Исследовательская статья

Длинная некодирующая РНК IRAIN управляет иммунометаболическим перепрограммированием глиомы по оси IGF1R-JAK-STAT-BIRC5

329 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/69711

⸱

12 декабря 2025 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Neurosurgery, Zhangzhou Municipal Hospital of Fujian Province and Zhangzhou Affiliated Hospital of Fujian Medical University, 2The School of Clinical Medicine, Fujian Medical University, Zhangzhou Affiliated Hospital of Fujian Medical University

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

Используя интегрированное машинное обучение для нескольких когорт, мы создали надёжную прогностическую подпись IMRG для глиомы. IRAIN заметно понижен, обратно связан с степенью и выживаемостью, и подавляет сигнализацию IGF1R-JAK2-STAT3-BIRC5, сдерживая пролиферацию, миграцию и ангиогенез. Результаты указывают на IRAIN и IMRG в качестве биомаркеров и терапевтических целей.

Аннотация

Глиома — это агрессивное злокачественное образование с ограниченными терапевтическими возможностями и неблагоприятным прогнозом. Его развитие тесно связано с метаболическим перепрограммированием и уклонением от иммунитета, что подчёркивает необходимость выявления молекулярных регуляторов, интегрирующих эти процессы. Здесь мы установили надёжный прогностический сигнатуру иммунометаболически связанного гена (IMRG) и прояснили роль длинной некодирующей РНК IRAIN в регулировании иммунометаболизма глиомы через ось IGF1R-JAK-STAT-BIRC5. Были проанализированы транскриптомические и клинические данные из когорт TCGA, CGGA (693/325) и GEO (GSE43378). Дифференциальный анализ экспрессии и взвешенный анализ коэкспрессии генов (β = 8) обеспечил безмасштабную топологию, а система кросс-валидации с исключением, объединяющая десять алгоритмов машинного обучения, дала 101 прогностическую модель. Оптимальная сигнатура IMRG из 17 генов была подтверждена во всех когортах и независимо предсказала общую выживаемость. Функциональные анализы показали, что гиперэкспрессия IRAIN ингибирует IGF1R, подавляет фосфорилирование JAK2/STAT3 и снижает уровень BIRC5, тем самым способствуя апоптозу и снижая ангиогенез. Низкая экспрессия IRAIN коррелировала с иммуносупрессивными макрофагами Treg и M2, а также с повышенными показателями опухоли и микросреды, что указывает на иммунноуклончивый фенотип. Эти результаты подтверждают IRAIN как ключевого регулятора иммунометаболического перепрограммирования глиомы и подтверждают иммунометаболическую репрограммировку IMRG как надёжный прогностический инструмент, выделяя путь IRAIN-IGF1R-JAK-STAT-BIRC5 как механистический мост, связывающий иммунную и метаболическую дисрегуляцию при глиоме и предлагающий потенциальные цели для прецизионной терапии.

Введение

Глиома представляет собой самый распространённый первичный злокачественный рак центральной нервной системы и остаётся одним из самых смертоносных видов рака у человека, несмотря на прогресс в нейрохирургии, лучевой терапии и химиотерапии. Высококлассные глиомы, особенно глиобластома мультиформе (GBM), характеризуются быстрым размножением, диффузной инфильтрацией и неизбежнымрецидивом 1,2. В последнее время появился ряд эффективных терапевтических подходов, таких как хирургические вмешательства, иммунотерапия и химиотерапия3. Медианная выживаемость составляет примерно 14–18 месяцев, даже при максимальной терапии, что подчёркивает необходимость новых терапевтических стратегий и прогностическихбиомаркеров 4.

Взаимодействие между микроокружением опухоли (ТМЭ) и раковыми клетками критически способствует агрессивному росту и молекулярной гетерогенности глиом. Многочисленные иммунные компоненты, включая микроглию, нейронные прекурсорные клетки, сосудистые клетки и адаптивные иммунные клетки, тесно участвуют в формировании TME 5,6,7. В последние годы были достигнуты впечатляющие достижения в иммунотерапии, что ознаменовало эпоху преобразования в онкологии. Тем не менее, блокада иммунных контрольных точек (ICB) и другие иммунотерапевтические методы показали лишь ограниченный успех приглиоме 8. Неудача иммунотерапии в этом контексте связана с несколькими внутренними особенностями микросреды глиомы — а именно: низкая мутационная нагрузка на опухоли, выраженная внутриопухолевая гетерогенность, низкая проницаемость гематоэнцефалического барьера, снижение уровня основных комплексных молекул гистосовместимости и редкая инфильтрацияТ-клеток 9,10,11,12.

Все больше данных свидетельствуют о том, что микросреда опухолей (ТМЭ), проявляющая метаболические нарушения, характеризуется кислотными состояниями, нехваткой питательных веществ и накоплением метаболитов, подавляющих иммунные ответы. Это состояние впоследствии приводит к дисфункции иммунных клеток, проникающих в опухоли, и снижает эффективность иммунотерапии13. Одновременно иммунные клетки внутри ТМЭ подвергаются контекстно-зависимым метаболическим изменениям, которые определяют их дифференцировку и функции эффекторов. Например, активированные Т-клетки зависят от гликолиза для быстрой пролиферации, тогда как регуляторные Т-клетки (Треги) и макрофаги (ТАМ), особенно подтип М2, зависят от окисляющего фосфорилирования и метаболизма жирных кислот для поддержания иммуносупрессивнойактивности 14,15.

