Методическая статья

Улучшение экранов CRISPR-Cas9 в CAR T-клетках: усовершенствованный метод подготовки библиотек

DOI:

10.3791/69721

⸱

2 января 2026 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Hemato-Oncology Program, Cima Universidad de Navarra, IdiSNA, 2Centro de Investigacion Biomedica en Red de Cancer (CIBERONC), 3Computational Biology and Translational Genomics Program, Cima Universidad de Navarra, IdiSNA, 4Cancer Center Clinica Universidad de Navarra (CCUN), 5Data Science and Artificial Intelligence Institute (DATAI), Universidad de Navarra, 6Hematology and Cell Therapy Department, Clinica Universidad de Navarra, IdiSNA

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы разработали оптимизированный протокол нокаут-скрининга CRISPR-Cas9 для первичных Т-клеток CAR. За счёт снижения переноса gDNA через ферментативное переваривание и pulldown кассет sgRNA позволяет минимизировать артефакты ПЦР, обеспечивая точное обнаружение sgRNA и надёжную идентификацию функциональных генных мишеней.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Терапия Т-клетками на основе химерных антигенных рецепторов (CAR) показала выдающуюся эффективность при ряде гематологических злокачественных опухолей, однако их успех не был полностью воспроизведен при солидных опухолях. Кроме того, даже при гематологических видах рака рецидив после инфузии CAR T-клеток продолжает ухудшать долгосрочные последствия. Эти вызовы подчёркивают острую необходимость разработки стратегий, повышающих эффективность, устойчивость CAR T-клеток, преодолевающие опухолевой и микроопосредованную устойчивость. Кластерные регулярно перемежуточные короткие палиндромные повторы (CRISPR)-Cas9 предоставляют мощный подход к систематическому выявлению генов, регулирующих функцию CAR-Т-клеток. Связывая генетические нарушения с фенотипическими исходами, эти анализы позволяют открыть пути, контролирующие активацию, пролиферацию, формирование памяти и цитотоксичность. Стандартные рабочие процессы включают трансдукцию значительного количества клеток с помощью единой библиотеки направляющей РНК (sgRNA), редактирование через Cas9, отбор отредактированных клеток и ПЦР-амплификацию кассет sgRNA из геномной ДНК (gDNA) перед секвенированием. Однако амплификация ПЦР с использованием большого количества gДНК представляет серьёзные сложности и часто не способна селективно амплифицировать и получить sgRNA. Здесь мы описываем оптимизированный протокол нокаут-скрининга CRISPR-Cas9, который мы тестировали на первичных человеческих CAR T-клетках. Метод включает промежуточный этап при подготовке библиотеки sgRNA, который снижает перенос gDNA за счёт ферментативного переваривания и селективного вытягивания кассеты sgRNA, тем самым повышая эффективность первой амплификации ПЦР. Эта модификация позволила нам получать информацию о sgRNA через наши скрининги CAR T-клеток, которые оставались недостижимыми при предыдущих попытках с использованием традиционных протоколов амплификации ПЦР с 1 и 2 шагами. В заключение, этот оптимизированный рабочий процесс облегчает подготовку скрининговой библиотеки CRISPR в сложных образцах и позволяет выявлять ключевые генетические детерминанты, которые можно таргетировать для повышения терапевтической эффективности.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Иммунотерапия произвела революцию в лечении рака, предложив новые стратегии для усиления и модуляции иммунной системы. Среди них терапия химерными антигенными рецепторами (CAR) Т-клеток стала одним из самых преобразующих подходов. Эта терапия включает генетическую инженерию Т-клеток пациента ex vivo с помощью синтетического рецептора, предназначенного для распознавания конкретного опухольного антигена, тем самым повышая противоопухолевуюактивность 1. Т-клетки CAR показали выдающийся успех при гематологических злокачественных опухолях, с результатами от кратковременной ремиссии до продолжительной выживаемости без болезней с минимальной токсичностью у пациентов, получающих терапию CD19 илиBCMA-таргет 2. На сегодняшний день FDA одобрило семь продуктов с Т-клетками CAR для лечения гематологическогорака 3. Несмотря на эти достижения, значительные ограничения остаются. Проблемы возникают из-за самого продукта CAR T-клеток, часто под влиянием производственного процесса или приспособленности Т-клеток пациента, которые могут быть нарушены прогрессированием заболевания, предшествующими методами лечения или возрастом. Механизмы, связанные с опухолевой резистентностью, такие как снижение уровня антигена, также могут снижатьэффективность 4. Кроме того, иммуносупрессивная микросреда опухолей создаёт дополнительный барьер, который сильно ограничивает устойчивость и функцию CAR T-клеток, особенно у пациентов с солиднойопухолью 5. Следовательно, существует острая необходимость повысить как начальную, так и долгосрочную эффективность терапий CAR T-клетками.

Появление редактирования генов CRISPR-Cas9 предоставило мощные инструменты для анализа функции генов с помощью масштабных скрининговых методов. В этих анализах клетки трансдуцируются с помощью библиотеки с одним проводящим РНК (sgRNA), обычно доставляемой лентивирусными векторами, что обеспечивает одну sgRNA на клетку и стабильную геномную интеграцию. После редактирования и отбора трансдуцированных клеток с помощью Cas9 извлекается геномная ДНК (gDNA), а кассеты sgRNA амплифицируются с помощью ПЦР для подготовки библиотеки. Высокопроизводительное секвенирование затем позволяет количественно оценивать распределение sgRNA по различным фенотипам, тем самым выявляя гены, которые положительно или отрицательно регулируют процесс исследования6.

