Исследовательская статья
* These authors contributed equally
Это исследование показывает, что сесквитерпены обладают лактонами из Eupatorium lindleyanum DC. (SLEL) оказывают значительное противовоспалительные эффекты при отёке ушей мышей, вызванном ксилолом, и моделей отёка лап, вызванных каррагинаном, смягчая гистопатологические повреждения, снижая выброс цитокинов и тормозя активацию сигнальных сигналов NF-κB.
Острое воспаление — фундаментальный патологический процесс, связанный со многими иммунными заболеваниями. Eupatorium lindleyanum DC., традиционное лечебное растение, богато сесквитерпеновыми лактонами (SLEL), которые, как сообщается, проявляют фармакологическую активность; однако их противовоспалительные эффекты и связанные с ними молекулярные изменения остаются неполностью охарактеризованы. В этом исследовании острые воспалительные реакции были индуцированы в модели отёка ушей мышей, индуцированной ксилолом, и модели отёка лапы крыс, индуцированной каррагинаном. Повреждение тканей и воспалительная инфильтрация оценивались с помощью окрашивания гематоксилином и эозином. Уровни провоспалительных цитокинов (TNF-α, IL-6 и IL-1β) были количественно измерены в сыворотке с помощью ELISA, а их транскрипционная экспрессия в воспалённых тканях анализировала с помощью количественной ПЦР (qPCR). Изменения в белках, связанных с NF-κB путём, включая фосфорилированный IκBα и p65, были оценены методом вестерн-блоттинга. Лечение SLEL уменьшало отёк уха и лап и облегчало гистопатологические проявления острого воспаления, включая тканевой отёк, инфильтрацию воспалительных клеток и сосудистую заложенность. Параллельно введение SLEL сопровождалось снижением уровня сыворотки и экспрессии тканевой мРНК Tnf-α, Il-6 и Il-1β. Анализ Western blot показал снижение фосфорилирования IκBα и p65 в воспалённых тканях после обработки SLEL, что указывает на модуляцию сигнальных событий, связанных с NF-κB. Вместе эти результаты демонстрируют экспериментальный процесс оценки противовоспалительной активности SLEL в моделях острого воспаления и предполагают, что его эффекты связаны со снижением экспрессии провоспалительных цитокинов и изменением сигнализации, связанной с NF-κB.
Воспаление — это сложная защитная реакция, вызванная патогенным вторжением или повреждением тканей, и играет ключевую роль в ограничении инфекции, устранении вредных стимулов и стимулировании восстановлениятканей 1. Хотя контролируемые воспалительные реакции необходимы для поддержания гомеостаза тканей, чрезмерное или стойкое воспаление может привести к повреждению тканей, нарушениям функции органов и прогрессированию хронических заболеваний. Клинически воспаление характеризуется покраснением, отёком, теплом и болью, а в тяжёлых случаях может привести к системным патологическим реакциям. Всё больше данных связывает нарушение воспаления с развитием рака, сердечно-сосудистых заболеваний и аутоиммунныхзаболеваний 2˒3.
Нестероидные противовоспалительные препараты (НПВС) в настоящее время являются наиболее широко используемыми средствами для управления воспалением. Несмотря на эффективность в облегчении симптомов, длительное применение НПВС часто сопровождается побочными эффектами, включая раздражение желудочно-кишечного тракта, реакции гиперчувствительности и гепатотоксичность4, что ограничивает их клиническую применимость. В результате растет интерес к выявлению альтернативных противовоспалительных средств с улучшенными профилями безопасности. Изучены натуральные продукты, включая традиционные травяные препараты, как потенциальные источники биоактивных соединений с иммуномодуляторными свойствами. Однако обобщённые утверждения о низкой токсичности или системных регуляторных функциях следует интерпретировать осторожно и требовать экспериментальной валидации в определённых моделяхболезни 5.
