Гидроксильный сафлор желтого А (HSYA) смягчает остеоартрит коленного сустава, усиливая аутофагию и пролиферацию хондроцитов, подавляя апоптоз и воспаление за счет ингибирования пути HIF-1α/BNIP3.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Исследовательская статья
Гидроксильный сафлор желтого А (HSYA) смягчает остеоартрит коленного сустава, усиливая аутофагию и пролиферацию хондроцитов, подавляя апоптоз и воспаление за счет ингибирования пути HIF-1α/BNIP3.
Уменьшение аутофагии в хрящевой ткани тесно связано с развитием остеоартрита коленного сустава (КОА), однако механизмы, с помощью которых гидроксильный сафлор желтый А (HSYA) оказывает защитное действие, остаются до конца неизученными. В этом исследовании хондроциты КОА человека были выделены и распределены по различным группам лечения, включая нормальный контроль, бланковую модель, HSYA, ингибитор индуцируемого гипоксией фактора-1α (HIF-1α), индуктор аутофагии, HSYA в сочетании с ингибитором HIF-1α и HSYA в сочетании с индуктором аутофагии. Провоспалительные цитокины (IL-1β, TNF-α, IL-6) количественно определяли с помощью иммуноферментного анализа, экспрессию белков HIF-1α, BNIP3 и маркеров, связанных с аутофагией, изучали с помощью вестерн-блоттинга, а аутофагические везикулы в митохондриях оценивали с помощью окрашивания монодансилкадаверином и просвечивающей электронной микроскопии. По сравнению с нормальным контролем, в группе бланковой модели наблюдалось достоверно повышенное содержание IL-1β, TNF-α, IL-6 и HIF-1α, что сопровождалось более высокими показателями апоптоза, снижением пролиферации и подавлением активности белков, связанных с аутофагией (P < 0,05). Лечение HSYA, ингибитором HIF-1α или индуктором аутофагии значительно повышало экспрессию белка, связанного с аутофагией, и снижало уровень воспалительных цитокинов. Кроме того, HSYA в сочетании с ингибитором HIF-1α или индуктором аутофагии дал наиболее выраженные эффекты, с заметным снижением высвобождения цитокинов и апоптоза, наряду с усилением пролиферации хондроцитов и образованием митохондриальных аутофагических везикул (P < 0,05). Эти результаты показывают, что HSYA оказывает хондропротекторное действие на КОА, по крайней мере, частично, за счет ингибирования пути HIF-1α/BNIP3, тем самым способствуя аутофагии и ослабляя воспалительное повреждение в хондроцитах.
Остеоартрит коленного сустава (КОА) является распространенным хроническим ортопедическим заболеванием и поражает людей среднего и пожилого возраста, значительно влияя на качество их жизни 1,2. Несмотря на его широкое распространение, точная этиология и патофизиологические механизмы, лежащие в основе КОА, остаются до конца неизученными. Кроме того, как для профилактики, так и для лечебного лечения подчеркивается настоятельная необходимость раскрытия сложных патологических основ этого состояния. Одной из областей, представляющих новый интерес, является роль аутофагии в хрящевом гомеостазе, при этом накапливаются данные, свидетельствующие о том, что сниженная аутофагия в хрящевой ткани способствует ее дегенерации при KOA 3,4.
Аутофагия, процесс клеточной деградации, жизненно важный для поддержания клеточного гомеостаза, имеет большое значение для поддержания и восстановления хрящей. В гипоксическом микроокружении, преобладающем в суставном хряще, индуцируемый гипоксией сигнальный путь фактора 1α (HIF-1α)/аденовируса E1B 19 кДа, взаимодействующего белка 3 (BNIP3), выступает в качестве ключевого регулятора аутофагии. Повышенная экспрессия HIF-1α наблюдалась у пациентов с КОА, что позволяет предположить, что нарушение регуляции этого пути может способствовать нарушению аутофагии и последующей дегенерации хряща 5,6,7.
