Method Article

Разработка и эффективность наночастиц, чувствительных к ферментам сквален-хидамида для рака поджелудочной железы

DOI:

10.3791/69875

⸱

March 13th, 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School of Pharmaceutical Sciences, Zhejiang Chinese Medical University, 2Huzhou Institute for Food and Drug Control, 3Academy of Chinese Medical Sciences, Zhejiang Chinese Medical University, 4Institute for Innovation in Modern Traditional Chinese Medicine, The First Affiliated Hospital of Zhejiang Chinese Medical University, Zhejiang Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол подробно описывает синтез и характеристику наночастиц, модифицированных фолиевой кислотой, сквален-хитозан, оценивает их ферментно-отзывчивый выброс препаратов и клеточное поглощение in vitro, а также применяет их для усиления терапии рака поджелудочной железы через таргетную доставку.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы представляем протокол для устранения ограниченного внутриопухольного проникновения маломолекулярных препаратов, вызванного плотным внеклеточным матриксом (ЭКМ) при аденокарциноме протоков поджелудочной железы (PDAC). Пропрепараты обладают большим потенциалом для преодоления этой проблемы, повышая проникновение препаратов и эффективность уничтожения опухолей. Сквален (SQ), природный предшественник биосинтеза холестерина с отличной биобезопасностью и биосовместимостью, может улучшать мембранную совместимость гидрофильных препаратов и усиливать их клеточное поглощение при конъюгации с химиотерапевтическими агентами или биоактивными малыми молекулами. В этом исследовании мы разработали новую липофильную пролекарственную систему на основе SQ: гидрофильный противораковый препарат чидамид (CHI) был конъюгирован с SQ через амидную связь — связь, чувствительную к панкреатину и катепсину B (ключевым ферментам, переэкспрессируемым в микроокружении PDAC). Это сопряжение дало амфифильный пропрепарат SQ-CHI, который дополнительно самособирался в наночастицы, модифицированные фолатом (FA) (FA-SQ-CHI NPs). Оптимизированные NP имели однородный гидродинамический диаметр 173,3 ± 1,5 нм, индекс полидисперсности (PDI) 0,181 ± 0,18, высокую нагрузку на препарат 59,0% ± 0,77% и стабильный потенциал зета -13,10 ± 0,86 мВ. Исследования с выбросом in vitro показали, что NPs достигали 80,2% ± 4,22% кумулятивного выброса препарата в течение 72 часов при наличии 0,25% панкреатина, тогда как только 33%-38% выброс наблюдался в pH-скорректированных буферах (pH 4,5 или 7,4) без ферментов. Анализы клеточного поглощения подтвердили, что модификация FA значительно повысила эффективность внутриклеточной доставки, при этом интенсивность флуоресценции в клетках PDAC (PSN-1 и CFPAC-1) была в 1,8–2,3 раза выше по сравнению с нетаргетными NP в течение 12-24 часов. Текущий протокол предусматривает комплексную методологию синтеза и характеристики пропрепарата, in vitro оценки кинетики ферментно-отзывчивого высвобождения, а также сравнительный анализ терапевтической эффективности и проникновения тканей, подчёркивая основные преимущества наноносителя — таргетированную доставку, высокую нагрузку лекарства и контролируемое выброс ферментами.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Аденокарцинома протоков поджелудочной железы (PDAC) — это высокозлокачественная опухоль пищеварительного тракта, частота которой почти равна смертности, а выживаемость составляет всего 8%–9%1 за 5 лет. Сложная микросреда опухоли (ТМЭ) — отличительная чертаPDAC 2. Он в основном состоит из аномального внеклеточного матрикса (ЭКМ), активированных афро-ассоциированных фибробластов (CAF) и глубоко иммуносупрессивной клеточной среды. РЭБ PDAC богат коллагеном первого типа. Как изменённое содержание, так и аномальная структура способствуют прогрессированию опухоли и связаны с плохимпрогнозом 3. CAF — самые распространённые стромальные клетки и состоят из функционально различных подтипов, таких как матриксообразующие myCAFs и воспалительные iCAF, которые демонстрируют фенотипическуюпластичность 4.

С иммунологической точки зрения PDAC TME доминируют проопухолевые миелоидные клетки. Противоопухолевые лимфоциты редки или неэффективны. Зрелые B-лимфоциты также способствуют иммуносупрессии 3,4. В совокупности эти компоненты создают множество терапевтических барьеров. Плотная строма, характеризующаяся высоким давлением интерстициальной жидкости, создаёт значительный барьер проникновения, который серьёзно затрудняет доставку терапевтических препаратов в глубокие опухоли, тем самым существенно ограничивая клиническую эффективность химиотерапевтическихпрепаратов 5. Поэтому разработка систем доставки лекарств, способных преодолевать этот стромальный барьер и глубоко проникать в ткань опухолей поджелудочной железы, имеет решающее значение.