Поэтому интеграция иммунных и метаболических сигнатур предоставляет рациональную основу для лучшей классификации глиом и прогнозирования прогноза пациентов. Длинные некодируемые РНК (lncRNA) недавно стали универсальными регуляторами архитектуры хроматина, транскрипции генов и посттранскрипционной модификации. Несколько lncRNA были причастны к патогенезу глиомы, влияя на пролиферацию, инвазию и иммуннуюмодуляцию 16. Среди них импринтованный антисмысловый транскрипт IRAIN (IGF1R антисенсовая импринтированная небелковая кодирующая РНК) привлёк внимание своей ролью в регулировании гена инсулиноподобного фактора роста 1 (IGF1R) через цис-действующие хроматиновые взаимодействия, который доказано снижает регуляцию и снижает контроль цис-конкуренции, особенно в раковых клетках, таких как рак молочной железы, линии лейкемии, рак гортани и острый миелоидный лейкоз, который напрямую приводит к повышению уровня IGF1R 17,18,19. Поскольку сигнализация IGF1R активирует нижние пути JAK-STAT и PI3K-AKT — оба центральные для роста опухоли и иммунной регуляции20,21 — изменения экспрессии IRAIN могут критически влиять на иммунометаболизм опухоли. Однако роль IRAIN в глиоме и его потенциальное влияние на иммунометаболический ландшафт пока не выяснены. Устранение этого пробела в знаниях может дать механистическое понимание того, как некодирующие РНК координируют метаболическую адаптацию и уклонение от иммунитета при глиоме.

В этом исследовании мы объединили многокогортные транскриптомические данные с экспериментальной валидацией для изучения иммунометаболической регуляции при глиоме. Используя интегрированные фреймворки машинного обучения в когортах TCGA, CGGA (693/325) и GEO (GSE43378), мы выявили устойчивый прогностический сигнатур иммунометаболически связанного с 17 генами (IMRG), способный стратификационировать выживаемость пациентов по множеству данных. Позже мы сосредоточились на IRAIN как потенциальном верхнем регуляторе этой сети, учитывая его предполагаемое взаимодействие с осью сигнализации IGF1R-Jak-stat. Функциональные анализы показали, что гиперэкспрессия IRAIN подавляет пролиферацию глиомы и ангиогенез, ингибируя экспрессию IGF1R и последующей фосфорилляции STAT3, что приводит к снижению экспрессии антиапоптотического белка BIRC5 (также известного как Survivin). В совокупности эти результаты подтверждают рабочую модель, в которой IRAIN функционирует как механистический мост, связывающий иммунную регуляцию и метаболическое перепрограммирование при глиоме. Мы выдвигаем гипотезу, что нарушение экспрессии IRAIN способствует прогрессированию опухоли, нарушая этот баланс, тем самым способствуя иммуносупрессивной микросреде и придавая устойчивость терапии.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все процедуры, связанные с человеческими тканями, соответствовали институциональным рекомендациям и Хельсинкской декларации и были утверждены Институциональным обзорным советом Фуцзянского медицинского университета (Одобрение No 2021KYB089). Письменное информированное согласие было получено от всех участников до забора тканей.

Экспрессия генов и анализ выживаемости
Данные секвенирования РНК и соответствующая клиническая информация были получены из нескольких публичных баз данных. 1) Когорта TCGA: данные RNA-seq (FPKM) для 175 образцов глиобластомы многоформной (GBM) и 534 образцов низкой степени глиомы (LGG) были загружены из Атласа геномов рака (https://portal.gdc.cancer.gov/); 2) Нормальная контрольная группа: Профили экспрессии 211 нормальных мозговых тканей и 662 тканей глиомы были скачаны из базы данных UCSC Xena (https://xenabrowser.net/datapages/); 3) Внешняя валидация: данные из когорт CGGA693 и CGGA325 были получены из китайского атласа геномов глиомы (http://www.cgga.org.cn); 4) Набор данных GEO: Набор данных GSE43378, содержащий экспрессию и клинические данные для 50 образцов глиомы, был загружен из Gene Expression Omnibus (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/). Все исходные данные подсчёта были преобразованы в транскрипты на миллион (TPM) и преобразованы вlog 2. Для уже нормализованных наборов данных анализировались матрицы экспрессии для обеспечения сопоставимых распределений. Гены с TPM < 1 в более чем 80% выборок были исключены. Отсутствующая клиническая информация (возраст, статус IDH, коделяция 1p/19q, метилирование MGMT) была удалена с помощью полной фильтрации. Пакетные эффекты между наборами данных корректировались с помощью алгоритма ComBat, реализованного в пакете R sva. Значения выражения стандартизировались с помощью z-скорл преобразования в каждом наборе данных. Анализ выживаемости проводился с использованием R-пакетов Survival и Survminer. Пациентов дихотомизировали на группы с высокой и низкой экспрессией в зависимости от медианного уровня экспрессии IRAIN. Были сгенерированы кривые выживаемости Каплана-Мейера, а статистическая значимость оценивалась с помощью логарифмического теста. Коэффициенты риска (HR) и 95% доверительные интервалы (CI) оценивались с помощью моделей регрессии пропорциональных опасностей по Коксу.

