Method Article

Многометный протокол микроскопии локализации одной молекулы для исследования хроматина в плотной ядерной среде

DOI:

10.3791/69868

⸱

June 5th, 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Northwestern University, 2Center for Physical Genomics and Engineering, Northwestern University, 3Department of Gastroenterology and Hepatology, Northwestern University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы представляем протокол окрашивания и анализа с использованием трёхцветной хроматиновой мономолекулы (SMLM), который позволяет воспроизводимо картировать эухроматина, гетерохроматина и RNAP II для пространственного анализа. Этот протокол обеспечивает эффективную многоцветную маркировку в плотных ядерных средах, включая мишени, связанные с хроматином, что обеспечивает надёжное одновременное обнаружение.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Микроскопия с сверхразрешением значительно продвинула нашу способность исследовать биологические структуры за пределами дифракционного предела, сделав её незаменимой для изучения плотно упакованных ядерных структур, таких как хроматин, ядерная слойка и ядерные тела, например нуклеолы. Хроматин обладает многомасштабной организацией — от нуклеосом размером с нанометр до микронных доменов, что требует подходов к визуализации, способным обеспечивать как высокое разрешение, так и молекулярную специфичность. Микроскопия локализации одной молекулы (SMLM), особенно стохастическая оптическая реконструкционная микроскопия (STORM), позволяет точно картировать эпигенетические метки, предоставляя критическое понимание структуры и функции хроматина. Однако многометковая визуализация в ядерной среде представляет собой уникальные проблемы, включая снижение доступности антител, усиление неспецифического связывания и нестабильность флуорофоров. Для решения этих проблем мы представляем последовательный протокол иммуномаркировки, оптимизированный для ядерных сред с высокой плотностью, обеспечивающий устойчивый трёхцветный SMLM с минимальным перекрёстным контактом и меньшим ухудшением сигнала. Этот метод включает оптимизированные буферные формулы, отбор флуорофоров и стратегии валидации антител для обеспечения воспроизводимой высококачественной маркировки на нескольких целях. Важно отметить, что мы интегрируем этот протокол с вычислительным анализом, который использует локализации от одной молекулярной цели в качестве пространственных якорей (точек посев) для количественной оценки расстояний между целями, локальных плотностей и многометочной ко-аффинности. Это позволяет провести детальный пространственный анализ компонентов хроматина на наноуровне. Этот протокол служит воспроизводимой основой для многокомпонентной визуализации и количественного анализа в плотных субклеточных средах, предоставляя мощный инструмент для исследователей, изучающих сложные ядерные архитектуры, такие как хроматин.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Появление мономолекулярной локализационной микроскопии (SMLM) позволило беспрецедентно исследовать биологические структуры нананометровом масштабе 1,2,3,4,5. Помимо одноцелевого визуализации, расширение на многоцветную SMLM ещё больше продвинуло область, позволив одновременно визуализировать несколько молекулярных видов, а также пространственные и временные связи между субдифракционнымиструктурами 6,7,8,9,10,11 . Однако применение мультиплексированного SMLM к широко распределённым модификациям гистонов остаётся сложным из-за плотной, полимерной природы ядерной ДНК и ограниченного доступа антител в этойсреде 12,13,14,15,16,17,18.

Хроматин демонстрирует иерархическую многомасштабную организацию, охватывающую длину в несколько порядков — от сборок нуклеосом в нанометровом масштабе до микрометровой ядерной архитектуры. На самых больших масштабах хромосомы занимают отдельные хромосомные территории, в которых геном дополнительно разделяется на отделы A/B и топологически связанные домены (TAD), ограничивающие долгосрочные регуляторные взаимодействия с помощью механизмов, таких как петлевиднаяэкструзия 19,20,21,22 . На масштабах ниже 200 нм хроматин организован как неупорядоченный полимер, состоящий из гетерогенных доменов упаковки (PD), а не из отдельных блоков эухроматина и гетерохроматина, при этом транскрипционно активные регионы преимущественно локализуются на границахPD 23,24,25,26,27,28,29 . На самых малых масштабах (5–20 нм) хроматин состоит из неправильных нуклеосом и кладок нуклеосом, что подчёркивает отсутствие однородного мотива сворачивания высшего порядка и подчёркивает возникающий, чешуйно-зависимый характер организациигенома 24,26,30. С быстрым развитием подходов на основе секвенирования, таких как секвенирование иммунопреципитацией хроматина и высокопроизводительное улавливание конформациихроматина 19,30,31,32,33, были выявлены различные особенности структур мезомасштабных организаций хроматина 31,32. Однако эти методы, в отличие от визуализации, не позволяют захватить пространственную геометрию, которая наблюдается только после разрешения этих структур. Методы электронной микроскопии, такие как хроматиновая электронная микроскопия (ChromEM 24) и хроматиновая сканирующая трансмиссионная электронная микроскопия (ChromSTEM 25), показали, что хроматин гетерогенен и организован в упаковочные домены на масштабах длины 50–200нм (25,28,29). Хотя эти методы обеспечивают впечатляющую точность для идентификации доменов упаковки хроматина, они не могут обеспечить молекулярно-специфическое отображение, которое предлагает SMLM. Накопление точек ДНК для визуализации в наномасштабной топографии (DNA-PAINT 22) и мультиплексированная флуоресцентная гибридизация in situ (FISH)19обеспечивают высокий мультиплекс; однако на ДНК-PAINT сильно влияет повышенный фоновой шум, возникающий из-за случайных связывающих событий в олигонуклеотидно-богатой ядернойсреде 12,34, тогда как традиционные методы FISH на основе термической денатурации требуют нарушений сворачивания нативного хроматина. Предыдущие исследования применяли методы сверхразрешающей визуализации для изучения хроматина на этом масштабе длины и выявили гибридный состав доменов упаковки, противопоставляющий модели разделения предыдущихфаз 12,23,34,35. Этот протокол основан на ранее опубликованной статье, в которой обсуждается биологическое значение этихнаходок 34. Таким образом, благодаря высокому разрешению и возможностям мультиплексирования, dSTORM на основе иммунного окрашивания остаётся наиболее жизнеспособной стратегией для многоцветной хроматиновой визуализации в близких условиях.

Этот протокол не первый, демонстрирующий маркировку более чем двух ядерных мишеней, при этом предыдущие исследования маркировали отдельные белковые комплексы илигены 12,36. Несмотря на успешную маркировку посттрансляционных модификаций гистонов нуклеосом, многоцветная хроматиновая SMLM-маркировка, визуализация и анализ представляют собой значительные сложности. Во-первых, иммунокрашивание в плотной среде хроматина требует оптимизации концентрации антител, инкубационной последовательности и буферного состава для обеспечения достаточного проникновения и связывания без избыточного фона. Во-вторых, необходим всесторонний анализ множественных меток, поскольку взаимодействия между эухроматином, гетерохроматином и ферментами, такими как РНК-полимераза, скорее всего, выходят за рамки простых бинарных исключений. На данный момент максимальное количество цветов, продемонстрированных на хроматиновой dSTORM-съёмке, остаётся двумя— 18, 37, 38, 39.

Здесь мы представляем надёжный протокол для трёхцветной хроматиновой SMLM-визуализации и анализа. Наш рабочий процесс окрашивания оптимизирует время инкубации антител и использует улучшенные буферывизуализации 40для длительной сессии визуализации с несколькими метками. Далее мы описываем вычислительные конвейеры для анализа двухцветных расстояний и анализа плотности трёхцветных соединений, что позволяет количественно охарактеризовать взаимосвязи между гетерохроматином, эвхроматином и транскрипционными аппаратами. В отличие от более ранних исследований двухцветного хроматина SMLM, которые предполагали разделение гетерохроматина и эухроматина, трёхцветная визуализация хроматина показывает, что геном организован в упаковочные домены, при этом эухроматин и активная транскрипция локализованы на периферии составляющих ядергетерохроматина 34.