CRISPR-скрининг широко применяется для изучения биологии Т-клеток и, в последнее время, для повышения эффективности CAR T-клеток. Геномные скрининги выявили регуляторы фундаментальных процессов Т-клеток, включая активацию, пролиферацию и дифференцировку. Например, FAM49B был идентифицирован как регулятор сигнализации рецепторовТ-клеток 7, тогда как SOCS1, TCEB2, RASA2 и CBLB оказались необходимыми для пролиферации послестимуляции 8. Помимо этих основных путей, скрининг CRISPR также выявил гены, участвующие в памяти и истощении Т-клеток. Исследования in vivo выявили Fli1 как кандидата для усиления эффекторных ответов без нарушения памяти или истощенияпрекурсоров 9, а ремоделатор хроматина Arid1a — как регулятор, потеря которого снижает истощениеТ-клеток 10. Регуляторы дифференцировки Т-хелперов типа 2 (Th2) также были характеризованы с помощью этогоподхода 11. Используя специализированную библиотеку sgRNA, ориентированную на 25 киназ, p38 способствует расширению, формированию памяти и защите от окислительного и геномногостресса 12. Аналогично, нокаут REGNASE-1 в CD8+ Т-клетках обеспечил эффекторный фенотип длительного времени, улучшивший контроль опухолей в моделяхмеланомы и лейкемии 13. Дополнительные геномные скрининги выявили Dhx37 как регулятор активации и цитотоксичностиТ-клеток 14, тогда как LTBR и другие гены были валидированы как усилители функции Т-клеток в CAR T и γδT-клетках 15. В последнее время скрининг CRISPR применялся непосредственно в CAR T-клетках, выявляя новые мишени, такие как PRODH2 — фермент, участвующий в метаболизме пролина, усиливающий противоопухоловую активностьCAR T 16, а также TLE4 и IKZF2, инактивация которых повысила эффективность CAR T в глиобластомемоделей 17.

Критическим этапом в скрининге CRISPR является именно селективное усиление кассет sgRNA из чрезмерно больших объёмов gDNA, что сложно обойти из-за огромного количества клеток, используемых в CRISPR-скринингах. Амплификация ПЦР от таких больших объёмов переноса ДНК ставит ряд технических проблем, включая молекулярную перегруженность, ограничивающую физическую диффузию молекул ДНК и полимеразы, временное неспецифическое связывание праймеров и полимеразы с фоном ДНК, внецелевую амплификацию, вызывающую истощение праймера, или секвестрирование Mg2+ основой фосфатного ДНК, а также другиетрудности 18, 19,20,21. Это часто приводит к неудачам ПЦР и/или смещению. Для смягчения этих проблем были предложены различные стратегии, включая разделение амплификации sgRNA от добавления адаптера на два этапа ПЦР22, использование обогащения мишени биотинилированными олигократами и магнитного захваташариков 23,24, а также проектирование плазмид с рестрикционными участками по фланкам кассеты sgRNA для обогащенияфрагментов 25.

В этом исследовании мы представляем оптимизированный протокол нокаут-скрининга CRISPR-Cas9 для первичных человеческих CAR Т-клеток. Используемая библиотека CRISPR — это Brunello Kinome 1, библиотека, содержащая 3052 уникальные sgRNA длиной 20nt, направленные на 763 гена человеческих киназных (4 sgRNA на цель). Т-клетки были выделены путём магнитно-положительного отбора CD4+ и CD8+ из части образцов крови, обогащённой ПБМЦ, от здоровых доноров. При активации анти-CD3 и анти-CD28 Т-клетки были сфинфекцированы библиотекой скрининга CRISPR, а затем трансдуцированы с помощью CAR лентивируса. Клетки расширялись, а затем нуклеофектировали для введения белка Cas9. Клетки, содержащие CRISPR, были отобраны с помощью пуромицина, а CAR-положительные Т-клетки были отсортированы. После экстракции геномная ДНК переваривалась с помощью рестрикционных ферментов (RE), а фрагменты, содержащие sgРНК, были увлечены с помощью биотин-зонда стрептавидина. Затем sgRNA были избирательно амплифицированы и индексированы с помощью двух последовательных ПЦР, а полученные библиотеки секвенировались. Внедрив промежуточный этап для снижения переноса gDNA, мы смогли селективно извлечь и амплифицировать интересующую нашу sgRNA, что позволяет изучать роль киназ в клетках CAR T.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол был выполнен в соответствии с руководящими принципами Университета Наварры. Все участники предоставили письменное информированное согласие. Реагенты и оборудование, использованные в этом исследовании, перечислены в Таблице материалов.

