Методическая статья

Характеристика секреции внеклеточных везикул, полученных из адипоцитов, с использованием модели мышей с репортером CD63-GFP in vivo и in vitro

DOI:

10.3791/69670

⸱

5 декабря 2025 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medicine, Albert Einstein College of Medicine, 2Fleischer Institute for Diabetes and Metabolism, Albert Einstein College of Medicine, 3Department of Molecular Pharmacology, Albert Einstein College of Medicine, 4Department of Microbiology and Immunology, Albert Einstein College of Medicine, 5Division of Infectious Diseases, Department of Medicine, Albert Einstein College of Medicine, 6Department of Developmental and Molecular Biology, Albert Einstein College of Medicine

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Протокол использует специфическую для адипоцитов репортерную линию CD63-GFP для визуализации и количественной оценки секреции внеклеточных везикул, полученных от адипоцитов (EV), а также демонстрации их поглощения клетками-предшественниками, выявляя паракринный путь внутри жировой ткани.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Адипоциты всё чаще признаются активными эндокринными клетками, выделяющими значительные количества ЭВ, обогащённых белками, липидами и нуклеиновым кислотами. Однако механизмы, управляющие секрецией EV и динамикой их высвобождения в различных биологических контекстах, до конца не изучены. Чтобы устранить этот разрыв, мы создали новую линию репортеров CD63-GFP, специфичную для адипоцитов, в которой экспрессия CD63, помеченного GFP, определяется промотором адипонектина, что позволяет селективно маркировать и отслеживать AdEV in vivo. Используя эту модель репортёра, мы исследовали секрецию AdEV и их доставку в АПК в жировых тканях. Конфокальная визуализация и проточная цитометрия показали, что AdEV активно поглощаются АПК, что подчёркивает ранее недооценённый механизм паракринной коммуникации в жировой микросреде.

В дополнение к исследованиям in vivo была создана система in vitro , позволяющая осуществлять прямой мониторинг секреции EV из дифференцированных адипоцитов. АПК были выделены из подкожных белых жировых тканей репортерских мышей и индуцированы для дифференцировки в зрелые адипоциты. В этих клетках сигналы CD63-GFP наблюдались как отдельные пункты и обогащались на плазматической мембране при ингибировании секреции EV, что соответствует накоплению везикул при блокированном высвобождении. При нормальных условиях роста ЭВ, выделяемые в культурную среду, концентрировались и затем очищались с помощью хроматографии исключения размеров, что позволило проводить последующие функциональные и биохимические анализы.

Эта платформа может применяться к АПК, полученным из других жировых депо, таких как эпидидимальная белая и коричневая жировая ткань, либо дифференцировать их в депоспецифические адипоциты, что позволяет сравнивать секрецию EV между разными типами адипоцитов.

Вместе эти подходы вводят надёжный генетический инструмент и комплементарную in vitro систему для анализа динамики секреции и таргетирования AdEV. Эти достижения проливают свет на внутрижировую клеточную коммуникацию и закладывают основу для понимания более широкого метаболического влияния AdEV на здоровье и заболевания.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Жировая ткань всё больше признаётся динамическим эндокринным органом с ключевой ролью в энергетическом гомеостазе всего тела 1,2,3,4,5. Помимо классической функции как запасного пункта липид, адипоциты регулируют системную чувствительность к инсулину, а нарушения жировой массы — избыточная или дефицитная — связаны с инсулинорезистентностью и метаболическимизаболеваниями 6,7,8,9. Одним из предложенных механизмов для повышения этой регуляторной способности является межклеточная коммуникация через секретируемые факторы. Хотя адипокины хорошо установлены как ключевые эндокринные сигналы из жировойткани 10,11,12,13,14,15,16,17,18, адипоциты также высвобождают значительное количество внеклеточных везикулов (ЭВ) — мембранных частиц, содержащих липиды, белки, нуклеиновые кислоты и метаболиты. Неизвестно, несут ли адипоцитные EV (AdEV) гликаны, как и другие типы EV, 19,20,21,22,23,24. Доказано, что адипоциты являются основным источником EV, поскольку примерно 80% циркулирующих экзосомных микроРНК происходят от адипоцитов в моделях мышей, что было показано на примере специфических к адипоциту мышей Dicer knockout при базовыхусловиях 25. Роль AdEV в метаболизме, воспалении, чувствительности к инсулину и адипогенезе была описана, но остаётся неполностьюизученной 26,27,28,29. Другие возможные функции, особенно в опосредовании перекрёстных контактов с другими типами клеток и органами, до сих пор в значительной степени неизвестны. Численность26 EV указывает на то, что они могут играть важную роль как в локальной, так и в системной сигнализации, однако биологическое значение и механизмы действия AdEV в значительной степени остаются неизученными. Этот пробел в знаниях подчёркивает необходимость надёжных и специализированных методов изучения секреции и функции AdEV.

