течение 15 мин при комнатной температуре в темноте. Образцы анализировали на проточном цитометре, при этом в каждом образце собиралось не менее 10 000 событий (возбуждение 488 нм, излучение FITC 530/30 нм, PI > 600 нм). Апоптотические клетки количественно оценивали с помощью стандартного программного обеспечения.

7. Вестерн-блоттинг

Клетки дважды промывали холодным PBS и лизировали в 200 мкл буфера RIPA, содержащего ингибиторы протеазы, на льду в течение 30 мин. Клетки соскабливали пластиковым скребком, пипетировали вверх и вниз для снижения вязкости и центрифугировали при 12 000 × г в течение 10 мин при 4 °C. Были собраны надосадочные жидкости и измерены концентрации белков с помощью анализа BCA. Равное количество белка (30 мкг) смешивали с 5× загрузочным буфером, нагревали при 95 °C в течение 5 мин и разделяли на 10%-12% гелей SDS-PAGE. Электрофорез проводили при напряжении 80 В для укладки и 120 В для разделения, а белки переносили на мембраны PVDF при давлении 300 мА в течение 90 мин. Мембраны блокировали в 5% обезжиренном молоке в течение 1 ч при комнатной температуре и инкубировали в течение ночи при 4 °C с первичными антителами (1:1000). После трех промываний TBST мембраны инкубировали с HRP-конъюгированными вторичными антителами (1:5000) в течение 1 ч при комнатной температуре. Белковые полосы визуализировали с помощью подложки ECL и визуализировали с помощью системы детектирования хемилюминесценции с экспозицией 30-120 с. Интенсивность полос была количественно определена с помощью ImageJ, а в качестве контроля нагрузки использовался GAPDH.

8. Окрашивание монодансилкадаверином (МДХ)

Непосредственно перед применением из исходного раствора готовили рабочий раствор MDC с концентрацией 50 мкМ. Клетки фиксировали 1 мл 4% параформальдегида в течение 10 мин при комнатной температуре, дважды промывали PBS и инкубировали с рабочим раствором MDC 500 мкл в течение 30 мин при 37 °C в темноте. После двух промывок PBS покровные стекла были смонтированы с антивыцветающей монтажной средой и исследованы под флуоресцентным микроскопом (возбуждение 355 нм, излучение 512 нм).

9. Просвечивающий электронный микроскоп (ПЭМ)

Клетки собирали и гранулировали центрифугированием при 200 × г в течение 5 минут, а затем фиксировали в 2% глутаральдегиде при 4 °C в течение ночи. Образцы трижды промывали PBS в течение 5 мин каждый и фиксировали в 1% тетраоксиде осмия в течение 1 ч при 4 °C в вытяжном шкафу. Дегидратацию проводили с помощью градуированной серии ацетонов 30%, 50%, 70%, 90% и 100% в течение 10 минут каждая. Образцы инфильтрировали ацетоном/эпоксидной смолой 1:1 в течение 1 часа, а затем чистой смолой в течение ночи. Заделку проводили в свежую смолу и полимеризовали при 60 °С в течение 48 ч. Ультратонкие срезы с длиной волны 50-70 нм разрезали ультрамикротом, устанавливали на медные сетки с 200 мешами, окрашивали 2% уранилацетатом в течение 30 мин с последующим вводом цитрата свинца в течение 15 мин, промывали дистиллированной водой, сушили на воздухе и исследовали под просвечивающим электронным микроскопом при напряжении 80 кВ. Следует отметить, что глутаральдегид и тетраоксид осмия токсичны и летучи, и с ними следует работать только в вытяжном шкафу в перчатках и защитных очках. Отходы должны утилизироваться в специально отведенных для этого опасных контейнерах в соответствии с протоколами безопасности учреждения.

10. Статистический анализ

Все эксперименты проводились в трех экземплярах. ±Статистическую значимость оценивали с помощью одностороннего ANOVA с последующим апостериорным тестом на ЛСД, при этом P < 0,05 считался значимым.

Влияние HSYA на экспрессию провоспалительных цитокинов хондроцитов (IL-1β, TNF-α, IL-6)
По сравнению с нормальной контрольной группой, во всех остальных группах наблюдался значительно повышенный уровень провоспалительных цитокинов (IL-1β, TNF-α и IL-6) (P < 0,05, табл. 1, рис. 1A-G). Лечение HSYA, ингибитором HIF-1α, индуктором аутофагии, ингибитором HSYA + HIF-1α или индуктором HSYA + аутофагии значительно снижало уровень цитокинов по сравнению с группой бланковой модели (P < 0,05). Среди них комбинированные методы лечения (HSYA + ингибитор HIF-1α или HSYA + индуктор аутофагии) еще больше снизили экспрессию цитокинов, снизив ее примерно на 35%-40% по сравнению с модельной группой (P < 0,05). В экспериментах по интерференции генов (рис. 1H-J) нокдаун миРНК HIF-1α или BNIP3 привел к снижению уровня цитокинов на ~25%-30% по сравнению с модельной + бланковой группой. Лечение HSYA еще больше усилило эти эффекты. В частности, уровни цитокинов в группе siHIF-1α + HSYA были на ~20% ниже, чем в группе siHIF-1α + бланк, а уровни в группе siBNIP3 + HSYA были на ~22% ниже, чем в группе siBNIP3 + бланк (P < 0,05).