В последние годы сквален (SQ), природный предшественник биосинтеза холестерина, привлекает значительное внимание благодаря своей отличной биобезопасности ибиосовместимости 6. Будучи высоко гидрофобным, SQ может быть конъюгирован с гидрофильными препаратами для образования амфифильных пропрепаратов, что повышает биосовместимость гидрофильных маломолекулярных препаратов с клеточными мембранами и повышает их эффективность клеточногоусваивания 7. Предыдущие исследования показали, что SQ может ковалентно конъюгироваться с различными химиотерапевтическими агентами, такими как цисплатин, паклитаксел и гемцитабин, образуя пропрепаратные наночастицы с высокой нагрузкой лекарств, что улучшает доставку препарата к солиднымопухолям 8,9. Эти свойства подчёркивают широкий потенциал применения SQ в разработке систем доставки лекарств.

Для усиления таргетирования опухолей в этом исследовании используется фолиевая кислота (ФА) в качестве таргетирующего лиганда. FA — это водорастворимый витамин, важный для одноуглеродного метаболизма,биосинтеза 10, редокс-гомеостаза11 и реакцийметилирования 12. Конъюгация FA через её карбоксильные группы с наноносителем обеспечивает специфическое распознавание и связывание с фолатовым рецептором (FR), за которым следует эндоцитоз, опосредованныйрецепторами 13. Используя повышенную проницаемость и эффект удержания опухолевых клеток, Чжэн и др.14 оценили экспрессию фолатных рецепторов α (FRα) при раке поджелудочной железы, нормальной поджелудочной железе, прилегающих тканях и хроническом панкреатите с помощью западного блоттинга и иммуногистохимии, а также проанализировали её связь с клиникопатологическими особенностями. FRα экспрессировался в 94,7% (72/76) случаев рака поджелудочной железы, коррелируя с метастазами, но отсутствовал в нормальных тканях поджелудочной железы. Наночастицы, модифицированные FA, могут селективно накапливаться в FR-положительных тканях, что позволяет проводить молекулярно-таргетную терапию.

Чидамид (CHI) — это новый ингибитор гистондеацетилазы. Доклинические исследования показали, что он также обладает высокой противоопухолевой активностью против солидных опухолей, таких как рак поджелудочной железы и молочной железы, и может обратить против лекарственной устойчивости в опухолевыхклетках 15,16. Однако его высокая гидрофильность связана с низкой эффективностью проникновения в микроокружение опухолей и плохим распределением в твёрдых тканях опухоли, что серьёзно ограничивает клинический терапевтический потенциал при ракеподжелудочной железы 5. Используя хидамид (CHI) в качестве модельного препарата, это исследование предполагает получение самособранных наночастиц путём конъюгации CHI с SQ и последующего изменения с помощью FA. Эта стратегия направлена на повышение противоопухолевой эффективности CHI против рака поджелудочной железы, преодолевая его плохое проникновение в микроокружение опухолей и неоптимальное распределение в твердой опухолевой ткани. Кроме того, оценивая эффективность CHI in vitro в клетках рака поджелудочной железы, этот подход, как ожидается, значительно улучшит проникательность и цитотоксические эффекты CHI — представительного гидрофильного маломолекулярного препарата — в микросреде опухолей поджелудочной железы, тем самым предоставляя экспериментальную основу для направления терапии на основе CHI при раке поджелудочной железы.

В нашем исследовании рассматриваются экспериментальные процедуры подготовки самособираемых пролекарственных наночастиц CHI-SQ-PEG-FA для лечения рака поджелудочной железы. В частности, мы описываем оптимизацию и характеристику процесса подготовки наночастиц CHI-SQ-PEG-FA, а также исследования высвобождения препаратов in vitro . Процесс включает в себя: во-первых, оптимизацию формулы с использованием однофакторного экспериментального подхода и определение оптимального размера частиц и нагрузки препарата; во-вторых, характеристику наночастиц с помощью UPLC и MTS-анализов; и, наконец, создание модели сфероидов опухолей с ко-культивируемыми in vitro . Используя кумарин-6 (C6) в качестве флуоресцентного зонд в таргетных наночастицах, мы дополнительно проверяем проникновение и распределение наночастиц в трёхмерных сфероидах опухолей и получаем соответствующие данные.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Синтез SQ-CHI и SQ-PEG-FA