Для устранения этого разрыва мы сгенерировали мышей CD63-GFP, специфичных к адипоциту (AdipCD63-GFP), скрещивая мышей Adiponectin-Cre с мышамиStop fl/fl/CD63-GFP (штамм#:036865, JAX). В качестве контроля использовалисьстоп-фл/фл/CD63-GFP, которые не экспрессировали CD63-GFP при отсутствии Cre. Репортерный штамм CD63-GFP успешно использовался для отслеживания специфических клеточных EV in vivo, включая эндотелиальные и нейронныеEV 30,31. Поскольку адипонектин экспрессируется только в зрелых адипоцитах, а не в прогениторных клетках адипоцитов (APC)32,33, а CD63 является маркером EV34, GFP+ EV, обнаруженные в кровообращении и тканях, можно конкретно идентифицировать как AdEV. Таким образом, в данном исследовании GFP+ EV, обнаруженные внутри APC, интерпретируются как AdEV, поглощённые этими предшественниками. Эта репортерная система позволяет непосредственно отслеживать высвобождение пузырьков и возможные взаимодействия с целями in vivo и in vitro, что позволяет изучать AdEV в других типах жировых тканей. Важно, что AdEV особенно богаты липидами по сравнению с EV из других типов клеток, что делает их более плавучими, хрупкими и трудными для восстановления с помощью традиционных методов ультрацентрифугирования 35,36,37. Высокие центробежные силы могут повредить эти везикулы или привести к значительной потере образца и загрязнению, что усложняет дальнейший анализ. Чтобы преодолеть эти ограничения, мы оптимизировали рабочий процесс, сочетающий несколько низкоскоростных этапов центрифугирования с хроматографией с исключением размера, что минимизирует сдвиговое напряжение, сохраняет целостность везикул и повышает чистоту и выход, позволяя точную количественную оценку и функциональные исследования. Вместе система CD63-GFP и этот оптимизированный изоляционный конвейер обеспечивают доступный и воспроизводимый подход к изучению секреции и функции AdEV в перекрёстных контактах жировых тканей и системной метаболической регуляции.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В соответствии с правилами по уходу за животными и использованием Медицинского колледжа Альберта Эйнштейна, самцов мышей содержали в группах при температуре 22 °C с относительной влажностью 30-70% в цикле 12 часов света и 12 часов темноты, обеспечивали импровальный доступ к пище и воде, а также содержались на фоне C57BL/6J.