Этот протокол предоставляет сообществу воспроизводимую основу для выполнения многоцветного хроматинового SMLM и разрабатывает стратегии анализа, подходящие для нескольких функционально конъюгированных ядерных целей. Преодолевая методологические пробелы, она позволяет систематически исследовать организацию доменов хроматина на наднуклеосомном уровне, дополняя подходы секвенирования и электронной микроскопии, сохраняя при этом нативную ядерную архитектуру. Эта статья является расширенным протоколом опубликованнойстатьи 34.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ПРИМЕЧАНИЕ: Следующий раздел протокола будет разделён на процесс окрашивания и процесс набывания, описанные ниже. Для учебных материалов по анализу данных, пожалуйста, обратитесь к соответствующей публикации34, в которой подробно описан анализ многомаркировки модификаций гистонов.

1. Процесс окрашивания:

ПРИМЕЧАНИЕ: В протоколе упоминаются тарелки диаметром 35 мм или 8 хорошо оборудованных пластин. Это сосуды, которые наша группа использует для культивирования клеток, однако возможны более мелкие и эффективные методы. Убедитесь, что при использовании альтернативных материалов поддерживаются рекомендуемые концентрации буферных антител. Из-за последовательного характера этого протокола выбор антител важен для успешного маркировки. Мы используем стандартные рассуждения, чтобы убедиться, что наши антитела к мишеням отличаются, чтобы наши вторичные антитела могли нацелиться на отдельные виды хозяина, эффективно минимизируя эффекты вне цели. Порядок маркировки определяется на основе расположения мишени внутри ядра. Поскольку мы нацелены на домены упаковкихроматина 25, 28, 34, 35 и понимаем, что это процесс, управляемый диффузией, мы всегда сначала маркируем гетерохроматические мишени, затем эухроматины и, наконец, RNAPII, чтобы минимизировать стерическое исключение в плотных гетерохроматических областях. Оптимизация буферов проводилась эмпирически в ходе разработки протокола. Мы обнаружили, что включение козьей сыворотки после первой мишени помогает снизить внецелевые эффекты на последующих этапах.