Определение наборов иммунных и метаболических генов
Гены, связанные с иммунитетом (IRG, n = 2 483) были получены из базы данных ImmPort (https://www.immport.org/shared/), а гены, связанные с метаболизмом (MRGs, n = 948) — из базы данных молекулярных подписей (MSigDB, https://www.gsea-msigdb.org/). Объединённый набор этих генов был определен как иммунометаболически связанные гены (IMRG). Эти списки генов служили справочниками для последующих анализов дифференциальной экспрессии и сетевого анализа.

Анализ дифференциальной экспрессии и взвешенных сетей коэкспрессии генов
Дифференцированно экспрессированные гены (DEG) между нормальными тканями мозга и глиомы были выявлены с помощью лиммы пакета R. Данные выражения оснащались линейной моделью, за которой следовала эмпирическая байесовская модерация. Гены с изменением складки |log₂| > 1,5 и коэффициент ложного обнаружения (FDR) < 0,05 считались значительно дифференцированными. Взвешенный анализ коэкспрессии генов (WGCNA) проводился с использованием пакета R WGCNA. Выброшные выборки исключались посредством иерархической кластеризации. Степень мягкого порога была установлена на β = 8 для достижения индекса соответствия топологии без масштаба (R2 ≥ 0,85) при сохранении достаточной средней связности. Были построены топологические матрицы перекрытия (TOM), а гены сгруппированы в модули с минимальным размером 50 с использованием алгоритма динамического вырезания деревьев. Собственные генгены модуля коррелировали с клиническими признаками, и был выбран модуль, наиболее сильно ассоциированный с глиомой (R> Pearson 0.7, P < 1×10-10), для идентификации генов хаба.

Построение прогностической модели на основе машинного обучения
Для построения и оценки прогностических моделей была применена комплексная кросс-валидация (LOOCV), интегрирующая десять алгоритмов машинного обучения. Всего было реализовано 101 комбинаторный рабочий процесс с использованием когорты TCGA в качестве обучающего набора данных. Иммунометаболические гены, связанные с прогнозом (IMRG), впервые были идентифицированы с помощью одномерной регрессии Кокса (P < 0,05). Оптимальная модель определялась путём максимизации среднего индекса согласованности Харрелла (C-индекс) по трём валидационным наборам данных (CGGA693, CGGA325 и GSE43378). Полученная модель RSF-Enet (α = 0,3) показала наивысшую предсказательную эффективность и сохранила устойчивую обобщимость среди независимыхкогорт 22.

ТМЭ и иммунная инфильтрация
Для всесторонней характеристики иммуногеномного ландшафта мы применили многоуровневый аналитический подход. Во-первых, уровни иммунной и стромальной инфильтрации были количественно измерены с помощью алгоритмаESTIMATE 23. Дифференциальная экспрессия ключевых молекул иммунных контрольных точек, включая PDCD1, CTLA4 и LAG3, затем оценивалась с помощью анализа на основе лиммы, а корреляции между генами контрольных точек визуализировались с помощью корреляционных матриц. Профили соматических мутаций из 903 образцов глиомы в когорте TCGA использовались для расчёта баллов по мутационной нагрузке опухолей (TMB), микросателлитной нестабильности (MSI) и иммунной дисфункции и исключения опухоли (TIDE) с целью прогнозирования возможных ответов на иммунотерапию. Пациентов затем стратифицировали на четыре прогностические группы в зависимости от совокупного статуса TMB (высокий/низкий) и баллов риска (высокие/низкие), а результаты выживаемости сравнивались с помощью анализа Каплана-Мейера.

Анализ функционального обогащения
Анализ обогащения путей генной онтологии (GO) и Kyoto Encyclopedia of Ges and Genomes (KEGG) проводился с использованием кластера Profiler пакета R. Результаты обогащения с скорректированными значениями P < 0,05 считались статистически значимыми. Чрезмерно представленные биологические процессы, клеточные компоненты и молекулярные функции визуализировались с помощью точечных и барных графиков. Сети взаимодействия белков и белков (PPI) были построены с использованием базы данных STRING (≥ 0.4) и визуализированы в Cytoscape. Функциональные модули в сети PPI были идентифицированы с помощью алгоритма MCODE. Взаимодействие ген-ген и коэкспрессионные сети были дополнительно проанализированы с помощью GeneMANIA (https://string-db.org; доверительный балл ≥ 0,4) и визуализированы в Cytoscape. Функциональные модули в сети PPI были идентифицированы с помощью алгоритма MCODE. Взаимодействие ген-ген и коэкспрессионные сети были дополнительно проанализированы с помощью GeneMANIA (https://genemania.org), который интегрирует информацию о физических и генетических взаимодействиях, общих путях и паттернах коэкспрессии для вывода потенциальных функциональных ассоциаций.