1. Обнаружение в организме секретируемых AdEV через поглощение БТР

  1. Подготовка буфера
    1. Буфер для пищеварения: Приготовьте HEPES-буферную DMEM, добавив 0,5 мл 1 M HEPES и 0,5 г бедного жирными кислотами бычьей сыворотки альбумина (BSA) к 50 мл DMEM. Смешивайте до растворения.
    2. Буфер для мытья: Приготовьте PBS с 2,5 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (EDTA) и 4% плодовой бычьей сывороткой (FBS).
    3. Приготовьте запас Либеразы и ДНКазы 1 при концентрации 5 мг/мл и 5 KU/мл. Храните при -20 °C. Разморозьте сразу перед использованием.
  2. Сбор и пищеварение паховой жировой ткани
    ПРИМЕЧАНИЕ: Четырёхмесячные контрольные мыши AdipCD63-GFP и CD63-GFP были эвтаназии с помощью вдыхания углекислого газа.
    1. Исключите жировые ткани стерильной техникой и поместите 1 г ткани в 0,5 мл буфера для пищеварения, а затем мелко измельчите ткань стерильными ножницами на куски не больше 1 мм.
    2. Суспензировать измельченную ткань в 10 мл переваренного буфера, содержащего 0,5 мг/мл либераза и 50 U/мл ДНКазы 1.
    3. Инкубировать при 37 °C на орбитальном шейкере (100 об/мин) в течение 30-60 минут. Аккуратно перемешайте ткань, несколько раз инвертируя трубку во время инкубации. Когда раствор кажется мутным и видимых фрагментов ткани не осталось, пищеварение считается завершенным.
  3. Изоляция БТР
    1. Разведите суспензию двумя объёмами буфера для пищеварения и аккуратно переверните трубку 3-4 раза.
    2. Пропустите стерильный фильтр диаметром 100 мкм, чтобы удалить непереваренную ткань.
    3. Центрифугуйте фильтрат при 300 × г в течение 5 минут при 4 °C.
    4. Отбросьте супернатантную часть адипоцита и помечайте гранулу как стромальную сосудистую фракцию (SVF).
    5. Приготовьте свежий буфер для лизиса эритроцитов (эритроцитов) × с помощью стерильной воды. Лизируйте эритроциты в SVF, инкубируя на льду в течение 5 минут, защищая от света.
    6. Добавьте два объёма буфера для мойки, затем фильтруйте центрифугу при 400 × г в течение 5 минут при 4 °C.
    7. Следуйте протоколу набора для изоляции прогенитора жировой ткани (мыши), ресуспензируйте SVF в буфере 80 мкЛ (PBS, pH 7,2, 0,5 % BSA, 2 mM EDTA) на грамм ткани.
    8. Добавьте 20 мкл неадипоцитного коктейля для истощения прогениторов на грамм ткани.
    9. Перемешайте и инкубуйте 15 минут при 2-8 °C в темноте.
    10. Пропустите образец через колонку LS и соберите проток.
    11. Центрифугуйте проток (отрицательный для CD31, CD45, Ter119) при 300 × г в течение 5 минут при 4 °C, чтобы получить APC для исследования.
  4. Обнаружение секретируемых AdEV посредством поглощения APC с помощью конфокальной микроскопии
    1. Семена 250 мкл изолированных АПК (1 × 104 клеток/мл) из мышей AdipCD63-GFP или CD63-GFP на стекли с 8 камерами с коллагеном, чтобы клеткам прикрепляться примерно в течение 6 часов.
    2. Зафиксируйте клетки 4% параформальдегидом на 10 минут, чтобы сохранить клеточные и EV структуры для визуализации.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В этих анализах сигналы GFP маркируют AdEV, а их обнаружение внутри APC с помощью конфокальной микроскопии указывает на поглощение AdEV этими предшественными клетками.
    3. Промыйте стекли три раза с помощью PBS, установите с помощью антифейд-среды и захватите сигналы GFP с помощью конфокального микроскопа с масляным погружением объективом 63×. Получайте изображения в виде стеков серии z с шагом 0,5 мкм, используя лазер 488 нм для возбуждения GFP и обнаружения излучения на 500-550 нм.
  5. Обнаружение секретируемых AdEV через поглощение APC с помощью потоковой цитометрии
    1. Посчитайте бронетранспортёры и разбавьте краску жизнеспособности (например, Зомби) 1:1000 в 1X PBS. Подвесить клетки при температуре 1 × 106 на 100 мкл. Инкубировать 20 минут на льду, защищённых от света.
    2. Один раз промывайте клетки с помощью буфера для мойки. Центрифуга при 300 × г в течение 5 минут при 4 °C.
    3. Подвешивают клетки в ярком буфере для окрашивания при 1 ×10 6 клеток на 100 мкл.
    4. Блокируйте неспецифическое связывание реагентом, блокирующим Fc-рецепторы (например, анти-CD16/CD32) 1:100 на льду в течение 10 минут.
    5. Предварительная антитела Sca-1 при 6 000 × г в течение 10 минут при 4 °C. Затем добавьте 1 мкл антитела Sca-1 в пробирку APC и инкубируют 20 минут на льду, сохраняя пробирку покрытой фольгой.
    6. Постирайте дважды с 1 мл буфера для мойки, центрифугуйте при 300 × г на 5 минут при 4 °C.
    7. Подвешивают ячейки в буфере для промывки примерно на 1 ×10 6 ячеек на 500 мкл для сортировки проточной цитометрии. Собирайте данные по клеткам Sca1+ и GFP+ с помощью спектрального потокового цитометра, оснащённого фиолетовым лазером 405 нм (фильтр 450/50 нм для Pacific Blue) и синим лазером 488 нм (фильтр 530/30 нм для GFP). Проанализируйте образцы с помощью программного обеспечения инструмента, с элементами Sca1 + с гейтированием, и проанализировать подмножество GFP+ в этой популяции, как показано на рисунке 2.

