Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Исследовательская статья

Гранула Ганчжиронга подавляет печёночный глюконеогенез через ось SIRT3-MPC1-PC/PDH при сахарном диабете 2 типа

419 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/69500

⸱

12 декабря 2025 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1College of Traditional Chinese Medicine, Changchun University of Chinese Medicine, 2Department of Gastroenterology, The Affiliated Hospital to Changchun University of Chinese Medicine, 3Research Center of Chinese Traditional Medicine, The Affiliated Hospital to Changchun University of Chinese Medicine, 4Preventive Treatment Center, The Affiliated Hospital to Changchun University of Chinese Medicine

В этой статье

Краткое содержание

В этом исследовании изучалось, улучшает ли Ganzhirong Granule гипергликемию при сахарном диабете 2 типа, ингибируя печёночный глюконеогенез через ось SIRT3-MPC1-PC/PDH.

Аннотация

Сахарный диабет 2 типа (СД2) — это глобальное метаболическое заболевание, характеризующееся печёночной инсулинорезистентностью и чрезмерным глюконеогенезом. Гранула Ганчжиронг (GZRG), формула традиционной китайской медицины, показала потенциал в лечении ЦД2, однако её основные механизмы, особенно связанные с печёночным глюконеогенезом, остаются неясными. В этом исследовании изучалось, улучшает ли GZRG гипергликемию путём модулирования сигнального пути, опосредованного SIRT3. Противодиабетические эффекты GZRG оценивались у мышей с СД2 с высоким содержанием жиров (HFD) и инсулинорезистентных клетках HepG2, индуцированных свободными жирными кислотами (FFA). Оценивались метаболические параметры, толерантность к глюкозе и пируватам, чувствительность к инсулину и липидный профиль. Молекулярные механизмы изучались через сверхэкспрессию и снижение SIRT3, изучая экспрессию ключевых белков (SIRT3, MPC1, PC, PDH-E2, PCK1 и G6Pase) в глюконеогенном пути. Лечение GZRG значительно улучшило гипергликемию, повысило чувствительность к инсулину и улучшило липидный метаболизм как у мышей с ЦД2, так и у инсулинорезистентных (IR) клетках HepG2. Он ослаблял печёночный стеатоз и подавлял глюконеогенез. Механически GZRG понизил экспрессию SIRT3, что привело к одновременному снижению уровней MPC1 и PC, а также увеличению PDH-E2. Этот сдвиг экспрессии белков перенаправил метаболизм пируватов от глюконеогенеза. Гиперэкспрессия SIRT3 обратила подавляющие эффекты GZRG на глюконеогенез, тогда как нокдаун SIRT3 синергировал с GZRG. GZRG облегчает Т2ДМ, ингибируя печёночный глюконеогенез через ось SIRT3-MPC1-PC/PDH. Эти результаты проясняют новый молекулярный механизм GZRG и выделяют SIRT3 как потенциальную терапевтическую мишень для лечения СД 2.

Введение

Сахарный диабет 2 типа (СД2) стал одним из самых распространённых и изнуряющих хронических метаболических нарушений в мире, создавая значительную нагрузку для общественного здоровья и экономики 1,2. Характеризуется инсулинорезистентностью (IR) и прогрессирующей дисфункцией β-клеток поджелудочной железы, СД 2 в первую очередь вызван нарушением гомеостаза глюкозыи липидов 3,4. Среди множества органов, участвующих в регуляции глюкозы, печень играет центральную роль, контролируя эндогенное производство глюкозы посредством гликогенолиза и глюконеогенеза5. Чрезмерный гепатический глюконеогенез является одним из основных факторов гипергликемии натощак, характерной чертой патофизиологии ЦД2, и представляет собой важную терапевтическую мишень для восстановления глюкозногобаланса 6.

Современные гипогликемические препараты — включаяметформин 7, тиазолидиндионы8, агонисты рецепторов GLP-19 и ингибиторы SGLT210 — обеспечивают контроль гликемии с помощью различных механизмов, однако их длительное применение часто ограничено побочными эффектами, снижением эффективности или непереносимостью лечения. В результате растёт интерес к комплементарным или альтернативным терапевтическим подходам, которые могут безопасно и эффективно воздействовать на несколько метаболических путей. Традиционная китайская медицина (ТКМ), характеризующаяся многокомпонентными и многоцелевыми фармакологическими свойствами, предлагает перспективные перспективы для управления сложными метаболическими заболеваниями, такими как ДМ 11,12,13,14,15. Несколько классических ТКМ были сообщены в улучшении инсулинорезистентности, улучшении липидного метаболизма и подавлении печёночного глюконеогенеза с помощью интегрированных регуляторныхмеханизмов 16,17.