Клинические образцы
Свежие ткани глиомы (n = 6) и смежные неопухолевые ткани мозга (n = 6; расположены не менее 3 см от края опухоли и гистологически подтверждены как свободные от опухоли) были собраны у пациентов, проходящих первичную резекцию глиомы в Чжанчжоуской больнице Фуцзянского медицинского университета. Ни один из пациентов не проходил химиотерапию или лучевую терапию до операции. Все патологические диагнозы были независимо подтверждены двумя невропатологами согласно классификации опухолей центральной нервной системы Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) 2021 года. Сразу после хирургического удаления образцы тканей промывались ледяным фосфатно-буферным физиологическим раствором (PBS) для удаления остатков крови, быстро замораживались в жидком азоте (-196 °C) и хранили при -80 °C до извлечения РНК.

Клеточные линии и культура клеток
Линии клеток человеческой глиобластомы SHG44, U251, A172 и T98G, а также нормальные человеческие глиальные клетки (HEB), были получены из аутентифицированных хранилищ и подтверждены как свободные от микоплазмы до использования. Клетки содержались в модифицированной среде Eagle's Medium (DMEM, с высоким уровнем глюкозы) от Dulbecco's с добавлением 10% плодовой бычьей сыворотки (FBS), 2 мМ L-глутамин и 1% пенициллин-стрептомицина при 37 °C в увлажнённом инкубаторе с 5% CO₂. Клетки проходили каждые 4-5 дней, достигнув слияния 80-90%. Для установления линий с переэкспрессией IRAIN и контроля клетки трансдуцировали с лентивирусными векторами, несущими полноразмерный транскрипт IRAIN или пустой вектор в качестве контроля. Стабильные клоны были отобраны с использованием пуромицина (2 мкг/мл) в течение 14 дней. Эффективность гиперэкспрессии была подтверждена количественным ПЦР с обратной транскрипцией (qRT-PCR) перед последующим анализом.

3- (4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолий бромид (MTT) клеток пролиферации
Клетки были засеяны в пластинах с 96 лунками при плотности 1 ×10 4 клеток на колодец в 100 мкл полной культурной среды. Через 24, 48 и 72 часа после посева в каждую скважину добавляли 20 мкл раствора MTT (5 мг/мл в фосфатно-буферном физиологическом растворе) и инкубировали в течение 4 часов при 37 °C. Затем супернатант был удалён, и для растворения кристаллов формазана добавили 150 мкл диметилсульфоксида (DMSO). Пластину аккуратно перемешивали в течение 10 минут для полной растворительности. Поглощение измерялось на 490 нм с помощью микропластинчатого спектрофотометра. Фоновые показания из пустых скважин были вычитаны. Жизнеспособность клеток рассчитывалась относительно 24-часовой группы или контрольной группы (установленная как 1.0). Все эксперименты проводились с использованием шести технических репликат и трех независимых биологических репликат. Данные выражаются в виде среднего ± стандартного отклонения (SD), а статистическая значимость определялась с помощью двухстороннего t-теста.

Проточная цитометрия для апоптоза (Annexin V - FITC/PI окрашивание)
Клетки были засеяны при слиянии 60-70% и обработаны в течение 24 часов при указанных условиях. Плавающие и прилипшие клетки собирались с использованием трипсина, не содержащего ЭДТА, комбинированы и дважды промывались ледяным PBS. Клеточные гранулы были повторно суспендированы в буфере связывания Annexin V (10 мМ HEPES pH 7,4, 140 мМ NaCl, 2,5 мМ CaCl2) при 1 ×10 6 клеток/мл. Для каждого образца инкубировалось 100 мкл суспензии с 5 мкл Annexin V-FITC и 5 мкл йодида пропидия (PI; 50 мкг/мл) в темноте в течение 15 минут при комнатной температуре. После добавления 400 мкл буфера связывания образцы хранились на льду и анализировались в течение 1 часа на потоковом цитометре (возбуждение 488 нм; 530/30 нм для FITC и >585 нм для PI). Для компенсации были включены соответствующие контроли с одиночным окрашиванием и флуоресценцией минус один. В каждом выборке было зафиксировано не менее 10 000 событий. Данные анализировались по квадрантному гейтингу: живые (Annexin V⁻/PI⁻), раннеапоптотические (Annexin V⁺/PI⁻), позднеапоптотические (Annexin V⁺/PI⁺) и некротические (Annexin V⁻/PI⁺) популяции. Были отмечены проценты ранних + поздних апоптотических клеток (среднее ± SD, n = 3).