  1. Подготовка буфера
    1. Компоненты буфера:
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для получения дополнительной информации о компонентах, включая время хранения и подготовки, смотрите таблицу материалов. Мы рекомендуем пользователю подготовить все решения до начала протокола, чтобы избежать экспериментальных ошибок. Раствор для закалки должен быть последним.
    2. Сделайте блокирующий буфер
    3. Взвесьте бычий сывороточный альбумин (BSA) так, чтобы конечная концентрация буфера, необходимого для эксперимента, составляла 3%, и добавьте в центрифугную трубку. Наклоните трубку под углом 45°, чтобы кристаллы BSA были распределены внутри, затем добавьте фосфатно-буферный физиологический раствор (PBS). Это делается для предотвращения образования кристаллических комков, которые не растворяются.
    4. Оставьте трубку при комнатной температуре, пока все кристаллы не растворятся. Не трясите трубку или вихрь — это приведёт к образованию пузырьков, которые притянут белки к поверхности и предотвратят полное растворение BSA.
    5. После полного растворения добавьте Triton X-100 так, чтобы его конечная концентрация составила 0,2% (v/v) при объёме, выбранном на шаге 1.3. Если кристаллы не полностью растворены, несколько раз поднимайте и опускайте пипетку, чтобы раствор медленно перемешивать без образования пузырей.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если делаете модифицированный буфер, включите в этот процесс 10% козью сыворотку. Однако модифицированные блокирующие буферы следует готовить свежими во время использования и не хранить долго, но при этом конечные концентрации оставались такими же, как указано в таблице материалов — 3% BSA, 0,2% Triton X-100.
    6. Сделайте буфер для стирки:
      Повторяйте шаги для блокировки буфера в версии 1.1.2, но используйте концентрации, указанные в разделе материалов и здесь для вашего удобства (0,2% BSA, 0,1% Triton X-100 в 1X -DPBS, а для модифицированных — 1% козья сыворотка)
    7. Создайте фиксирующее решение:
      1. Добавьте PBS в центрифугную трубку.
      2. Добавьте соответствующее количество 16% параформальдегида в трубку центрифуги для окончательной концентрации 4%.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Готовьте свежие и готовые при извлечении клеток из инкубатора. Хотя текущий фиксирующий раствор обычно не использует глутаральдегид, он может быть включён в состав и может быть полезен благодаря более устойчивой фиксации и более длительной фиксации по сравнению с параформальдегидем. Система dSTORM не обладает возможностями для флуоресцентных сигналов с использованием глутаральдегида (GA), однако пользователи, обладающие этой возможностью, могут найти полезное для отделения от флуорофорных структур.
    8. Сделайте раствор для закалки:
      1. Взвесьте борогидрид натрия на бумаге.
      2. Подготовьте центрифугную трубку.
      3. Добавьте боргидрид натрия в пробирку.
      4. Добавьте PBS в трубку.
        ПРИМЕЧАНИЕ: После добавления PBS раствор должен иметь пузырьки.
    9. Создайте буфер для изображения:
      1. Растворить 1,4-диабициклооктан (DABCO) в деионизированной РНАЗЕ, свободной от ДНК воде для получения раствора DABCO объемом 13 мл с концентрацией 1 М.
      2. Добавьте 12 M HCl (~240 мкл), пока DABCO полностью растворится и pH не достигнет 8,0.
      3. Приготовьте сульфит натрия 1 м, растворив его в 10 раз в PBS. DTT не требует подготовки.
      4. Для окончательной подготовки используйте предыдущие запасы для получения 65 мМ DABCO с 30 мМ сульфита натрия и 30 мМ DTT (1 М запаса) в деионизированной воде.
      5. Корректируйте pH с помощью титрирования с помощью HCl и NaOH, пока pH не достигнет 8.0. Храните покрытым и запечатанным парапленкой при температуре 4°C не более 2 месяцев. Отслеживайте pH на протяжении всего использования.
  2. Первые детали процесса окрашивания этикетки:
    1. Фиксация:
      1. Возьмите живые клетки из инкубатора и уберите клеточную культурную среду из тарелки. Выбросьте клеточную культурную среду в контейнер для биологических отходов.
      2. Добавьте достаточно PBS, чтобы покрыть элементы (1 мл для 35-мм антенны и 500 мкл для камерного стеклянного затвора).
      3. Аккуратно помешайте посуду, чтобы промыть клетки с помощью PBS, затем уберите PBS из тарелки. Выбросьте PBS в контейнер для биологических отходов.
      4. Добавьте достаточно фиксирующего раствора, чтобы покрыть клетки (1 мл для 35-мм тарелки и 500 мкл для камерного стеклянного затвора), затем оставьте клетки на 10 минут.
      5. Пока клетки фиксируются, взвесьте борогидрид натрия для раствора для закалки и добавьте его в центрифугную трубку.
      6. Удалите фиксирующий раствор из чашки и выбросьте его в соответствующий контейнер для жидких химических отходов.
    2. Закалка
      1. Добавьте достаточно PBS, чтобы покрыть поверхность (1 мл для 35 мм тарелки и 500 мкл для камерного стеклянного слайда), затем поставьте миску на шейкер (любой стандартный шейкер подойдёт) на 5 минут, чтобы промыть клетки.
      2. Снимите тарелку с шейкера, снимите PBS и выбросьте её в соответствующий контейнер для жидких химических отходов.
      3. Добавьте достаточно раствора для закалки (250 мкл в чаше на 8 лунок) в чашу, чтобы покрыть поверхность (1 мл для 35 мм тарелки и 500 мкл для камерного стеклянного слайда), затем поставьте миску на шейкер на 7 минут, чтобы закалить автофлуоресценцию в клетках.
      4. Пока ячейки находятся на шейкере, оставшийся раствор для закалки выбросьте в трубку центрифуги в правильно маркированный контейнер для жидких химических отходов.
      5. Снимите чашу с шейкера, уберите раствор для закалки и выбросьте её в соответствующе маркированный контейнер для жидких химических отходов.
      6. Добавьте достаточно (250 мкл с 8-луночной чашкой) PBS в тарелку, чтобы покрыть поверхность (1 мл для 35 мм тарелки и 500 мкл для камерного стеклянного слайда), затем поставьте тарелку на шейкер на 5 минут для промывания ячеек.
      7. Снимите тарелку с шейкера, снимите PBS и выбросьте её в соответствующий контейнер для жидких химических отходов.
      8. Повторите шаги 1.2.2.6 и 1.2.2.7 ещё два раза (всего 3 промывания PBS).
    3. Блокировка
      1. Добавьте достаточно блокирующего буфера в тарелку, чтобы покрыть поверхность (250 мкл для 8-луночной чашки, 1 мл для 35 мм тарелки и 500 мкл для камерного стеклянного затвора).
      2. Поставьте тарелку на шейкер не менее чем на 1 час, чтобы проникнуть клеточные мембраны и заблокировать участки связывания (занять неуказанные участки, чтобы они не мешали целевой мембране). (Хотя мы несколько раз проверяли минимальную успешную длительность блокировки в 20 минут, мы настоятельно рекомендуем блокировать не менее 1 часа и дольше до ночи. Возможно, потребуется оптимизация для целевой и клеточной линии.)
      3. Пока клетки находятся на шейкере, приготовьте раствор для окрашивания первичных антител (см. рекомендуемую концентрацию на сайте поставщика или см. таблицу в разделе материалов).
      4. Чтобы определить общий объём растворов для окрашивания, добавьте 0,5 мл к объёму, необходимому для покрытия ячеек (например, для одной 35-мм тарелки приготовьте раствор 1,5 мл).
      5. Удалите объём, определённый в разделе 1.2.3.1, из буферного блока и добавьте этот объём в новую трубку центрифуга, чтобы подготовить раствор для окрашивания.
      6. Добавьте соответствующее количество первичного антитела в блокирующий буфер, чтобы получить правильную конечную концентрацию. Основные объёмы запасов антител для нескольких часто используемых антител можно найти в разделе материалов.
      7. Снимите тарелку с шейкера, снимите засорный буфер и выбросьте её в соответствующе маркированный контейнер для жидких химических отходов.
    4. Первичное окрашивание антител:
      1. Добавьте достаточно раствора для окрашивания первичных антител в чашу, чтобы покрыть поверхность (1 мл для 35 мм тарелки и 500 мкл для камерного стеклянного слайда), затем поставьте чашу на шейкер минимум 1-2 часа до ночи для маркировки клеточных мишеней.
      2. Снимите чашу с шейкера, удалите первичный раствор для окрашивания антител и выбросьте её в соответствующе маркированный контейнер для жидких химических отходов.
      3. Добавьте достаточно буфера для мытья, чтобы покрыть поверхность (1 мл для 35 мм тарелки и 500 мкл для камерного стеклянного слайда), затем поставьте миску на шейкер на 5 минут, чтобы промыть клетки.
      4. Снимите тарелку с шейкера, снимите буфер для стирки и выбросьте её в соответствующе маркированный контейнер для жидких химических отходов.
      5. Повторите шаги 1.2.4.3 и 1.2.4.4 ещё два раза (всего 3 буферных промывки).
      6. Пока клетки находятся на шейкере во время последней промывки, приготовьте вторичный раствор для окрашивания антител (см. рекомендуемую концентрацию на сайте поставщика или см. предыдущие эксперименты).
      7. Чтобы определить общий объём растворов для окрашивания, добавьте 0,5 мл к объёму, необходимому для покрытия ячеек (например, для одной 35-мм тарелки приготовьте раствор 1,5 мл).
      8. Удалите объём, определённый в разделе 1.2.4.7, из блокирующего буфера и добавьте этот объём в новую трубку центрифуга, чтобы подготовить раствор для окрашивания.
      9. Добавьте соответствующее количество вторичного антитела в блокирующий буфер, чтобы получить правильную конечную концентрацию. Объемы запаса вторичных антител для нескольких часто используемых антител можно найти в таблице материалов.
      10. Оберните трубку центрифуги вторичным раствором для окрашивания антител алюминиевой фольгой, пока она не будет готова добавить к клеткам в чашке.
    5. Вторичное окрашивание антител:
      1. Добавьте в чашу достаточное количество раствора для окрашивания антител, чтобы покрыть поверхность (1 мл для 35 мм тарелки и 500 мкл для камерного стеклянного слайда), затем поставьте чашу на шейкер минимум на 40 минут, чтобы добавить флуорофоры к маркированным клеткам целям.
      2. Убедитесь, что чаша покрыта алюминиевой фольгой, чтобы предотвратить отбеливание флюорофоров.
      3. Снимите чашу с шейкера, удалите вторичный раствор для окрашивания антител и выбросьте её в соответствующе маркированный контейнер для жидких химических отходов.
      4. Добавьте в чашу достаточно PBS, чтобы покрыть поверхность (1 мл для тарелки 35 мм и 500 мкл для стеклянного затвора камеры), затем поставьте миску на шейкер на 5 минут, чтобы промыть клетки.
      5. Снимите тарелку с шейкера, снимите PBS и выбросьте её в соответствующий контейнер для жидких химических отходов.
      6. Повторите разделы 1.2.5.4 и 1.2.5.5 ещё раз (всего 2 промывания PBS).
      7. Теперь клетки можно сфотографировать или сохранить для последующего съёмки. Если вы делаете снимок сразу, следуйте шагам в разделе «Получение». Если храните для съёмки позже, продолжайте следовать приведённым ниже шагам.
      8. Добавьте достаточно PBS в чашу, чтобы покрыть поверхность (1 мл для 35 мм тарелки и 500 мл для камерного стеклянного затвора) перед хранением.
      9. Оберните чашу парапленкой, затем алюминиевой фольгой, чтобы предотвратить как испарение жидкости, так и отбеливание флуорофоров.
      10. Храните упакованную форму при 4°C до готовности к изображению.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Для этикеток, используемых в этом протоколе, тарелки можно хранить 2-3 дня, прежде чем качество изображения значительно ухудшится; Однако разные антитела могут иметь разную стабильность, но при правильном хранении остаются стабильными в течение некоторого времени после завершения протокола. Хранить размеченную посуду дольше недели не рекомендуется, так как фиксирующий раствор недостаточно концентрирован для долгосрочной стабильности.
  3. Последующий процесс окрашивания этикетки:
    1. Блокировка:
      1. Обратитесь к 1.2.3.1 - 1.2.3.2, но используйте блокирующий буфер с козьей сывороткой. Время инкубации блокировки может составлять до 1 часа, но мы рекомендуем использовать более длительное время с верхней границей на ночь (18-24 часа) для этих последующих меток, чтобы снизить внецелевой связывание. Пожалуйста, обратитесь к предыдущим экспериментам.
      2. Тем временем готовьте первичные растворы антител вместо блокирующего буфера с помощью козьей сыворотки.
    2. Первичное окрашивание антител:
      1. Подготовьте модифицированный блокирующий буфер и буфер для промывания с козьей сывороткой и буфер для промывания козьей сывороткой, как описано в разделе подготовки буфера.
      2. Обратитесь к разделам 1.2.3-1.2.4 (Блокировка и первичное окрашивание антител) с использованием модифицированных буферов блокировки и промывания:
        ПРИМЕЧАНИЕ: Время инкубации первичного антитела может составлять от 1 часа до ночного времени (8-24 часа). Хотя наилучшие результаты маркировки достигаются при более длительном времени инкубации, особенно для мультилейбла. Данные в этом протоколе подготовлены с помощью этапов инкубации за ночь.
      3. Незадолго до окончания инкубационного времени приготовьте вторичные растворы антител в модифицированном блокирующем буфере 1.1.3.
    3. Вторичное окрашивание антител:
      1. Обратитесь к разделу 1.2.5 (Вторичное окрашивание антителами), но используйте блокирующий буфер с козьей сывороткой.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Обратите внимание, что время инкубации может быть всего 1 часа, но мы тестировали более длинные времена (2-4 часа) с похожей производительностью. Для следующих меток повторяйте раздел 1.3.

2. Процесс приобретения

ПРИМЕЧАНИЕ: Для сбора данных используйте программное обеспечение элементов Nikon Imaging Software (NIS), совместимое с используемым микроскопом. Любое программное обеспечение, которое может управлять фильтром, световым путём и настройками камеры, подходит для этого протокола. Следующий протокол визуализации адаптирован для подсветки образца с помощью полной внутренней флуоресценции (TIRF); однако протокол маркировки совместим с несколькими видами визуализации. Не-TIRF визуализация возможна с этим протоколом маркировки для STORM и необходима для 3D-приложений STORM. Пожалуйста, используйте стандартный протокол для альтернативных методов визуализации.