1. Изоляция и активация Т-клеток

  1. Изоляция PBMC
    1. Собрать образцы крови у доноров из пробирок этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА), перенести образцы крови в конические трубки объёмом 50 мл и разбавить кровь PBS (разбавление 1:1).
    2. Добавьте 15 мл среды градиента плотности на дно конической трубки объёмом 50 мл (плотность для PBMC: 1,07). Затем аккуратно добавьте 25 мл разбавленной крови поверх среднего слоя градиента плотности (самая медленная скорость контроллера пипетки). Центрифуга на 30 минут при 800 × г без тормоза.
    3. Соберите кольцо/слой PBMC пипеткой Pasteur в коническую трубку объёмом 50 мл и добавьте PBS до общего объёма 50 мл для мытья. Центрифугу при 650 × г в течение 8 минут. Отбросьте супернатант.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Проверьте мутность супернатанта, чтобы убедиться, что там нет клеток. Если сомневаетесь, разделите подвеску на вдвое больше исходных конических трубок по 50 мл, добавьте PBS до 50 мл и снова центрифугируете.
    4. Повторная суспензия в 50 мл PBS. Считайте с помощью акридина оранжево-пропидиевого йодида (AOPI) в ячейном счетчике. Центрифугу при 650 × г в течение 8 минут.
  2. Магнитная селекция CD4 и CD8
    1. Подготовьте буфер сортировки клеток с флуоресценцией (FACS): PBS, EDTA 2,5 мкм, BSA 0,5% и фильтруйте через 0,2 мкм.
    2. Ресуспензировать PBMC в 80 мкл буфера FACS стерильно на 10 ×10 6 клеток и добавить 10 мкл микрошариков CD4 и 10 мкл микрошариков CD8 на 10 ×10 6 клеток. Инкубировать 20 минут при 4 °C.
    3. Добавьте 10 мл буфера FACS и центрифугу на 8 минут при 650 × г. Полностью отбросьте супернатант.
    4. Повторная суспензия в 500 мкл на 1 × 108 клеток буфера FACS в конической трубке объёмом 15 мл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В одном забеге можно вместить 200 x10 6 ячеек.
    5. Используйте программу Possel для изоляции AutoMacs (высокоскоростного магнитного сортировщика ячеек).
    6. Добавьте до 10 мл PBS, посчитайте с помощью AOPI в люминесцентном счётчике и центрифугуйте при 650 × г в течение 8 минут.
    7. Ресуспензировать клетки 1 x 106/мл в среде роста Т-клеток, содержащие 3% человеческой сыворотки (HS), 1% пенициллина/стрептомицина (P/S), 625 МЕ/мл интерлейкина (IL)-7, 85 МЕ/мл IL-15. Добавьте 10 мкл реагента для стимуляции Т-клеток на 1 мл и хорошо перемешайте. Пластина 2 мл на каждую скважину в плите с 24 лунками (p24w) и инкубировать в течение 24 часов при 37 °C.

2. Производство Т-элементов CAR и скрининг CRISPR

  1. Библиотечная спинфекция и трансдукция CAR
    1. Добавьте соответствующее количество библиотеки лентивируса CRISPR (например, библиотека Brunello Kinome 1. См. дополнительную таблицу 1), определяемую в титрованном анализе, и 8 мкг/мл полибрена.
    2. Центрифугирование при 700 x г в течение 1 часа 30 минут при 32 °C.
    3. Заменить среду свежей Т-клеточной средой с 3% HS, 1% P/S, 625 МЕ/мл IL-7, 85 МЕ/мл IL-15 (финальная [клетка]= 106 клеток/мл).
    4. Через 6 часов добавьте соответствующее количество CAR лентивирусного вектора к мультипликаце инфекции (MOI) 3 и инкубировать в течение 4 дней.
  2. Электропорация Cas 9
    1. Соберите Т-клетки CAR, промывайте один раз с помощью PBS и подсчитывайте клетки с AOPI в счётчике люминесцентных клеток.
    2. Подготовьте 4 мкм Cas9 в электропорационном буфере.
    3. Ресуспензировать CAR T-клетки в 50 мкл на 5 × 106 клеток. Смешайте и аккуратно добавьте 50 мкл суспензии клеток в каждую яме многоколодной кюветной полоски, не образуя пузырей. Затем, используя наконечник пипетки, удалите возможные пузырьки и проведите кончиком вдоль краёв колодца.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если в каком-либо скважине в кювете остаётся без образца, добавьте такой же объём электропорационного буфера. Это критически важный шаг: если машина обнаружит разницу пузыря или разницу в объёмах, она выдаст ошибку.
    4. Используйте программу EXPAND T CELL 3 to nucleofect CAR T-клетки.
    5. Оставьте клетки в кюветах в инкубаторе при 37 °C на 40 минут.
    6. Суспендировать нуклеофектированные клетки в среде роста Т-клеток с 3% HS, 1% P/S, 625 МЕ/мл IL-7, 85 МЕ/мл IL-15 (финальная [клетка]= 106 клеток/мл) и инкубировать при 37 °C в течение 3 дней.
  3. Выбор пуромицинов
    1. Считайте с помощью AOPI в люминесцентном счётчике.
    2. Отрегулировать до 1 x 106 клеток/мл с Т-клеточной средой с IL7 и IL15.
    3. Добавьте пуромицин (2,5 мкг/мл) в среду.
    4. Подсчитывайте клетки каждые 2 дня в течение 6 дней и корректируйте до 1 x 106 клеток/мл при среде роста клеток с 3% HS, 1% P/S, 625 МЕ/мл IL-7, 85 МЕ/мл IL-15 и 2,5 мкг/мл пуромицина.
    5. Проверьте процент АВТОМОБИЛЯ.
  4. Сортируйте популяции Т-клеток CAR и храните образцы (сухие клеточные пеллеты) при -80 °C.

3. Изоляция гДНК

ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте потерь клеток или гДНК на протяжении всего процесса, так как это может подорвать репрезентативность sgRNA. Стремитесь к покрытию sgRNA не менее 500 раз.