Количественное ПЦР в реальном времени (qRT-PCR)
Общая РНК была выделена с помощью кислотного реагента фенол-гуанидиний согласно протоколу производителя. Чистота РНК проверялась спектрофотометрией (A₂₆₀/A₂₈₀ = 1,8-2,1), а целостность подтверждалась гель-электрофорезом (число целостности РНК ≥ 7). Один микрограмм полной РНК был обработан ДНКазой I и обратно транскрибирован в реакции объёмом 20 мкл с использованием случайных гексамеров и олиго(dT) праймеров. Реакция проводилась при 25 °C в течение 10 минут, при 50 °C 30 минут и при 85 °C в течение 5 минут. Количественная ПЦР проводилась в системе объёмом 10 мкл, содержащей 5 мкл 2× SYBR Green Master Mix, по 0,3 мкм каждого праймера и 1 мкл кДНК (≈ эквивалент 20 нг РНК). Условия термического циклирования включали 95 °C в течение 5 минут, затем 40 циклов по 95 °C в течение 15 с и 60 °C в течение 30 секунд, затем анализ кривой расплавления от 65 °C до 95 °C с шагом 0,3 °C. Все реакции проводились в трёх экземплярах, включая контрольные тесты без шаблона и минус RT. Значения CT > 35 или техническое повторение SD > 0,5 были исключены. Относительная экспрессия рассчитывалась с использованием метода 2⁻ΔΔCt, при этом GAPDH был внутренним контролем. Средние значения ± SD были представлены от трёх независимых биологических репликат, а различия в группах анализировались с помощью двухстороннего t-теста.

Вестерн-блот анализ
Клетки лизировались на льду в буфере RIPA (50 мМ Tris-HCl, pH 7,4, 150 мМ NaCl, 1% NP-40, 0,5% дезоксихолата натрия, 0,1% SDS) с дополнением ингибиторов протеазы и фосфатазы. Лизаты инкубировали 30 минут на льду с периодическим вихрем и очищались центрифугой при 12 000 × г в течение 15 минут при 4 °C. Концентрации белка измерялись с помощью BCA-анализа, скорректировали до 1-2 мкг/мкл и смешивались в соотношении 1:3 с буфером 4× Леммли (последний 1× буфер с 100 мМ ДТТ). Образцы денатурировали при 95 °C в течение 5 минут. Равные количества белка (50 мкг) были разложены с помощью 12 % SDS-PAGE при 100 В в течение 90 минут и электропереноса в мембраны PVDF при 250 мА в течение 90 минут. Мембраны блокировались 5% обезжиренным молоком в TBST (0,1 % Tween-20) в течение 1 часа при комнатной температуре (или 5 % BSA для фосфопротеинов) и инкубировали ночью при 4 °C с первичными антителами против IGF1, IGF1R, JAK2, p-JAK2 (Y1007/1008), STAT3, p-STAT3 (Y705), BIRC5 и β-актина (типичное разбавление 1:1000, β-актин 1:5000). После трёх 10-минутных промываний в TBST мембраны инкубировали с HRP-конъюгированным вторичным антителом (1:5000) в течение 1 часа при комнатной температуре, затем снова промывались и проявлялись с использованием хемилюминесцентного субстрата. Интенсивность полос была количественно измерена с помощью ImageJ, нормализована до β-актина или полного белка и экспрессирована в среднем ± SD в трёх независимых экспериментах.

Иммуноцитохимия
Клетки, выращенные на стерильных стеклянных накладках, дважды промывались PBS и фиксировали в 4% параформальдегиде в течение 15 минут при комнатной температуре. После трёх промывок с PBS клетки проницались с 0,2% Triton X-100 в течение 10 минут, блокировались 5% бычьей сывороткой альбумина (BSA) в течение 1 часа и инкубировали ночью при 4 °C с первичным антителом против CD31 (разбавление 1:200 при 1% BSA). После трёх промываний PBS клетки инкубировали вторичным антителом, конъюгированным с Alexa Fluor (разбавление 1:500) в течение 1 часа в темноте, контрокрашивались DAPI (1 мкг/мл, 5 мин) и устанавливались в антифейдной среде. Изображения были сделаны с помощью флуоресцентного микроскопа при одинаковых настройках экспозиции и усиления. Процент CD31-положительной области был количественно измерен в пяти случайно выбранных непересекающихся полях на выборку с помощью программного обеспечения ImageJ. Этот анализ проводился в клеточных моделях, а не на срезах ткани.

Статистический анализ
Статистический анализ проводился с использованием версии R 4.3.0 вместе с соответствующими пакетами. Для сравнения категориальных переменных использовался тест хи-квадрат, а непрерывные переменные оценивались либо с помощью теста ранга Уилкоксона, либо теста T. Оценка непрерывных переменных осуществлялась с помощью коэффициента корреляции Пирсона. Анализы выживаемости проводились с использованием пакета выживания, который включал моделирование пропорциональных опасностей Кокса и генерацию кривых Каплана–Мейера, при этом оптимальные пороги стратификации были установлены пакетом survminer и формулой Riskscore = Уравнение 1. Пакет CompareC использовался для оценки C-индексов различных переменных. Кривая операционной характеристики приёмника (ROC), предназначенная для прогнозирования бинарных категориальных переменных, была сгенерирована с помощью пакета pROC. Кроме того, временно-зависимая область под кривой ROC (AUC) для метрик выживаемости была проанализирована с помощью пакета timeROC. Все статистические тесты проводились в двустороннем подходе. Уровень значимости P < 0,05 считался статистически значимым.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

IRAIN снижается при глиоме и ассоциируется с неблагоприятными клиникопатологическими признаками
Процесс анализа иллюстрируется на рисунке 1. Экспрессия IRAIN впервые была оценена методом qRT-PCR в первичных астроцитах, тканях глиомы и линиях клеток глиомы. Уровни IRAIN были заметно снижены как в тканях низкого, так и высокого степени глиомы, а также во всех четырёх линиях глиомы (SHG44, A172, U251 и T98G) по сравнению с нормальными астроцитами (см. ри...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Глиома остаётся одним из самых смертоносных злокачественных опухоль центральной нервной системы, характеризующимся глубокой внутриопухолевой гетерогенностью и устойчивостью к традиционной терапии. Несмотря на хирургическую резекцию в сочетании с химиолучевой терапией, рецидивы и смертность остаются высокими, а медианная выживаемость пациентов, особенно с глиобластомой, показала ограниченное улучшение за последниедесятилетия 4,24....