2. Обнаружение и анализ секретируемых AdEV in vitro

  1. Дифференциация АПК в зрелые адипоциты
    ПРИМЕЧАНИЕ: Все культуры поддерживаются при 37 °C, 8%CO2 , если не указано иное.
    1. День 0: Покрытие тарелок 0,2% желатина в течение 30 минут при комнатной температуре (RT), аспирировать и посеять свежеизолированные APC в DMEM/F12 + 15% FBS + 1% пенициллина/стрептомицина (P/S) + 0,1% примоцина для достижения 100% совпадения перед дифференциацией.
    2. День 1-8: Замените на адипогенную дифференцировочную среду MesenCult (всего 50 мл: 45 мл основания + 5 мл добавки + 0,5 мл GlutaMAX + 50 мкл Примоцина), на 4-й день замените на свежую дифференцировочную среду.
    3. День 9: Промыйте адипоциты дважды PBS, затем замените зрелой средой для культуры адипоцитов (DMEM +1% BSA + 0,2% примоцина) и поддерживайте их 16 часов.
  2. Изоляция и очистка AdEV
    1. Пропустите культуру адипоцитов 15 мл, полученную выше, сначала через фильтр диаметром 40 мкм, затем фильтр на 30 мкм.
    2. Центрифугуйте фильтрат при 500 × г в течение 5 минут, затем 2 000 × г на 10 минут, чтобы удалить остатки клеток и мусор.
    3. Пропустите фильтрат через фильтр диаметром 0,8 мкм, затем концентрируйте среду от 15 мл до 0,5 мл с помощью ультрафильтрационного блока с отсечением 100 кДа (объём образца 15 мл), центрифугировав при 4000 × г в течение 15 минут.
    4. Загрузите образец на колонки хроматографии исключения размера (SEC) с помощью автоматического коллектора дробей и собирайте фракции F1-8.
    5. Концентрируйте собранные EV фракции с помощью ультрафильтрационного блока отсечения 100 кДа (объём образца 4 мл) и приступите к проверке содержания EV каждой фракции с помощью вестерн-блота, инструмента для анализа наночастиц и трансмиссионной электронной микроскопии (TEM).
  3. Валидация, количественная оценка и оценка размера/морфологии AdEV
    1. Вестерн-блот для маркеров электромобилей
      1. Концентрируйте каждую фракцию от 400 мкл до 25 мкл, затем добавьте 50 мкл буфера радиоиммуноприпиципации (RIPA) с дополнением ингибиторов протеазы и фосфатазы. Образцы денатурируются, добавляя 2× додецилсульфат натрия (SDS) буферный буфер и разрешение белков на гель с трис-глиценом 4-12%.
    2. Анализ размера, концентрации и качества электромобиля с помощью инструмента отслеживания наночастиц.
      1. Перед анализом разбавьте образцы EV стерильным фильтром PBS с частотой 0,1 мкм в соотношении 1:1000, чтобы концентрация частиц находилась в оптимальном диапазоне обнаружения (примерно 107-10 9 частиц/мл). Аккуратно перемешайте разбавленные образцы, чтобы избежать образования пузырей.
      2. Загрузите образец в прибор, оснащённый высокочувствительной научной камерой на основе комплементарного металл-оксид-полупроводника (sCMOS), зелёным лазерным модулем 532 нм и порогом обнаружения 10 нм (до 1000 нм) /10 6 –10 9 частиц/мл.
      3. Выполнять визуализацию и количественную оценку с помощью программного комплекса NS Xplorer, который применяет динамический алгоритм концентрации на основе объёма наблюдения.
    3. Изучение морфологии EV с помощью трансмиссионной электронной микроскопии (TEM)
      1. Отправьте 50 мкл электромобилей, собранных до концентрации, в основной центр для отрицательного окрашивания электромобилей. Применяйте электромобили к медным сеткам с 400-сеткой только на углероде, которые были плазменно очищены с помощью очистителя плазмы.
      2. После краткой адсорбции промыйте решётку дистиллированной водой, окрасьте 1% (с в) уранилацетатом и удалите лишние пятна фильтрующей бумагой перед сушкой на воздухе. Затем снимите сетки с помощью электронного микроскопа с частотой 120 кВ.