  1. Последующий процесс окрашивания этикетки:
    1. Включите необходимые оптические компоненты и установите связь с соответствующим программным обеспечением. В большинстве случаев, как в NIS, программное обеспечение не полностью инициализируется, если компьютер не сможет правильно взаимодействовать с микроскопом, камерой и управлением сценой.
    2. Открытое программное обеспечение NIS (или его аналог).
    3. Настройте live view: Включите live view > переключение) Оставите автомасштаб > в настройках камеры установить время экспозиции на 30 мс.
    4. Настройте путь данных для приобретений.
    5. Перейти к верхней панели Приобрести> Быстрый таймлапс> Путь
    6. Выберите правильное имя файла для первого приобретения и установите количество кадров на 10 000.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эти меры предпринимаются для ограничения времени воздействия образца на источник света после начала съёмки.
    7. Убедитесь, что критический и нулевой угол TIRF заранее установлены до захвата. Пожалуйста, обратитесь к онлайн-источникам с обучающими материалами о том, как это сделать. Как уже говорилось, если вы не используете подсветку TIRF, этот шаг можно пропустить.
    8. Выберите правильный световой путь для камеры и переключите опцию Epi Illumination в разделе Lamps (на NIS или аналогичном программном обеспечении), чтобы убедиться, что зеркало настроено для широкого освещения от не-лазерного стандартного источника света.
  2. Подготовка образцов:
    1. Получите образцы и добавьте буфер визуализации (формулировка, описанная в разделе 1.1, Подготовка буфера) к образцу. (В зависимости от используемого буфера изображения, могут потребоваться различные меры предосторожности. Защищайте образцы от света.)
    2. После добавления масла в объектив поместите образец на сцену с правильным держателем и переключением Perfect Focus, а затем сфокусируйтесь на образце.
  3. Этапы визуализации:
    1. Найдите лазерную точку и перейдите к месту на тарелке/тарелке без ячеек.
    2. Включи подсветку TIRF .
    3. Измените фильтр, чтобы он соответствовал соответствующему фильтру для пропускания красного (или любого лазера, используемого для получения данных для данного образца).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте фильтр с несколькими вырезами, как описано в таблице материалов. Многопрофильный фильтр не требуется, и пользователи могут выполнять изображения неразличимых фильтрующих кубиков, предназначенных для флуорофоров, используемых при окрашивании.
    4. Включите лазер на минимальной мощности лазера ~ 1 мВт (это зависит от источника освещения, но делается для предотвращения случайного обесцвечивания) и установите угол зеркала на критический угол.
    5. Если рядом нет ячеек, увеличьте мощность лазера, пока лазерное пятно не станет чётко видно в реальном времени.
    6. Используйте инструмент Область интереса (ROI), нарисуйте, установите и сохраните ROI там, где находится лазерное пятно.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для образцов с несколькими этикетками, пожалуйста, убедитесь, что лазерные пятна для всех необходимых источников света выровнены. В этом протоколе мы используем три лазера и следим за совпадением всех пятен. Это крайне важно, поскольку совместная регистрация пространственных данных требует лазерного выравнивания.
    7. Вернуться к подсвечению Epi и фильтру Bright Field.
    8. Используя инструмент определения ROI, найдите подходящую здоровую клетку (например, подходящая клетка HCT116 должна иметь приклееную, полигональную или овальную форму с чёткой границей клетки).
    9. Центрируйте ROI на ядре и нажмите OK , чтобы увеличить положение ROI (используйте яркое освещение, так как состояние клетки нельзя определить напрямую по широкополым флуоресцентным изображениям ядра).
    10. Вернуться к освещению TIRF с использованием того же метода, что и в версии 2.3.2.
    11. Выберите подходящий фильтр для максимальной длины волны, помеченной мишени (в большинстве случаев это far red, то есть Alexa Fluor 647 с меткой мишени). Обычно выбирают самую длинную длину волны первым, чтобы избежать фотоотбеливания образца с короткими длинами волн, если у отмеченных мишень вторичные элементы, перекрывающие спектры.
    12. При НИЗКОЙ мощности лазера для каждого необходимого лазера (в случае с несколькими метками это будет 3 лазера) включите лазер и засветите ядро, чтобы убедиться, что образец правильно выровнен.
    13. Используйте органы управления TIRF, чтобы убедиться, что образец освещён TIRF.
    14. Выберите подходящую Z-позицию для приобретения в зависимости от потребностей. Однако это можно скорректировать непосредственно перед приобретением.
    15. Set exposure time based on needs of the fluorophores (use anywhere between 10‬-30 ms).
    16. Нажмите «Приобрести> Быстрый таймлапс».
    17. Установите кадры на ≥10,000 и нажмите Применить , чтобы создать файл в указанной директории.
    18. Включите мощность лазера на 50% и используйте образец с фотоотбеливателя.
    19. Ядро сначала должно отбелить, но вскоре (через несколько секунд) оно должно начать мигать.
    20. Вернуться к желаемому критическому углу и Z-позиции, переключая сохраненные позиции или вручную управляя углом зеркала и Z-позицией, чтобы получить быстрый таймлапс.
    21. Убедитесь, что на этапе нет дрейфа, иначе совместная регистрация многоканальных изображений будет выполнена неправильно. Используйте фидуциарные маркеры (флуоресцентные микрошарики) или сохраняйте Z-позицию в начале сбора для последующего использования для коррекции дрейфа с помощью метода сохранения положения для многоточечного сбора в устройстве.
    22. Смените фильтр (или оставьте его, если используете многоступенчатый фильтр с пропускающей полосой для необходимого фторофора) и повторите разделы 2.3.17-2.3.20 (Для последующих маркировк всегда начинайте с низкой мощности лазера, регулируйте параметры и получайте).
  4. Обработка данных:
    1. Загрузите raw стек изображений в FIJI с помощью плагина Bio-Formats. Сгенерируйте проекцию минимальной интенсивности, выбрав Image> Stacks> Z Project и выбрав минимальную интенсивность в качестве типа проекции. Вычтите эту минимальную проекцию из raw стека с помощью калькулятора процесса > изображения. На полученном изображении выполните фоновый вычитание (Процесс > Вычитание фона) с радиусом вращающегося шара 5 пикселей.
    2. Определите область интереса (ROI) для отдельных ячеек вручную или с помощью плагина Nuclei Outline (Plugins > GDSC > Cells > Nuclei Outline).
    3. Проведите анализ локализации предварительно обработанного стека изображений в рамках определённой ROI с помощью плагина ThunderSTORM (Плагины > анализ ThunderSTORM > Run). Используйте соответствующие параметры для надёжной локализации (например, фильтр изображения: B-spline, порядок = 3, масштаб = 2; порог пиковой интенсивности = 1,5× std (Wave.F1); метод локализации субпикселей: Гаусс, сигма = 2; радиус посадки = 4; метод подгонки: максимальная вероятность). Полученные координаты можно использовать для восстановления изображения сверхразрешения.
    4. Для многоканальных экспериментов объединяйте каналы для создания составного хроматинового реконструированного dSTORM-изображения (изображение > цветные > объединённые каналы).

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Репрезентативные трёхцветные изображения хроматина dSTORM

Предлагаемый протокол последовательного окрашивания был проверен как валидный для различных клеточных линий, включая BJ-фибробласт, HCT116, AC16, HeLa, MCF10A и др. На рисунке 1 показаны репрезентативные изображения из клеток BJ-фибробласта, HeLa и MCF10A.