Eupatorium lindleyanum DC. — это традиционное лекарственное растение, характерные фитохимикаты которого включают сесквитерпеновые лактоны, преимущественно соединения типа гуайанолида и эвдесманолидов, а также гермакранолиды и ксантанолиды6. Экстракты Eupatorium lindleyanum DC. сообщалось о проявлении липидного понижения, антиатеросклеротических, противоопухолевых и противовоспалительных эффектов в различных экспериментальныхусловиях 6. В частности, экстракты этанола Eupatorium lindleyanum DC. показали защитные эффекты в моделях острого поражения лёгких, вызванных липополисахаридами (LPS),7. Однако противовоспалительная активность SLEL и её влияние в классических моделях острого воспаления остаются недостаточно охарактеризованными.
Для устранения этого пробела мы использовали две комплементарные острые воспалительные модели: ксилолов-индуцированный отёк ушей у мышей, который фиксирует быстрые нейрогенные и сосудистые воспалительные реакции, и отёк лап, вызванный каррагинаном у крыс — хорошо зарекомендовавшая модель, отражающая острое воспаление, зависящее от времени, включающее выработку цитокинов и клеточную инфильтрацию. Альтернативные модели, такие как системное воспаление, вызванное ЛПС, не были отобраны из-за акцента на системной иммунной активации, а не локализованного отёка тканей, и ограниченной пригодности для парных тканевых гистологических и молекулярныханализов 8.
Используя эту комбинированную модельную стратегию, воспалительные реакции оценивались с помощью количественных измерений отёка, гистопатологической оценки с помощью окрашивания гематоксилином и эозином (H&E), профилирования цитокинов в сыворотке, транскрипционного анализа на уровне тканей и изменений белка, связанных с NF-κB. Этот протокол особенно подходит для скрининга противовоспалительной активности при остром воспалении, где интересны образование отёка, экспрессия цитокинов и молекулярные показания, связанные с путями. Тем не менее, следует признать ограничения острых моделей, включая ограниченное экстраполяцию на хронические воспалительные состояния и интерпретативные границы при выводе причинности по изменениям сигнализации на уровне тканей.
В совокупности это исследование выделяет подход, основанный на протоколе, который интегрирует комплементарные модели острого воспаления с парными гистологическими и молекулярными анализами, предоставляя воспроизводимую основу для оценки противовоспалительного потенциала соединений травяного происхождения.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол исследования на животных был утверждён Институциональным комитетом по уходу и использованию животных Чунцинского медицинского университета (IACUC-CQMU-2025-10073).
Подготовка фракции сесквитерпена, обогащённой лактоном (SLEL)
Сушёные лекарственные материалы Eupatorium lindleyanum DC. были измельчены и подвергнуты экстракции рефлюкса дважды с 70% (V/V) этанолом при пониженном давлении. Каждое извлечение проводилось с соотношением растворителя к материалу 10:1 (v/w) в течение 2 часа. Комбинированные экстракты были фильтрованы, концентрированы под пониженным давлением при ≤60 °C, а затем вакуумно высушены для получения порошка сырого этанола.
Высушенный экстракт полностью растворялся в дистиллированной воде (окончательная концентрация: 100 мг/мл) и последовательно подвергался полиамидной хроматографии смолы, а затем применялась макропористая адсорбционная хроматография D101 для обогащения сесквитерпеновых лактонов. После достижения равновесия адсорбции смола D101 промывалась дистиллированной водой для удаления полярных примесей, а затем элюировалась безводным этанолом. После этаноловой элапиляции собранная фракция концентрировалась под пониженным давлением и подвергалась сублимационной сушке для получения SLEL-фракции, которая хранилась при −20 °C до использования.
Разделение осуществлялось на платформе UPLC с использованием двойной мобильной фазы ацетонитрила и 0,1% (v/v) муравьиной кислоты в воде. Программа градиента включала начальную 25-минутную изократическую задержку при низком содержании органа, короткий линейный шаг до 70% ацетонитрила, фазу высокоорганического уровня с 90% ацетонитрила и финальный этап уравновесия с возвращением к исходным условиям. Система работала при давлении 0,25 мл·мин⁻1 при температуре колонки 35 °C и объёме впрыска 0,1 мкл (дополнительный рисунок S1).
Животные
В этом исследовании использовали всего 36 самцов крыс типа Спраг–Доули (200 ± 20 г) и 36 самцов мышей BALB/c (20 ± 2 г). Животных содержали в стандартизированных условиях (22 ± 2 °C, влажность 55 ± 5%, цикл света и темноты 12 часов) с свободным доступом к корму и воде. Животных акклиматизировали в течение 7 дней перед экспериментами и ежедневно контролировали общее состояние здоровья. Все процедуры проводились с целью минимизации страданий животных, а анестезия применялась перед забором крови и тканями.
Отёк уха, вызванный ксилолом у мышей
Модель отёка мышиных ушей была установлена как описановыше 9. После акклиматизации мыши были случайным образом распределены на шесть групп (n = 6 на группу): контрольные (CG), модельные (MG), дексаметазон (DEX, 10 мг/кг) и SLEL с низкой дозой (75 мг/кг), средней дозой (150 мг/кг) и с высокими дозами (300 мг/кг). Все процедуры проводились перорально гаваж один раз в день в течение 7 дней подряд (итоговый объем дозировки: 10 мл/кг). Через 1,5 часа после окончательного введения воспаление вызывалось равномерным нанесением 30 мкл ксилола на обе поверхности правого уха, за исключением контрольной группы. Через тридцать минут мыши были анестезиированы, взяты образцы крови и получены 8-мм круглые удары по ушам из одинаковых анатомических положений обоих ушей.
Отёк лап, вызванный Каррагинаном у крыс
Модель отёка крысиных лапок была установлена с использованием каррагинана, как описаноранее 10. Крысы были случайным образом распределены по шести группам (n = 6 на группу): CG, MG, DEX (5 мг/кг) и SLEL с низкой дозой (50 мг/кг), средней дозе (100 мг/кг) и с высокими дозами (200 мг/кг). Лечение вводилось перорально один раз в день в течение 7 дней (10 мл/кг). Исходный объём лапы измерялся перед окончательной дозировкой. Через тридцать минут после последнего применения подкожно ввели 0,1 мл раствора каррагинана 1% (w/v) в подкожную поверхность правой задней лапы. Объём лап измерялся через 1, 2, 3 и 4 часа после инъекции с помощью плетизометра. Отёк лап рассчитывался следующим образом:
Отёк лап (%) = (Vt − V0) / V0 × 100%
Гистологическое исследование
Ткани ушей и лапы были собраны сразу после функциональных оценок. Ткани фиксировались в 10% нейтральном буферном формалине в течение 72 часов при комнатной температуре, вставлялись в парафин, секцировались (5 мкм) и окрашивались H&E согласно стандартнымпротоколам 11.
Ферментно-связанный иммуносорбентный анализ (ELISA)
Образцы сыворотки были получены методом центрифугирования при 3 000 × г в течение 10 минут при 4 °C. Уровни TNF-α, IL-6 и IL-1β были количественно измерены с помощью коммерчески доступных наборов ELISA согласно стандартным протоколам.
Вестерн-блот анализ
Полные экстракты белка были получены из тканей ушей и лап с использованием буфера лизиса RIPA с дополнением ингибиторами протеазы и фосфатазы. Концентрации белков были количественно измерены с помощью анализа BCA, а равные количества белка (30 мкг на образец) были выделены SDS-PAGE и перенесены на мембраны PVDF. Мембраны блокировались 5% обезжиренным молоком в течение 1 часа при комнатной температуре, затем инкубировали первичными антителами при 4 °C ночью и вторичными антителами, конъюгированными с HRP, в течение 1 часа при комнатной температуре. Иммунореактивные полосы были выявлены с помощью усиленной хемилюминесценции и количественно измерены с помощью программного обеспечения ImageJ.