3. Информация о безопасности и отходах

  1. Обрабатывайте параформальдегид и уранилацетат в вытяжной жидкости с средствами индивидуальной защиты (СИЗ), так как оба токсичны. Собирайте отходы уранилацетата в маркированные опасные контейнеры.
  2. Рассматривать все биологические образцы как потенциально инфекционные и утилизировать материалы в соответствии с институциональными политиками и протоколами биобезопасности, одобренными Комитетом по уходу и использованию животных (IACUC).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Используя этот протокол обнаружения AdEV через поглощение APC с помощью конфокальной микроскопии, мы изолировали APC из паховых жировых тканей мышей AdipCD63-GFP и Stopfl/fl/CD63-GFP и окрашили их DAPI для визуализации ядер. При конфокальном микроскопическом исследовании АПК от мышейStop fl/fl/CD63-GFP не выявили обнаруживаемой пункты GFP (рисунок 1A). В отличие от этого, APC, выделенные из мышей AdipCD63-GFP, демонстрировали множество различных пунктов GFP по всей цито...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Описанный протокол заполняет важный методологический пробел, обеспечивая надёжную и воспроизводимую систему для изоляции и характеристики AdEV и их поглощения БПК. По сравнению с электромобилями из других источников, AdEV более богаты липидами и плавучести, что делает классические методы ультрацентрифугационной изоляции электромобилей менееэффективными. Однако большинство опубликованных протоколов очистки AdEV по-прежнему зависят от ультрацентрифугирования, которо...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

У авторов нет финансовых интересов для декларирования.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Благодарим Центр цитометрии потока Эйнштейна за FACS и Аналитическую визуализацию за весь анализ изображений. Эта работа была частично поддержана грантами Национальных институтов здоровья DK128839 и грантом NCI на поддержку онкологического центра P30CA013330.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
0,5 M EDTA, pH 8,0ФишерAM9260G500-кратное разбавление
10x PBSFisher Scientific70-013-0321000-кратное разбавление водой
1 M HEPESGibco156300801000-кратное разбавление
Набор для изоляции предков жировой ткани, мышьMiltenyi biotec30-106-639Готово к использованию
Центробежный фильтр Amicon Ultra, 100 кДа MWCOSigmaUFC9100Объём образца 15 мл
Центробежный фильтр Amicon Ultra, 100 кДа MWCOSigmaUFC9100Объём образца 4 мл
BSASigmaA6003Готово к использованию
Антитела к кальнексинуcalnexinab225951000-кратное разбавление
Антитела к CD63AbcamAB217345500-кратное разбавление
CD81Технология клеточной сигнализации10037-е500-кратное разбавление
Corning  BioCoat  Слайд культуры коллагена ISigmaCLS354630Готово к использованию
Corning  Ячейное ситоSigmaCLS43175040 μ m размер пор
Corning  Ячейное ситоSigmaCLS431752100 & MU; m размер пор
Антитела к COX IVТехнология клеточной сигнализации48441000-кратное разбавление
DMEMGibco11965092Готово к использованию
DMEM/F-12, добавка GlutaMAXТермофишер10565018Готово к использованию
Dnase 1SigmaD4513Запасной 5 К/мл при -20 и градусах; C
Добавка GlutaMAXGibco35050061100-кратное разбавление
Halt™ Коктейль с ингибиторами протеазы и фосфатазы (100X)Термофишер78444Готово к использованию
Антитела к HSP70AbcamAB1816061000-кратное разбавление
Invitrogen eBioscience 10X буфер лизиса эритроцитов (многовидовый)Fisher Scientific50-112-974310-кратное разбавление в воде
Izon Science Usa Ltd QEVORIGINAL 70NMGEN2 5/PK SDPFisher ScientificNC2042225Готово к использованию
КОНФОКАЛЬНЫЙ МИКРОСКОП LEICA STELLARIS 8Микроскопы LeicaН/Д
Либераза TM Исследовательская оценкаSigmaLIBTM-ROСтандартное содержание 5 мг/мл при -20 и градусах; C
Фильтр для шприцев Millex MCESigmaSLAA0250,8 & mu; m размер пор
NanoSight ProMalvern PanalyticalН/Д
Мини-протеиновые гели Novex Tris-Glycine, 4– 12%,ТермофишерXP04120BOXГотово к использованию
Буфер для образцов SDS Novex Tris-Glycine (2 раза)ТермофишерLC2676Готово к использованию
Антитело Ly-6A/E (Sca-1) Pacific Blue против мышейBioLegend10811925-кратное разбавление
Параформальдегидный раствор (16%)Fisher Scientific50-980-487разбавлять до 4% с помощью PBS
pluriStrainer S / 30 и микро; m (Клеточное ситечко)Fisher ScientificNC092245930 & MU; m размер пор
Решение Ponceau SSigmaP7170-1LГотово к использованию
ПримоцинInvivogenNC9141851500-кратное разбавление
Антифейдный реагент ProLong Gold с DAPIТехнология клеточной сигнализации8961SГотово к использованию
Очищенное антитело CD16/32 против мышейBioLegend101301100-кратное разбавление
RIPA buffer Fisher ScientificPI8990010-кратное разбавление в воде
Спектральный потоковый цитометр (Aurora 3)Cytek BiosciencesН/Д
Антитела к синтаксину 4Синаптические системы110042Разбавление 5000x
Tecnai 20 (Пропускной электронный микроскоп)FEIН/Д
Tergeo-EMООО PIE ScientificН/Д
Антитела к винкулинуAbcamab18508Разбавление 5000x