Валидация аналитического конвейера с использованием смоделированных наборов данных

Разработка трёхцветного протокола иммунофлуоресценции потребовала создания специализированного вычислительного подхода, способного обрабатывать сложность многоцелевых ядерных SMLM-данных (рисунок 2A,2B). Учитывая плотную хроматиновую среду, где несколько целей сосуществуют вблизи, мы реализовали фреймворк анализа точечного облака, который напрямую обрабатывает координаты локализации, а не реконструируют изображения. Этот подход использует обширные инструменты кластерного анализа данных в облакеточек 40, 41, 42. Мы систематически оценивали способность аналитического конвейера различать биологически значимые пространственные закономерности с помощью контролируемых моделируемых наборов данных. Были сгенерированы четыре типа распределения для представления различных сценариев организации хроматина: нормальное распределение для плотно кластерных модификаций, равномерное распределение для дисперсных паттернов, зоны исключения тороидального моделирования распределения и случайное распределение как организационный контроль (рисунок 2C). Эти симулированные паттерны были закреплены на подлинных позициях кластеров гетерохроматина, полученных из экспериментальных данных H3K9me3, сохраняя реалистичные ядерные пространственные ограничения. Этот аналитический фреймворк использует кластеризацию DBSCAN (эпсилон = 50 нм, минимальные точки = 3), который является одним из многих методов кластерного анализа в данныхSMLM 40,41,42. Для обеспечения правильных параметров кластеризации мы ранее описали метод оптимизации, адаптированный для обнаружения доменов упаковкихроматина 34. Обратите внимание, что при использовании этого в качестве начального этапа анализа пользователям необходимо оптимизировать параметры, определяющие выбор, через структуру, окружение и функцию целевого объекта. Здесь границы кластера определяются с помощью вычислений выпуклой оболочки, что исключает предположения о геометрии области. Наша валидация показала чёткое различие всех моделируемых паттернов распределения по уникальным профилям гистограмм расстояния (рисунок 2D). Каждый тип пространственной организации создавал характерные сигнатуры при анализе локализаций относительно центроидов гетерохроматина. Анализ заполненности совместных помещений тестировался с использованием моделирования с двумя маркерами и контролируемыми пространственными соотношениями (рисунок 2E). Пространственно сегрегированные маркеры (нормально-тороидальная конфигурация) обеспечивали минимальную плотность соединения, как ожидалось, что привело к плоским профилям распределения (рисунок 2E). Перекрывающиеся маркерные паттерны (нормально-случайная конфигурация) приводили к уменьшению плотности соединения с увеличением расстояния от опорных точек, что соответствует теоретическим прогнозам. Результаты валидации демонстрируют способность нашей системы обнаруживать и количественно оценивать пространственные взаимосвязи в сложных многоцелевых наборах данных. Для получения дополнительной информации о том, как были созданы эти симулированные наборы данных, пожалуйста, обратитесь к полной публикации34.

Репрезентативные результаты анализа структуры хроматина

Внедрение нашего метода валидированного анализа в биологических образцах выявляет характерные пространственные организационные паттерны, достижимые с помощью этого протокола. Используя клетки HeLa, обработанные с помощью нашей трёхцветной процедуры окрашивания H3K9me3, H3K27ac и РНК-полимеразы II, мы демонстрируем аналитические возможности, обеспечиваемые этой методологией. Гетерохроматин H3K9me3 служит идеальной эталонной системой, учитывая устоявшиеся данные о структуре концентрического хроматина на шкале 200 нм из предыдущих сверхразрешающихисследований 23, 28, 35. Анализ начинается с идентификации доменов гетерохроматина на основе DBSCAN, которые затем классифицируются по эффективному радиусу: малые домены (25-40 нм), средние домены (40-80 нм) и большие домены (80-253 нм). Эта стратификация размеров объясняет задокументированную гетерогенность размеров доменов упаковки ДНК, при этом средние домены составляют примерно 80 нм врадиусе 25. Измерения расстояния используют окно поиска с радиусом 1,5x (см. рисунок 2B вверху) для захвата проксимальных эухроматиновых и полимеразных сигналов (рисунок 3A,B).

Репрезентативные результаты показывают, что как H3K27ac, так и РНК-полимераза II стабильно локализуются вблизи границ гетерохроматина по всем категориям доменов, что соответствует предыдущимисследованиям 28,44 и моделям расположения транскрипции относительно доменовхроматина 23,35,45,46. Количественный анализ расстояний показывает средние позиции очень близко к периферии доменов: большие домены показывают H3K27ac на -1,0 нм и РНК-полимеразу II на 8,4 нм от границ, тогда как меньшие домены демонстрируют сопоставимые периферические ассоциации с незначительными позиционными различиями. Эти измерения показывают, что активные элементы хроматина концентрируются на границе между репрессивным и пропускающим доменами, а не полностью исключаются. Анализ плотности суставов демонстрирует способность протокола выявлять пространственную связь между совместно маркированными целями (рисунок 3C-F). Анализ относительно доменов гетерохроматина показывает пиковую плотность суставов непосредственно за границами доменов (r/r₀> 1), что указывает на предпочтительную ко-локализацию H3K27ac-РНК-полимеразы II в периферических областях (рисунок 3G-I). Эти результаты демонстрируют, как этот конвейер окрашивания и анализа может помочь исследовать сложные пространственные связи в плотных условиях.

figure-results-1
Рисунок 1: Три цветных изображения используемых ячеек. Трёхцветные изображения (A) BJ фибробласта (B) HeLa и (C) MCF10A. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

figure-results-2
Рисунок 2: Фреймворк количественного анализа для пространственной организации целей относительно кластеров гетерохроматина. (A) Аналитический конвейер для многоканальных данных SMLM, используемых в этом исследовании. (B) Схематические расчёты расстояния до периферии для выявленных кластеров гетерохроматина и метод совместного учёта аффинности. Оба метода используются для количественного определения расположения двух мишеней относительно структуры кластера гетерохроматина. (C) Примеры распределений рассеяний вокруг конкретных кластеров гетерохроматина, использованные висследовании 34 для определения различных биологических организаций целевых структур (сгруппированных внутри домена, вокруг домена или несвязанных и случайно распределенных). (D) Расстояние до гистограммы периферии для центрально кластеров, случайно распределенных и тороидально распределенных и (E) кривых совместной аффинности для примеров моделирования. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

figure-results-3
Рисунок 3: Количественные пространственные отношения транскрипционных маркеров вокруг гистоновых доменов. (A) Результаты гистограммы расстояния до периферии для примерных биологических данных многомаркированных клеток HeLa. Для малых (<40 нм), средних (40-80 нм) и больших (>120 нм) доменов для RNAPII и (B) H3K27ac относительно кластеров H3K9me3. (C-E) Примеры изображений для трех меток dSTORM ячеек HeLa (H3K9me3, H3k27ac, RNAPII2-S2p, с вставленным и увеличенным изображением для одной области. (F) Выпуклая оболочка (красная) подгонка области, изображённой в E с зоной анализа, серым цветом. (G) Графики аффинности для RNAPII относительно H3K27ac и H3K27ac (H) относительно RNAPII в ROI анализа для всех доменов среднего размера данных в наборе данных. (I) Плотность суставов RNAPII и H3K27ac в анализе ROI для всех средних доменов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот трёхцветный протокол SMLM представляет собой значительный прогресс в наших способностях исследовать организацию хроматина в плотной ядерной среде. Последовательный подход к маркировке с помощью иммунофлуоресценции, в сочетании с пространственным анализом точечного облака, который использует оценки локализации в качестве точек в качестве основы анализа, предоставляет исследователям мощный инструмент для изучения наномасштабных связей между различными модификациями хроматина и активными транскрипционными механизмами, ранее необнаруживаемыми традиционными микроскопическими методами.

Стратегия последовательного окрашивания протокола решает фундаментальные проблемы, присущие многоцелевым ядерным съёмкам. В отличие от цитоплазматических или мембранно-ассоциированных структур, которые относительно редки, ядренные хроматиновые мишени существуют в чрезвычайно высокой плотности с перекрывающимися пространственными доменами. Наш модифицированный подход к блокированию, включающий сыворотку от вторичных видов хозяев после каждого раунда маркировки, эффективно предотвращает перекрёстную реактивность между парами антител, сохраняя при этом специфичность мишени. Ночные инкубации при 4°C обеспечивают полное проникновение антител по всему ядерному объёму, что критически важно для достижения равномерной плотности маркировки, необходимой для количественного анализа SMLM. Этот протокол надёжно создаёт изображения с разрешением 15-20 нм по нескольким клеточным линиям, что делает его широко применимым для исследований структуры хроматина.