Иглоукалывание, прижигание, травы и массаж – четыре классических метода традиционной китайской медицины для лечения артрита коленного сустава. Современные методы лечения, такие как нестероидные противовоспалительные препараты, инъекции гиалуроновой кислоты и эндопротезирование, доказали свою эффективность, но также связаны с определенными побочными эффектами. Более того, не существует рекомендуемого рутинного лечения остеоартроза коленного сустава. Со временем, в качестве распространенной дополнительной терапии КОА, традиционная китайская медицина (ТКМ) разработала множество растительных средств, которые показывают многообещающие результаты в лечении КОА9. Среди них гидроксильный сафлор желтый А привлек значительное внимание благодаря своим противовоспалительным и аутофагически модулирующим свойствам10,11. Тем не менее, точные механизмы, с помощью которых HSYA оказывает свое терапевтическое влияние на остеоартрит коленного сустава (КОА), особенно с точки зрения регуляции аутофагии через путь HIF-1α/BNIP3, остаются неясными. Таким образом, мы исследуем механизм терапевтических эффектов HSYA при КОА, уделяя особое внимание его влиянию на аутофагию хондроцитов и его взаимодействию с путем HIF-1α/BNIP3. Мы предполагаем, что HSYA смягчает остеоартрит коленного сустава за счет усиления аутофагии и пролиферации хондроцитов при одновременном подавлении апоптоза и воспаления посредством ингибирования пути HIF-1α/BNIP3.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Все процедуры, связанные с человеческими образцами, были одобрены Комитетом по этике Центральной народной больницы Чжаньцзяна (Approval No. KY-YS-2021-09). Перед сбором проб было получено письменное информированное согласие от всех участников. Используемые реагенты и оборудование приведены в Таблице материалов.
1. Пациенты и дизайн исследования
В исследование были включены тридцать пациентов с диагнозом остеоартрит коленного сустава (КОА) и перенесших тотальное эндопротезирование коленного сустава. Когорта включала 14 мужчин и 16 женщин в возрасте 52-75 лет (среднее ± SD: 64,3 ± 12,6 лет), все они соответствовали критериям12 Американского колледжа ревматологов KOA. Пациенты были исключены, если они получали нестероидные противовоспалительные препараты или стероиды в течение 2 недель до операции или внутрисуставные инъекции в течение 1 месяца.
2. Первичная культура хондроцитов
Суставной хрящ был собран в стерильных условиях сразу после операции и помещен в холодный PBS. С помощью стерильных скальпелей хрящ разрезали на фрагменты ~1 мм³ на ледяной стеклянной пластине и перенесли в центрифужную пробирку объемом 50 мл, содержащую 10 мл 0,25% трипсина-ЭДТА. Пробирку инкубировали на водяной бане при температуре 37 °C при 80 об/мин в течение 30 минут и осторожно переворачивали каждые 5 минут для облегчения пищеварения. Надосадочную жидкость отсасывали, а тканевую гранулу промывали один раз PBS и центрифугировали при 200 × г в течение 5 минут. Затем гранулу ресуспендировали в 10 мл 0,02% коллагеназы II типа и расщепляли при 37 °С в течение 4 ч с встряхиванием. Суспензию пипетировали вверх и вниз каждые 30 минут для стимулирования диссоциации, пропускали через ситечко 70 мкм и снова центрифугировали при 200 × g в течение 5 минут. Полученную гранулу ресуспендировали в DMEM с добавлением 10% FBS, 100 ЕД/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина и засевали в колбы T25. Клетки инкубировали при 37 °С с 5%СО2, среду заменяли каждые 2-3 дня, а для экспериментов использовали клетки из ходов 1-2. Экспериментальные группы включали нормальный контроль, холостую модель, HSYA (100 мкмоль/л), ингибитор HIF-1α YC-1 (10 мкмоль/л), рапамицин (10 нмоль/л), HSYA + YC-1 и HSYA + рапамицин.
3. siRNA-опосредованный HIF-lα, нокдаун BNIP3
Первичные хондроциты высевали в 6-луночные планшеты с концентрацией 2-5 ×10-5 клеток/лунку и культивировали при 37 °С до достижения ими 30%-50% конфлюенции. Для каждой лунки 5 мкл 20 мкМ миРНК разводили в 250 мкл Opti-MEM, а 5 мкл реагента для трансфекции на основе липидов разводили отдельно в 250 мкл Opti-MEM. Два раствора аккуратно перемешивали и инкубировали при комнатной температуре в течение 15-20 мин с образованием комплексов. Культуральную среду заменяли на 1,5 мл свежего DMEM с 10% FBS, а комплекс миРНК-липид (500 μл) добавляли по каплям вдоль стенки лунки с легким закручиванием. Клетки инкубировали в течение 6 ч, среду заменяли на полную среду, и культивирование продолжали в течение 48-72 ч. Эффективность нокдауна была проверена с помощью qRT-PCR и вестерн-блоттинга перед дальнейшим лечением.
4. ИФА
Супернатанты клеточных культур собирали, центрифугировали при 200 × г в течение 5 мин и при необходимости разводили в соотношении 1:2 в буфере для анализа. Наборы ИФА для ИЛ-1β, ФНО-α и ИЛ-6 использовались в соответствии с протоколом производителя. Стандарты, бланки и образцы были пропущены в трех экземплярах. После реакции на подложку абсорбцию измеряли при длине волны 450 нм с помощью считывателя микропланшетов в течение 15 минут.
