Research Article

Интегрированный транскриптомический и секретомный протеомный анализ эндотелиальных клеток, стимулиранных гипергликемией, и скрининг целевых соединений

DOI:

10.3791/69578

⸱

December 30th, 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Hebei Luoxue Innovation Medicine Research Institute, 2State Key Laboratory for Innovation and Transformation of Luobing Theory, 3Hebei University of Chinese Medicine, 4Hebei Medical University, 5Chengde Medical University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол устанавливает интегрированный мультиомический конвейер (транскриптом и протеом) в сочетании с сетевым фармакологическим скринингом для выявления молекулярных драйверов и терапевтических мишеней для эндотелиальной дисфункции при диабетических осложнениях.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Дисфункция эндотелиума является ключевым фактором диабетической болезни почек (ДКД), однако её системные молекулярные механизмы остаются неполностью расшифрованными. Мы выдвинули гипотезу, что интегрированный мультиомический анализ может отражать повреждения эндотелиа, вызванные гипергликемией, и выявлять многоразовые терапевтические средства. Для интеграции транскриптомных/секретомных профилей из гипергликемических эндотелиальных клеток и диабетических почек был применён многоразовый вычислительный конвейер. Это выявило 534 часто повышенных гена/белка. Функциональное обогащение выявило активацию ремоделирования внеклеточного матрикса, межклеточной коммуникации и путей воспаления. Кросс-базная проверка выявила 278 медиаторов высокой доверия, а анализ сетей взаимодействия белок-белок выявил десять генов-хабов. Используя сетевую фармакологию, мы открыли одобренную библиотеку лекарств, выявив несколько кандидатов (например, бруцеантин, идеалисиб), которые потенциально нацелены на эту сеть. Кроме того, регуляция транскрипционных факторов и образцовые молекулярные симуляции стыковки (например, идеалисиб с CTCF/BRD4) предоставили механистические гипотезы для экспериментальной проверки. В заключение, это исследование устанавливает многоразовую мультиомическую структуру, которая определяет эндотелиальные патогенные механизмы при ДКД и выделяет кандидаты на многоразовые препараты, предлагая стратегический подход к механистическим и терапевтическим открытиям.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Сахарный диабет как глобальная проблема здравоохранения затронул 529 миллионов человек по всему миру в 2021 году, и прогнозы предполагают, что к 2050 году он затронет 1,31 миллиардачеловек. Помимо гликемического контроля, долгосрочные осложнения являются основным источником заболеваемости, смертности и снижения качества жизни. К ним относятся микроваскулярные осложнения (например, диабетическая болезнь почек (ДКД), ретинопатия, невропатия) и макроваскулярные осложнения (например, ускоренный атеросклероз). Критично важно, что ДКД затрагивает 30%–40% пациентов с диабетом, являясь ведущей причиной терминальной стадии почечной недостаточности (ЭСРД) вовсём мире 2. Глубокое бремя этих осложнений подчёркивает острую, неудовлетворённую потребность в новых терапиях, направленных на их основные механизмы.

Эндотелиальные клетки (ЭК), образующие внутреннюю оболочку всех кровеносных сосудов, являются ключевыми хранителями здоровья сосудов. Эндотелиальная дисфункция, вызванная гипергликемией, является центральным фактором диабетической васкулопатии и поврежденияорганов 3,4. Высокий уровень глюкозы вызывает каскад неадаптивных реакций внутри ЭК, включая дисрегулированную биодоступность оксида азота (NO), усиление секреции эндотелина-1 (ET-1), повышенную экспрессию молекул адгезии (например, VCAM-1, ICAM-1), повышенный окислительный стресс за счёт чрезмерной генерации реактивных форм кислорода (ROS) (например, через окислители NADPH) и устойчивое низкостепенноевоспаление 3,4. В совокупности эти изменения приводят к снижению вазодилатации, повышению сосудистой проницаемости, адгезии и инфильтрации лейкоцитов, протромботическим состояниям и, в конечном итоге, ремоделированию сосудов5. Внутри почечной микроваскулаторной системы повреждение клубочкового эндотелиума нарушает фильтрационный барьер, способствует развитию альбуминурии и напрямую способствует накоплению внеклеточного матрикса (ЭКМ), гломерулосклерозу и тубулоинтерстициальномуфиброзу 5,6. Последующая активация резидентных почечных клеток в сочетании с притоком воспалительных клеток создаёт порочный круг, усиливающий повреждениепочек 5,7. Ключевым является то, что клинические исследования показывают, что маркеры системной эндотелиальной дисфункции сильно коррелируют с началом и прогрессированием альбуминурии и снижением частоты гломерулярной фильтрации (ГКФ) у диабетических пациентов 6,7,8, что подчёркивает их прямую связь с исходами заболевания у человека. Несмотря на признанную центральность, всестороннее системное понимание точного транскрипционного и секреторного перепрограммирования, вызванного хронической гипергликемией в ЭК — особенно изменений, вызывающих ремоделирование ЭКМ, ключом к почечному фиброзу — остаётся неполно охарактеризованным, что ограничивает выявление новых механистических терапевтических целей для ДКД и других сосудистых осложненийдиабета 7,8.