Ниже приведены советы по устранению неисправностей во время сеанса визуализации. Если ядра не отбеливаются, наиболее вероятная причина — недостаточная интенсивность лазера в образце, что может быть связано с низкой мощностью или неправильным углом TIRF; в этом случае устраните неполадку, проверяя выравнивание лазера, увеличивая мощность лазера и аккуратно регулируя угол TIRF. Если морганий в ядре очень мало, но они остаются постоянно яркими, это указывает на недостаточное обесцверждение ядров. Если моргания очень редкие, а ядра совсем не видны, наиболее вероятное объяснение — неудачное окрашивание, и реагенты и антитела следует проверить перед повторением протокола. Наоборот, если количество ядерных морганий очень велико (желательный результат), требуется более длительное время отбеливания, пока отдельные, хорошо разделённые мономолекулярные моргания не будут визуально разрешены. В традиционных экспериментах SMLM соответствующую плотность маркировки часто можно оценить с помощью чётко определённых эталонных структур, таких как микротрубочки; Однако хроматин обладает высокой гетерогенной организацией и не имеет чётко определённой структуры основы-истинности, что усложняет такую оценку. Основываясь на эмпирической оптимизации и предыдущем опыте, мы гарантируем, что эффективная плотность маркировки достигает примерно 100 локализаций на мкм², чтобы обеспечить надёжную реконструкцию доменов упаковки хроматина. В нашем протоколе мы не использовали фидуциарные маркеры, но рекомендуем, если они есть у пользователей. В наших экспериментах боковые сдвиги остаются в пределах 0,2 пикселя (менее ~5 нм), что можно игнорировать. Поэтому мы не использовали фидуциарные маркеры.

Выбор H3K9me3, H3K27ac и РНК-полимеразы II даёт дополнительную информацию о структуре хроматина на наноуровне. H3K9me3 служит идеальным пространственным ориентиром, поскольку он образует дискретные, хорошо определённые кластеры, представляющие конститутивный гетерохроматин и которые могут быть надежно идентифицированы с помощью автоматизированных алгоритмов кластеризации. H3K27ac отмечает хроматин, ассоциированный с энхансерами, который активно участвует в регуляции генов, тогда как РНК-полимераза II напрямую указывает на сайты активной транскрипции. Вместе эти три цели позволяют исследовать, как транскрипционные механизмы и регуляторные модификации хроматина организуются относительно гетерохроматических областей в ядерной архитектуре.

Рамка анализа точечного облака устраняет критические ограничения предыдущих исследований организации хроматина, позволяя комплексный пространственный анализ в плотных ядерных средах. Традиционные методы парного сравнения не могут отразить сложные пространственные отношения, возникающие при сосуществовании нескольких модификаций хроматина в одних и тех же ядерных областях. Наш подход использует анализ плотности суставов для выявления ко-локализации H3K27ac и РНК-полимераза II относительно кластеров H3K9me3, предоставляя количественную информацию, которую невозможно получить в отдельных двухцветных экспериментах.

Репрезентативные результаты последовательно демонстрируют целостную организационную модель, а не строгую компартментализацию хроматина. И H3K27ac, и РНК-полимераза II преимущественно локализуются на периферии кластеров гетерохроматина при разных размерах доменов, при этом количественные измерения показывают расположение в пределах 10 нм от границ кластера, что подтверждает результаты других групп с аналогичными методами и моделямитранскрипции 23,28,35,45,46 . Анализ плотности суставов показывает, что активные транскрипционные механизмы и ассоциированный с энхансерами хроматин чаще всего связываются в областях вокруг гетерохроматических кластеров. Эти результаты оспаривают простые модели фазового разделения и поддерживают интегрированные организационные принципы, при которых различные модификации хроматина сохраняют тесную пространственную близость, а не образуют отдельные отдельные отделения.

Модульная конструкция протокола позволяет исследовать различные вопросы по биологии хроматина с помощью замещения мишень, сохраняя при этом одинаковую аналитическую основу. Исследования времени репликации могут заменять белки клеточного цикла, такие как антиген клеточного ядра пролиферации (PCNA) и поддержание мини-хромосомы (MCM), тогда как исследования ответа на повреждение ДНК могут быть направлены на γH2AX и факторы восстановления. Исследования клеточных циклов могут изучать модификации гистонов, изменяющиеся в процессе деления, а исследования дифференциации могут быть сосредоточены на эпигенетических признаках, связанных с привязанностью к родословной. Последовательный подход к маркировке учитывает любую комбинацию ядерных белков или модификаций хроматина, для которых существуют надёжные антитела, ограниченные главным образом спектральной совместимостью и факторами перекрёстной реактивности. Эта гибкость позволяет исследователям решать фундаментальные вопросы динамики хроматина в различных клеточных процессах, сохраняя при этом возможности количественного пространственного анализа.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы этого протокола не имеют раскрытия информации или конкурирующих интересов.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана грантами NIH U54CA268084, U54CA261694 и R01CA228272, грантами Национального научного фонда EFMA-1830961 и CBET-2430743, а также благотворительной поддержкой Роба и Кристин Голдман, мистера Дэвида Сакса и благотворительного фонда Кристины Каринато.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Andor iXon Ultra 888 электронно-умножающий CCD АндорDU-888U3-CSO-#BV NA
Бычий сывороточный альбуминСигма ОлдричA7030Используется для блокировки и мытья буферов. Не храните блокирующий буфер на основе BSA более 1 месяца при 4&°; C
Changchun New Industries Optoelectronics Tech. Co., Ltd., модель MGL-FN-532 (532 нм) PSU-H-LED https://www.cnilaser.com/MGL-FN-532.htmNA
Когерентная OBIS лазерная коробка (405 нм, 488 нм, 532 нм, 552 нм, 637 нм) и bbsp;Когерентный1228877 Лазеры коллимировали с 3– 10 кВт/см³ средняя мощность при выборке, минимум 10 000 кадров, собранных на канал длины волны с   10– 30  ms  Время приобретения. 
DABCO (1,4-диабицикло-(2.2.2)-октановое)SigmaD27802NA
DBPS (1 раз)Термо Фишер14190-136NA
Дистиллированная водаNANAЛюбая дистиллированная вода подойдёт хорошо 
DTT (дитиотрейтол), 1MSigma43816NA
Восемь хорошо оборудованных крышных стеклянCellvisC8-1.5H-NЭто может быть любая стеклянная нижняя пластина, но объём нужно регулировать в зависимости от сосуда.
Козлая противомышиная система AF568Термо ФишерA11004Концентрация запаса: 2 мг/мл<бр/> Маркировка стабильности: 2– 3 дня
Козёл против кроликов AF647Термо ФишерA21245Концентрация запаса: 2 мг/мл<бр/> Стабильность после маркировки: 4– 5 дней
Козлая крыса A488Термо ФишерA11006Концентрация запаса: 2 мг/мл<бр/> Маркировка стабильности: 2– 3 дня
Первичные антитела H3K27acТермо ФишерMA5-23516Концентрация запасов: 1,0 мг/мл 
H3K9me3 Первичный антител  AbcamAB1769156Концентрация запасов: 1,287 мг/мл 
Коническая трубка из поли-пропилена высокой прозрачности 15 мл   Corning 352096Используется для фиксационных и закаливающих растворов  
Коническая трубка высокой прозрачности из полипропилена объёмом 50 млКорнинг352070Используется для рабочих запасов блокировочных и промывочных буферов объёмом 40 мл
Соляная кислота (HCl), 12MSigma258148NA
Nikon Eclipse Ti-E с идеальной системой фокусировки НиконTI-DH 611392 Инвертированный микроскоп и bbsp;
Nikon SR APO TIRF, увеличение 100x, 1.49 NA Nikonhttps://www.microscope.healthcare.nikon.com/products/optics/cfi-apochromat-tirf-series  NA
Обычная козья сывороткаAbcamAB7481-1002Используется после завершения первой маркировки. Должно присутствовать в буферах для блокировки и мойки
Параформальдегид 16 % Науки об электронной микроскопии15710Используется в фиксирующем растворе, который следует использовать в течение 2 недель после изготовления. Защищайте от света при температуре 4°; C
Фосфатно-буферный физиологический раствор (PBS) 10XАмбионAM9625NA
Наконечники пипетт 1000 мклSureOne02-707-404Любой наконечник пипетки подойдёт, главное — s, соответствующее тому
RNAPII-PS2AbcamAB252855Стандартный концентрат: 0,98 мг/мл
Борогидрид натрияТермо ФишерS678-10Используйте fresh для закалки буфера каждый раз. 
Гидроксид натрия (NaOH)Thermo Fisher A16037.36NA
Сульфит натрияSigmaS0505NA
Triton X-100 10%Thermo Fisher 28314NA