5. Анализ МТТ
Хондроциты засеивали в 96-луночные планшеты со скоростью 5000 клеток/лунку в 100 мкл полной среды и инкубировали в течение 0 ч, 24 ч, 48 ч или 72 ч. В каждый момент времени 20 мкл раствора MTT (5 мг/мл в PBS) добавляли непосредственно в каждую лунку, и планшеты инкубировали при 37 °C в течение 30 мин до тех пор, пока на дне лунок не становились видимыми фиолетовые кристаллы формазана. Надосадочную жидкость осторожно отсасывали без нарушения кристаллов, добавляли 150 мкл ДМСО в каждую лунку и помещали пластины на шейкер при 100 об/мин на 10 мин для полного растворения кристаллов. Поглощение измеряли на длине волны 490 нм с помощью микропланшетного ридера. Короткое время инкубации было выбрано таким образом, чтобы избежать насыщения сигнала в высокометаболически активных клетках.
6. Проточная цитометрия
Клетки собирали методом трипсинизации, центрифугировали при 200 × г в течение 5 мин и дважды промывали холодным PBS. Их ресуспендировали в 500 мкл связывающего буфера при ~1 × 106 клеток/мл, а также добавляли 5 мкл аннексина V-FITC и 5 мкл PI. После бережного перемешивания клетки инкубировали в течение 15 мин при комнатной температуре в темноте. Образцы анализировали на проточном цитометре, при этом в каждом образце собиралось не менее 10 000 событий (возбуждение 488 нм, излучение FITC 530/30 нм, PI > 600 нм). Апоптотические клетки количественно оценивали с помощью стандартного программного обеспечения.
7. Вестерн-блоттинг
Клетки дважды промывали холодным PBS и лизировали в 200 мкл буфера RIPA, содержащего ингибиторы протеазы, на льду в течение 30 мин. Клетки соскабливали пластиковым скребком, пипетировали вверх и вниз для снижения вязкости и центрифугировали при 12 000 × г в течение 10 мин при 4 °C. Были собраны надосадочные жидкости и измерены концентрации белков с помощью анализа BCA. Равное количество белка (30 мкг) смешивали с 5× загрузочным буфером, нагревали при 95 °C в течение 5 мин и разделяли на 10%-12% гелей SDS-PAGE. Электрофорез проводили при напряжении 80 В для укладки и 120 В для разделения, а белки переносили на мембраны PVDF при давлении 300 мА в течение 90 мин. Мембраны блокировали в 5% обезжиренном молоке в течение 1 ч при комнатной температуре и инкубировали в течение ночи при 4 °C с первичными антителами (1:1000). После трех промываний TBST мембраны инкубировали с HRP-конъюгированными вторичными антителами (1:5000) в течение 1 ч при комнатной температуре. Белковые полосы визуализировали с помощью подложки ECL и визуализировали с помощью системы детектирования хемилюминесценции с экспозицией 30-120 с. Интенсивность полос была количественно определена с помощью ImageJ, а в качестве контроля нагрузки использовался GAPDH.
8. Окрашивание монодансилкадаверином (МДХ)
Непосредственно перед применением из исходного раствора готовили рабочий раствор MDC с концентрацией 50 мкМ. Клетки фиксировали 1 мл 4% параформальдегида в течение 10 мин при комнатной температуре, дважды промывали PBS и инкубировали с рабочим раствором MDC 500 мкл в течение 30 мин при 37 °C в темноте. После двух промывок PBS покровные стекла были смонтированы с антивыцветающей монтажной средой и исследованы под флуоресцентным микроскопом (возбуждение 355 нм, излучение 512 нм).
9. Просвечивающий электронный микроскоп (ПЭМ)
Клетки собирали и гранулировали центрифугированием при 200 × г в течение 5 минут, а затем фиксировали в 2% глутаральдегиде при 4 °C в течение ночи. Образцы трижды промывали PBS в течение 5 мин каждый и фиксировали в 1% тетраоксиде осмия в течение 1 ч при 4 °C в вытяжном шкафу. Дегидратацию проводили с помощью градуированной серии ацетонов 30%, 50%, 70%, 90% и 100% в течение 10 минут каждая. Образцы инфильтрировали ацетоном/эпоксидной смолой 1:1 в течение 1 часа, а затем чистой смолой в течение ночи. Заделку проводили в свежую смолу и полимеризовали при 60 °С в течение 48 ч. Ультратонкие срезы с длиной волны 50-70 нм разрезали ультрамикротом, устанавливали на медные сетки с 200 мешами, окрашивали 2% уранилацетатом в течение 30 мин с последующим вводом цитрата свинца в течение 15 мин, промывали дистиллированной водой, сушили на воздухе и исследовали под просвечивающим электронным микроскопом при напряжении 80 кВ. Следует отметить, что глутаральдегид и тетраоксид осмия токсичны и летучи, и с ними следует работать только в вытяжном шкафу в перчатках и защитных очках. Отходы должны утилизироваться в специально отведенных для этого опасных контейнерах в соответствии с протоколами безопасности учреждения.