Глубокая молекулярная сложность, лежащая в основе эндотелиальной дисфункции при диабете, представляет собой серьёзную задачу для традиционных одноцелевых терапевтических подходов. Именно здесь вычислительная биология и биоинформатика становятся незаменимыми инструментами, позволяющими интегрировать и анализировать разнообразные, многомерные омикс-наборы данных для приоритизирования причинно-следственных хабов в патологических сетях и выявления многоцелевых терапевтическихстратегий 9. Критически важно, что традиционные одномодальные подходы (например, только транскриптом/протеом или фармакологический скрининг) часто упускают критическое взаимодействие между молекулярными слоями (например, экспрессия генов, динамика белков, ответ на лекарства), не улавливая синергетические драйверы или нецелевыеэффекты 10,11. Интегрированный мультиомический конвейер преодолевает эти ограничения, одновременно профилируя транскриптомные, секретомные и фармакологические данные в одной системе, обеспечивая целостный взгляд на механизмы заболевания. Сетевая фармакология, алгоритмы прогнозирования лигандов/мишень и in silico молекулярное докирование позволяют систематически исследовать одобренные библиотеки лекарств, ускоряя переориентацию или открытие соединений, способных противодействовать сложным болезням3. Этот сдвиг парадигмы особенно перспективен для выявления терапии, направленных на эндотелиальную дисрегуляцию и её разрушительные микрососудистые последствия, такие как DKD, что открывает потенциал для повышения эффективности и снижения профилей побочных эффектов. Интеграция транскриптомных/секретомных анализов эндотелиальных клеток, подвергшихся гипергликемии, выявила 534 молекулы, часто апрегулированные. Функциональное обогащение связано с ремоделированием внеклеточного матрикса, окислительным стрессом и воспалением в раннем патогенезе DKD. Анализ между базами данных дал приоритет 278 целям с высокой уверенностью, уточнённых через сети ИПП генов-центров. Сетевой фармакологический скрининг одобренных препаратов предсказал 85 кандидатных соединений (включая брефельдин-А, бруцеантин, парацетамол и идеалисиб), направленных на эти узлы. В процессе in silico транскрипционного фактора и стыковки исследовались механизмы. В данной работе определяются эндотелиальные драйверы ДКД, устанавливается вычислительный конвейер открытий и предлагается терапевтические кандидаты на валидацию. В конечном итоге ожидается, что этот канал будет способствовать развитию терапевтических программ открытия по диабетическим осложнениям.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эксперименты на животных проводились с одобрения Комитета по исследованиям и этике животных Медицинского исследовательского института Хэбэй Илин (номер одобрения: N2024082). Ознакомьтесь с Таблицей материалов для изучения экспериментальных материалов и инструментов, использованных в этом исследовании. Персонал должен строго носить соответствующие средства индивидуальной защиты (СИЗ) при работе с опасными реагентами, такими как TRIzol (раздражитель кожи/глаз, содержит фенол) и ингибиторы протеазы (потенциальные респираторные/кожные сенсибилизаторы). Разделять биологические и жидкие отходы в автоклавируемые пакеты и опасные химические отходы в специализированные контейнеры для институциональной утилизации. Дезинфицируйте расходники перед утилизацией.

Моделирование мышей с диабетической нефропатией

Самцы мышей db/db и db/m (12 недель) содержались в специфических условиях без патогенов (SPF) при температуре 22 ± 2 °C и влажности 56% ± 5% с 12-часовым циклами света и темноты, а также с постепенным доступом к пище/воде. После 1-недельного периода акклиматизации мышам случайным образом присваивались числовые идентификаторы и распределялись по экспериментальным группам. Мыши с db/db получали пищу с высоким содержанием белка в течение 6 недель для установления DKD. Успешное моделирование было подтверждено значительно повышенным соотношением альбумина к креатинину в моче (UACR) по сравнению с контролями в дб/м, при этом UACR >30 мг/г служит основным функциональным биомаркером раннегоDKD 12.

Моделирование эндотелиальных клеток с высоким содержанием глюкозы

Эндотелиальные клетки почечных клубочков человека (HRGEC) были подготовлены в стандартизированных условиях. HRGEC культивировались либо в нормальной глюкозе (NG, 5,5 мМ D-глюкозы), либо в среде с высоким содержанием глюкозы (HG, 30 мМ D-глюкозы) и содержались в увлажнённом инкубаторе при 37 °C с 5%CO2. Клетки либо подвергались непрерывному воздействию ГГ, либо выращивались в контрольных условиях в течение 24 часов перед следующим анализом. Следует включить осмотический контроль (ГМ, содержащий 5,5 мМ D-глюкозы с 24,5 мМ маннитола). Все состояния должны соответствовать строгим критериям клеточной приспособленности: жизнеспособность оставалась ≥85%, уровни апоптоза оставались ниже 15%, рост РОС по сравнению с ГМ не превышал 20%, а выброс ЛНГ оставался ниже 10%, что подтверждало целостность клеток до дальнейших анализов.