Влияние HSYA на пролиферацию хондроцитов
Нормальная контрольная группа продемонстрировала исходную пролиферативную активность, в то время как группа с бланковой моделью показала значительное снижение (P < 0,05, рис. 2A). Пролиферация была частично восстановлена после лечения HSYA, ингибитором HIF-1α или индуктором аутофагии и заметно усилена комбинированным лечением HSYA + ингибитор HIF-1α или HSYA + индуктор аутофагии (P < 0,05). В экспериментах с миРНК (рис. 2B) нокдаун HIF-1α или BNIP3 способствовал пролиферации на ~25% по сравнению с модельной контрольной группой. Лечение HSYA еще больше усилило пролиферацию, что привело к увеличению пролиферации на ~40% по сравнению с модельной группой (P < 0,05).

Влияние HSYA на апоптоз и экспрессию белков, связанных с аутофагией, в хондроцитах
Вестерн-блоттинг выявил значимые различия в экспрессии белков между группами (табл. 2). В группе бланковой модели наблюдалась выраженная повышенная регуляция HIF-1α и сниженная экспрессия LC3, P62, Beclin1 и BNIP3 по сравнению с контрольной группой (P < 0,05). Лечение HSYA, ингибитором HIF-1α или индуктором аутофагии увеличивало экспрессию LC3, P62, Beclin1 и BNIP3 и снижало уровни HIF-1α (P < 0,05). Комбинированное лечение ингибитором HSYA + HIF-1α или индуктором HSYA + аутофагии привело к наибольшим изменениям, при этом уровни LC3 и Beclin1 почти удвоились по сравнению с группой холостых моделей. Хотя уровень P62 обычно снижается при активации аутофагии, здесь его уровень увеличивается после лечения HSYA. Это может указывать на усиленное накопление аутофагосом или неполный поток, о чем также сообщалось в предыдущих исследованиях аутофагии хондроцитов.

Влияние HSYA на частоту апоптоза в хондроцитах
Анализ проточной цитометрии показал, что в группе бланковой модели наблюдалась значительно более высокая частота апоптоза, чем в нормальной контрольной группе (P < 0,05, рис. 3A, B). HSYA, ингибитор HIF-1α и индуктор аутофагии уменьшали апоптоз, в то время как комбинированные методы лечения (HSYA + ингибитор HIF-1α или HSYA + индуктор аутофагии) приводили к самым низким показателям апоптоза, со снижением на ~45%-50% по сравнению с группой с бланковой моделью (P < 0,05). В экспериментах с миРНК апоптоз также снижался за счет нокдауна HIF-1α или BNIP3 и дополнительно снижался при лечении HSYA.

Влияние HSYA на частоту апоптоза и формирование аутофагических везикул в хондроцитах
Окрашивание MDC и визуализация ПЭМ выявили явные различия в образовании аутофагических везикул между группами (рис. 4A-D). В группе бланковой модели наблюдалось разреженное распределение везикул, в то время как лечение HSYA, ингибитором HIF-1α или индукторами аутофагии увеличивало количество везикул. Комбинированные методы лечения (HSYA + ингибитор HIF-1α или HSYA + индуктор аутофагии) привели к наиболее заметному усилению, при этом с помощью ПЭМ наблюдалось примерно в два раза больше везикул по сравнению с модельной группой. В соответствии с этими данными, частота апоптоза, измеренная с помощью проточной цитометрии (рис. 5A-E), была самой низкой в группах комбинированного лечения.

ДОСТУПНОСТЬ ДАННЫХ:
Все данные, полученные в этом исследовании, представлены в Дополнительном файле 1.

Рисунок 1: Экспрессия провоспалительных цитокинов хондроцитов (IL-1β, TNF-α, IL-6) в каждой группе (n = 3). (А-Г) Уровни экспрессии белков IL-1β, TNF-α и IL-6 определяли с помощью вестерн-блоттинга (WB). (Х-Дж) Содержание IL-1β, TNF-α и IL-6 определяли методом иммуноферментного анализа (ИФА) (P < 0,05). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 2: Сравнение активности пролиферации хондроцитов в каждой группе (n = 3). (А) обработанные группы, и (Б) группы нокдауна HIF-1α и BNIP3, P< 0,05. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 3: Сравнение частоты апоптоза в каждой группе (n = 3). (А) 1, Нормальная группа; 2, Модельная группа; 3, группа HSYA; 4, группа ингибиторов HIF-1α; 5, группа аутофагии; 6, группа ингибиторов HSYA + HIF-1α; 7, группа индукторов аутофагии HSYA +. (B) Группы нокдауна генов HIF-1α и BNIP3. По сравнению с нормальной контрольной группой, *P < 0,05. По сравнению с группой моделей с заготовками, #P< 0,05. По сравнению с группой ингибиторов HSYA + HIF-1α, & P< 0,05. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 4: ПЭМ-визуализация формирования аутофагических везикул в митохондриях. (А) Пустая модель. (Б) Группа HSYA. (C) Группа ингибиторов HIF-1α. (D) Группа индукторов аутофагии. Масштабная линейка = 1 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 5:Влияние HSYA на частоту клеточного апоптоза в каждой группе (n = 3). (А) Пустая модель. (Б) Группа HSYA. (C) Группа ингибиторов HIF-1α. (D) Группа индукторов аутофагии. (E) Общий анализ каждой группы по сравнению с нормальной контрольной группой, **P< 0,01. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Таблица 1: Сравнение уровней провоспалительных цитокинов в каждой группе. По сравнению с нормальной контрольной группой, *P < 0,05. По сравнению с группой моделей с заготовками, #P< 0,05. По сравнению с группами, получавшими HASY, ингибитор HIF-1α и индуктор аутофагии, & P< 0,05.

Таблица 2: Сравнение белков в разных группах. По сравнению с нормальной контрольной группой, *P< 0,05. По сравнению с группами, получавшими HSYA, ингибитор HIF-1α и индуктор аутофагии #P< 0,05.

Дополнительный файл 1: Исходные данные, полученные в ходе исследования. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих интересов.