Количественное ПЦР в реальном времени (qRT-PCR)
Общая РНК была выделена из тканей ушей и лап с помощью реагента для экстракции РНК, указанного в Таблице материалов. Один микрограмм полной РНК был обратно транскрипирован в кДНК с помощью коммерческого комплекта обратной транскрипции согласно инструкциям производителя. Количественная ПЦР проводилась с использованием химии SYBR Green с геноспецифическими праймерами (Таблица 1) в реакционном объёме 10 мкл по двухступенчатому протоколу амплификации. Подробные условия обратной транскрипции и параметры циклирования ПЦР приведены в разделе «Протокол». Относительные уровни транскриптов рассчитывались с помощью метода 2⁻ΔΔCT , при этом Gapdh использовался в качестве внутреннего эталонного гена.
Данные и статистический анализ
Данные выражаются в среднем ± SD. Статистические сравнения между двумя группами проводились с помощью непарного t-теста Студента, тогда как односторонний ANOVA применялся для анализов с более чем двумя группами. Статистическая значимость была определена как p < 0,05. Значимость обозначается как # p < 0,05 и ## p < 0,01 по сравнению с контрольной группой (CG), а * p < 0,05 и ** p < 0,01 по сравнению с модельной группой (MG).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Химический состав в SLEL через UPLC-Q/TOF/MSn
Химический профиль SLEL был изучен с использованием UPLC-Q/TOF-MSn в положительном и отрицательном ионных режимах. Девять секвитерпенных лактонов были выделены как доминирующие составляющие (дополнительный рисунок S1). Назначения молекулярных формул были получены на основе наблюдаемых ионов аддуктов, включая [M+H]⁺ и [M+Na]⁺ в положительном режиме, а также [M−H]⁻ и [M+HCOO]⁻ в отрицательной моде (Дополнител...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
В этом исследовании использованы сесквитерпеновые лактоны из Eupatorium lindleyanum DC. (SLEL) оценивались с использованием двух проверенных моделей острого воспаления: отёка ушей, вызванного ксилолом, у мышей и отёка лап, вызванного каррагинаном, у крыс. Включая гистопатологические оценки, измерения цитокинов в сыворотке, количественную оценку мРНК на уровне тканей и сигнальные данные на уровне белков, этот протокол обеспечивает многоуровневую характеристику локальных и системн...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.
Это исследование было профинансировано проектом Фонда естественных наук муниципалитета Чунцин (No cstc2021jcyj-msxmX0365), программой исследований в области науки и технологий Муниципальной комиссии по образованию Чунцина (No KJZD-K202215101, нет. KJZD-M202515104), Совместный исследовательский фонд технологических инноваций Бюро науки и технологий района Чунцин Бишань и Чунцинского университета китайской медицины (No BSZYYLH010), Китайского фонда постдокторских наук (No 2025M783952) и Сычуань-Чунцинского совместного инновационного проекта в области науки и технологий под управлением провинциального департамента науки и технологий провинции Сычуань (No 2024YFHZ0083).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| против GAPDH | ImmunoWay | YN5585 | |
| анти-И&каппа; Bα | Технология клеточной сигнализации | 4812 | |
| анти P65 | Abmart | TA5006 | |
| против P-Iκ Bα | Технология клеточной сигнализации | 2859 | |
| анти-P-P65 | Abmart | TP70621 | |
| BCA | Beyotime Biotechnology Co., Ltd | P10010 | |
| IL-1 и бета; Набор | Xiamen Huijia Biotechnology Co., Ltd | EHJ-20537r | |
| Комплект IL-6 | Xiamen Huijia Biotechnology Co., Ltd | EHJ-20746r | |
| Микропипетка | Эппендорф | ||
| Считыватель микропластин | Gene Co., Ltd | Odyssey Fc | |
| PVDF | Миллипор | IPVH00010 | |
| Набор для обратной транскрипции | MedChemExpress | HY-K051A | |
| Буфер RIPA | Beyotime Biotechnology Co., Ltd | P0013B | |
| SYBR Green Mastermix | MedChemExpress | HY-K0522 | |
| TNF и альфа; Набор | Xiamen Huijia Biotechnology Co., Ltd | EHJ-20039r | |
| ТРИзол | Термо Фишер Сайентифик | 15596018CN | |
| Морозильник с ультранизкой температурой | SANYO |
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE
Запросить разрешение