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kershaw, E. E., Flier, J. S. Adipose tissue as an endocrine organ. J Clin Endocrinol Metab. 89 (3), 2548-2556 (2004).
  2. Wu, J., et al. Beige adipocytes are a distinct type of thermogenic fat cell in mouse and human. Cell. 150 (2), 366-376 (2012).
  3. Luo, L., Liu, M. Adipose tissue in control of metabolism. J Endocrinol. 231 (3), R77-R99 (2016).
  4. Lynes, M. D., et al. The cold-induced lipokine 12,13-diHOME promotes fatty acid transport into brown adipose tissue. Nat Med. 23, 631-637 (2017).
  5. Sakers, A., De Siqueira, M. K., Seale, P., Villanueva, C. J. Adipose-tissue plasticity in health and disease. Cell. 185 (3), 419-446 (2022).
  6. Santoro, A., McGraw, T. E., Kahn, B. B. Insulin action in adipocytes, adipose remodeling, and systemic effects. Cell Metab. 33 (4), 748-757 (2021).
  7. Czech, M. P. Mechanisms of insulin resistance related to white, beige, and brown adipocytes. Mol Metab. 34, 27-42 (2020).
  8. Kahn, S. E., Hull, R. L., Utzschneider, K. M. Mechanisms linking obesity to insulin resistance and type 2 diabetes. Nature. 444, 840-846 (2006).
  9. Feng, D., et al. SNAP23 regulates BAX-dependent adipocyte programmed cell death independently of canonical macroautophagy. J Clin Invest. 128 (9), 3941-3956 (2018).
  10. Ouchi, N., Parker, J. L., Lugus, J. J., Walsh, K. Adipokines in inflammation and metabolic disease. Nat Rev Immunol. 11, 85-97 (2011).
  11. Zhang, Y., et al. Positional cloning of the mouse obese gene and its human homologue. Nature. 372, 425-432 (1994).
  12. Scherer, P. E., Williams, S., Fogliano, M., Baldini, G., Lodish, H. F. A novel serum protein similar to C1q, produced exclusively in adipocytes. J Biol Chem. 270 (45), 26746-26749 (1995).
  13. Considine, R. V., et al. Serum immunoreactive-leptin concentrations in normal-weight and obese humans. N Engl J Med. 334, 292-295 (1996).
  14. Hotamisligil, G. S., Shargill, N. S., Spiegelman, B. M. Adipose expression of tumor necrosis factor-alpha: Direct role in obesity-linked insulin resistance. Science. 259 (5091), 87-91 (1993).
  15. Steppan, C. M., et al. The hormone resistin links obesity to diabetes. Nature. 409, 307-312 (2001).
  16. Yang, Q., et al. Serum retinol binding protein 4 contributes to insulin resistance in obesity and type 2 diabetes. Nature. 436, 356-362 (2005).
  17. Tilg, H., et al. Adipokines: Masterminds of metabolic inflammation. Nat Rev Immunol. 25, 250-265 (2025).
  18. Clemente-Suarez, V. J., et al. The role of adipokines in health and disease. Biomedicines. 11 (5), 1290(2023).
  19. Hallal, S., et al. Understanding the extracellular vesicle surface for clinical molecular biology. J Extracell Vesicles. 11 (10), e12260(2022).
  20. Welsh, J. A., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles (MISEV2023): From basic to advanced approaches. J Extracell Vesicles. 13 (2), e12404(2024).
  21. Le Lay, S., Scherer, P. E. Exploring adipose tissue-derived extracellular vesicles in inter-organ crosstalk: Implications for metabolic regulation and adipose tissue function. Cell Rep. 44 (6), 115732(2025).
  22. Shimoda, A., et al. Exosome surface glycans reflect osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells: Profiling by an evanescent field fluorescence-assisted lectin array system. Sci Rep. 9, 11497(2019).
  23. Albuquerque, P. C., et al. A Paracoccidioides brasiliensis glycan shares serologic and functional properties with cryptococcal glucuronoxylomannan. Fungal Genet Biol. 49 (11), 943-954 (2012).
  24. Li, Y., Tang, X., Gu, Y., Zhou, G. Adipocyte-derived extracellular vesicles: Small vesicles with big impact. Front Biosci (Landmark Ed). 28 (7), 149(2023).
  25. Thomou, T., et al. Adipose-derived circulating miRNAs regulate gene expression in other tissues. Nature. 542, 450-455 (2017).
  26. Crewe, C., et al. An endothelial-to-adipocyte extracellular vesicle axis governed by metabolic state. Cell. 175 (3), 695-708.e13 (2018).
  27. Flaherty, S. E. 3rd, et al. A lipase-independent pathway of lipid release and immune modulation by adipocytes. Science. 363 (6430), 989-993 (2019).
  28. Clement, E., et al. Adipocyte extracellular vesicles carry enzymes and fatty acids that stimulate mitochondrial metabolism and remodeling in tumor cells. EMBO J. 39, e102525(2020).
  29. Kulaj, K., et al. Adipocyte-derived extracellular vesicles increase insulin secretion through transport of insulinotropic protein cargo. Nat Commun. 14, 709(2023).
  30. McCann, J. V., et al. Reporter mice for isolating and auditing cell type-specific extracellular vesicles in vivo. Genesis. 58 (7), e23369(2020).
  31. Men, Y., et al. Exosome reporter mice reveal the involvement of exosomes in mediating neuron to astroglia communication in the CNS. Nat Commun. 10, 4136(2019).
  32. Jeffery, E., et al. Characterization of Cre recombinase models for the study of adipose tissue. Adipocyte. 3 (3), 206-211 (2014).
  33. Emont, M. P., et al. A single-cell atlas of human and mouse white adipose tissue. Nature. 603, 926-933 (2022).
  34. Krylova, S. V., Feng, D. The machinery of exosomes: Biogenesis, release, and uptake. Int J Mol Sci. 24 (2), (2023).
  35. Crewe, C. The challenges of interrogating adipose tissue extracellular vesicle functions in physiology. Commun Biol. 5, 581(2022).
  36. Blandin, A., et al. Lipidomic analysis of adipose-derived extracellular vesicles reveals specific EV lipid sorting informative of the obesity metabolic state. Cell Rep. 42 (3), 112169(2023).
  37. Matilainen, J., et al. Increased secretion of adipocyte-derived extracellular vesicles is associated with adipose tissue inflammation and the mobilization of excess lipid in human obesity. J Transl Med. 22, 623(2024).
  38. Thery, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): A position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. J Extracell Vesicles. 7 (1), 1535750(2018).
  39. Olson, A. L., Knight, J. B., Pessin, J. E. Syntaxin 4, VAMP2, and/or VAMP3/cellubrevin are functional target membrane and vesicle SNAP receptors for insulin-stimulated GLUT4 translocation in adipocytes. Mol Cell Biol. 17 (5), 2425-2435 (1997).
  40. Oh, E., Miller, R. A., Thurmond, D. C. Syntaxin 4 overexpression ameliorates effects of aging and high-fat diet on glucose control and extends lifespan. Cell Metab. 22 (3), 499-507 (2015).
  41. Merz, K. E., et al. Enrichment of the exocytosis protein STX4 in skeletal muscle remediates peripheral insulin resistance and alters mitochondrial dynamics via Drp1. Nat Commun. 13, 424(2022).
  42. Yu, X., et al. Involution of brown adipose tissue through a syntaxin 4 dependent pyroptosis pathway. Nat Commun. 15, 2856(2024).
  43. Verweij, F. J., et al. Quantifying exosome secretion from single cells reveals a modulatory role for GPCR signaling. J Cell Biol. 217 (3), 1129-1142 (2018).
  44. Arora, A., Sharma, V., Gupta, R., Aggarwal, A. Isolation and characterization of extracellular vesicles derived from ex vivo culture of visceral adipose tissue. Bio Protoc. 14 (11), e5011(2024).
  45. Benedikter, B. J., et al. Ultrafiltration combined with size exclusion chromatography efficiently isolates extracellular vesicles from cell culture media for compositional and functional studies. Sci Rep. 7, 15297(2017).
  46. Nordin, J. Z., et al. Ultrafiltration with size-exclusion liquid chromatography for high yield isolation of extracellular vesicles preserving intact biophysical and functional properties. Nanomedicine. 11 (4), 879-883 (2015).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Adipocyte EVsExtracellular VesiclesEV SecretionStromal Vascular FractionAdipocyte Progenitor CellsSize Exclusion ChromatographyFlow CytometryConfocal MicroscopyNanoparticle Tracking

Похожие статьи