  1. Извлекайте gDNA из образцов с помощью набора для экстракции клеток и тканей. Элюируйте дважды, чтобы максимизировать восстановление gDNA.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не используйте более 4 x10 6 клеток на столбец для более эффективного восстановления гДНК.
  2. Измеряйте концентрацию gDNA с помощью набора для количественной оценки dsDNA.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если концентрация слишком низкая для последующих шагов протокола, используйте твердофазный обратимый иммобилизационный реагент (SPRI) на основе бусины для концентрации ДНК.

4. Обогащение кассеты sgRNA (и устранение переноса gDNA)

  1. Переваривание ферментов рестрикции
    1. Переварить максимум 5 мкг гДНК с 20 U фермента (например, для основы LentiGuide-puro библиотеки Brunello Kinome 1 использовать комбинацию NdeI и PspXI) в общем объёме 50 мкл. Увеличить количество реакций для достижения желаемой репрезентативности sgRNA.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Выберите рестрикционные ферменты для разрезания в боковых областях кассеты, но имейте в виду, что некоторые sgRNA могут содержать рестрикционный участок. Эти sgRNA будут потеряны на этом этапе и не появятся в секвенировании. Отсутствие этого руководства служит контролем пищеварения. Дополнительная таблица 1 показывает список sgRNA Kinome 1, которые разделяются PspXI и NdeI.
    2. Инкубировать ночь при 37 °C в термоциклере.
    3. Выполните двухкратную очистку SPRI.
      1. Приготовьте 10 мл элюсионного буфера (EB) (10 мМ Tris-HCl, pH 8,0) и 50 мл свежего этанола 70%.
      2. Закрутите бусины и добавьте 100 мкл в продукт пищеварения.
      3. Тщательно перемешайте с помощью пипетки и инкубуйте 5 минут. Намагничивайте ещё 5 минут.
      4. Во время магнита добавьте 200 мкл этанола 70%, не нарушая гранулу. Подождите 30 секунд, затем сбросьте супернатант.
      5. Повторите шаг 4.1.3.3, всего получится 2 промывки. Дайте бусинам высохнуть 2 минуты.
      6. Вынимите из магнита, добавьте 40 мкл буфера элюции и подвесите шарики с помощью пипетирования. Инкубировать 2 минуты.
      7. Намагничивайте на 2 минуты и переведите супернатант в новую трубку.
        ПРИМЕЧАНИЕ: При первом настройке этого протокола проверьте пищеварение с помощью (капиллярного) электрофореза. Убедитесь, что следит мазок.
  2. Стягивание вниз кассеты sgRNA.
    1. Подготовка магнитных бусинок стрептавидина.
      1. Подготовьте буфер для промывки/связки 2x: 10 мМ Tris-HCl pH 7,5, 2 млн NaCl, 1 мМ EDTA. Разбавьте половину объёма H20до 1x.
      2. Вихрь бусины на 1 минуту.
      3. Перенесите желаемый объём бусины в трубку (обычно достаточно 1 мг), добавьте равный объём буфера для мыть/связывания 1 раз, или не менее 1 мл, и повторно подвесите.
      4. Поставьте трубку на магнит на 1 минуту и выбросьте супернатант.
      5. Снимите трубку из магнита и подвесите вымытые бусины в том же объёме 1x буфера для мытья/связывания, что и первоначальный объём бусин, взятых из флакона.
      6. Повторяйте — всего три промывания.
      7. Подвесьте бусины в 2x Wash/Binding Buffer.
    2. Добавьте 5 мкл 10 мкм вытяжных праймеров, указанных в Таблице 1 , к очищенному расщеплению с шага 4.1.3.6.
    3. Инкубировать в сухой ванне при 96 °C в течение 5 минут, затем сразу поставить во льд на 5 минут.
    4. Добавьте 1 мг заранее вымытых магнитных шариков стрептавидина.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Связывание биотина и стрептавидина лучше всего работает при 1 M NaCl. Обязательно смешивайте равные объёмы бусины и биотинилированной ДНК.
    5. Инкубировать 20 минут, повторно подвешивая смесь каждые 4 минуты.
    6. Намагничивайте на 5 минут.
    7. Помойте бусины три раза с помощью буфера для мытья/перевязки 1×.
    8. Подвесьте бусины в 50 мкл EB 8.0.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используемые здесь кассеты sgRNA связаны со стрептавидиновыми шариками. Не выбрасывайте их.