Гранула Ганчжиронга (GZRG) — это стандартизированная формула ТКМ с историей клинического применения в лечении метаболических нарушений. GZRG — это травяная формула, состоящая из восьми лекарственных трав. На основе наших предыдущих фитохимических и фармакологических исследований в GZRG был выявлен ряд биоактивных соединений, включая, но не ограничиваясь, сальвианоловой кислотой B, D-стахиозой, проантоцианидинами, фиолетовой щавелевой кислотой, сальвианоловой кислотой A, сальвианоловой кислотой C, каликозин-7 глюкозидом, 3′-метоксипуэрарином, 3′-гидрокси-пуэрарином, апигенин-7-o-бета-d-пирано, эмодином-8-O-β-D-глюкозой, хризофанолом-1-O-глюкозином, хризофанолом-8-O-глюкозином, пуэрином, розмариновой кислотой, криптотаншиноном, катехином, Ft-nyflavin, каликозин, рейн, гуанозин, олеиновая кислота, алоэ эмодин, формонетин, пальмитиновая кислота, хризофанол, D-триптофан, Danshensu, феруловая кислота, маннитол, галловая кислота и L-фенилаланин. Фундаментальное преимущество традиционной китайской медицины (ТКМ) в лечении сахарного диабета 2 типа заключается в её многокомпонентной и многоцелевой синергетической активности. Десятки активных компонентов, содержащихся в GZRG, скорее всего, взаимодействуют с несколькими биологическими процессами — такими как пути сигнализации инсулина, метаболизм гликогена и воспалительные реакции — тем самым создавая интегрированный сетевой эффект, который невозможно адекватно воспроизвести ни одним очищеннымсоединением 18. Предыдущие исследования показали, что GZRG оказывает положительное влияние на метаболизм глюкозы и липидов в диабетическихмоделях 19; однако точные молекулярные механизмы, лежащие в основе этих эффектов, остаются неясными. В частности, до сих пор не выяснено, оказывает ли GZRG противодиабетическое действие путём модуляции печёночной глюконеогенной сигнализации.

Сиртуин 3 (SIRT3), митохондриальная деацетилаза, зависимая от NAD⁺, является ключевым регулятором гомеостаза 20 клеточнойэнергии. Деацетилируя и активируя ключевые метаболические ферменты, SIRT3 влияет на окислительное фосфорилирование митохондрии, окисление жирных кислот и глюконеогенез21. Аберрантная экспрессия SIRT3 участвует в патогенезе инсулинорезистентности, жировой печёнки и СД22,23. Данные свидетельствуют о том, что гиперэкспрессия SIRT3 в печени усиливает глюконеогенный поток за счёт модуляции ферментов, таких как митохондриальный пируват-носитель 1 (MPC1)24, пируваткарбоксилаза (PC)25, пируватдегидрогеназа (PDH)26, фосфоэнолпируват карбоксикиназа (PCK1)27 и глюкозо-6-фосфатаза (G6Pase)28. Таким образом, контроль метаболизма пируватов под руководством SIRT3 представляет собой критический узл, связывающий функцию митохондрий и выброс глюкозы в печени, что делает SIRT3 привлекательной целью для терапевтического вмешательства при СД2.

Учитывая установленные метаболические эффекты биоактивных компонентов в GZRG, а также центральную роль SIRT3 в гомеостазе глюкозы печени, было выдвинуто гипотезу, что GZRG смягчает гипергликемию при Т2 ДМ за счёт модуляции глюконеогенного пути, опосредованного SIRT3. Для оценки этой гипотезы были оценены эффекты GZRG на метаболизм глюкозы и липидов у мышей с высоким содержанием жиров (HFD), индуцированных T2 DM, и индуцированных инсулинорезистентными клетками HepG2, индуцированными свободными жирными кислотами (FFA). Дальнейшие исследования изучали участие оси сигнализации SIRT3-MPC1-PC/PDH в опосредовании подавляющего эффекта GZRG на печёночный глюконеогенез. Цель данного исследования — выяснить молекулярные механизмы, лежащие в основе метаболических преимуществ GZRG, а также предоставить экспериментальные доказательства в поддержку его терапевтического потенциала как многоцелевого модулятора для управления СДМ 2.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Протокол исследования на животных был утверждён Институциональным комитетом по уходу и использованию животных Университета китайской медицины Чанчунь (одобрение No 2024396). Все эксперименты на животных проводились в соответствии с национальными рекомендациями и соответствующими национальными законами по защите животных.

Экспериментальные препараты
GZRG (номер партии 26210483) была предоставлена аффилированной больницей Университета китайской медицины Чанчунь (Цзилинь, Китай). Основные биоактивные компоненты и параметры контроля качества GZRG были описаны в предыдущемисследовании 18.

Реагенты и антитела
Коммерческие наборы для анализа использовались для количественного определения глюкозы, гликогена, неэтерифицированных жирных кислот (NEFA), триглицеридов (TG), общего холестерина (TC), высокоплотного липопротеина (HDL) и холестерина липопротеинов низкой плотности (LDL). Также коммерчески были получены наборы для ферментно-связанного иммуносорбента (ELISA) для изучения гликозилированного гемоглобина и инсулина. Также были получены наборы ELISA для пируватдегидрогеназы (PDH) и пируваткарбоксилазы (PC). Для работы с РНК и кДНК коммерчески приобретались набор для тканей и клеток РНК, qPCR PreMix и gDNA RT SuperMix. Трансфекция проводилась с помощью трансфекционного реагента. Первичные антитела против SIRT3 (RRID: AB_2837621), фосфонолпируваткарбокиназы 1 (PCK1; RRID: AB_2838732), PDH-E2, глюкозо-6-фосфатаза (G6Pase; RRID: AB_2845572), носитель митохондриальных пируватов 1 (MPC1; RRID: AB_2836209), PC (RRID: AB_2836732) и глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназу (GAPDH; RRID: AB_2833041) были закуплены у коммерческого поставщика.

Мыши и методы лечения
Самцы мышей C57BL/6J (5-6 недель) были взяты в компании Liaoning Changsheng Biotechnology Co., Ltd. и содержались в стандартных условиях (22 ± 2 °C, влажность 50%–60%, 12 часов цикла свет/темнота) с свободным доступом к корму и воде. После 1-недельного периода акклиматизации шесть мышей были случайным образом выделены в контрольную (Con) группу и кормлены стандартной диетой. Оставшиеся мыши получали диету с высоким содержанием жиров (HFD) в течение 12 недель для стимуляции ожирения и инсулинорезистентности.

На 13-й неделе мыши с уровнем глюкозы натощак (FBG) ≥ 11,1 ммоль/л были классифицированы как успешные модели сахарного диабета 2 типа (СД2). Эти диабетические мыши были случайным образом разделены на пять экспериментальных групп (n = 6 на группу): модель HFD, низкодозовая GZRG (L-GZRG, 3,2 г/кг/сутки), средняя доза GZRG (M-GZRG, 6,4 г/кг/сут), высокодозовая GZRG (H-GZRG, 12,8 г/кг/сутки) и метформин (Met, 0,2 г/кг/сут). GZRG и Met ежедневно вводились перорально в течение 8 недель. Группы моделей Con и HFD получили эквивалентные объёмы дистиллированной воды. По завершении периода лечения у всех мышей были собраны образцы тканей крови и печени для последующего анализа.

Внутрибрюшинный тест на толерантность к глюкозе (IPGTT), тест на пируваты (PTT) и тест на инсулиновую толерантность (ITT)
Тесты на метаболическую толерантность проводились в период от 6 до 8 недель после начала медикаментозного лечения. Для IPGTT и PTT мыши проводились натощак на ночь (примерно 16 часов). Для ITT был введён более короткий 4-часовой период голодания. После голодания мышам делали внутрибрюшинную инъекцию глюкозы (2 г/кг для IPGTT), пирувата натрия (2 г/кг для PTT) или обычного инсулина для человека (1 U/kg для ITT). Уровень глюкозы в крови измерялся по образцам крови из хвостовой вены через 0, 30, 60, 90 и 120 минут после инъекции с помощью калиброванного глюкометра.

Биохимический анализ и анализы активности ферментов
Уровень глюкозы натощак (FBG), гемоглобина A1c (HbA1c) и инсулина (INS) был измерен с помощью коммерческих тестовых наборов согласно инструкциям производителя. Гомеостатическая модель оценки инсулинорезистентности (HOMA-IR) была рассчитана по формуле:

HOMA-IR = [FBG (ммоль/L) x INS (μU/mL)] / 22,5

Циркулирующие уровни NEFA, TG, TC, LDL-C, LLPL-C и ферментативная активность PDH и PC в тканях печени были количественно оценены с помощью соответствующих коммерческих наборов.

Гистопатологический анализ тканей печени
Свежие ткани печени фиксировались в 10% нейтрально буферизованном формалине в течение 24 часов, после чего проводилась стандартная обработка для внедрения парафина. Срезы толщиной 5 мкм были вырезаны и окрашены гематоксилином и эозином (H&E) для общей морфологической оценки. Для визуализации липидов отдельные образцы печени были вложены в соединение с оптимальной температурой резки (OCT), замораживались, криосекцировались и окрашивались маслом красным O.

Культивирование и обработка клеток
Человеческая гепатомная клетка HepG2 была получена из Коллекции типовых культур Китайской академии наук (Китай). Клетки культивировались в минимально необходимой среде (MEM) с добавлением глюкозы 25 mM, сывороткой плода 10% бычьей сыворотки (FBS) и 1% пенициллин-стрептомицином. Культуры поддерживались при 37 °C в увлажнённом инкубаторе с 5%CO2.