10. Статистический анализ
Все эксперименты проводились в трех экземплярах. ±Статистическую значимость оценивали с помощью одностороннего ANOVA с последующим апостериорным тестом на ЛСД, при этом P < 0,05 считался значимым.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Влияние HSYA на экспрессию провоспалительных цитокинов хондроцитов (IL-1β, TNF-α, IL-6)
По сравнению с нормальной контрольной группой, во всех остальных группах наблюдался значительно повышенный уровень провоспалительных цитокинов (IL-1β, TNF-α и IL-6) (P < 0,05, табл. 1, рис. 1A-G). Лечение HSYA, ингибитором HIF-1α, индуктором аутофагии, ингибитором HSYA + HIF-1α или индуктором HSYA + аутофагии значительно снижало уро...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Остеоартрит (ОА), распространенное хроническое заболевание, значительно ухудшает качество жизни пациентов. Среди различных подтипов ОА КОА является наиболее распространенным, способствуя глобальному бремени болезней. Несмотря на высокую частоту встречаемости, точная этиология и лежащие в основе патофизиологические механизмы КОА остаются неясными. Сложное взаимодействие между механическими и биохимическими процессами в суставном хряще, в частности, регуляцией функции хондроцитов, имеет ре...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих интересов.
Эта работа была поддержана Бюро традиционной китайской медицины провинции Гуандун
(Грант No 20221446).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 1% тетроксид осмия | Науки об электронной микроскопии | 19150 | Дальнейшие исправления и образцы окрасок для анализа TEM |
| 2% глутаральдегид | Сигма-Олдрич | G5882 | Исправление ячеек для подготовки образцов TEM |
| 4% параформальдегид | Servicebio | G1101 | Исправляет клетки для окрашивания MDC и подготовки образцов TEM |
| AG1478 | Корпорация Selleck | S1005 | 20 мг/кг внутривенной инъекции, ингибитор киназы рецептора ErbB в модели крыс |
| Комплект для обнаружения апоптоза Annexin V-FITC/PI | Биоболото | BS3030 | Окрашивает апоптотические клетки для обнаружения потоковой цитометрии |
| Индуктор аутофагии (RAPA) | Sigma Corporation | R0395 | Рапамицин, индуктор аутофагии, используемый при 10 нмоль/л в экспериментах с хондроцитами |
| Антитело Beclin1 | Санта-Крус Биотехнология | SC-48341 | Первичное антитело для обнаружения Western blot белка Beclin1, связанного с аутофагией, |
| Антитела к BNIP3 | Санта-Крус Биотехнология | SC-517348 | Первичное антитело для обнаружения Western blot BNIP3 |
| Инкубатор углекислого газа | Ихэн | BPN-150CW | для клеточной культуры |
| Диметилсульфоксид (DMSO) | Сигма-Олдрич | D2650 | Растворяет кристаллы формазана в МТТ-анализе |
| DMEM | Beyotime | C0001 | Клеточная культурная среда, дополненная 10% FBS для культуры хондроцитов |
| Считыватель микропластин ELISA | Термо Фишер Сайентифик | Мультискан ФК | Измеряет значения OD в анализах ELISA и MTT |
| Реагент усиленной хемилюминесценции (ECL) | Термо Фишер Сайентифик | 32106 | Визуализирует белковые полосы в вестерн-блоте |
| Эпоксидная смола (EPON812) | Науки об электронной микроскопии | 14120 | Встраивает сэмплы для секционирования TEM |
| FBS | Beyotime | C0205 | Сыворотка плода крупного рогатого скота, добавленная в DMEM для питания хондроцитов |
| Потоковый цитометр | Бекман (упоминается за апоптоз) | CytoFLEX S | Обнаруживает скорость апоптоза хондроцитов и клеточные маркеры |
| Флуоресцентный микроскоп | Олимп | IX73 | Наблюдает аутофагические пузырьки, окрашенные MDC, |
| Гелевая система визуализации | Био-Рад | ChemiDoc XRS+ | Захватывает и количественно определяет белковые полосы из Western blot |