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Multiplexed DNA-PAINT imaging of the heterogeneity of late endosome/lysosome protein composition. bioRxiv: The Preprint Server for Biology. , (2024).">Bond, C., Hugelier, S., Xing, J., Sorokina, E. M., Lakadamyali, M. Multiplexed DNA-PAINT imaging of the heterogeneity of late endosome/lysosome protein composition. bioRxiv: The Preprint Server for Biology. , (2024).
  2. Quantitative single-molecule localization microscopy. Annu. Rev. Biophys. 52 (1), 139-160 (2023).">Hugelier, S., Colosi, P. L., Lakadamyali, M. Quantitative single-molecule localization microscopy. Annu. Rev. Biophys. 52 (1), 139-160 (2023).
  3. Single-molecule localization microscopy. Nat. Rev. Methods Primers. 1, 39(2021).">Lelek, M., et al. Single-molecule localization microscopy. Nat. Rev. Methods Primers. 1, 39(2021).
  4. Super-resolution imaging with stochastic single-molecule localization: concepts, technical developments, and biological applications. Microsc Res Tech. 77 (7), 502-509 (2014).">Oddone, A., Vilanova, I. V., Tam, J., Lakadamyali, M. Super-resolution imaging with stochastic single-molecule localization: concepts, technical developments, and biological applications. Microsc Res Tech. 77 (7), 502-509 (2014).
  5. Multicolor super-resolution imaging with photo-switchable fluorescent probes. Science. 317 (5845), 1749-1753 (2007).">Bates, M., Huang, B., Dempsey, G. T., Zhuang, X. Multicolor super-resolution imaging with photo-switchable fluorescent probes. Science. 317 (5845), 1749-1753 (2007).
  6. Super resolution imaging of chromatin in pluripotency, differentiation, and reprogramming. Curr Opin Genet Dev. 46, 186-193 (2017).">Ricci, M. A., Cosma, M. P., Lakadamyali, M. Super resolution imaging of chromatin in pluripotency, differentiation, and reprogramming. Curr Opin Genet Dev. 46, 186-193 (2017).
  7. Aberrant chromatin reorganization in cells from diseased fibrous connective tissue in response to altered chemomechanical cues. Nat Biomed Eng. 7 (2), 177-191 (2023).">Heo, S. J., et al. Aberrant chromatin reorganization in cells from diseased fibrous connective tissue in response to altered chemomechanical cues. Nat Biomed Eng. 7 (2), 177-191 (2023).
  8. Comprehensive molecular characterization of the hippo signaling pathway in cancer. Cell Rep. 25 (5), 1304-1317.e5 (2018).">Wang, Y., et al. Comprehensive molecular characterization of the hippo signaling pathway in cancer. Cell Rep. 25 (5), 1304-1317.e5 (2018).
  9. Multicolor super-resolution imaging using spectroscopic single-molecule localization microscopy with optimal spectral dispersion. Appl Opt. 58 (9), 2248-2255 (2019).">Zhang, Y., et al. Multicolor super-resolution imaging using spectroscopic single-molecule localization microscopy with optimal spectral dispersion. Appl Opt. 58 (9), 2248-2255 (2019).
  10. Correlative single molecule lattice light sheet imaging reveals the dynamic relationship between nucleosomes and the local chromatin environment. Nat Comm. 15 (1), 4178(2024).">Daugird, T. A., et al. Correlative single molecule lattice light sheet imaging reveals the dynamic relationship between nucleosomes and the local chromatin environment. Nat Comm. 15 (1), 4178(2024).
  11. Active transcription and epigenetic reactions synergistically regulate meso-scale genomic organization. Nat Comm. 15 (1), 4338(2024).">Kant, A., et al. Active transcription and epigenetic reactions synergistically regulate meso-scale genomic organization. Nat Comm. 15 (1), 4338(2024).
  12. Three-dimensional spectral precision distance microscopy of chromatin nanostructures after triple-colour DNA labelling: a study of the BCR region on chromosome 22 and the Philadelphia chromosome. J Microsc. 199 (2), 96-105 (2000).">Esa, A., et al. Three-dimensional spectral precision distance microscopy of chromatin nanostructures after triple-colour DNA labelling: a study of the BCR region on chromosome 22 and the Philadelphia chromosome. J Microsc. 199 (2), 96-105 (2000).
  13. Superresolution imaging of HIV in infected cells with FlAsH-PALM. Proc Natl Acad Sci. 109 (22), 8564-8569 (2012).">Lelek, M., Di Nunzio, F., Henriques, R., Charneau, P., Arhel, N., Zimmer, C. Superresolution imaging of HIV in infected cells with FlAsH-PALM. Proc Natl Acad Sci. 109 (22), 8564-8569 (2012).
  14. Tailoring fluorescent labels for far-field nanoscopy. Far-Field Optical Nanoscopy. , 159-188 (2015).">Yushchenko, D. A., Bruchez, M. P. Tailoring fluorescent labels for far-field nanoscopy. Far-Field Optical Nanoscopy. , 159-188 (2015).
  15. Coherent nonlinear optical imaging: beyond fluorescence microscopy. Annu rev phys chem. 62, 507-530 (2011).">Min, W., Freudiger, C. W., Lu, S., Xie, X. S. Coherent nonlinear optical imaging: beyond fluorescence microscopy. Annu rev phys chem. 62, 507-530 (2011).
  16. Quantification of immunohistochemistry--issues concerning methods, utility and semiquantitative assessment I. Histopath. 49 (4), 406-410 (2006).">Walker, R. A. Quantification of immunohistochemistry--issues concerning methods, utility and semiquantitative assessment I. Histopath. 49 (4), 406-410 (2006).
  17. A practical guide to evaluating colocalization in biological microscopy. Am J Physiol Cell Physiol. 300 (4), C723-C742 (2011).">Dunn, K. W., Kamocka, M. M., McDonald, J. H. A practical guide to evaluating colocalization in biological microscopy. Am J Physiol Cell Physiol. 300 (4), C723-C742 (2011).
  18. Super resolution microscopy reveals how elongating RNA polymerase II and nascent RNA interact with nucleosome clutches. Nucl Acids Res. 50 (1), 175-190 (2022).">Castells-Garcia, A., et al. Super resolution microscopy reveals how elongating RNA polymerase II and nascent RNA interact with nucleosome clutches. Nucl Acids Res. 50 (1), 175-190 (2022).
  19. A high-throughput DNA FISH protocol to visualize genome regions in human cells. STAR protocols. 2 (3), 100741(2021).">Finn, E. H., Misteli, T. A high-throughput DNA FISH protocol to visualize genome regions in human cells. STAR protocols. 2 (3), 100741(2021).
  20. Chromatin organization by an interplay of loop extrusion and compartmental segregation. Proc Natl Acad Sci. 115 (29), E6697-E6706 (2018).">Nuebler, J., Fudenberg, G., Imakaev, M., Abdennur, N., Mirny, L. A. Chromatin organization by an interplay of loop extrusion and compartmental segregation. Proc Natl Acad Sci. 115 (29), E6697-E6706 (2018).
  21. Genome folding through loop extrusion by SMC complexes. Nat Rev Mol Cell Biol. 22 (7), 445-464 (2021).">Davidson, I. F., Peters, J. M. Genome folding through loop extrusion by SMC complexes. Nat Rev Mol Cell Biol. 22 (7), 445-464 (2021).
  22. Unraveling cellular complexity with transient adapters in highly multiplexed super-resolution imaging. Cell. 187 (7), 1769-1784.e18 (2024).">Schueder, F., et al. Unraveling cellular complexity with transient adapters in highly multiplexed super-resolution imaging. Cell. 187 (7), 1769-1784.e18 (2024).
  23. Chromatin arranges in chains of mesoscale domains with nanoscale functional topography independent of cohesin. Sci Adv. 6 (39), eaba8811(2020).">Miron, E., et al. Chromatin arranges in chains of mesoscale domains with nanoscale functional topography independent of cohesin. Sci Adv. 6 (39), eaba8811(2020).