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Мы благодарим всех участников и исследователей, участвующих в проекте Genotype-Tissue Expression (GTEx), а также базам данных TCGA, CGGA за обмен доступными данными. Эта работа была поддержана проектом Фуцзяньского провинциального проекта по технологиям здравоохранения (2024GG01010154) и проектом по скалолазанию на рабочие станции для докторантуры больницы Чжанчжоу (PDA202306). Спонсор предоставил средства для наших исследований.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Комплект апоптоза Annexin V-PI  Southern Biotechnology, Бирмингем, Алабама, СШАNAИспользуется для оценки апоптоза
Комплект апоптоза AnnexinV-PIЮжная биотехнология10010-02Используется для оценки апоптоза с помощью потоковой цитометрии.
Анти-IGF1, Anti-IGF1R, Anti-JAK2, Anti-STAT3, Anti-survivin, Anti-β-actinAbcamAB182408, AB108596, AB109085, AB76424, AB8227Антитела используются для анализа Western Blot сигнальных путей.
BiocManagerCRAN1.30.25Устанавливать и управлять пакетами Bioconductor в R & Ge; 3.6.
Система Bio-Rad Cfx96Биопроводник1.5.1Программный доступ к STRING protein– белковые взаимодействия.
КаретCRAN0.4Временно-зависимый ROC/AUC для моделей выживания.
Китайский атлас генома глиомы (CGGA)NACGGA693 и CGGA325 Используется для концепции и валидации моделей
ClusterprofilerБиопроводник2.18.0Разбор файлов MAF; вычислить мутационное бремя опухолей (TMB) и ландшафт мутаций.
КорплотCRAN3.5.0Общее построение графиков (коробочные графики, скрипичные графики, рассеяние, трендовые линии).
CoxboostCRAN7.3-60stepAIC для пошагового выбора модели Cox.
Data.TableCRANreadr2.1.5Быстрое чтение разделённых файлов; надёжная управляемость UTF-8.
ДозаБиопроводник3.17.0Аннотация человеческих генов (Entrez, Ensembl, SYMBOL mappings).
DynamictreecutCRAN1.73Взвешенный анализ сети коэкспрессии генов; pickSoftThreshold, TOM, обнаружение модулей.
ЭджерБиопроводник3.56.2Дифференциальное выражение (voom/линейные модели); Уилкоксон/эмпирический Байес; Вводные данные по вулканам/тепловой карте.
Обогащённый плотБиопроводник3.26.2Обогащение онтологий заболеваний и помощники GSEA (используются вместе с clusterProfiler).
FlashclustCRAN1.63-1Адаптивное сечение ветвей для обнаружения модулей WGCNA.
GBMCRAN1.12Контролируемые основные компоненты для анализа выживаемости.
Омнибус экспрессии генов (GEO)NAGSE43378Используется для концепции и валидации моделей
GEOqueryБиопроводникNAСкачивайте и анализируйте наборы данных GEO.
Ggplot2CRAN1.0.12Готовые к публикации тепловые карты сигнатур выражений.
GlmnetCRAN3.3.1Случайный лес выживания для правильных цензурированных результатов.
Вторичные антитела к кроличьим антителам, маркированным пероксидазой хренаAbcamab6721Вторичные антитела для обнаружения в Western Blot.
Клеточные линии человеческой глиобластомы (SHG44, U251, A172, T98G)Американская коллекция тканевых культурNAКлеточные линии человеческой глиобластомы для исследований глиомы. Клетки были культивированы в DMEM + 10% FBS, 2 мМ L-глутамина.
ИграфCRAN10.0.1Доступ к наборам генов MSigDB (например, метаболическим MRG); удобные аккуратные рамы.
Программное обеспечение Image J  Медиа Кибернетика, США152Используется для визуализации
Лентивирусный вектор, кодирующей lncRNA-IRAINGeneChem, Шанхай, Китай  NAЛентивирусные векторы, используемые для трансфекции клеток глиомы и HEB с целью создания стабильных клонов.
ЛиммаБиопроводник3.48.0Пакетная коррекция (ComBat) и анализ заменных переменных.
MaftoolsБиопроводник1.52.0Харрелл индекс согласованности (C индекс) и сравнение выживаемости.
МассаCRAN4.1-8Штрафные модели Кокса: лассо, ридж и эластичная сетка.
MsigdbrCRAN0.0.5Поддерживайте методы векторной машины для выживаемости.
MTTСигма-ОлдричM2128Используется для анализов клеточной пролиферации.
Нормальные глиальные клетки (HEB)Американская коллекция тканевых культурNAНормальная человеческая глиальная клетка для сравнительных исследований. Культивировано в DMEM + 10% FBS.
Org.Hs.Eg.DbБиопроводник4.8.3обогащение GO/KEGG и GSEA; поддерживает несколько типов идентификаторов.
PheatmapCRAN2.0.0Грамматика науки о данных; Включает dplyr, tidyr, purrr, ggplot2 для управления и построения сюжета.
PlsrcoxCRAN1.5Бустинг на основе вероятностей для моделей Cox.
Мембраны PVDFМиллипорIPVH00010Мембраны, используемые для переноса белков после SDS-PAGE.
RandomforestsrcCRAN6.0-94Унифицированное передискретирование (включая LOOCV), сетки настройки и конвейеры моделей.
ReadrCRANNAПолучить матрицы/фенотипы из UCSC Xena (например, хабы TCGA/GTEx).
SDS-Page Gel (12%)Био-Рад185-5096Система, используемая для количественного ПЦР.
StringdbБиопроводник1.20.3Визуализация результатов обогащения (dotplot, cnetplot, ridgeplot).
SuperpcCRAN1.7.7Регрессия с частичными наименьшими квадратами, адаптированная к моделям Кокса.
SurvcompБиопроводник3.42.4Считает нормализацию и оценку дисперсии при необходимости (необязательно, дополняет лимма-вум).
ВыживаниеCRAN1.01-2Быстрая иерархическая кластеризация, используемая WGCNA (по желанию).
SurvivalsvmCRAN2.2.2Обобщённое усиленное регрессионное моделирование (градиентное бустинг).
SurvminerCRAN3.8-3модели пропорциональных опасностей Кокса; Kaplan– Майер изгибается.
TCGAbiolinksБиопроводникT9039Программный доступ к данным TCGA; Скачайте и подготовьте экспрессию и клинические данные.
Программа атласа генома рака (TCGA)NAhttps://www.cancer.gov/tcga; 175 GBM и 534 LGGИспользуется для концепции и валидации моделей
TidyverseCRAN1.17.6Высокопроизводительная обработка данных для больших матриц/таблиц.
ТаймерокCRAN0.5.0Визуализация KM и рендеринг таблицы рисков.
ТРИзолИнвитроген15596026Реагент для экстракции РНК из клеток.
UCSC XenaNAhttps://xenabrowser.net/datapages/Используется для концепции и валидации моделей
UcscxenatoolsБио-Рад4561044Используется для разделения белков в анализе Western Blot.
WGCNACRAN0.95Корреляционные матрицы для генов контрольных точек и взаимосвязей признаков.