5. Подготовка библиотеки sgRNA

  1. PCR1
    1. Приготовьте смесь ПЦР1 с 20 мкл геркулазы 5x буфера, 1 мкл dNTP (100 мМ), 1 мкл ДНК-полимеразы, 2,5 мкл 10 мкм прямых и обратно праймеров PCR1, указанных в Таблице 1, и 23 мкл воды ПЦР-класса. Перемешайте пипеты и добавьте смесь PCR1 к шарикам из шага 4.2.8.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В таблице 1 перечислены праймеры PCR1, разработанные для библиотеки Brunello Kinome 1.
    2. Поместите лампы в термоциклер и запустите программу для PCR1, описанную в таблице 2.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что термоциклер может поддерживать реакции 100 мкл. В противном случае — аликвот в реакциях 50 мкл. Масштабируйте по необходимости.
    3. Собрать все PCR1 из одних и тех же образцов в одну пробирку.
    4. SPRI очищает PCR1 с использованием 150 мкл (1,5x) шариков (следуя шагам 4.1.3.3-4.1.3.3.7). Каждую реакцию ПЦР повторно приостановывают в 100 мкл EB 8.0.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При первом настраивании этого протокола проверьте размер и качество продукта ПЦР, запустив 2 мкл 30-тактового ПЦР-продукта в капиллярной электрофорезной системе (например, TapeStation Systems от Agilent).
  2. PCR2
    1. Приготовьте смесь PCR2 с 10 мкл продукта PCR1, 10 мкл буфера 5X, 0,5 мкл dNTP (100 мМ), 1 мкл ДНК-полимеразы, 1,25 мкл праймеров PCR2 вперёд и обратно, перечисленных в Таблице 1 (используйте разные комбинации rP7-i7-BC и P5-i5-BC для каждого образца) и 26 мкл воды сорта ПЦР общего объёма 50 мкл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для поддержания представления библиотеки выполните одну реакцию PCR2 на каждые 104 конструкций в библиотеке.
    2. Поместите лампы в термоциклер и запустите программу для PCR2, описанную в Таблице 2.
    3. SPRI очистка PCR2 с использованием 75 мкл (1,5x) шариков (следуя шагам 4.1.3.3-4.1.3.7). Каждую ПЦР-реакцию повторно приостановывают в 50 мкл EB 8.0.
  3. Количественно измерить PCR2 (то есть библиотеку sgRNA) с помощью комплекта для количественной оценки dsDNA и проверить размер ампликона с помощью капиллярного электрофореза (например, системы TapeStation). Объедините образцы.
  4. Последовательность на инструменте Illumina.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для библиотеки 3052 sgRNA Brunello Kinome 1 обычно достаточно глубины секвенирования 100–200 миллионов чтений на выборку.

6. Анализ

  1. Демультиплексные сэмплы с использованием bcl2fastq.
  2. Проверьте качество файлов fastq, сгенерированных с помощью FastQC.
  3. Извлеките последовательность sgRNA, используя в качестве узора кассетные последовательности, расположенные по бокам sgRNA, а также длину направляющего (20 nt).
  4. Выровняйте последовательность, извлеченную с библиотечной ссылкой, с помощью Bowtie2, чтобы проверить, сколько гипотетических руководств являются аутентичными sgRNA из библиотеки. Используйте samtools для преобразования файла SAM с информацией о выравнивании в формат BAM и генерации файлов сводки.
  5. Подсчитайте и нормализуйте количество чтений для каждой sgRNA в отредактированных и контрольных образцах с помощью функции подсчёта из программного обеспечения MAGecK.
  6. Сравните подсчета с тестовой функцией MAGecK, чтобы получить баллы RRA и список кандидатов генов.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Как описано в разделе протокола, CAR T-клетки были созданы в соответствии с нашим установленнымпротоколом 26. Для CRISPR-скрининга мы адаптировали рабочий процесс, разработанный Вангом и др.17 (рисунок 1A). Кратко: Т-клетки двух независимых доноров были выделены и активированы в течение 24 часов, прежде чем последовательная трансдукция с помощью библиотеки CRISPR sgRNA и лентивирусного вектора CAR, достигнув 67 и 72% CAR-положительных клеток к пятому дню. Часть клеток была нуклеофектирована белком Cas9 для индуцирования нокаутов, а оставшиеся клетки служили базой для представления sgRNA. Трансдуцированные клетки отбирались с помощью антибиотиков, а отдельные популяции затем сортировались по исследуемым фенотипам. Пролиферация CAR Т-клеток отслеживалась на протяжении всего скрининга с использованием AOPI-основанных количества клеток и экспрессировалась в виде изменения складки (рисунок 1B). После добавления пуромицина на 8, 10 и 12 день мы подтвердили успешное обогащение CAR T-клеток, трансдуцированных с помощью библиотеки CRISPR, у обоих доноров, что подтверждается продолжающейся выживаемостью и размножением. Нетрансдуцированные Т-клетки (UTD) и CAR T-клетки без трансдукции библиотеки CRISPR использовались в качестве контроля для отбора антибиотиков.

После экстракции геномной ДНК библиотеки sgRNA были подготовлены методом амплификации ПЦР. Чтобы преодолеть проблемы, возникающие из-за чрезмерной переноски gDNA, мы внедрили протокол, включающий переваривание ферментов рестрикции и вытягивание биотина-стрептавидина кассеты sgRNA (рисунок 2A,B). gDNA была переварена с помощью рестрикционных ферментов NdeI и PspXI, нацеленных на сайты, расположенные по бокам кассеты sgRNA (рисунок 2C). Биотинилированные олиго, предназначенные для связывания выше участков отжига праймера PCR1, использовались для захвата фрагментов кассет sgРНК, а затем стягивались с помощью стрептавидиновых шариков для устранения перенесённой gDNA. Фрагменты, содержащие sgРНК, затем селективно амплифицировались (рисунок 2D) и индексировались через 2 последовательные ПЦР.

Библиотеки из каждого образца секвенировались с помощью следующего поколения секвенирования (NGS). После демультиплексирования, контроля качества и идентификации sgRNA данные анализировались с помощью конвейера MAGeCK. Во-первых, команда подсчёта количественно оценивала и нормализовала количество чтений sgRNA в контрольных (базальных) и Cas9-отредактированных образцах (рисунок 3A,B). Корреляции Пирсона и Спирмана показывают, что репрезентативность sgRNA сохранялась во время эксперимента (донорская gDNA) по сравнению с плазмидной библиотекой (рисунок 3C). Далее команда теста сравнивала оба состояния, присваивая каждому гену баллы по устойчивой агрегации рангов (RRA) (рисунок 3D). Значительно обогащённые или истощённые гены были выявлены с помощью порогов p < 0,05 и логарифмического изменения (LFC) > 0,5 (рисунок 3E). Наконец, анализ обогащения путей кандидатных генов был проведён с помощью Metascape, что выявило основные термины генной онтологии, связанные с идентифицированными регуляторами (рисунок 3F).