  1. Синтез SQ-CHI: весит 120,4 мг (0,3 ммоль) 1,1',2-трис-норскваленоевой кислоты и растворяется в 1 мл N, N-диметилформамида (DMF). Последовательно добавляйте NHS (46 мг, 0,4 ммоль) и EDCI (72 мг, 0,38 ммоль) и дайте реакции продолжаться 90 минут под защитой азота.
  2. Растворите чидамид (58,56 мг, 0,15 ммоль) в 1 мл ДМФ и добавляйте его по капле в реакционную смесь. Перемешивать реакцию при комнатной температуре в атмосфере азота в течение 72 часов.
  3. После завершения испарить растворитель под пониженным давлением при 5-15 кПа для получения сырого продукта. Очищение сырого продукта с помощью хроматографии с использованием градиентной элюции DCM/MeOH (99:1, 99:5, 85:5).
  4. Структурная проверка SQ-CHI: поместить синтезированный продукт SQ-CHI в стеклянный флакон и сушить его в вакууме в десикаторе в течение 24 часов. Растворить продукт примерно в 1 мл дейтерированного хлороформе (CDCl 3) и перенести его в ЯМР-пробирку. Проведите 1H ЯМР-анализ для подтверждения химической структурыпродукта 17.
  5. Синтез SQ-PEG-FA: растворить 41,12 мг 1,1',2-трис-норскваленоевой кислоты в 35 мкл ДМФ. Последовательно добавляйте в этот раствор N-гидроксисукцинимид (NHS, 15,71 мг) и 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимид (EDCI, 24,59 мг).
  6. Дайте реакции продлиться 90 минут в атмосфере азота. Растворите 20 мг FA-PEG-NH2 в 35 мкл DMF и добавьте по капле в реакционную смесь.
  7. Перемешайте полученную смесь при комнатной температуре 72 часа под азотом. Очистите сырый продукт с помощью ультрафильтрационной центрифужной трубки объемом 3 кДа MWCO при 5 200 x g в течение 30 минут для удаления нереагируемой свободной кислоты. Поместите очищенный сложный водный раствор SQ-PEG-FA в стеклянный флакон и предварительно заморозьте при -50 °C. Лиофилизировать предварительно замороженный раствор в сублимационной сушилке, чтобы получить комплекс SQ-PEG-FA в виде лиофилизированного порошка.