  24. ChromEMT: Visualizing 3D chromatin structure and compaction n interphase and mitotic cells. Science. 357 (6349), eaag0025(2017).">Ou, H. D., Phan, S., Deerinck, T. J., Thor, A., Ellisman, M. H., O'Shea, C. C. ChromEMT: Visualizing 3D chromatin structure and compaction n interphase and mitotic cells. Science. 357 (6349), eaag0025(2017).
  25. Analysis of three-dimensional chromatin packing domains by chromatin scanning transmission electron microscopy (ChromSTEM). Sci Rep. 12 (1), 12198(2022).">Li, Y., et al. Analysis of three-dimensional chromatin packing domains by chromatin scanning transmission electron microscopy (ChromSTEM). Sci Rep. 12 (1), 12198(2022).
  26. Heterochromatin as an important driver of genome organization. Front Cell Dev Biol. 8, (2020).">Penagos-Puig, A., Furlan-Magaril, M. Heterochromatin as an important driver of genome organization. Front Cell Dev Biol. 8, (2020).
  27. Histone post-translational modifications - cause and consequence of genome function. Nat Rev Genet. 23 (9), 563-580 (2022).">Millán-Zambrano, G., Burton, A., Bannister, A. J., Schneider, R. Histone post-translational modifications - cause and consequence of genome function. Nat Rev Genet. 23 (9), 563-580 (2022).
  28. Nanoscale chromatin imaging and analysis platform bridges 4D chromatin organization with molecular function. Sci Adv. 7 (1), eabe4310(2021).">Li, Y., et al. Nanoscale chromatin imaging and analysis platform bridges 4D chromatin organization with molecular function. Sci Adv. 7 (1), eabe4310(2021).
  29. Mature chromatin packing domains persist after RAD21 depletion in 3D. Sci Adv. 11 (4), eadp0855(2025).">Li, W. S., et al. Mature chromatin packing domains persist after RAD21 depletion in 3D. Sci Adv. 11 (4), eadp0855(2025).
  30. Chromatin accessibility: methods, mechanisms, and biological insights. Nucleus. 13 (1), 236-276 (2022).">Mansisidor, A. R., Risca, V. I. Chromatin accessibility: methods, mechanisms, and biological insights. Nucleus. 13 (1), 236-276 (2022).
  31. Decoding topologically associating domains with ultra-low resolution Hi-C data by graph structural entropy. Nat Comm. 9 (1), 3265(2018).">Li, A., et al. Decoding topologically associating domains with ultra-low resolution Hi-C data by graph structural entropy. Nat Comm. 9 (1), 3265(2018).
  32. Principles of genome folding into topologically associating domains. Sci Adv. 5 (4), eaaw1668(2019).">Szabo, Q., Bantignies, F., Cavalli, G. Principles of genome folding into topologically associating domains. Sci Adv. 5 (4), eaaw1668(2019).
  33. Next-generation sequencing technology: current trends and advancements. Biology. 12 (7), 997(2023).">Satam, H., et al. Next-generation sequencing technology: current trends and advancements. Biology. 12 (7), 997(2023).
  34. Three-color single-molecule localization microscopy in chromatin. Light: Sci Appl. 14 (1), 123(2025).">Acosta, N., et al. Three-color single-molecule localization microscopy in chromatin. Light: Sci Appl. 14 (1), 123(2025).
  35. Chromatin conformation, gene transcription, and nucleosome remodeling as an emergent system. Sci Adv. 11 (2), eadq6652(2025).">Almassalha, L. M., et al. Chromatin conformation, gene transcription, and nucleosome remodeling as an emergent system. Sci Adv. 11 (2), eadq6652(2025).
  36. Ultrafast data mining of molecular assemblies in multiplexed high-density super-resolution images. Nat Comm. 10 (1), 119(2019).">Yin, Y., Lee, W. T. C., Rothenberg, E. Ultrafast data mining of molecular assemblies in multiplexed high-density super-resolution images. Nat Comm. 10 (1), 119(2019).
  37. Super-resolution imaging of higher-order chromatin structures at different epigenomic states in single mammalian cells. Cell Rep. 24 (4), 873-882 (2018).">Xu, J., et al. Super-resolution imaging of higher-order chromatin structures at different epigenomic states in single mammalian cells. Cell Rep. 24 (4), 873-882 (2018).
  38. Imaging higher-order chromatin structures in single cells using stochastic optical reconstruction microscopy. Bio-Protocol. 9 (3), e3160(2019).">Xu, J., Liu, Y. Imaging higher-order chromatin structures in single cells using stochastic optical reconstruction microscopy. Bio-Protocol. 9 (3), e3160(2019).
  39. Super-resolution microscopy reveals how histone tail acetylation affects DNA compaction within nucleosomes in vivo. Nucleic Acids Res. 47 (16), (2019).">Otterstrom, J., Castells-Garcia, A., Vicario, C., Gomez-Garcia, P. A., Cosma, M. P., Lakadamyali, M. Super-resolution microscopy reveals how histone tail acetylation affects DNA compaction within nucleosomes in vivo. Nucleic Acids Res. 47 (16), (2019).
  40. An optimized buffer for repeatable multicolor STORM. ACS Photonics. 9 (12), 3926-3934 (2022).">Abdelsayed, V., Boukhatem, H., Olivier, N. An optimized buffer for repeatable multicolor STORM. ACS Photonics. 9 (12), 3926-3934 (2022).
  41. Advanced image-free analysis of the nano-organization of chromatin and other biomolecules by single molecule localization microscopy (SMLM). Comput Struct Biotechnol J. 21, 2018-2034 (2023).">Weidner, J., et al. Advanced image-free analysis of the nano-organization of chromatin and other biomolecules by single molecule localization microscopy (SMLM). Comput Struct Biotechnol J. 21, 2018-2034 (2023).
  42. A framework for evaluating the performance of SMLM cluster analysis algorithms. Nat Methods. 20 (2), 259-267 (2023).">Nieves, D. J., et al. A framework for evaluating the performance of SMLM cluster analysis algorithms. Nat Methods. 20 (2), 259-267 (2023).
  43. Recent development of computational cluster analysis methods for single-molecule localization microscopy images. Comput Struct Biotechnol J. 21, 879-888 (2023).">Hyun, Y., Kim, D. Recent development of computational cluster analysis methods for single-molecule localization microscopy images. Comput Struct Biotechnol J. 21, 879-888 (2023).
  44. Functional nuclear organization of transcription and DNA replication: a topographical marriage between chromatin domains and the interchromatin compartment. Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 75 (0), 475-492 (2010).">Markaki, Y., et al. Functional nuclear organization of transcription and DNA replication: a topographical marriage between chromatin domains and the interchromatin compartment. Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 75 (0), 475-492 (2010).
  45. Space-time dynamics of genome replication studied with super-resolved microscopy. Postepy biochem. 70 (1), 8-21 (2024).">Gelléri, M., Sterr, M., Strickfaden, H., Cremer, C., Cremer, T., Cremer, M. Space-time dynamics of genome replication studied with super-resolved microscopy. Postepy biochem. 70 (1), 8-21 (2024).
  46. The 4D nucleome: Evidence for a dynamic nuclear landscape based on co-aligned active and inactive nuclear compartments. FEBS Letters. 589 (20), 2931-2943 (2015).">Cremer, T., et al. The 4D nucleome: Evidence for a dynamic nuclear landscape based on co-aligned active and inactive nuclear compartments. FEBS Letters. 589 (20), 2931-2943 (2015).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Single Molecule LocalizationChromatin StructureSuper Resolution MicroscopySequential ImmunolabelingDense Nuclear EnvironmentThree Color SMLMEpigenetic MarksAntibody StainingFluorophore SelectionSpatial Analysis Chromatin

Related Articles