figure-results-1
Рисунок 1: CRISPR-скрининг в CAR T-клетках. (A) Схема CRISPR-скрининга в CAR T-клетках. (B) Отбор трансдуцированных клеток с помощью пуромицина (P). Плазмидные библиотеки включают ген пуромицин-резистентности для положительного отбора. Антибиотик был добавлен на 8-й день в среду в нетрансдуцированных образцах нетрансдуцированных (UTD) и CAR T-клеток, а также трансдуцированных CAR T-клеток. Образцы без пуромицина использовались для контроля пролиферации. Представлены данные от двух независимых доноров. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

figure-results-2
Рисунок 2: Подготовка библиотеки для анализа обогащения sgRNA .(A) Схема протокола подготовки библиотеки. (B) Схема относительной локализации размеров резов рестриктивного фермента (ножницы) и областей отжига праймеров PCR1 (стрелка) и биотинилированных праймеров (стрелка с зелёной точкой). (C) Электрофорез гДНК до и после переваривания RE. (D) Селективное обогащение кассет sgRNA после PCR1. Представлены данные от двух независимых доноров из базальных и Cas9 образцов этих двух фенотипов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

figure-results-3
Рисунок 3: Анализ обогащения руководства с помощью MAGeCK. (A) Сводка выходной функции счёта MAGeCK. (B) Распределение чтений. (C) коэффициенты Пирсона и Спирмана для корреляции между донорской гДНК и количеством библиотек плазмид. (D) Потенциальные обогащённые/истощённые гены, ранжированные по модифицированной устойчивой агрегации ранжирования (RRA). (E) Вулканический график, показывающий значимые гены (p-значение < 0,05, LFC > 0,5) красным. (F) Основные термины генной онтологии (GO) после анализа путей Metascape обогащённых значимых генов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Таблица 1: Последовательность праймеров. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Таблица 2: Условия ПЦР. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Дополнительная таблица 1: Список sgRNA в библиотеке Kinome 1 и sgRNA, потерянных при пищеварении с NdeI и PspXI Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

CRISPR-скрининг основан на принципе возмущения с одним направляющим, то есть в одну ячейку должна быть интегрирована только одна sgRNA. Для достижения этого sgRNA обычно доставляются через лентивирусные векторы, и мультипликативность инфекции (MOI) должна тщательно контролироваться. Мой опыт примерно Обычно рекомендуется 0,3, в результате чего от 25% до 30% клеток трансдуцируются одной вируснойчастицей 6. Поэтому точное титрование необходимо для определения необходимого объёма вирусных частиц. Ещё одним важным этапом является потеря покрытия sgRNA во время протокола. Потеря клеток во время сбора предметов, неэффективность при извлечении gDNA (в частности, перегрузка столбцов и неполное элюирование ДНК) или чрезмерная шаблонность при амплификации ПЦР могут способствовать этой потере, что искажает наш анализ sgRNA. Что касается биотинилированных олиго, лучше всего их очищать с помощью ВЭЖХ, чтобы избежать того, что свободный биотин, используемый в синтезе, насыщает шарики стрептавидина. Кроме того, настоятельно рекомендуется использовать 3'-амино-модификатор для предотвращения амплификации биотинилированных праймеров в последующих ПЦР. Кроме того, при проектировании этих олиго избегайте перекрытия с праймерами PCR1, чтобы избежать конкуренции при усилении. Кроме того, биоинформатический анализ требует тщательного внимания: паттерны экстракции sgRNA зависят от основы плазмиды (например, lentiGuide-puro или lentiCRISPR v2), а жёсткость выравнивания может варьироваться от точного совпадения до некоторой терпимости к несоответствиям. Кроме того, поскольку этот протокол включает этап переваривания, некоторые sgRNA с рестрикционными сайтами могут быть потеряны, что требует корректировки справочной библиотеки.

В этом исследовании мы предлагаем оптимизированный протокол подготовки библиотеки скрининга CRISPR, который обогащает фрагменты, содержащие sgРНК, посредством переваривания и, что важнее, этапа вытягивания вниз. Ранее рестрикционное переваривание ферментов ранее предлагалось как стратегия снижения входа и обогащения gDNA для sgRNAкассет 27. Аналогично, биотинилированные зонды широко применяются в молекулярной биологии для захвата специфических нуклеиновых кислот или белок-нуклеиновых кислоткомплексов 28,29,30,31.

Наш протокол основан на этих принципах и адаптирует их для CRISPR-скрининга в первичных CAR Т-клетках, хотя следует признать ряд ограничений. Во-первых, первичные Т-клетки CAR накладывают ограничения на масштаб скрининга, так как их возможности расширения ограничены. Для поддержания достаточного покрытия и представления sgRNA требуется большое количество стартовых клеток. Когда это невозможно, можно использовать меньшие пользовательскиебиблиотеки 12, хотя это уменьшает масштаб генетического допроса. Биологическая изменчивость — ещё одна проблема; Различия между донорами ожидаемы, а перекрытие значимых ударов часто составляетскромные 17. Во-вторых, стратегия обогащения основана на наличии и расположении мест рестрикционного фермента. В редких случаях эти сайты могут находиться внутри sgRNA последовательностей, что более проблематично для небольших библиотек с ограниченной избыточностью. Однако большинство библиотек, особенно геномные дизайны, включают несколько sgRNA на цель, минимизируя общее влияние потери направляющего. Наконец, альтернативные стратегии обогащения на основе фрагментации, такие как соникация в сочетании с захватомзонда 24, могут обеспечить некоторую гибкость в случаях, когда переваривание рестрикционных ферментов неподходящее.