| HIF-1α Антитело | Санта-Крус Биотехнология | SC-13515 | Первичное антитело для обнаружения западных блотов HIF-1 и альфа; |
| HIF-1α Ингибитор (YC-1) | Корпорация Selleck | S1047 | HIF-1α Ингибитор пути, применяемый при 10 и мю; mol/l в клеточных экспериментах |
| Высокоскоростная холодильная центрифуга | Эппендорф | 5430R | Используется для разделения компонентов |
| Вторичные антитела, конъюгированные с HRP | Jackson ImmunoResearch | 115-035-003 | Связывает первичные антитела для усиления сигнала в вестерн-блоте |
| IL-1 и бета; ELISA Kit | Биология Шэнгун | C5236 | Количественно определяет IL-1 и бета; Уровни в клеточных супернатантах с помощью ИФА |
| Комплект IL-6 ELISA | Биология Шэнгун | C5237 | Количественно оценивает уровень IL-6 в клеточных супернатантах с помощью ELISA |
| Антитела к LC3 | Санта-Крус Биотехнология | SC-398822 | Первичное антитело для обнаружения западного блота белка LC3, связанного с аутофагией |
| Реагент Липофектамина 3000 | Термо Фишер Сайентифик | L3000001 | Липидный трансфекционный реагент для тансфекции |
| Монодансилькадаверин (MDC) | Сигма-Олдрич | D4008 | 0,05 моль/л, окрашивает аутофагические пузырьки для флуоресцентной микроскопии |
| Реагент MTT | Beyotime | C0009 | 0,5 мг/мл, используется в МТТ-анализе для оценки пролиферации хондроцитов |
| NanoDrop 2000 | Термо Фишер Сайентифик | ND-1000 | определить концентрацию РНК |
| Набор NRG1 ELISA | Abcam (Великобритания) | ab213961 | Измеряет концентрацию NRG1 в сердечных тканях с помощью ELISA |
| Антитела к P62 | Санта-Крус Биотехнология | SC-28359 | Первичное антитело для обнаружения западного блота белка P62, связанного с аутофагией |
| Фосфорилированное антитело к ErbB4 (p-ErbB4) | Сходство | AF3445 | Первичное антитело для обнаружения западного блота активированного ErbB4 |
| PrimeScript RT Reagent Kit | Такара | RR047A | Обратная транскрипция РНК для создания шаблонов для эксперимента qPCR |
| Система количественной ПЦР в реальном времени | Био-Рад | CFX96 | для обнаружения RT-PCR |
| Рекомбинантный человеческий NRG1 (rh-NRG1) | R& D Systems | 396-HB | 5 мг/кг внутривенно введение для активации пути NRG1/ErbB4 в модели крыс |
| Буфер RIPA | Мейлунбио | MA0151 | Буфер лизиса с ингибиторами протеаз/фосфатазы для экстракции белка |
| Сафлауэр Жёлтый A (HSYA) | Chengdu Mansit Biotechnology Co., Ltd. | Must-160601 | Биоактивный компонент Carthamus tinctorius L., используемый при 100 и мю; мол/л для лечения хондроцитов |
| Оборудование SDS-PAGE | Био-Рад | Mini-PROTEAN Tetra | Разделяет белки по молекулярной массе в Western blot |
| TB Green Premix Ex Taq II | Такара | RR820A | для эксперимента qPCR |
| TNF и альфа; ELISA Kit | Биология Шэнгун | C5238 | Количественно определяет TNF-и альфа; Уровни в клеточных супернатантах с помощью ИФА |
| Общее количество антител к ErbB4 | Proteintech | 19943-1-AP | Первичное антитело для обнаружения западного блота общего ErbB4 |
| Пропускной электронный микроскоп (TEM) | Hitachi (упоминается для аутофагических пузырьков) | H-7650 | Наблюдает аутофагические везикулы в митохондриях на ультраструктурном уровне |
| Тризол Реагент | Термо Фишер Сайентифик | 15596026 | для экстракции РНК |
| Trypsin-EDTA | Gibco (Термо Фишер) | 25200056 | Используется для ферментативного расщепления суставного хряща с целью выделения хондроцитов |
| Коллагеназа типа II (0,02%) | Worthington Biochemical | CLS-2 | Переваривает хрящевую ткань для выделения хондроцитов |
| &бета;катениновое антитело | Санта-Крус Биотехнология | SC-7963 | Внутренний эталонный антител для нормализации западного блота |
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.