Коллекция условных носителей

Кондиционированные среды (КМ) собирались с использованием стандартизированного протокола анализасекретомов 13 с модификациями. После 24 часов стимуляции высокого уровня глюкозы (30 мМ Д-глюкозы), нормальной глюкозы (5,5 мМ Д-глюкозы) или осмотического контроля (5,5 мМ Д-глюкозы + 24,5 мМ маннитола), HRGEC промывали стерильным фосфатно-буферным физиологическим раствором (PBS) для удаления остаточных белков сыворотки. Клетки пополнялись базальной эндотелиальной средой без сыворотки и без фенолов, без красного цвета, и инкубировали в течение 12 часов при 37 °C с 5% CO₂ для накопления секретируемых факторов.

CM собирался с помощью предварительно охлаждённых центрифугных трубок. Последовательно обработка выборки проводилась как описано ниже.

Основное уточнение: CM был перемещён в конические трубки без РНаз/DNазы и центрифугирован при 3000 x g в течение 10 минут при 4 °C. Осколки были выброшены.

Ингибирование протеаз: В течение 2 минут после первичного уточнения был добавлен ингредиент с ингибитором протеаз, свободный от ЭДТА, в 1x конечную концентрацию (1:50), содержащий 1x ингибиторы фосфатазы.

Концентрация: Supernatant немедленно загружали в предварительно промываемые центробежные фильтры PBS (3 кДа MWCO) и центрифугировали при 4000 x g в течение 90 минут при 4 °C для достижения концентрации в 10 раз.

Второстепенное уточнение: Концентрат перемещался в предварительно охлаждённые микроцентрифугные трубки и центрифугировался при 12 000 x g в течение 15 минут при 4 °C. Супернатант собирался, избегая гранулированных заполнителей.

Хранение: Аликвоты объёмом 50 мкл были получены в стерильных криовальных с низким уровнем связывания белка. Флаконы были мгновенно замораживаны в жидком азоте в течение 30 минут после завершения сбора урожая. Флаконы хранились при -80 °C (без циклов замораживания-оттаивания).

Партии CM проходили тестирование на эндотоксины (<0,25 EU/mL). Протокол инкубации без сыворотки не выявил индукции стресса (подтверждено иммуноботами HSP70/CHOP). Доход белка CM нормализовался до жизнеспособного количества клеток/содержания ДНК при сборе. Строгость обработки сохраняется: стерильная техника на всех этапах; ≤30 минут от сбора до заморозки; Уравновесление температуры ротора подтверждено.

CCK-8 анализ кондиционированных клеток почечных труб

Для оценки функционального влияния эндотелиального секретома на жизнеспособность тубулярных клеток почки был проведён анализ CCK-8 на проксимальной трубочной эпителиальной линии HK-2 человека, обработанной КМ, полученным из эндотелиальных клеток почек почек (HRGEC), в соответствии с установленными протоколами. Клетки HK-2 были культивированы в среде DMEM с дополнением 10% плодовой бычьей сыворотки (FBS). Для анализа ячейки засеивались в пластины с 96 лунками с плотностью 5 x 10³ ячеек на каждую скважину. Сывороточное голодание клеток проводилось в течение 12 часов в среде с содержанием 0,5% FBS непосредственно перед лечением КМ.

CM применялся с равной общей нормированной массой белка. Замороженные аликвоты CM размораживались при 37 °C в сухой ванне (<5 мин) и очищались центрифугированием при 10 000 x g в течение 5 минут при 4 °C. Клетки HK-2 (100 мкл/скважины) обрабатывались HG-cm, ng-cm или HM-CM, нормализовав с соответствующим содержанием белка и ДНК. Всего было подготовлено по 3 биологических репликации на каждое состояние (по 3 технических реплики каждого). Образцы инкубировали при 37 °C с 5% CO₂ в течение 24 часов. Жизнеспособность клеток оценивалась с помощью Cell Counting Kit-8. Для этого в каждую скважину добавляли 10 мкл раствора CCK-8 и инкубировали 1–4 часа при 37 °C. Поглощение измерялось при 450 нм с помощью считывателя микропластин. Жизнеспособность рассчитывалась следующим образом:

Жизнеспособность (%) = [(A_sample - A_blank) / (A_baseline_control - A_blank)] x 100

Обнаружение окислительного стресса

Уровни клеточного малондиалдегида (MDA) были количественно измерены — одним из основных конечных продуктов перекисления липидов мембраны — с помощью TBA-анализа. Клеточные лизаты (1 x 107 клеток) очищались путём центрифугирования при 10 000 x г в течение 15 минут, после чего 0,02 мл супернатант был аликотирован в пробирки вместе с 0,02 мл стандарта MDA. К аликвоту добавляли 0,02 мл ясного вещества и 0,6 мл кислотного реагента. Образцы/стандарты обработаны 0,2 мл хромогенного агента (контрольные пробирки: добавлено 0,2 мл 50% уксусной кислоты). После герметизации, смешивания и инкубации при 100 °C в течение 40 минут образцы охлаждались и центрифугировали при 9569 x г в течение 10 минут. Супернатант переносился на микропластины при 250 мкл для измерения OD₅₃₂.

Транскриптомическое профилирование

Общая РНК была выделена с помощью реагента TRIzol согласно протоколу производителя. Количество и чистота РНК оценивались с помощью спектрофотометра и фрагментоанализатора соответственно. Только высококачественные образцы РНК использовались с числом целостности РНК (RIN) > 7.0 для построения библиотеки секвенирования.

Полиаденилированная (поли(A)+) мРНК обогащалась двумя раундами отбора на основе магнитных шариков на основе олиго(dT). Очищенная мРНК была фрагментирована до 200-300 нуклеотидов с помощью набора для фрагментации на основе магния при температуре 94 °C в течение 5-7 минут. Синтез кДНК первой цепи осуществлялся с помощью обратной транскриптазы, затем синтез кДНК второй цепи с использованием полимеразы E. coli ДНК I и RNase H в присутствии dUTP (для обеспечения специфичности цепочек). Последующие этапы включали ремонт концов, A-хвост, перевязку адаптеров и выбор размера с помощью магнитных шариков. До амплификации ПЦР вторая цепь, инкорпорированная в dUTP, переваривалась с помощью фермента UDG.

Была создана специализированная библиотека с средним размером вставка 400 ± 50 bp с использованием ПЦР при следующих условиях: начальная денатурация при 98 °C в течение 1 минуты; 14 циклов денатурации при 98 °C в течение 10 с, отжига при 60 °C 30 с и удлинения при 72 °C в течение 30 с; и финальное удлинение при 72 °C в течение 5 минут. Парное секвенирование с частотой 150 bp проводилось на платформе Illumina с глубиной секвенирования ≥40 миллионов чтений на образец (Q30 > 85%).

Биоинформатический анализ транскриптомических данных

Проверка качества исходных считываний проводилась с помощью FastQC (v0.11.8), а выравнивание с референсным геномом GRCh38.p13 с помощью HISAT2 (v2.2.1). Количественная оценка транскриптов и сборка транскрипта по выборке выполнялись с помощью StringTie (v2.1.6) с параметрами по умолчанию. Все собранные транскриптомы объединялись из отдельных образцов для восстановления комплексного транскриптома с помощью программного обеспечения gffcompare (версия 0.12.6; gffcompare — это отдельный инструмент, не входит в состав StringTie, и его версия скорректирована на общий стабильный релиз). Дифференциальный анализ экспрессии проводился с помощью DESeq2 (v1.38.3) с использованием порогов |log2 fold change (FC)| > 1 и коэффициент ложного обнаружения (FDR) < 0,05. Пакетные эффекты корректировались с помощью пакета variancePartition.

Секретомный протеомный анализ

КМ был собран из HRGEC, культивируемых в условиях контроля NG, HG или HM с использованием ранее описанногометода 13 с модификациями для секретомного анализа. Клетки промывались PBS после стимуляции и инкубировали в безсывороточной среде в течение 12 часов. СМ собирали и центрифугировали при 3 000 x g в течение 10 минут (4 °C).

Равные количества пептида из каждого образца смешивались, затем разбавлялись растворителем A (5% ACN, pH 9,8) и вводили в колонку. Фракционирование пептидной смеси проводилось с использованием колонки размером 3,5 мкм 4,6 x 150 300Extend-C18 на системе двойного быстрого разделения. Градиентная элюция проводилась при расходе 0,3 мл/мин: от 5% до 21% растворителя B (97% ACN, pH 9,8) за 38 минут, 21,5–40% растворителя B за 20 минут, 40–90% растворителя B за 2 минуты, 90% растворителя B в течение 3 минут и 5% растворителя B в уравновешенном состоянии 10 минут. Пики элюции отслеживались на 214 нм, а фракции собирались каждую минуту. Фракции комбинировались по хроматограммам пиков элюирования. Всего было собрано 10 фраций, которые затем были залимированы.

Были подготовлены подвижные фазы A (100% вода, 0,1% муравиная кислота) и B (80% ацетонитрил), а высушенные образцы пептида восстанавливались с 0,1% муравьиной кислоты и центрифугированы при 20 000 x g в течение 10 минут. Разделение осуществлялось с помощью жидкофазовой системы UHPLC. Образцы подавались на столбец ES906 HPLC (150 мм) с градиентом 8 минут при 2,5 мкл/мин и разделялись по следующему эффективному градиенту: 0-4 мин, 4% подвижной фазы B с линейным ростом до 25%; 4-6,9 мин, мобильная фаза B линейно увеличивается с 25% до 35%; 6,9–7,3 мин, мобильная фаза B линейно увеличивается с 35% до 99%; 7,3-8,0 мин, поддерживал мобильную фазу B на 99%. Пептиды, разделённые в жидкой фазе, передавались на масс-спектрометр для обнаружения в режиме DIA. Основные параметры были установлены следующим образом: нормализованная энергия столкновения 25%, стандартное состояние заряда 2, разрешение 240 000, сканирование каждые 0,6 с, диапазон сканирования 380-980 м/з, масс-спектрометрия AGC 500%. Фрагментационные ионные сканирования записывались с максимальным временем сканирования 3 мс и использовали 300 2-х окон сканирования со скоростью от 380 до 980 м/ц.

DIA-NN (https://www.nature.com/articles/s41592-019-0638-x, версия 1.9.1) использовался для анализа данных DIA методом без библиотеки. Данные MS/MS были проанализированы по белковым последовательностям, которые скачивались из базы данных Uniprot со следующими настройками: фермент: трипсин/P; Максимальное количество пропущенных декольте: 2; фиксированная модификация: карбамидометил (C); переменные модификации: окисление (M) и ацетил (белок N-терм); толерантность к массе предшественников: 20 ppm; Толерантность к массе осколков: 0,05Да. Результаты были отфильтрованы по 1% FDR, и в дальнейшем анализе использовались только те белковые группы, которые соответствовали этому критерию.