В целом, кассета sgRNA представляет собой крошечную долю всей геномной ДНК в клетках, отредактируемых с помощью CRISPR, что делает эффективное обогащение критически важным для успешной подготовки библиотеки. По сравнению со стандартными протоколами, наш оптимизированный рабочий процесс снижает перенос gDNA и способствует амплификации ПЦР-амплификации интересующей sgRNA. Хотя сочетание фрагментации гДНК и биотинилированного пробного пуллдауна со стрептавидиновыми шариками концептуально не является новостью, его интеграция в CRISPR-скрининг позволяет избежать распространённых ПЦР-подводных камней и повышает воспроизводимость CRISPR-скрининга. Кроме того, включение стандартизированных метрик контроля качества на каждом ключевом этапе (таких как чистота Т-клеток после сортировки, доля клеток, устойчивых к пуромицину, целостность gDNA и эффективность трансдукции CAR) дополнительно повысит устойчивость и воспроизводимость рабочего процесса. В заключение, хотя этот оптимизированный протокол разработан в контексте первичных CAR T-клеток и с двумя донорами (что может представлять собой ограничение, хотя использовалось несколько образцов от каждого донора), этот оптимизированный протокол может быть широко применим к другим CRISPR-скринингам и NGS-процессам с большими переносами gDNA.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

У авторов нет конфликтов интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Это исследование было поддержано проектом PID2022-137914OB-I00, финансируемым MICIU/AEI /10.13039/501100011033 и FEDER, UE. Это исследование было поддержано Instituto de Salud Carlos III (ISCIII) через Red de Terapias Avanzadas TERAV и TERAV+ (RD21/0017/0009 и RD24/0014/0010), а также через Centro de Investigacion Biomedica en Red de Cancer CIBERONC (CB16/12/00489). Это исследование было поддержано Gobierno de Navarra Salud (GN2023/08 и GN2024/04) и Proyectos Estratégicos (DIAMANTE 0011-1411-2023-000105 и 0011-1411-2023-000074). Рисунки 1B и 2A были созданы с помощью BioRender.com

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
4200 TapeStationAgilentG2991A
Акридин ОранжИнвитрогенA1301
AMPure XP Бекман КоултерA63881
Сепаратор autoMACS NEOМильтени130-120-327Высокоскоростной магнитный сортировщик элементов
Биотинилированные олигоIDT
BSASigmaA9647
Счётчик флуоресцентных клеток целлометра K2РеввитиCMT-K2-MX-150Счётчик люминесцентных элементов
Камеры подсчёта CHT4РеввитиCHT4-SD100-002
CytoSinct CD4 наношарикиGenScriptL00863-1
Нанобусины CytoSinct CD8GenScriptL00864-1
dNTPAgilent200418-51
Динабиды М-280 СтрептавидинИнвитроген11206D
Магнит DynaMag-2Инвитроген12321D
EDTA pH 0,5 м 8,0Инвитроген15575-038
ЭтанолMerck1,00,98,31,000
Электропоратор ExPERT AtxMaxCyteExPERT ATx
Фиколь-ПакЦитива17544203
Filtropur S 0.2 µ mСарштедт83,18,26,001
GenCRISPR Ultra NLS-Cas9-ResearchGenScriptZ03621-1
Геркулазный буфер 5XAgilent600675-525X буфер
Фермент Herculase II FusionAgilent600679-51ДНК-полимераза
ИЛ-15Мильтени130-095-765
IL-7Мильтени130-095-362
Mastercycler X50aЭппендорф6313HG006059
Электропорационный буфер MaxCyteЦитиваEPB1
NdeINew England BiolabsR0111L
Нуклеоспинная тканьМачери-Нагель74,09,52,250
PBSGibco14190-094
PolybreneMerckTR-1003-6
ПраймерыThermoFisher
Пропидиевой йодSigmaP4864
PspXINew England BiolabsR0656S
ПуромицинGibcoA11138-03
Флюорметр Кубит 3.0ИнвитрогенQ33216
Анализ ДНК Qubit HSИнвитрогенQ32851
Сборка обработки стерильной скважины R-50x3MaxCyteLM243882
Т-клетка TransAct у человекаМильтени130-111-160Реагент стимуляции Т-клеток
Ленточная станция HSD1000Agilent5067-5585
TEXMACSМильтени130-097-196Среда роста Т-клеток
Трис Буфер, 1,0 м, pH 8,0, класс молекулярной биологииEMD Милипор648314
Вода — для молекулярной биологии, без ДНК, РНК и протеазыThermoScientific327390010