Ссылки

  1. Goodenberger, M. L., Jenkins, R. B. Genetics of adult glioma. Cancer Genet. 205 (12), 613-621 (2012).
  2. Cordier, D., Krolicki, L., Morgenstern, A., Merlo, A. Targeted radiolabeled compounds in glioma therapy. Semin Nucl Med. 46 (3), 243-249 (2016).
  3. Jiang, T., et al. Clinical practice guidelines for the management of adult diffuse gliomas. Cancer Lett. 499, 60-72 (2021).
  4. Huang, X., et al. Immune-Related Gene SERPINE1 Is a Novel Biomarker for Diffuse Lower-Grade Gliomas via Large-Scale Analysis. Front Oncol. 11, 646060(2021).
  5. Cole, A. P., et al. Microglia in the Brain Tumor Microenvironment. Adv Exp Med Biol. 1273, 197-208 (2020).
  6. Vitale, I., Manic, G., Coussens, L. M., Kroemer, G., Galluzzi, L. Macrophages and metabolism in the tumor microenvironment. Cell Metab. 30 (1), 36-50 (2019).
  7. Cheng, W., et al. Bioinformatic profiling identifies an immune-related risk signature for glioblastoma. Neurology. 86 (24), 2226-2234 (2016).
  8. Rodriguez, S. M. B., et al. Glioblastoma and immune checkpoint inhibitors: a glance at available treatment options and future directions. Int J Mol Sci. 25 (19), (2024).
  9. Arrieta, V. A., et al. Immune checkpoint blockade in glioblastoma: from tumor heterogeneity to personalized treatment. J Clin Invest. 133 (2), (2023).
  10. Kadry, H., Noorani, B., Cucullo, L. A blood-brain barrier overview on structure, function, impairment, and biomarkers of integrity. Fluids Barriers CNS. 17 (1), 69(2020).
  11. Wang, Q., et al. Tumor evolution of glioma-intrinsic gene expression subtypes associates with immunological changes in the microenvironment. Cancer Cell. 32 (1), 42-56.e6 (2017).
  12. Jansen, J. A., Omuro, A., Lucca, L. E. T-cell dysfunction in glioblastoma: a barrier and an opportunity for the development of successful immunotherapies. Curr Opin Neurol. 34 (6), 827-833 (2021).
  13. Vander Heiden, M. G., Cantley, L. C., Thompson, C. B. Understanding the Warburg effect: the metabolic requirements of cell proliferation. Science. 324 (5930), 1029-1033 (2009).
  14. Dong, X., et al. Tumor metabolism-rewriting nanomedicines for cancer immunotherapy. ACS Cent Sci. 9 (10), 1864-1893 (2023).
  15. Kesarwani, P., Prabhu, A., Kant, S., Chinnaiyan, P. Metabolic remodeling contributes towards an immune-suppressive phenotype in glioblastoma. Cancer Immunol Immunother. 68 (7), 1107-1120 (2019).
  16. Xu, X., et al. LncRNA as potential biomarker and therapeutic target in glioma. Mol Biol Rep. 50 (1), 841-851 (2023).
  17. Sun, J., et al. A novel antisense long noncoding RNA within the IGF1R gene locus is imprinted in hematopoietic malignancies. Nucleic Acids Res. 42 (15), 9588-9601 (2014).
  18. Wang, J. Y., Liu, D., Meng, Y. D., Guo, Y. Y., Zhao, M. Aberrant allelic switch of antisense lncRNA IRAIN may be an early diagnostic marker in laryngeal cancer. Oncol Lett. 20 (4), 65(2020).
  19. Pian, L., et al. Targeting the IGF1R pathway in breast cancer using antisense lncRNA-mediated promoter cis-competition. Mol Ther Nucleic Acids. 12, 105-117 (2018).
  20. Salminen, A., Kaarniranta, K., Kauppinen, A. Insulin/IGF-1 signaling promotes immunosuppression via the STAT3 pathway: impact on the aging process and age-related diseases. Inflamm Res. 70 (10-12), 1043-1061 (2021).