Для установления in vitro модели инсулинорезистентности (IR) клетки на 70%-80% слияния обрабатывались в течение 24 часов смесью свободных жирных кислот (FFA), включающей олеиновую и пальмитиновую кислоты, в молярном соотношении 2:1, на основе ранее описанного метода с незначительнымиизменениями 29. После индукции FFA культурная среда была заменена свежей MEM с той же смесью FFA и различными концентрациями GZRG для дополнительной инкубации в течение 24 часов.

Анализ жизнеспособности клеток (CCK-8)
Клетки HepG2 в логарифмической фазе роста были собраны и засеяны в пластины с 96 лунками при плотности 1 x 104 ячейки на колодцу. Периферийные скважины были заполнены 100 мкл стерильного фосфатно-буферного физиологического раствора (PBS) для минимизации испарения. После ночной инкубации для обеспечения прикрепления клетки обрабатывали в соответствии с экспериментальным дизайном. После обработки в каждую скважину добавляли по 10 мкл раствора CCK-8, и пластины инкубировали в течение 2 часов при 37 °C. Поглощение при 450 нм измерялось с помощью считывателя микропластин. Жизнеспособность клеток рассчитывалась следующим образом:

[(As - Ab) / (Ac - Ab)] x 100%

где As — поглощение образца, Ac — поглощение контрольных (необработанных ячеек), а Ab — поглощение заготовки (яек без клеток).

Трансфекция плазмид в клетках гепатита 2
Плазмида сверхэкспрессии SIRT3 (OV-SIRT3) и три отдельных микро-интерферирующих плазмиды РНК с нацелением на SIRT3 (si-SIRT3-1#, si-SIRT3-2#, si-SIRT3-3#), а также отрицательная контрольная сиРНК (si-NC) были созданы поставщиком. Трансфекции проводились с использованием трансфекционного реагента, когда слияние клеток достигало 50%-60%. Трансфекционный комплекс был подготовлен в стерильных условиях следующим образом: раствор A был получен путём разбавления 1 мкг плазмидной ДНК в 250 мкл восстановленной сывороточной среды с аккуратным смешиванием. Раствор B был приготовлен путём разбавления 2–3 мкл трансфекционного реагента в 250 мкл восстановленной сывороточной среды, после чего инкубировали при комнатной температуре в течение 5 минут без вихря. Оба раствора были комбинированы, аккуратно перемешаны с помощью пипетирования и инкубированы при комнатной температуре в течение 30 минут для образования ДНК-липидных комплексов. Для трансфекции за час до процедуры среду для культивирования клеток аспирировали, клетки промывали PBS, и добавляли 1 мл редукционированной сывороточной среды (без сыворотки и антибиотиков). Затем в каждую скважину добавлялось по 500 мкл трансфекционного комплекса, а культивационная пластина аккуратно перемешивалась для обеспечения однородности. Клетки инкубировали при 37 °C в течение 4–6 часов, после чего среду заменяли на полноценную среду для снижения цитотоксичности. Впоследствии клетки культивировали ещё 24–48 часов перед дальнейшим анализом. Эффективность трансфекции оценивалась с помощью количественной ПЦР (qPCR). Общая РНК была извлечена, обратно транскриптована в кДНК и усилена с помощью специфических для SIRT3 праймеров с 18S рРНК в качестве внутреннего контроля. Относительные уровни экспрессии были определены методом ΔΔCt, и наиболее эффективная конструкция siRNA была выбрана для последующих экспериментов на основе этих результатов.

Окрашивание масло-красного O-цвета для внутриклеточного накопления липидов
Клетки HepG2 в логарифмической фазе роста были засеяны в пластины с 24 лунками с плотностью 2 x 105 клеток на колодку и индуцированы с помощью высоколипидной среды с 250 мкм олеиновой кислотой и 250 мкм пальмитиновой кислоты в течение 48 часов для создания модели накопления липидов. После обработки клетки промывали PBS и фиксировали 10% формальдегидом на 10 минут при комнатной температуре. После промывания дистиллированной водой и краткого погружения в 60% изопропанол клетки окрашивались свежеприготовленным рабочим раствором Oil Red O (полученным путём смешивания компонентов A1 и A2 в соотношении 3:2) в течение 10–15 минут. Лишний краситель удалялся путём промывания 60% изопропанола, затем дистиллированной водой. Ядра были контрокрашены гематоксилином Майера (1,0 г/л) в течение 1-2 минут. После финальной промывки клетки были установлены глицериновым желатином, а изображения были сделаны с помощью светового микроскопа при увеличении в 200 раз для качественной оценки липидных капель.

Индукция инсулинорезистентности и количественная оценка глюкозы в клетках гепатита 2
Клетки HepG2 культивировались в пластинах с 24 лунками при плотности посева 2 x 105 клеток на каждую скважину для создания модели инсулинорезистентности in vitro . После 24 часов обработки был собран посевный супернатант для дальнейшего анализа. Для измерения внутриклеточной глюкозы суспензии клеток центрифугировали при 1000 x г в течение 10 минут при 4 °C. Супернатант отбрасывались, а клеточная гранула промывалась один-два раза изотоническим буфером, после чего центрифугировали при тех же условиях. Затем гранула была гомогенизирована в 0,2–0,3 мл гомогенизационной среды и подвергалась ультразвуковому разрушению в ледяной водяной ванне с помощью зонда мощностью 300 Вт, с импульсами 3-5 с с интервалами в 30 с, повторяющимися 3-5 раз. Полученный гомогенат был проанализирован напрямую без дальнейшего центрифуга. Уровни глюкозы как в культурном супернатанте, так и в клеточном гомогенате измерялись с помощью стандартизированного теста глюкозы согласно инструкциям производителя для обеспечения точной и воспроизводимой оценки метаболических реакций.

Измерение содержания клеточных триглицеридов
Клетки HepG2 собирались центрифугированием при 1000 x г в течение 10 минут, после чего супернатант отбрасывался. Клеточная гранула промывалась 1 или 2 раза изотоническим фосфатным буфером (0,1 м, pH 7,0-7,4), после чего проводилась центрифугирование при тех же условиях. После удаления супернатанта гранулу вновь суспензировали и гомогенизировали с добавлением 0,2–0,3 мл абсолютного этанола. Гомогенат подвергался ультразвуковому разрушению на льду (300 Вт, 3-5 с на всплеск, интервалы 30 с, повторение 3-5 раз). Полученный гомогенат использовался непосредственно для последующего анализа без дальнейшего центрифуга. Была установлена пластина на 96 лунок с пустыми, стандартными и пробными скважинами. После тщательного смешивания пластину инкубировали при 37 °C в течение 10 минут, а поглощение измерялось на 500 нм с помощью считывателя микропластин. Содержание триглицеридов в образцах клеток рассчитывалось на основе стандартной кривой, полученной из последовательных разбавлений стандартов глицерола.

Измерение общего содержания холестерина
Клетки HepG2 (5 x 106) были лизированы в 1 мл буфера экстракции с помощью ультразвукового разрушения на льду. Гомогенат был центрифугирован при 10 000 x г в течение 10 минут при 4 °C, а супернатант был собран для немедленного анализа. Стандартный раствор холестерина (50 ммоль/мл) был подготовлен и последовательно разбавлен для получения стандартной кривой (0,3125–10 мкмоль/мл). Рабочий хромогенный раствор был приготовлен путём смешивания реагентов один, два и три, включённых в тест на холестерин, и предварительно прогрелся до 37 °C. Образцы или стандарты смешивались с рабочим раствором, инкубировали при 37 °C в течение 30 минут, а поглощание измерялось на 500 нм. Содержание холестерина рассчитывалось на основе стандартной кривой.

Иммунофлуоресцентное окрашивание
Клетки, выращенные на накладных слипах, промывались ледяным PBS и фиксировались 4% параформальдегидом в течение 15 минут при комнатной температуре. После промывки PBS клетки проникали с помощью 0,1% Triton X-100 в течение 10 минут и блокировали 5% BSA при 4 °C ночью. Клетки затем инкубировали первичным антителом против SIRT3 (разбавление 1:500) при 4 °C ночью. После промывания PBS клетки инкубировали с флуоресцентно-конъюгированным вторичным антителом (разбавление 1:2000) в течение 1 часа при комнатной температуре в темноте. Ядра окрашивались DAPI (0,5 мкг/мл) в течение 10 минут. Коверслипы монтировались на стеклянные стекли с помощью монтажного материала против затухания и визуализировались под флуоресцентным микроскопом.

Экстракция РНК и количественная ПЦР в реальном времени (qRT-PCR)
Общая РНК была извлечена из клеток с помощью РНК-набора ткани/клеток. Геномная ДНК была удалена, а cDNA синтезирована с помощью RT-набора gDNA. Количественная ПЦР проводилась с использованием комплекта qPCR на системе обнаружения ПЦР в реальном времени. Геноспецифические последовательности праймеров приведены в таблице 1.

Вестерн-блот анализ
Для извлечения белка из печеночных тканей взвешивалось примерно 50–200 мг ткани, измельчённое в чашке Петри и перенесено в гомогенизатор. Для предотвращения деградации белка был добавлен предварительно охлаждённый лизисный буфер (RIPA-буфер), дополненный ингибиторами протеазы и фосфатазы. Гомогенизация была проведена тщательно на льду для полного разрушения тканей, а гомогенат был перемещён в центрифугу и инкубировался на льду в течение 30 минут для облегчения растворения белков. Впоследствии гомогенат центрифугировали при 4 °C при 12 000 г в течение 10–30 минут, а супернатант тщательно собирали как общий белковый экстракт, чтобы избежать загрязнения гранулой. Для клеточного извлечения белка в клетки добавлялся предварительно охлаждённый лизисный буфер (RIPA-буфер, содержащий 1% ингибиторы тритона X-100 и протеаз), после чего следовала инкубация на льду в течение 15–30 минут для полного лизиса. Разрушение ячеек обеспечивалось многократным соскребанием скребком или интенсивной пипеткой. Лизат был перемещён в центрифугную трубку и центрифугирован при 4 °C при 14 000 x г в течение 30 минут, после чего супернатант собирался как общий белковый экстракт. Концентрация белка количественно измерялась с помощью набора для анализа белков BCA, а аликвоты хранились при -80 °C для дальнейшего анализа Western blot или использовались непосредственно для подготовки образцов. Образцы белка денатурировались в буфере Леммли при 100 °C в течение 10 минут, разделялись с помощью SDS-PAGE и переносились на мембраны PVDF. Мембраны блокировались 5% обезжиренным молоком в течение 2 часов при комнатной температуре, а затем инкубировали с помощью специфических первичных антител в течение ночи при 4 °C. После промывания мембраны инкубировали с сопряжёнными с HRP вторичными антителами в течение 1 часа при комнатной температуре. Белковые ленты визуализировались с помощью усиленного хемилюминесцентного (ECL) субстрата. Химилюминесцентные сигналы были зафиксированы, а интенсивность полос количественно измерена с помощью денситометрического анализа с помощью программного обеспечения ImageJ. Сырые западные пятна приведены в Дополнительном файле 1.

Статистический анализ
Все данные выражаются в виде среднего ± стандартной ошибки среднего значения (SEM). Статистические сравнения между двумя группами проводились с помощью t-теста Стьюдента без пары. Для сравнений между тремя и более группами применялся односторонний анализ дисперсии (ANOVA), а затем пост-хок тест Тьюки для множественных сравнений. Все статистические анализы проводились с использованием программного обеспечения GraphPad Prism (версия 9.5.0). p-значение менее 0,05 считалось статистически значимым.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

GZRG улучшил инсулинорезистентность и глюконеогенез у мышей с Т2 СД, индуцированных HFD.
Модель мышей с диабетом 2 типа (СД2), индуцированной HFD, характеризующейся инсулинорезистентностью, гипергликемией и дислипидемией, широко используется для изучения патогенеза заболеваний и оценки терапевтических вмешательств30. В настоящем исследовании была установлена модель СДМ, индуцированной HFD, у мышей C57BL/6J для оценки эффективности и основных механизмов GZRG.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Настоящее исследование демонстрирует, что GZRG оказывает значительные антигипергликемические и инсулиночувствительные эффекты как в in vivo , так и в in vitro моделях ДД2, главным образом за счёт подавления печёночного глюконеогенеза за счёт модуляции оси SIRT3-MPC1-PC/PDH. Экспериментальные данные показывают, что введение GZRG ослабляло гипергликемию натощак, улучшало толерантность к глюкозе и инсулину, восстанавливало липидный гомеостаз и снижало печёночный стеатоз у ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Все авторы заявляют, что у них нет известных конкурирующих финансовых интересов или личных отношений, которые могли бы повлиять на работу, описанную в этой статье.

Благодарности

Это исследование было профинансировано Планом развития науки и технологий провинции Цзилинь, грантовый номер 20210101199JC, YDZJ202301ZYTS454.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
FastKing gDNA Рассеивание RT SuperMix     Tiangen Biotech Co., Ltd. (Китай). KR118-02
Антитела к глюкозе-6-фосфатазе (G6Pase)Wuhan Lingjiesi Biotechnology Co., Ltd. (Китай)LJS-D-12610
антитела к глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназе (GAPDH)Wuhan Lingjiesi Biotechnology Co., Ltd. (Китай)LJS-T-0004
Наборы для гликозилированного гемоглобина ELISA     Jiangsu Meimian Industrial Co., Ltd. (Китай).MM-0159M2
GZRGАффилированная больница Университета китайской медицины Чанчунь (Цзилинь, Китай)26210483
Наборы для анализа холестерина на липопротеины высокой плотности (ЛПВП)Нанкинский институт биоинженерии (Китай)A112-1-1
Наборы ELISA для инсулинаJiangsu Meimian Industrial Co., Ltd. (Китай).MM-0579M2
Липофектамин2000 Invitrogen, США11668-019
Наборы для анализа холестерина с липопротеинами низкой плотностью (ЛПНПН)Нанкинский институт биоинженерии (Китай)A113-1-1
Наборы для анализа глюкозыНанкинский институт биоинженерии (Китай)F006-1-1
Антитело к носителю митохондриальных пируватов 1 (MPC1)Wuhan Lingjiesi Biotechnology Co., Ltd. (Китай)LJS-D-3852
Наборы для анализа неэтерифицированных жирных кислот (NEFAs)Нанкинский институт биоинженерии (Китай)A042-2-1
Антитела к PCWuhan Lingjiesi Biotechnology Co., Ltd. (Китай)LJS-D-4364
Антитела к PDH-E2Wuhan Lingjiesi Biotechnology Co., Ltd. (Китай)LJS-D-14046
Антитела к фосфонолпирувате карбоксикиназе 1 (PCK1)Wuhan Lingjiesi Biotechnology Co., Ltd. (Китай)LJS-D-6770
пируваткарбоксилаза (ПК) наборы для ИФа Wuhan Lingjiesi Biotechnology Co., Ltd. (Китай)LJS-160408H
Пируватдегидрогеназа (PDH)наборы ELISA   Wuhan Lingjiesi Biotechnology Co., Ltd. (Китай)LJS-160300H
РНК-Easy Fast Tissue/Cell Kit   Tiangen Biotech Co., Ltd. (Китай). DP451
Антитела к SIRT3Wuhan Lingjiesi Biotechnology Co., Ltd. (Китай)LJS-A-5135
Таланты SYBR Green qPCR PreMix Tiangen Biotech Co., Ltd. (Китай). FP209-02
Наборы для анализа общего холестерина (TC)Нанкинский институт биоинженерии (Китай)A110-1-1
Наборы для анализа триглицеридов (ТГ)Нанкинский институт биоинженерии (Китай)A111-1-1

Ссылки

  1. Ahmad, E., Lim, S., Lamptey, R., Webb, D. R., Davies, M. J. Type 2 diabetes. Lancet (London, England). 400, 1803-1820 (2022).
  2. Singh, A., Shadangi, S., Gupta, P. K., Rana, S. Type 2 Diabetes Mellitus: A Comprehensive Review of Pathophysiology, Comorbidities, and Emerging Therapies. Comp Physiol. 15, e70003(2025).
  3. Lu, X., et al. Type 2 diabetes mellitus in adults: pathogenesis, prevention and therapy. Signal Transduct Target Ther. 9, 262(2024).
  4. Yang, W., Jiang, W., Guo, S. Regulation of Macronutrients in Insulin Resistance and Glucose Homeostasis during Type 2 Diabetes Mellitus. Nutrients. 15 (21), 4671(2023).
  5. Petersen, M. C., Vatner, D. F., Shulman, G. I. Regulation of hepatic glucose metabolism in health and disease. Nat Rev Endocrinol. 13 (10), 572-587 (2017).
  6. Barroso, E., Jurado-Aguilar, J., Wahli, W., Palomer, X., Vázquez-Carrera, M. Increased hepatic gluconeogenesis and type 2 diabetes mellitus. Trends Endocrinol Metab. 35 (12), 1062-1077 (2024).
  7. Dutta, S., et al. Metformin: A Review of Potential Mechanism and Therapeutic Utility Beyond Diabetes. Drug Des Devel Ther. 17, 1907-1932 (2023).
  8. Lebovitz, H. E. Thiazolidinediones: the Forgotten Diabetes Medications. Curr Diab Rep. 19 (12), 151(2019).
  9. Yao, H., et al. Comparative effectiveness of GLP-1 receptor agonists on glycaemic control, body weight, and lipid profile for type 2 diabetes: systematic review and network meta-analysis. BMJ. 384, e076410(2024).
  10. Vallon, V., Verma, S. Effects of SGLT2 Inhibitors on Kidney and Cardiovascular Function. Annu Rev Physiol. 83, 503-528 (2021).
  11. Dou, Z., et al. Syndrome Differentiation and Treatment Regularity in Traditional Chinese Medicine for Type 2 Diabetes: A Text Mining Analysis. Front Endocrinol (Lausanne). 12, 728032(2021).
  12. Ni, Y., et al. Evidence of traditional Chinese medicine for treating type 2 diabetes mellitus: from molecular mechanisms to clinical efficacy. Pharm Biol. 62 (1), 592-606 (2024).
  13. Wang, J., et al. Effects of three Huanglian-derived polysaccharides on the gut microbiome and fecal metabolome of high-fat diet/streptozocin-induced type 2 diabetes mice. Int J Biol Macromol. 273 (Pt 1), 133060(2024).
  14. Qi, L., et al. Structural characterization of red yeast rice-derived polysaccharide and its promotion of lipid metabolism and gut function in high-fat diet-induced mice. Int J Biol Macromol. 282 (Pt 1), 136744(2024).
  15. Liu, Y., et al. Flavonoid-Rich mulberry leaf extract modulate lipid metabolism, antioxidant capacity, and gut microbiota in high-fat diet-induced obesity: potential roles of FGF21 and SOCS2. Food Med Homol. 1, 9420016(2024).
  16. Wu, H., et al. Efficacy and safety assessment of traditional Chinese medicine for metabolic syndrome. BMJ Open Diabetes Res Care. 8 (1), e001181(2020).
  17. Jin, Z., Wang, X. Traditional Chinese medicine and plant-derived natural products in regulating triglyceride metabolism: Mechanisms and therapeutic potential. Pharmacol Res. 208, 107387(2024).
  18. Chen, S., et al. Screening and identification of active compounds of GanZhiRong granule based on liquid chromatography-mass spectrometry and biomolecular networks. Chinese J Anal Chem. 51, 100294(2023).
  19. Yu, Y., Liu, T., Yang, Y., Wang, H., Liu, Y. Effects of Liver Fat Soluble Granule Comnined and Metformin on Blood Glucose in Diabetic Rats. Jilin J Trad Chinese Med. 39, 654-656 (2019).
  20. Ji, Z., Liu, G. H., Qu, J. Mitochondrial sirtuins, metabolism, and aging. J Genet Genomics. 49 (4), 287-298 (2022).
  21. Zhang, J., et al. Mitochondrial Sirtuin 3: New emerging biological function and therapeutic target. Theranostics. 10 (18), 8315-8342 (2020).
  22. Chen, J., et al. The role of sirtuins in the regulatin of oxidative stress during the progress and therapy of type 2 diabetes mellitus. Life Sci. 333, 122187(2023).
  23. Weng, S., et al. Chaperonin counteracts diet-induced non-alcoholic fatty liver disease by aiding sirtuin 3 in the control of fatty acid oxidation. Diabetologia. 66 (5), 913-930 (2023).
  24. Liang, L., Li, Q., Huang, L., Li, D., Li, X. Sirt3 binds to and deacetylates mitochondrial pyruvate carrier 1 to enhance its activity. Biochem Biophys Res Commun. 468 (4), 807-812 (2015).
  25. Guo, X., et al. The Role of Palmitoleic Acid in Regulating Hepatic Gluconeogenesis through SIRT3 in Obese Mice. Nutrients. 14 (7), 1482(2022).
  26. Han, Y., et al. Bawei Chenxiang Wan ameliorates right ventricular hypertrophy in rats with high altitude heart disease by SIRT3-HIF1α-PDK/PDH signaling pathway improving fatty acid and glucose metabolism. BMC Complement Med Ther. 24 (1), 190(2024).
  27. Wei, X., et al. Both prolonged high-fat diet consumption and calorie restriction boost hepatic NAD+ metabolism in mice. J Nutr Biochem. 115, 109296(2023).
  28. Kavanaugh, J. W. Skeletal Muscle Acetylation in Response to an Acute and Chronic High-Fat Diet [Doctoral Dissertations]. , Virginia Tech. (2017).
  29. Lee, M. R., Yang, H. J., Park, K. I., Ma, J. Y. Lycopus lucidus Turcz. ex Benth. Attenuates free fatty acid-induced steatosis in HepG2 cells and non-alcoholic fatty liver disease in high-fat diet-induced obese mice. Phytomedicine. 55, 14-22 (2019).
  30. Qu, X., et al. Riligustilide alleviates hepatic insulin resistance and gluconeogenesis in T2DM mice through multitarget actions. Phytother Res. 36 (1), 462-474 (2022).
  31. Rui, L. Energy Metabolism in the Liver. Compr Physiol. 4, 177-197 (2014).
  32. Li, A., et al. Berberine Reduces Pyruvate-driven Hepatic Glucose Production by Limiting Mitochondrial Import of Pyruvate through Mitochondrial Pyruvate Carrier 1. EBioMedicine. 34, 243-255 (2018).
  33. Tavoulari, S., Sichrovsky, M., Kunji, E. R. S. Fifty years of the mitochondrial pyruvate carrier: New insights into its structure, function, and inhibition. Acta Physiol (Oxford, England). 238 (4), e14016(2023).
  34. Dutta, S., et al. Metformin: A Review of Potential Mechanism and Therapeutic Utility Beyond Diabetes. Drug Des Devel Ther. 17, 1907-1932 (2023).
  35. Xu, G., et al. Mitochondrial ACSS1-K635 acetylation knock-in mice exhibit altered metabolism, cell senescence, and nonalcoholic fatty liver disease. Sci Adv. 10 (20), eadj5942(2024).
  36. Jin, L., et al. FGF21-Sirtuin 3 Axis Confers the Protective Effects of Exercise Against Diabetic Cardiomyopathy by Governing Mitochondrial Integrity. Circulation. 146 (20), 1537-1557 (2022).
  37. Ning, Y., et al. SIRT3: A potential therapeutic target for liver fibrosis. Pharmacol Ther. 257, 108639(2024).
  38. Xian, Y., et al. Enhanced SIRT3 expression restores mitochondrial quality control mechanism to reverse osteogenic impairment in type 2 diabetes mellitus. Bone Res. 13 (1), 30(2025).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Больше статей

Путь SIRT3инсулинорезистентностьметаболизм пируватаклетки HepG2экспрессия белковлипидный обментолерантность к глюкозе
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.