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Brudno, J. N., Maus, M. V., Hinrichs, C. S. CAR T cells and T-cell therapies for cancer: A translational science review. JAMA. 332 (22), 1924-1935 (2024).
  2. Cappell, K. M., Kochenderfer, J. N. Long-term outcomes following CAR T cell therapy: What we know so far. Nat Rev Clin Oncol. 20 (6), 359-371 (2023).
  3. Cui, K., et al. The challenges and progress of CAR-T cell therapy in the treatment of solid tumors. Mol Cell Biochem. 480 (10), 5345-5367 (2025).
  4. Shah, N. N., Fry, T. J. Mechanisms of resistance to CAR T cell therapy. Nat Rev Clin Oncol. 16 (6), 372-385 (2019).
  5. Redondo-Frutos, R. A., et al. Genetic engineering in CAR T cells for solid tumors: Current state, barriers and future developments. Hum Gene Ther. 36 (17-18), 1138-1153 (2025).
  6. Bock, C., et al. High-content CRISPR screening. Nat Rev Methods Primers. 2 (1), 1-23 (2022).
  7. Shang, W., et al. Genome-wide CRISPR screen identifies FAM49B as a key regulator of actin dynamics and T cell activation. Proc Natl Acad Sci U S A. 115 (17), E4051-E4060 (2018).
  8. Shifrut, E., et al. Genome-wide CRISPR screens in primary human T cells reveal key regulators of immune function. Cell. 175 (7), 1958-1971 (2018).
  9. Chen, Z., et al. In vivo CD8+ T cell CRISPR screening reveals control by Fli1 in infection and cancer. Cell. 184 (5), 1262-1280.e22 (2021).
  10. Belk, J. A., et al. Genome-wide CRISPR screens of T cell exhaustion identify chromatin remodeling factors that limit T cell persistence. Cancer Cell. 40 (7), 768-786.e7 (2022).
  11. Henriksson, J., et al. Genome-wide CRISPR screens in T helper cells reveal pervasive crosstalk between activation and differentiation. Cell. 176 (4), 882-896.e18 (2019).
  12. Gurusamy, D., et al. Multi-phenotype CRISPR-Cas9 screen identifies p38 kinase as a target for adoptive immunotherapies. Cancer Cell. 37 (6), 818-833.e9 (2020).
  13. Wei, J., et al. Targeting REGNASE-1 programs long-lived effector T cells for cancer therapy. Nature. 576 (7787), 471-476 (2019).
  14. Dong, M. B., et al. Systematic immunotherapy target discovery using genome-scale in vivo CRISPR screens in CD8 T cells. Cell. 178 (5), 1189-1204.e23 (2019).
  15. Legut, M., et al. A genome-scale screen for synthetic drivers of T cell proliferation. Nature. 603 (7902), 728-735 (2022).
  16. Ye, L., et al. A genome-scale gain-of-function CRISPR screen in CD8 T cells identifies proline metabolism as a means to enhance CAR-T therapy. Cell Metab. 34 (4), 595-614.e14 (2022).
  17. Wang, D., et al. CRISPR screening of CAR T cells and cancer stem cells reveals critical dependencies for cell-based therapies. Cancer Discov. 11 (5), 1192-1211 (2021).
  18. Yukl, S. A., Kaiser, P., Kim, P., Li, P., Wong, J. K. Advantages of using the QIAshredder instead of restriction digestion to prepare DNA for droplet digital PCR. BioTechniques. 56 (4), 194(2014).
  19. Latham, S., Hughes, E., Budgen, B., Morley, A. Inhibition of the PCR by genomic DNA. PLoS One. 18 (4), e0284538(2023).
  20. Owczarzy, R., Moreira, B. G., You, Y., Behlke, M. A., Wälder, J. A. Predicting stability of DNA duplexes in solutions containing magnesium and monovalent cations. Biochemistry. 47 (19), 5336-5353 (2008).
  21. Sasaki, Y., Miyoshi, D., Sugimoto, N. Effect of molecular crowding on DNA polymerase activity. Biotechnol J. 1 (4), 440-446 (2006).
  22. Seitz, V., Schaper, S., Dröge, A., Lenze, D., Hummel, M., Hennig, S. A new method to prevent carryover contaminations in two-step PCR NGS library preparations. Nucleic Acids Res. 43 (20), e135(2015).
  23. Giuffre, A., et al. Overview of the Agilent Technologies SureSelectTM target enrichment system. J Biomol Tech. 22 (Suppl), S30(2011).
  24. Chen, R., Im, H., Snyder, M. Whole-exome enrichment with the Roche NimbleGen SeqCap EZ Exome Library SR platform. Cold Spring Harb Protoc. 2015 (7), 634-641 (2015).
  25. Horlbeck, M. A., et al. Compact and highly active next-generation libraries for CRISPR-mediated gene repression and activation. eLife. 5, e19760(2016).
  26. Rodriguez-Marquez, P., et al. density influences antitumoral efficacy of BCMA CAR T cells and correlates with clinical outcome. Sci Adv. 8 (39), 514(2022).
  27. Gilbert, L. A., et al. Genome-scale CRISPR-mediated control of gene repression and activation. Cell. 159 (3), 647-661 (2014).
  28. Dash, S., Balasubramaniam, M., Dash, C., Pandhare, J. Biotin-based pulldown assay to validate mRNA targets of cellular miRNAs. J Vis Exp. (136), e57786(2018).
  29. Tsuji, Y. Optimization of biotinylated RNA or DNA pulldown assays for detection of binding proteins: Examples of IRP1, IRP2, HuR, AUF1, and Nrf2. Int J Mol Sci. 24 (4), 3604(2023).
  30. Sui, H., Chen, Q., Imamichi, T. A pulldown assay using DNA/RNA-conjugated beads with a customized competition strategy: An effective approach to identify DNA/RNA binding proteins. MethodsX. 7, 100890(2020).
  31. Chaparian, R. R., van Kessel, J. C. Promoter pulldown assay: A biochemical screen for DNA-binding proteins. Methods Mol Biol. 2346, 165-172 (2021).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

CRISPRCas9sgRNA

Похожие статьи