  21. Cortés-Ballinas, L., López-Pérez, T. V., Rocha-Zavaleta, L. STAT3 and the STAT3-regulated inhibitor of apoptosis protein survivin as potential therapeutic targets in colorectal cancer (Review). Biomed Rep. 21 (6), 175(2024).
  22. Liu, Z., et al. Machine learning-based integration develops an immune-derived lncRNA signature for improving outcomes in colorectal cancer. Nat Commun. 13 (1), 816(2022).
  23. Yoshihara, K., et al. Inferring tumour purity and stromal and immune cell admixture from expression data. Nat Commun. 4, 2612(2013).
  24. Ostrom, Q. T., et al. The epidemiology of glioma in adults: a "state of the science" review. Neuro Oncol. 16 (7), 896-913 (2014).
  25. Weidner, N., Semple, J. P., Welch, W. R., Folkman, J. Tumor angiogenesis and metastasis-correlation in invasive breast carcinoma. N Engl J Med. 324 (1), 1-8 (1991).
  26. Perrin, S. L., et al. Glioblastoma heterogeneity and the tumour microenvironment: implications for preclinical research and development of new treatments. Biochem Soc Trans. 47 (2), 625-638 (2019).
  27. Justus, C. R., Sanderlin, E. J., Yang, L. V. Molecular connections between cancer cell metabolism and the tumor microenvironment. Int J Mol Sci. 16 (5), 11055-11086 (2015).
  28. Boedtkjer, E., Pedersen, S. F. The acidic tumor microenvironment as a driver of cancer. Annu Rev Physiol. 82, 103-126 (2020).
  29. Bernhard, C., Reita, D., Martin, S., Entz-Werle, N., Dontenwill, M. Glioblastoma metabolism: insights and therapeutic strategies. Int J Mol Sci. 24 (11), 9137(2023).
  30. Kesarwani, P., Kant, S., Prabhu, A., Chinnaiyan, P. The interplay between metabolic remodeling and immune regulation in glioblastoma. Neuro Oncol. 19 (10), 1308-1315 (2017).
  31. Pellegrino, M., et al. Manipulating the tumor immune microenvironment to improve cancer immunotherapy: IGF1R, a promising target. Front Immunol. 15, 1356321(2024).
  32. Zhang, W., et al. Polarization of macrophages in the tumor microenvironment is influenced by EGFR signaling within colon cancer cells. Oncotarget. 7 (46), 75366-75378 (2016).
  33. DiToro, D., et al. Insulin-like growth factors are key regulators of T helper 17/regulatory T cell balance in autoimmunity. Immunity. 52 (4), 650-667.e10 (2020).
  34. Pennati, M., Folini, M., Zaffaroni, N. Targeting survivin in cancer therapy: fulfilled promises and open questions. Carcinogenesis. 28 (6), 1133-1139 (2007).
  35. Sah, N. K., Khan, Z., Khan, G. J., Bisen, P. S. Structural, functional and therapeutic biology of survivin. Cancer Lett. 244 (2), 164-171 (2006).
  36. Altieri, D. C. Survivin apoptosis: an interloper between cell death and cell proliferation in cancer. Lab Invest. 79, 1327-1333 (1999).
  37. Feng, J., et al. A novel long noncoding RNA IRAIN regulates cell proliferation in non-small cell lung cancer. Int J Clin Exp Pathol. 8 (10), 12268-12275 (2015).
  38. Zhang, H., Zhang, D., Luan, X., Xie, G., Pan, X. Inhibition of the signal transducers and activators of transcription (STAT) 3 signalling pathway by AG490 in laryngeal carcinoma cells. J Int Med Res. 38 (5), 1673-1681 (2010).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи