Method Article

Автоматизированная подготовка образца для мультиплексированного анализа посттрансляционных модификаций гистонов с одной клетками (sc-hPTM2)

DOI:

10.3791/69588

⸱

December 19th, 2025

 ,  ,  ,  , 
1Albert Einstein College of Medicine, 2SCIENION, 3Department of Chemical, Life and Environmental Sustainability Sciences, University of Parma

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы представляем протокол автоматизации анализа посттрансляционной модификации гистонов в одной клеточке с использованием стратегии изотопного двухплексного маркировки и переваривания ArgC. Этот рабочий процесс позволяет количественное, воспроизводимое и высокочувствительное профилирование гетерогенности хроматина и эпигенетических ответов с одноклеточным разрешением.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Посттрансляционные модификации гистонов (hPTM) являются центральными регуляторами организации хроматина и экспрессии генов. Их дисрегуляция связана с развитием, раком и старением. Хотя масс-спектрометрия является основным методом изучения hPTM, большинство протоколов разработаны для объёма образцов и не могут определить вариативность между клетками. Поэтому расширение анализа гистонного PTM на уровень одной клетки необходимо, но технически сложно, так как гистоны малообъёмны, богаты лизином и сильно модифицированы.

Здесь мы описываем автоматизированный одноклеточный протеомический рабочий процесс для анализа гистонов PTM с использованием обработки наножидкостных средств. Система позволяет обрабатывать отдельные клетки в масштабе нанолитров с минимальной обработкой и высокой воспроизводимостью. Рабочий процесс включает пищеварение с протеазой ArgC Ultra, которая расщепляет остатки аргинина и избегает необходимости в этапах дериватизации, блокирующих лизин, обычно требуемых в протеомике гистонов. Для количественного сравнения условий мы применяем двухплексную стратегию маркировки пропионного ангидрида и его дейтерированного аналога — пропионного ангидрида-d10. Это сочетание автоматизированной подготовки образцов, изотопного мультиплексирования и переваривания ArgC Ultra приводит к упрощённому и чувствительному протоколу анализа гистонов PTM в одной клетке.

Метод позволяет исследовать гетерогенность хроматина и влияние эпигенетических возмущений при разрешении отдельных клеток. Для демонстрации рабочего процесса мы собрали сфероиды из клеток гепатоцеллюлярной карциномы гепатоцеллюля HepG2/C3A и обработали их бутиратом натрия — ингибитором гистондеацетилазы, вызывающим гиперацетилирование.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Гистоны — это белковые компоненты нуклеосом, повторяющихся единиц хроматина. Их N-конечные хвосты богаты остатками лизина и аргинина и сильно регулируются посттрансляционными модификациями (ПТМ), такими как ацетилирование, метилирование и фосфорилирование. Эти модификации влияют на доступность ДНК и, следовательно, контролируют процессы, включая транскрипцию, репликацию и восстановление. Изменённые паттерны гистонного ПТМ тесно связаны с заболеваниями — от рака до нейродегенерации истарения 1,2. По этой причине анализ гистонов PTM вызвал большой интерес в исследованиях в области эпигенетики и протеомики. Масс-спектрометрия (РС) обеспечивает специфичный для места и количественный анализ модификаций гистонов, но гистоны представляют собой уникальные аналитические задачи. Их аминокислотный состав, множество сайтов модификации и сложные комбинаторные паттерны делают их более сложными для анализа, чем типичные белки. Устоявшиеся протоколы используют химическую дериватизацию для блокировки остатков лизина до переваривания, что улучшает восстановление пептида и хроматографическиехарактеристики 3. Хотя они эффективны в массовом анализе, эти многоступенчатые протоколы дериватизации могут создавать потери, которые вызывают проблемы для входов с одной ячейкой. Одноклеточный анализ становится всё более важным, поскольку биологические системы по своей природе гетерогенны. Объёмный гистон анализирует средние сигналы по многим клеткам и поэтому не фиксирует эту изменчивость. Субпопуляции клеток могут различаться по состоянию хроматина, и эти различия могут способствовать развитию, перепрограммированию клеток или лекарственнымреакциям 4,5.

Здесь представлен автоматизированный метод подготовки образца для мультиплексированного одноклеточного гистонного PTM анализа (sc-hPTM2). Этот метод основан на системе CellenONE, которая позволяет автоматически автоматизировать дозирование отдельных клеток и реагентов масштаба нанолитров. Этот метод является вариацией метода нано-протеомной подготовки образцов (nPOP), который впервые ввёл использование капельной подготовки на стеклянномстекле 6. Платформа nPOP оснащена современной автоматизированной одноклеточной протеомикой, однако её стандартный протокол триптического переваривания неоптимальн для гистонов из-за их высокого содержания лизина и обширной плотности модификации. Здесь мы адаптировали систему CellenONE, чтобы включить золотой стандарт дериватизации гистонов с пропионным ангидридом и внедрили изотопную маркировку, что позволило точно и всесторонне количественно оценивать посттрансляционные модификации гистонов с разрешением одной ячейки. В частности, мы упрощаем протокол, используя протеазу ArgC Ultra для переваривания белка. В отличие от трипсина, ArgC расщепляет только остатки аргинина и не требует блокировки лизина. Это устраняет необходимость двухэтапной стратегии дериватизации, оптимизируя протокол. Кроме того, метод включает двухплексную изотопную схему маркировки с использованием пропионанангидрида и пропионанангидрида-d10, что позволяет одновременно анализировать 2 клетки 7,3. После переваривания и маркировки образцы одноклеточных образцов извлекаются и анализируются с помощью жидкой хроматографии-масс-спектрометрии (LC-MS)/MS с использованием независимого от данных забора (DIA). В наших глазах этот метод показал повышение как чувствительности, так и воспроизводимости для количественной оценки гистонных ПТМ по сравнению с предыдущей версиейэтого метода 8.

Для демонстрации метода мы профилировали динамику одноклеточного гистонного PTM в сфероидах, полученных из клеток гепатоцеллюлярной карциномы гепатита HepG2/C3A. Мы обработали эти сфероиды бутиратом натрия — хорошо охарактеризованным ингибитором деацетилазы гистона, который увеличивает ацетилирование гистонов и служит ориентиром для изучения хроматиновойрегуляции 9,10. Сравнивая контролируемые и обработанные бутиратом натрия сфероиды с одноклеточным разрешением, мы демонстрируем принцип репрезентативных результатов, подчёркивающий потенциал более широкого применения в биологии хроматина и эпигенетике рака. В частности, для протокола мы ссылаемся на предыдущую публикацию, описывающую рост и обработку3D-сфероидов 10, получение гистон-пептидов вмасс-спектрометрии 11 и анализ данных с помощью программного обеспеченияEpiProfile 12.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Буферы и реагенты

  1. Среда роста клеток для клеток HepG2/C3A: Приготовьте модифицированную среду Eagle's Medium от Dulbecco (DMEM, 4,5 г/л глюкозы), содержащую 10% сыворотки плода бычьего скота (FBS), несущественные аминокислоты (1% v/v), L-глутамин (1% v/v) и пенициллин/стрептомицин (0,5% v/v). Среда для роста хранится при 4 °C.
  2. Мастер-смесь: приготовьте ArgC Ultra 60 нг/мл, HEPES 6 мМ, n-додецил-β-D-мальтозид (DDM) 0,03%, дитиотрейтол (DTT) 10 мМ в воде класса LC-MS.
  3. Раствор HA: Приготовьте 1% (v/v) гидроксиламина в воде класса LC-MS.
  4. Раствор для промывки: приготовьте 10 мл смеси ацетонитрила и воды 50:50, содержащей 0,1% (с весом) муравьиной кислоты (все класса LC-MS).
  5. Мобильная фаза A (MPA) — 0,1% муравьиной кислоты: добавьте 1 мл концентрированной муравьиной кислоты к 999 мл воды HPLC-класса и хорошо перемешайте.
  6. Мобильная фаза B (MPB) — 80% ацетонитрила ВЭЖХ + 0,1% муравьиной кислоты: добавьте 800 мл ацетонитрила HPLC-класса к 199 мл воды HPLC-класса. Затем добавьте 1 мл концентрированной муравьиной кислоты в этот раствор и перемешайте.

2. Подготовка сфероидов

  1. Для подготовки сфероидов см. Странски С и др. 11.
  2. Культивировать клетки гепатоцеллюлярной карциномы HepG2/C3A в вращающемся трёхмерном (3D) биореакторе в течение 5-7 дней, чтобы способствовать равномерному формированию сфероидов до достижения диаметра ~400-600 мкм. Используйте DMEM с добавлением 10% FBS, 1% незаменительных аминокислот, 1% L-глутамина и 0,5% пенициллина/стрептомицина. Поддерживайте сфероиды при 37 °C и 5%CO2 до лечения.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Рисунок 1A показывает оборудование, используемое для подготовки сфероидов в справочной бумаге.

3. Культивирование и обработка клеток

  1. Поместите ~10 сфероидов в 6-лучную пластину с тканевой культурой, содержащую 2 мл среды роста.
  2. Инкубировать клетки при 37 °C в увлажнённом инкубаторе с содержанием CO2 5%.
  3. Обработайте сфероиды в течение 24 часов бутиратом натрия 5 мм или добавьте такой же объём воды для контроля (рисунок 1B).

4. Изоляция ячеек и подготовка суспензии в одной ячейке

  1. После 24 часов обработки инкубировать клетки с 1 мл трипЛЭ при 37 °C в течение 3-5 минут.
  2. Аккуратно пипетируйте вверх и вниз, пока сфероид не расщепится и не получится отдельные клетки.
  3. Соберите клетки в трубку на 15 мл и промыть, разбавляя до 10 мл ледяной 1x PBS, центрифугуйте при 500 г в течение 5 минут при 4 °C и аспирируйте супернатант.
  4. Суспензируйте клетки в 1 мл ледяной температуры 1x PBS и добавьте окрашивание Sytox зелёной мёртвой клеток с конечной концентрацией 1 мкм.
  5. Инкубировать клетку с Sytox green в течение 20 минут на льду в тёмной среде.
  6. Промыйте ячейку 10 мл ледяной жидкости 1x PBS, центрифугуйте при 500 г на 5 минут при 4 °C и аспирируйте супернатант.
  7. Суспензировать клетки в 1 мл ледяного 1x PBS и добавить параформальдегид (PFA) с конечной концентрацией 0,5%.
  8. Инкубировать клетку с PFA в течение 15 минут на льду.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Хотя зеленый Sytox обычно несовместим с фиксацией из-за мембранной проницаемости, для клеток мы тестировали долю зеленых клеток Sytox остаётся прежней до 8 часов после фиксации без признаков утечки белка гистонов.
  9. Промыйте ячейку 10 мл ледяной жидкости 1x PBS, центрифугуйте при 500 г на 5 минут при 4 °C и аспирируйте супернатант.
  10. Восстановить клетки при конечной концентрации 200–500 клеток/мкл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для мелких клеток, которые не склонны к откладыванию, рекомендуется концентрация 500 клеток/мкл, а для крупных клеток, склонных к отложению — 200 клеток/мкл. Если подвеска ячейки склонна к агрегации, пропустите её через сито диаметром 40 мкм перед аспирацией, чтобы избежать засорения сопла. Если ячейки больше 40 мкм представляют интерес и, вероятно, присутствуют в образце, вместо этого можно использовать сито толщиной 70 мкм для удаления очень крупных агрегатов.
  11. Храните ячейки на льду, пока не загрузите их в инструмент для сортировки.

5. Программное подключение и инициализация системы

  1. Включите систему cellenONE (рисунок 2A), загрузите управляющий компьютер, запустите программное обеспечение и откройте пользовательское рабочее пространство v2.0-nPOP2 ; все необходимые файлы полей и шаблоны запуска для nPOP заранее загружаются там.
  2. Убедитесь, что охладитель прибора включён, затем установите значение точки погони росы в зависимости от внутренней температуры, которую сейчас сообщает прибор.
  3. Заготовьте систему с помощью сопел PDC-70 типа 2 (рисунок 2B), установленных в слотах 1 и 3, следуя инструкциям на экране.
  4. Установить ширину импульса и напряжение каждого сопла на значения, указанные на упаковке производителя.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Использование двух отдельных сопел сохраняет консистенцию дозирования: одно подаёт подвеску ячейки, другое — реагенты, так что любые мусоры, прилипшие к сопло, не навредят последующему падению. Использование обоих сопел на финальной стадии сбора также ускоряет извлечение образцов.
    1. (КРИТИЧЕСКИЙ ШАГ) Для максимальной эффективности захвата z-смещение между двумя соплами должно отличаться на <50 мкм. Определите это, определив оптимальное положение контакта для каждого сопла и сравнив показания высоты Z во вкладке «Настройка сопла».
  5. Наполните резервуар увлажнителя деионизированной водой до указанной линии заполнения.

6. Конфигурация предварительного запуска на жидкостном обработчике

  1. Выберите количество стеклянных слайдов (рисунок 2C) для подготовки. Этот выбор напрямую определяет общее количество ячеек, планируемых для анализа.
  2. Для схемы мультиплексирования 2-плексного (рисунок 3A) загрузите один слайд с 320 ячейками.

7. Напуск «рва» диметилсульфоксида (DMSO) вокруг краёв затвора

ПРИМЕЧАНИЕ: Рисунок 3B показывает этапы подготовки образцов в cellenONE, начиная с рва DMSO. В качестве дополнительного предотвращения испарения капель по краям затворов наносят DMSO.

  1. Во вкладке «Главная» выберите забег до 0_Dispense_DMSO_Moat.
  2. Перейдите на вкладку Target Setup , загрузите файл DMSO_Moat.fld из соответствующей папки scheme и установите No. of Fields на Y, что соответствует числу планируемых для обработки слайдов.
  3. Aliquot 150 мкл DMSO класса LC-MS в новую ПЦР-трубку и поместить её во вторую позицию станции CellenWASH так, чтобы крышка трубки была обращена к дверцу приборов.
  4. Откройте вкладку Run и нажмите Start Run. Система будет аспирировать 10 мкл DMSO и делает паузу для подтверждения стабильности капель. Выстрелить тремя тестовыми каплями автодропа (рисунок 4A); если все три идеально сформированы, нажмите «Продолжить бег».
  5. После дозирования сопла автоматически промываются, и инструмент делает изображения на всех стеклах для контроля качества. Просмотрите изображения, чтобы проверить равномерную каплю DMSO на каждом слайде и проверить отсутствие или нецелевые капли (рисунок 4B).

8. Дозирование DMSO

  1. Во вкладке «Главная » выберите пробег в 1_Dispense_DMSO.
  2. Откройте вкладку Target Setup, импортируйте файл DMSO.fld (рисунок 4C) из соответствующего каталога схемы и установите количество полей на Y, соответствующее количеству слайдов, которое вы собираетесь обработать.
  3. Aliquot 150 мкл DMSO класса LC-MS в новую ПЦР-трубку и поместить её во вторую позицию станции CellenWASH так, чтобы крышка трубки была обращена к дверцу приборов.
  4. Откройте вкладку Run и нажмите Start Run. Система будет аспирировать 10 мкл DMSO и делает паузу для подтверждения стабильности капель. Выстрелить тремя каплями для автоматического сброса; если все три идеально сформированы, нажмите «Продолжить бег».
  5. После завершения дозирования программа автоматически промывает сопла и делает изображения на каждом слайде для обеспечения качества. Просматривайте изображения, чтобы убедиться, что на каждом слайде есть одинаковая капля DMSO, а также проверить отсутствие или неточность капель.

9. Раздача ячеек

  1. Во вкладке «Главная » выберите пробежку до 2_Dispense_Cells.
  2. Во вкладке Target Setup откройте подпапку Cells Field Files выбранной папки схемы мультиплексирования.
  3. Поскольку эксперимент включает два условия, выберите файл поля, который соответствует образцу, который собирается сортировать — либо CellType_A.fld, либо CellType_B.fld.
  4. После загрузки файла установите количество полей на Y, чтобы это было равно общему числу слайдов за этот запуск.
  5. Дегаз из подвески ячеек с шага 4.11 с помощью вакуумного насоса на льду на 10 минут.
  6. Перенесите 150 мкл подготовленной ячейки в чистый CellenVIAL, затем поместите флакон в слот 1 карусели CellenWASH так, чтобы крышка была направлена на дверцу приборов.
  7. Перейдите на вкладку Настройка сопло> выполните задачу и выполните Take10ul_CellenVIAL_nozzle1 для аспирации образца из флакона.
  8. Оставаясь на вкладке Настройка сопла , запустите просмотрщик раздачи ячеек (рисунок 5A) и запустите процедуру отображения, чтобы определить зоны выброса и объекты затвора по размеру и удлинению. Параметры изоляции отдельных клеток, показанные на рисунке 5A, соответствуют точным настройкам, используемым для подачи клеток HepG2/C3A, диссоциированных от сфероидов.
  9. Затем активируйте режим флуоресценции, выбрав T > F. Установите режим выбора на отрицательный. Увеличить диапазон параметров изоляции по размеру и интенсивности от минимальных до максимальных значений, чтобы избежать изоляции мёртвых клеток.
  10. Проверьте параметры сопоставления, откройте вкладку Run и нажмите Start Run, затем следуйте программным подсказкам. После окончания дозирования прибор автоматически промывает сопла и делает слайдовые изображения для проверки расположения и равномерности капель.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Во время сортировки ячеек делаются изображения каждой отдельной ячейки, изолированной в ходе запуска (рисунок 5B).
  11. После завершения сортировки ячеек закройте окно для выдачи ячеек.
  12. Сохраняйте остатки суспензии ячеек на льду до окончания раздела 9; Излишки могут быть использованы позже для массовых выборок, создания эмпирических библиотек или дополнительных валидационных исследований.

10. Диспенсирование мастер-микса для пищеварения

  1. Во вкладке «Главная » выберите забег в 2_Dispense_Digest_10ulPickup.
  2. Откройте вкладку Target Setup , загрузите Digest.fld из соответствующей папки мультиплексирующей схемы и установите количество полей в Y , чтобы оно было равно количеству слайдов для этого запуска.
  3. Приготовьте свежую мастер-смесь для разваривания и дегазируйте раствор вакуумным насосом на льде в течение 10 минут (мастер-смесь: ArgC Ultra 60 нг/мл, HEPES 6 мМ, DDM 0,03%, DTT 10 мМ в воде класса LC-MS).
  4. Пипет 20 мкл мастер-смеси в пластину на 384 лунки и поместить пластину внутрь системы X1.
  5. Во вкладке Run нажмите Start Run и следуйте инструкциям. После того как система аспирирует реагент, при запросе подтвердите устойчивость капель.
  6. После завершения дозирования прибор автоматически промывает сопла и фотографирует каждое стекло; Просмотрите изображения, чтобы убедиться, что каждая капля получила смесь для переваривания равномерно.
  7. Инкубировать слайды на ночь для пищеварения, поддерживая заданные параметры влажности и точки росы. Каждая капля содержит ~13,5 нл переварительной смеси. Провести переварку ночью при относительной влажности ~75 %, при этом точка росы поддерживается на 1-2 °C ниже температуры камеры, чтобы предотвратить испарение капель.

11. Инкубация за ночь

  1. Во вкладке «Главная » выберите забег, чтобы 4_Incubation_16h.
  2. Переключитесь на вкладку Run , нажмите Start Run.
    ПРИМЕЧАНИЕ: приборы будут фотографировать слайды каждые 30 минут, чтобы отслеживать состояние капель. Если они высыхают или набухают во время инкубации, регулируйте точку росы по мере необходимости.
  3. После завершения инкубации появится сообщение о завершении инкубации.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Быстрые переваривания (≤4 часа) могут быть достижимы при более высоких эффективных условиях соотношения фермента к субстрату; Здесь это не оценивалось, поэтому валидированное состояние остаётся 16 ч.

12. Испарение

ПРИМЕЧАНИЕ: Перед переходом к этапу маркировки рекомендуется проверить состояние капель, чтобы убедиться, что они не слишком сильно опухли водой, так как вода может повлиять на эффективность маркировки. Для этой цели рекомендуется этап испарения.

  1. Во вкладке «Главная » выберите пробег, чтобы 5_Evaporation.
  2. Перейдите в раздел Файл, Управление охлаждающим блоком, и под контролем точки росы установите фиксированную контрольную температуру на 23 °C.
  3. Переключитесь на вкладку Run , нажмите Start Run. Сушка длится 5 минут, и после сушки приборы автоматически будут делать снимки слайдов.
  4. Осмотреть фотографии; Если капли достаточно сухие, остановите бег. Если нет, нажмите « Продолжить » и высушите ещё 5 минут (рисунок 6A).
  5. В конце прохождения переключитесь обратно на прежний Dew Point Control.

13. Раздаёт этикетки

  1. Во вкладке «Главная » выберите пробег для 6_Dispense_PA_Labels.
  2. Перейдите на вкладку Target Setup , загрузите файл Labels.fld из соответствующей папки scheme и установите No. of Fields на Y, сопоставив количество планируемых для обработки слайдов.
  3. Aliquot 150 мкл DMSO класса LC-MS в слот 2 станции CellenWASH.
  4. Приготовьте стандартный раствор двух маркировочных запасов для мультиплексированной дериватизации гистонов: 25% (v/v) пропионанангидрида в DMSO и 25% (v/v) пропионангидридаd 10 в DMSO.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Дегазируйте оба раствора перед переносом их на пластину, чтобы минимизировать образование пузырей.
  5. Введите по 20 мкл каждого реагента для маркировки в назначенные отверстия пластины с 384 лунками и поместите пластину внутрь системы X1. Каждая капля получает ~10 нл меченого реагента (25% пропионанангидрида или 25% пропионанангидрида-d10 в ДМСО).
  6. Переключитесь на вкладку Run , нажмите Start Run и следуйте инструкциям.
  7. Дайте меткам реагировать на слайде в течение 1 часа.
  8. После дозирования инструмент автоматически промывает сопла и фотографирует каждое стекло. Просмотрите изображения, чтобы убедиться в равномерном распределении и правильном расположении капель на всех слайдах.

14. Выдача HA

  1. Приготовьте раствор HA и отгазируйте его перед использованием.
  2. Загрузи флакон. Пипетка 150 мкл раствора HA в чистую ПЦР-трубку, разместить её в слот CellenWASH 2 и направить крышку к дверцу прибора.
  3. Выберите профиль забега. Во вкладке «Главная » выберите 7_Dispense_Quench.
  4. Настройте файл поля. Откройте вкладку Target Setup , загрузите HA.fld из соответствующей папки мультиплексирующей схемы и установите количество полей в Y , чтобы оно было равно общему числу слайдов.
  5. Начинай бег. Перейдите в «Забег», нажмите «Запустить» и следуйте инструкциям на экране.
  6. Инкубация. Дайте HA реагировать на затворах в течение 30 минут.
  7. Проверьте дозирование. После завершения система промывает сопла и делает изображения каждого слайда, чтобы подтвердить равномерное расположение и объём капель.

15. Подбор образца

  1. Подготовьте раствор для стирки в WashTray XL.
  2. Расставьте тарелку для пожертвования. Налить 2 мкл 0,01% (с ч) DDM в воде класса LC-MS в каждую скважину свежей пластины на 384 и поместить пластину внутрь жидкостного обработчика.
  3. Выберите маршрут для забора. Во вкладке «Главная » выберите профиль 8_Pickup_2plex.
  4. Загрузите файл поля. Откройте вкладку Target Setup , импортируйте Pick-up.fld из правильной папки мультиплексирующей схемы и установите количество полей в Y , чтобы оно совпадало с кольцем слайдов.
  5. Выполняй забег. Переключитесь на вкладку Run , нажмите Start Run и следуйте инструкциям. Прибор собирает каждую каплю, промывает сопла и делает изображение слайдов для проверки, чтобы убедиться, что все образцы собраны.

16. Обработка после выдачи

  1. Запечатайте пластину с 384 скважиной клейкой фольгой и ненадолго центрифугайте, чтобы капли попасли на дно скважин.
  2. Снимите фольгу и высушите образцы на низкой температуре в вакуумном концентраторе.
  3. Запечатайте пластину клеевой фольгой и храните засохшую пластину при -80 °C до готовности для анализа LC-MS/MS.

17. Подготовка крупных образцов

  1. Используя остатки суспензии из секции 9, вращите клетки вниз и ресуспензируйте в 1x PBS для получения концентрации 2000 клеток/мкл. Это должно быть выполнено после завершения раздела 10.
  2. Термический лизис: мгновенно заморозить оставшуюся суспензию при -80 °C в течение 10 минут, затем подвести тепловой шок при 90 °C в течение 10 минут.
  3. Дайте трубке остыть до комнатной температуры.
  4. Перенесите 25 мкл лизата в ПЦР-пробирку и добавьте 5 мкл предварительно приготовленной смеси для пищеварения.
  5. Инкубировать за ночь (≈ 16 часов) при 37 °C в тепловом циклере.
  6. Дериматизация по световой метке: добавить 5 мкл свежей 25% (v/v) световой метки в ацетонитриле и инкубировать 1 час.
  7. Реакционная закалка: добавить 5 мкл 1% раствора гидроксиламина (HA) и инкубировать 30 минут.
  8. Высушите образец в вакуумном концентраторе на низкой температуре, затем храните при -80 °C до готовности для LC-MS/MS.

18. Настройка LC/MS и сбор данных

ПРИМЕЧАНИЕ: Для сбора данных для этой рукописи была установлена система LC-MS\MS с аналитической колонкой Ion Optics 75 мкм x 25 см x 1,7 мкм.

  1. Подготовьте мобильные фазы для работы на ВЭЖХ:
    Мобильная фаза A (MPA): 0,1% муравьиной кислоты в воде класса HPLC
    Мобильная фаза B (MPB): 0,1% муравьиной кислоты в ацетонитриле ВЭЖХ класса
  2. Запрограммировать метод ВЭЖХ для активного градиента продолжительностью 30 минут: 5-23% MPB за 25,7 мин, 23-35% MPB за 2,6 минуты и 35-45% MPB за 1,7 мин, при расходе 200 nL/мин. Запрограммируйте автосэмплер на повторную суспензию образца в 0,1% FA + 0,01% DDM для «сухого» подъёма.
  3. Настройте метод получения MS для выполнения независимого от данных сбора (DIA):
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эти настройки специфичны для Thermo Exploris 480 с FAIMS Pro Duo и могут отличаться в зависимости от вашего инструмента. Рекомендуется использовать те, которые распространены для одноклеточной протеомики DIA с аналогичными диапазонами m/z, как описано ниже.
    1. Установите MS на полное сканирование от 300 до 1100 м/ж с разрешением 120 000, целевой AGC 300%, максимальным временем впрыска 246 мс и FAIMS CV -50 В.
    2. Установьте MS/MS на DIA-скан от 300 до 1100 м/з разрешением 60 000, окном изоляции 50 м/з, энергией столкновения HCD 27%, первой массой 120 м/з, целевой AGC 1000%, максимальным временем впрыска 118 мс и FAIMS CV -50 В.
  4. Удалите уплотнение фольги с пластины на 384 ямы, содержащей отдельные ячейки. Восстановить объёмный образец с концентрацией 100 клеток/мкл при 0,1% FA + 0,01% DDM и перенести 10 мкл в пустую яму, например P24. Затем запечатайте пластину резиновым ковриком и загрузите её в автопробосборщик.
  5. Выстраивайте запуски в очередь: сначала запускайте массовые выборки, а затем наборы отдельных ячеек.

19. Анализ данных

  1. Запустите исходные данные с помощью EpiProfile2.1, чтобы получить результат с содержанием пептидоформ клеток, помеченных пропионным ангидридом.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для использования EpiProfile 2.1 для обработки данных образцы необходимо собирать на приборе Thermo. Это программное обеспечение извлекает примерно 250 пептидоформ в своей канонической версии, но оно редактируемо в зависимости от организма, дополнительных интересующих модификаций, мутаций и т.д.12.
  2. Проверьте исходные данные с EpiProfile2.1_D5, чтобы получить результат с количеством пептидоформ для клеток, помеченных пропионным ангидридом-d10.
  3. Выполните отображение, связывающее метаданные с выходами Epiprofile с помощью программы quantQC.
  4. Отфильтруйте неудачные образцы, сравнивая с бланками.
  5. Отфильтруйте пептидоформы, которые не содержатся как минимум в 50% образцов.
  6. Фильтровать пептидоформы, сигнал интенсивности одной клетки не превышает 150% сигнала в бланках.
  7. Получите таблицу результатов (рисунок 7A) и обработайте данные дальше по мере необходимости.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Чтобы продемонстрировать применение нашего одноклеточного гистонного протеомического процесса в нашей системе, мы проанализировали сфероиды клеток HepG2/C3A, обработанные 5 мМ бутирата натрия в течение 24 часов. После получения LC-MS/MS необработанные данные обрабатывались с помощью EpiProfile как для легкой (пропион-ангидрид), так и для тяжёлой (пропион-ангидрид-d10) маркировки, получая нормализованные данные, отражающие содержание пептидов и гистонных отметок. Пакет QuantQC R затем использовался для отображения метадан...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Возможность измерять посттрансляционные модификации гистонов на уровне отдельных клеток представляет собой критический шаг к пониманию истинной гетерогенности регуляции хроматина. Традиционные методы массового отбора дали бесценную информацию о среднем распределении hPTM по тканям, но при этом они маскируют изменчивость между клетками, которая всё больше признаётся биологическизначимой. Одноклеточные протеомные подходы теперь позволяют нам разрешить этот скрытый с...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Джей Си работает в компании SCIENION US Inc.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы благодарим доктора Бернис Морроу и доктора Джидонга Шана из Центра молекулярной цитогенетики Медицинского колледжа Альберта Эйнштейна за поддержание прибора cellenONE.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Микроцентрифугные трубки объёмом 1,5 млБио-Рад2239480
1000 и микро; Наконечники пипеты с широким диаметром L-го диаметраFisher Scientific14222703
200 и микро; Наконечники пипеты с широким диаметром L-го диаметраFisher Scientific14222730
384-скважинная ПЦР-пластина Lo Bind Эппендорф30129547
96-ядровый вакуумный коллекторМиллипорMAVM0960R
Ацетонитрил, Optima LC-MS/MS классаFisher ScientificA955-1
Клейкая фольга для ПЦР-пластинТермо ФишерAB0626
Безводный ацетонитрилFisher ScientificAA42311AKРешение для маркировки запасов для оптом
Arg-C Ultra, масс-спектрометрический классPromegaVA1831
Вода для клеточной культурыКорнинг25-055-CV
CellenVIALsSCIENION/Каталожный номер сопровождается предложением
DMSO, AnhydrousТермо ФишерD12345Стандартное решение для этикеток
DTTSigmaD0632-5G
Модифицированный средний пистолет Орла Дульбекко (DMEM)Fisher ScientificMT17205CV
Сыворотка плода для быкаFisher ScientificMT35010CV
Муравьиная кислотаТермо28905
Муравьиная кислота 98%– 100% за LC-MS LiChropurSigma5330020050
Сбалансированный сольный раствор Хэнка (HBSS)Fisher ScientificMT21022CV
HEPES (Ultra Pure)Термо Фишер11344041
Ацетонитрил ВЭЖХ классаFisher ScientificA955-4
Вода класса HPLCFisher ScientificW5-4
Раствор гидроксиламина 50 wt. % в H2OSigma438227-50ML
L-глутаминFisher ScientificMT25015CI
n-Додецил-бета-Мальтозид (DDM) детергентFisher ScientificBN2005
Незаменительные аминокислотыFisher ScientificMT25025CI
Масс-спектрометр Orbitrap Exploris 480Термо ФишерBRE725539
Параформальдегид 16% водный раствор EM GradeНауки об электронной микроскопии15710-С
PDC-CM (покрытие типа 2)SCIENION/Каталожный номер сопровождается предложением
Пенициллин-стрептомицинFisher ScientificMT3002CI
Фосфатно-буферный физиологический раствор (PBS), 10x, pH 7,4, без РНазыТермо ФишерAM9625
Пирс диметилсульфоксид (DMSO), LC-MS GradeТермо Фишер85190
Пипет-пушкаЭппендорфZ666467 (Милипор Сигма)
Пропионный ангидрид и ГЭ; 99%Sigma240311-50G
Пропионанангид-d10 ≥ 98 атомов % D, ≥ 99% (CP)Sigma615692-1G
Рефрижераторная центрифугаТермо75-217-420
Стеклянные стекла с покрытием SciCHIP H1SCIENION/Каталожный номер сопровождается предложением
Вакуумный концентратор SpeedVac (пластины с 96 лунками)Термо15308325Savant SPD1010
Стерильный капюшонТермо1375
Стерильные серологические пипеткиFisher Scientific1367549
SYTOX Green Dead Cell Stain для проточной цитометрииТермо ФишерS34860
Фермент TrypLE Express (1X), без фенолового красногоТермо Фишер12604013
ВихрьSigmaZ258415
Водяная баняFisher ScientificFSGPD10

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bannister, A. J., Kouzarides, T. Regulation of chromatin by histone modifications. Cell Res. 21 (3), 381-395 (2011).
  2. Jenuwein, T., Allis, C. D. Translating the histone code. Science. 293 (5532), 1074-1080 (2001).
  3. Sidoli, S., Bhanu, N. V., Karch, K. R., Wang, X., Garcia, B. A. Complete workflow for analysis of histone post-translational modifications using bottom-up mass spectrometry: from histone extraction to data analysis. J Vis Exp. (111), e54112(2016).
  4. Budnik, B., Levy, E., Harmange, G., Slavov, N. SCoPE-MS: mass spectrometry of single mammalian cells quantifies proteome heterogeneity during cell differentiation. Genome Biol. 19 (1), 161(2018).
  5. Slavov, N. Single-cell protein analysis by mass spectrometry. Curr Opin Chem Biol. 60 (1), 1-9 (2021).
  6. Leduc, A., Khoury, L., Cantlon, J., Khan, S., Slavov, N. Massively parallel sample preparation for multiplexed single-cell proteomics using nPOP. Nat Protoc. 19 (12), 3750-3776 (2024).
  7. Lund, P. J., Kori, Y., Zhao, X., Sidoli, S., Yuan, Z. F., Garcia, B. A. Isotopic labeling and quantitative proteomics of acetylation on histones and beyond. Methods Mol Biol. 1977 (1), 43-70 (2019).
  8. Cutler, R., et al. Mass spectrometry-based profiling of single-cell histone post-translational modifications to dissect chromatin heterogeneity. Nature Communications. , (2025).
  9. Davie, J. R. Inhibition of histone deacetylase activity by butyrate. J Nutr. 133 (7 Suppl), 2485S-2493S (2003).
  10. Stransky, S., Cutler, R., Aguilan, J., Nieves, E., Sidoli, S. Investigation of reversible histone acetylation and dynamics in gene expression regulation using 3D liver spheroid model. Epigenetics Chromatin. 15 (1), 35-35 (2022).
  11. Stransky, S., et al. Semi-automated phenotypic analysis of functional 3D spheroid cell cultures. J Vis Exp. (1), e65086(2023).
  12. Yuan, Z. F., Sidoli, S., Marchione, D. M., Simithy, J., Janssen, K. A., Szurgot, M. R., Garcia, B. A. EpiProfile 2.0: a computational platform for processing epi-proteomics mass spectrometry data. J Proteome Res. 17 (7), 2533-2541 (2018).
  13. Jenuwein, T., Allis, C. D. Translating the histone code. Science. 293 (5532), 1074-1080 (2001).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Single Cell ProteomicsHistone ModificationsAutomated Sample PreparationMultiplex LabelingChromatin HeterogeneityMass SpectrometryArgC Ultra DigestionSpheroid AnalysisHigh Throughput WorkflowEpigenetic Perturbations

Related Articles