Омикс-анализ функционального обогащения (GO, KEGG и GSEA)

Анализы функционального обогащения проводились на фильтрованных наборах дифференциально экспрессируемых генов (транскриптомика) и белков (протеомики секретома) по установленным биоинформатическим конвейерам. Идентификаторы отображались с помощью Org.Hs.eg.db. Обогащение ГО (биологические процессы, молекулярные функции, клеточные компоненты) осуществлялось с помощью clusterProfiler. Скорректированное p-значение Бенджамини-Хохберга < 0,05, а для конденсирования терминов применялось уменьшение семантического сходства (срез=0,7). Анализ путей KEGG проводился с использованием KEGG REST API (HAS, релиз 2023 года). Использовалось гипергеометрическое тестирование с коррекцией Екутиели ФДР. Визуализация топологии путей была выполнена с помощью Pathview. GSEA применялась с использованием рангового подхода с ранжированием генов сигнал/шум. Было проведено тестирование на основе коллекций MSigDB (HALLMARK, C2, C5; v2023.2) и кураторских диабетических эндотелиальных сигнатур. Значимость оценивалась после 1000 перестановок фенотипов (FDR < 25%).

Анализ сетей взаимодействия белков и белков

Для выявления основных молекулярных регуляторов в патогенном кандидатском пуле были проведены построение сети ИПП и топологический анализ с использованием интегрированного вычислительного рабочего процесса. 278 кандидатных генов были отправлены в базу данных STRING (v12.0; Homo sapiens; Источники доказательств включали экспериментальные, коэкспрессионные и кураторские базы данных; порог доверия взаимодействия (комбинированный балл) >0,7 для рёбер с высокой уверенностью; и никакой дополнительной инфляции интеракторов. Результаты импортировались в Cytoscape (v3.9.1), а анализ топологии сети проводился с помощью плагинов MCODE (v1.5.2) и CytoHubba (v0.4.1). Впоследствии сеть была визуально оптимизирована в зависимости от степени соединения узлов, так что узлы с высокой связностью были темнее по цвету, крупнее по размеру и более выражены по метке.

Разработка набора генов-таргетов для диабетического заболевания почек

Критерии ко-апергуляционных мРНК/белков были определены следующим образом: транскриптом (FDR < 0,05 и |log2FC| > 1) и секретом (FDR < 0,01 и |log2FC| > 1,5). Имена белков и генов нормализовались с помощью UniProt и конвертировались в единый формат (Gene Symbol). Набор целевых генов для диабетических заболеваний почек был создан путём интеграции генов, связанных с заболеваниями, из нескольких публичных баз данных, включая GeneCards (версия 5.25, запрос: Diabetic Nephropathies, дата доступа июль 2025), Comparative Toxicogenomics Database (CTD; https://ctdbase.org/, запрос: Diabetic Nephropathies, дата доступа июль 2025) и Open Targets Platform (https://platform.opentargets.org/, версия 0.13.8, запрос: Diabetic Nephropathies, дата доступа июль 2025) 13,14,15. Этот набор был обозначен как комплексный эталонный набор диабетических заболеваний почек. Для дальнейших анализов было выявлено пересечение между ко-регулируемыми мРНК/белками и этим набором генов.

Обнаружение белков CCL2

Для количественной оценки CCL2 пластина с 96 лунками была покрыта захватным антителом (100 мкл/скважина) и инкубирована при 4 °C ночью. На следующий день пластину промыли двухкратным буфером и заблокировали разбавителем ELISA (200 мкл/скважину) на 1 час при RT. 7-точечная стандартная кривая была подготовлена путём двукратного последовательного разведения стандарта S1, затем образцы (100 мкл/скважины) добавлялись и инкубировались в течение 2 часов при 400 об/мин. После 5-кратной промывки добавлялось обнаружение антител (100 мкл/скважину), которое инкубировалось в течение 1 часа при 400 об/мин, затем добавляли раствор фермента (100 мкл/скважину) и инкубировали в течение 30 минут при 400 об/мин. Образцы были получены с использованием субстрата TMB (15-30 мин, RT). Реакция остановилась с кислотой (100 мкл/скважины), а поглощение измерялось на 450 нм (опционально 620 мкм эталон). Ключевые шаги включают строгую промывку, инкубации по времени и стандартизированные разведения для обеспечения воспроизводимости.

Репозиционирование лекарств

Терапевтические соединения предсказывались с помощью следующей платформы: LINCS L1000 Character Direction Signatures Search Engine (L1000CDS2; https://maayanlab.cloud/L1000CDS2). Эта платформа использует метод MODZ и анализ характеристического направления для выявления малых молекул или соединений, способных обращать или имитировать входные сигнатуры экспрессиигенов 16. Кандидаты были определены как те, которые обращают дисрегуляцию дифференциально экспрессируемых почечных генов с помощью этой платформы. Соединения ранжировались на основе их показателей реверсии в линиях почечных клеток по выбранной почке в тканевой колонке, а лучшие кандидаты подвергались молекулярному докированию для оценки их связывающих аффинностей с ключевыми белковыми мишенями.

Скрининг корегуляторных транскрипционных факторов

База данных hTFtarget была запрошена на предмет ко-регуляторных TFs, связывающихся с геном. База данных hTFtarget была проанализирована для выявления взаимосвязей между человеческим транскрипционным фактором (TF) и геном-таргетом путём вычислительного анализа крупномасштабных наборов данных ChIP-Seq по различным клеткам, тканям и условиям. Интегративный конвейер сочетал пиковы сигналы ChIP-Seq с эпигенетическим контекстом для точного определения связывания TF в промоторах/энхансерах, явно учитывая пространственно-временную регуляторную динамику. Как показали Чжан и др., она служила многомерной платформой, позволяющей исследовать цели TF или регуляторы генов, визуализировать данные ChIP-Seq, исследовать кооперативность TF и предсказывать сайтысвязывания 17.

Вычислительный конвейер и анализ для стыковки малых молекул и белков

AutoDock Vina 1.2.018 использовался для проведения молекулярного стыковочного анализа взаимодействий связывания между активными ингредиентами и транскрипционными факторами BRD4, CTCF, EP300 и SPI1. Кристаллические структуры BRD4 (PDB ID: 7REK), CTCF (PDB ID: 5K5I), EP300 (PDB ID: 5NU5) и SPI1 (PDB ID: 8E3K) были получены из Protein Data Bank (https://www.rcsb.org/)19,20. Маломолекулярные структуры в формате SDF загружались из базы данных PubChem (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/ 21), конвертированы в формат MOL2 с помощью Open Babel 2.4.1 и минимизированы по энергии с помощью PyRx 0.8. Предварительная обработка белка осуществлялась путем удаления молекул воды, добавления атомов водорода, вычисления зарядов Гастейгера и их преобразования в формат PDBQT (необходимый для AutoDock Vina). Была использована полугибкая стратегия стыковки, определяющая позицию и размеры стыковочной сетки на основе сайтов связывания сокристаллизованных лигандов в каждом белке. MA9-086 служит положительным контролем для BRD4, а XDM-CBP — для EP300. Для CTCF и SPI1 (без известных положительных лигандов) потенциальные карманы связывания были выявлены с помощью структурного анализа с использованием онлайн-платформы Proteins Plus (https://proteins.plus/). Параметры стыковочной сетки были установлены следующим образом (координаты и размеры в Å вдоль осей x, y и z): центр BRD4 в (-11.907, -8.617, -3.973) с размером коробки (18.387, 18.387, 18.387); Центр CTCF в (15.165, 4.854, 6.388) и размер коробки (17.25, 20.25, 9.75); EP300 по центру (39.781, 5.326, 9.998) и размер коробки (16.516, 16.516, 16.516); Центр SPI1 в (3.155, -3.853, 0.668) и размер коробки (17.25, 25.5, 10.5). Во время стыковки диапазон энергии устанавливался на 3, параметр исчерпывающей — на 8, а расстояние между сетками — на 0,375 Å. Стабильность связывания оценивалась по энергии связывания, где более низкие значения указывали на более стабильные конформации и большую вероятность взаимодействия, с порогом <-5 ккал/моль, определяемым как сильная активностьсвязывания 22,23. Наконец, с помощью PyMOL были выявлены режимы взаимодействия между соединениями и рецепторами.

Статистический анализ

Данные представлены в виде среднего ± SEM. Статистические тесты выбирались на основе нормальности (Шапиро-Уилка) и однородности дисперсии (тест Левена). Для сравнения между группами использовались непарные t-тесты (две группы) или односторонний ANOVA с пост-хок тестами на ЛСД (≥3 группы). p < 0,05 определялся как порог значимости. Графы генерировались с помощью GraphPad Prism 9.0.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Демонстрация патогенного воздействия гипергликемического эндотелиального секретома на почечные канальцы

Исследование началось с подтверждения патогенного эффекта гипергликемического эндотелиального секретома. Кондиционированная среда из гипергликемических эндотелиальных клеток человека (HG-CM) значительно ухудшила жизнеспособность человеческих эпителиальных клеток проксимального канальца (HK-2) по сравнению с ко...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В данном исследовании установлена, что дисфункция эндотелиального секретома, вызванная гипергликемией, является критическим фактором диабетического повреждения почек с помощью интегрированных мультиомических и вычислительных подходов. Демонстрация того, что цитотоксичность, опосредованная секретомом, в отношении почечных канальцочек совпадает с систематической дисрегуляцией 534 эндотелиальных факторов, сходящихся на ремоделирование матрикса, окислительный стресс и воспаление в патогенезе...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана Национальным фондом естественных наук Китая (32200644), Проектом программы науки и технологий Хэбэя (246W2501D, 252W7716D) и Золотой платформой Яньчжао (A20240022).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Комплект для ELISA CCL2Термо Фишер Сайентифик#88-7399-88
Ингибитор CCR2Мерк Миллипор#227016
Набор для анализа жизнеспособности клетокСемь биотехнологийCCK-8, SC119-01
Секвенсор ДНКIlluminaNovaSeq 6000
Высокопроизводительная система жидкостной хроматографииТермо Фишер СайентификUltiMate 3000 Binary RSLC
HRGEC Культурный медиумШанхайская Zhong Qiao Xin Zhou Biotechnology Co., Ltd.1001
Эндотелиальные клетки почечных клубочков человека (HRGEC)Шанхайская Чжунцяо Синьчжоу БиотехнологияPRI-H-00038
Полная среда человеческой почечной трубчатой эпителиальной клетки  ПроцеллCM-H193
Трубчатые эпителиальные клетки человека почки (HK2)ПроцеллCP-H193
Самцы мышей типа db/db и db/m (4 недели)Биотехнологическая компания Ханчжоу ЦзыюаньSCXK 20190004
Масс-спектрометрТермо Фишер СайентификАстральный
Считыватель поглощения микропластинМолекулярные устройстваSpectraMax iD5
Коктейль с ингибиторами протеазы (без ЭДТА)РошcOmplete, #5056489001
Реагент для экстракции РНКТермо Фишер СайентификTRIzol, #15596026
Анализатор качества РНКAgilent TechnologiesАнализатор фрагментов 5300, M5311AA
Инструмент количественной оценки РНКТермо Фишер СайентификКубит 3.0, Q33216
Набор для обнаружения ROSТермо Фишер Сайентифик#EEA019
Ультрафильтрационные центробежные устройства (3 кДа MWCO)Мерк МиллипорAmicon Ultra-4

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Tuttle, K. R., et al. Diabetic kidney disease: a report from an ADA Consensus Conference. Diabetes Care. 37 (10), 2864-2883 (2014).
  2. Gu, H. F. Genetic and Epigenetic Studies in Diabetic Kidney Disease. Front Genet. 10, 507(2019).
  3. Młynarska, E., et al. Novel Insights into Diabetic Kidney Disease. Int J Mol Sci. 25 (18), (2024).
  4. Tanase, D. M., et al. Oxidative Stress and NRF2/KEAP1/ARE Pathway in Diabetic Kidney Disease (DKD): New Perspectives. Biomolecules. 12 (9), (2022).
  5. Li, S., et al. Research progress on extracellular vesicles in the renal tubular injury of diabetic kidney disease. Front Endocrinol (Lausanne). 14, 1257430(2023).
  6. Chen, Y., et al. ANGPT2/CAV1 regulates albumin transcytosis of glomerular endothelial cells under high glucose exposure and is impaired by losartan. Nefrologia (Engl Ed). 44 (1), 50-60 (2024).
  7. Chae, S. Y., Kim, Y., Park, C. W. Oxidative Stress Induced by Lipotoxicity and Renal Hypoxia in Diabetic Kidney Disease and Possible Therapeutic Interventions: Targeting the Lipid Metabolism and Hypoxia. Antioxidants. 12 (12), (2023).
  8. Wang, X., et al. CERS6-derived ceramides aggravate kidney fibrosis by inhibiting PINK1-mediated mitophagy in diabetic kidney disease. Am J Physiol Cell Physiol. 325 (2), C538-C549 (2023).
  9. Zou, Y., et al. Development and internal validation of machine learning algorithms for end-stage renal disease risk prediction model of people with type 2 diabetes mellitus and diabetic kidney disease. Ren Fail. 44 (1), 562-570 (2022).
  10. Ma, L., et al. Baicalin Alleviates Oxidative Stress and Inflammation in Diabetic Nephropathy via Nrf2 and MAPK Signaling Pathway. Drug Des Devel Ther. 15, 3207-3221 (2021).
  11. Du, L., et al. Inhibition of S100A8/A9 ameliorates renal interstitial fibrosis in diabetic nephropathy. Metabolism. 144, 155376(2023).
  12. Imafuku, T., et al. Cysteinylated Albumin as a Potential Biomarker for the Progression of Kidney Disease in Patients With Type 2 Diabetes. Diabetes Care. 44 (6), e115-e117 (2021).
  13. Ochoa, D., et al. The next-generation Open Targets Platform: reimagined, redesigned, rebuilt. Nuc Acids Res. 51 (D1), D1353-D1359 (2023).
  14. Safran, M., et al. GeneCards Version 3: the human gene integrator. Database (Oxford). 2010, baq020(2010).
  15. Davis, A. P., et al. Comparative Toxicogenomics Database (CTD): update 2023. Nucl Acids Res. 51 (D1), D1257-D2126 (2023).
  16. Duan, Q., et al. L1000CDS2: LINCS L1000 characteristic direction signatures search engine. NPJ Syst Biol Appl. 2 (1), (2016).
  17. Zhang, Q., et al. hTFtarget: A Comprehensive Database for Regulations of Human Transcription Factors and Their Targets. Genom Proteo Bioinfo. 18 (2), 120-128 (2020).
  18. Trott, O., Olson, A. J. AutoDock Vina: Improving the speed and accuracy of docking with a new scoring function, efficient optimization, and multithreading. J Comp Chem. 31 (2), 455-461 (2009).
  19. Karuppasamy, M. P., Venkateswaran, S., Subbiah, P. PDB-2-PBv3.0: An updated protein block database. J Bioinfo Comp Biol. 18 (02), (2020).
  20. O'Boyle, N. M., et al. Open Babel: An open chemical toolbox. J Cheminfo. 3 (1), (2011).
  21. Kim, S., et al. PubChem Substance and Compound databases. Nuc Acids Res. 44 (D1), D1202-D1213 (2016).
  22. Li, B., Rui, J., Ding, X., Yang, X. Exploring the multicomponent synergy mechanism of Banxia Xiexin Decoction on irritable bowel syndrome by a systems pharmacology strategy. J Ethnopharmacol. 233, 158-168 (2019).
  23. Xue, B., et al. A System-Level Investigation into the Mechanisms of Chinese Traditional Medicine: Compound Danshen Formula for Cardiovascular Disease Treatment. PLoS ONE. 7 (9), (2012).
  24. Kasiske, B. L., et al. Response to Bui et al, "Patient Functional Status at Transplant and Its Impact on Posttransplant Survival of Adult Deceased-donor Kidney Recipients". Transplantation. 104 (2), e59(2020).
  25. Kawecki, C., Lenting, P. J., Denis, C. V. von Willebrand factor and inflammation. J Thromb Haemost. 15 (7), 1285-1294 (2017).
  26. Wilkening, A., et al. C-C chemokine receptor type 2 mediates glomerular injury and interstitial fibrosis in focal segmental glomerulosclerosis. Nephrol Dial Transplant. 35 (2), 227-239 (2020).
  27. Karasek, D., et al. Association of pigment epithelium derived factor with von Willebrand factor and plasminogen activator inhibitor 1 in patients with type 2 diabetes. Physiol Res. 68 (3), 409-418 (2019).
  28. Liu, J., et al. Single-Cell Spatial Transcriptomics Unveils Platelet-Fueled Cycling Macrophages for Kidney Fibrosis. Adv Sci (Weinh). 11 (29), e2308505(2024).
  29. Passi, I., Salwan, S., Kumar, B. US-FDA Approved Drugs in 2020 and 2021: A Review. Mini Rev Med Chem. 23 (12), 1273-1297 (2023).
  30. Das, P., Delost, M. D., Qureshi, M. H., Smith, D. T., Njardarson, J. T. A Survey of the Structures of US FDA Approved Combination Drugs. J Med Chem. 62 (9), 4265-4311 (2019).
  31. Zhou, L., et al. Brefeldin A inhibits colorectal cancer growth by triggering Bip/Akt-regulated autophagy. Faseb J. 33 (4), 5520-5534 (2019).
  32. Issa, M. E., Berndt, S., Carpentier, G., Pezzuto, J. M., Cuendet, M. Bruceantin inhibits multiple myeloma cancer stem cell proliferation. Cancer Biol Ther. 17 (9), 966-975 (2016).
  33. Guzzi, F., Cirillo, L., Roperto, R. M., Romagnani, P., Lazzeri, E. Molecular Mechanisms of the Acute Kidney Injury to Chronic Kidney Disease Transition: An Updated View. Int J Mol Sci. 20 (19), (2019).
  34. Tesch, G. H. MCP-1/CCL2: a new diagnostic marker and therapeutic target for progressive renal injury in diabetic nephropathy. Am J Physiol Renal Physiol. 294 (4), F697-F701 (2008).
  35. Wu, F., Sun, C. The Role of Chemokine Receptors in Renal Fibrosis. Rev Physiol Biochem Pharmacol. 177, 1-24 (2020).
  36. Davids, M. S., et al. An Integrated Safety Analysis of the Next Generation PI3Kδ Inhibitor Umbralisib (TGR-1202) in Patients with Relapsed/Refractory Lymphoid Malignancies. blood. 130, 4037(2017).
  37. Marar, P. V., Kumar, A., Swami, R., Shrivastava, S., Jeengar, M. K. Unlocking the Potential of Brusatol as an Antitumoral Agent: Molecular Mechanisms and Therapeutic Benefits. Rev Brasileira Farmaco. 34, 250-260 (2024).
  38. Seifert, S. A., et al. Acute hepatotoxicity associated with therapeutic doses of intravenous acetaminophen. Clin Toxicol. 54 (3), 282-285 (2016).
  39. Bolesta, S., Haber, S. L. Hepatotoxicity Associated with Chronic Acetaminophen Administration in Patients without Risk Factors. Ann Pharmacother. 36 (2), 331-333 (2002).
  40. Zhao, L., Zou, Y., Liu, F. Transforming Growth Factor-Beta1 in Diabetic Kidney Disease. Front Cell Dev Biol. 8, 187(2020).
  41. Matoba, K., et al. Unraveling the Role of Inflammation in the Pathogenesis of Diabetic Kidney Disease. Int J Mol Sci. 20 (14), (2019).
  42. Ezzo, M., Hinz, B. Novel approaches to target fibroblast mechanotransduction in fibroproliferative diseases. Pharmacol Ther. 250, 108528(2023).
  43. Giarratana, A. O., Prendergast, C. M., Salvatore, M. M., Capaccione, K. M. TGF-β signaling: critical nexus of fibrogenesis and cancer. J Transl Med. 22 (1), 594(2024).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Endothelial DysfunctionDiabetic Kidney DiseaseMulti Omics AnalysisTranscriptomic ProfilingSecretome ProteomicsHyperglycemic Endothelial CellsProtein Interaction NetworkDrug RepurposingNetwork PharmacologyMolecular Docking

Related Articles