2. Структурная проверка SQ-PEG-FA

  1. Поместите лиофилизированный комплекс SQ-PEG-FA в центрифугную трубку объёмом 2 мл и дополнительно высушите его в вакууме в десикаторе в течение 24 часов. Растворите продукт примерно в 1 мл дейтерированного диметилсульфоксида (DMSO-d 6) и переместите его в пробирку ЯМР-образца. Проведите 1H ЯМР-анализ для подтверждения химической структуры комплекса.
  2. Оптимизация подготовки и характеристики NP SQ-CHI-PEG-FA
  3. Взвесьте 6,64 мг SQ-CHI и растворите его в 2 мл абсолютного этанола для получения настоящей смеси 3,32 мг/мл (4,3 мкм).
  4. Добавляйте раствор этаноличного бульона SQ-CHI (1, 0,2, 0,1 или 0,05 мл) по капле в 1 мл деионизированной воды при перемешивании. Помешайте 5 минут, затем удалите этанол с помощью испарения с пониженным давлением. Соникировать полученную смесь в течение 30 минут, чтобы получить наночастицевую суспензию CHI-SQ. Измерьте гидродинамический диаметр и индекс полидисперсности (PDI) наночастиц с помощью Zetasizer, чтобы определить оптимальнуюформулу 18.
  5. Добавьте 0,1 мл раствора этанольового бульона SQ-CHI по капле до 1 мл деионизированной воды после разной длительности перемешивания (0, 5, 10 или 20 минут). После соответствующего периода перемешивания удалите этанол с помощью испарения с понижающим давлением, затем проводите соникование в течение 30 минут для получения суспензий наночастиц CHI-SQ. Измерьте гидродинамический диаметр и PDI, чтобы определить оптимальное время перемешивания.
  6. Добавьте 0,1 мл раствора этаноличного бульона SQ-CHI по капле до 1 мл деионизированной воды под перемешиванием в течение 5 минут. После перемешивания удалите этанол с помощью испарения с понижающим давление. Сониковать полученную смесь на разные периоды (0, 5, 20 или 30 минут) для получения наночастиц CHI-SQ. Измерьте гидродинамический диаметр и PDI, чтобы определить оптимальное время сонизации.
  7. Подтвердите оптимальные условия на основе приведённых выше результатов. Здесь полученное соотношение объёма воды к накладному раствору = 10:1, время помешивания = 5 мин, а время соникации = 30 мин. Повторяйте все эксперименты независимо в тройном экземпляре для обеспечения надёжности.
  8. Используйте метод с одним фактором, сохраняя другие параметры постоянными. Последовательно изменяют следующие факторы для оценки их влияния на распределение размеров частиц и потенциал Зета наночастиц: массовое отношение компонентов (SQ-CHI: SQ-PEG-FA = 1:0, 1:0.05, 1:0.5, 1:0.7), отношение объёма фазы (водная фаза: органическая фаза = 1:1, 1:5, 1:10, 1:20) и время соникации (5, 15, 30, 45 мин).
  9. Согласно оптимизированному протоколу, смешивайте стоковые решения SQ-CHI и SQ-PEG-FA в определённом соотношении. Добавьте эту смесь по капле в деионизированную воду при постоянном помешивании. Продолжайте перемешивать 5 минут, чтобы перемешивать всё тщательно. Удалить этанол путём испарения с редукцирующим давлением, затем провести зондную соникацию в течение 30 минут, чтобы получить окончательную наночастицную суспензию CHI-SQ-PEG-FA.
  10. Измерьте гидродинамический диаметр, распределение размеров (PDI) и потенциал зета наночастиц с помощью динамического рассеяния света с помощью лазерного анализатора размеров частиц. Наблюдайте морфологию наночастиц с помощью трансмиссионной электронной микроскопии (TEM, увеличение 150 000 раз) и сканирующей электронной микроскопии (SEM, увеличение 80 000 раз).
  11. Определение содержания нагрузки лекарств с помощью сверхэффективной жидкостной хроматографии (UPLC)
  12. Установите хроматографические условия следующим образом: столбец C18 (2,1 мм x 50 мм, 1,7 мкм); Подвижная фаза: 0,1% водный раствор мучьей кислоты — ацетонитрил (75:25, V/V); длина волны обнаружения: 258 нм; расход: 0,2 мл/мин; температура столба: 23 °C; объём инъекции: 5 мкл; Продолжительность: 10 минут.
  13. Восстановить подвеску CHI-SQ-PEG-FA NP и центрифугировать её при 7 500 x g в течение 30 минут. Соберите супернатант и профильтруйте его через микропористую мембрану диаметром 0,22 мкм. Используйте полученный фильтрат в качестве тестового раствора. Введение и анализ тестового раствора в заданных хроматографических условиях. Рассчитайте содержание наночастиц на основе измеренной концентрации CHI в фильтрате.

3. Исследование выброса препаратов in vitro

  1. Точно пипетить 2 мл аликвота либо свежеприготовленного раствора CHI, либо наночастиц CHI-SQ-PEG-FA в диализный мешок с порогом молекулярного веса 3 кДа.
  2. Погрузите диализный мешок в среду с разными концентрациями панкреатина (0%, 0,05%, 0,1%, 0,25%). В заранее определённые временные интервалы (0,1, 0,5, 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 24, 30, 36, 48, 72 часа) изнимают образцы объёмом 1 мл из среды выпуска и немедленно заменяют их равным объёмом предварительно нагретой свежей среды для поддержания условий для погружения.
  3. Определить концентрацию CHI во всех образцах с помощью метода UPLC (хроматографические условия, указанные в разделе 3) и рассчитать кумулятивный выброс препарата.
  4. Используйте буфер ацетата аммония (pH 4.5) в качестве среды для выпуска. Точно пипетить 2 мл суспензии наночастиц в диализный мешок (3 кДа). Добавьте различные единицы активности (0, 0,7, 1,4, 2,8 U) катепсина B непосредственно в диализную сумку. Окуните мешок в 40 мл среды для выпуска и инкубуйте его в встряхивателе постоянной температуры при 37 ± 0,5 °C и 75 об/мин. В заранее определённые временные точки (0,1, 0,5, 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 24, 30, 36, 48, 72 часа) возьмите образцы по 1 мл и немедленно замените их равным объёмом свежей, предварительно нагретой среды с тем же pH для поддержания равновесия в системе.
  5. Отфильтруйте собранные образцы через микропористую мембрану диаметром 0,22 мкм. Проанализируйте фильтраты с помощью UPLC для определения концентрации препарата. Рассчитайте совокупный процент высвобождения CHI и назначьте профили высвобождения препарата.
  6. Точно пипетировать 2 мл аликвота либо стандартного раствора CHI, либо подвески CHI-SQ-PEG-FA NP в диализный мешок (3 кДа MWCO). Погрузите диализный мешок в среду с разными концентрациями панкреатина (0%, 0,05%, 0,1%, 0,25%). В заранее определённые временные моменты (0,1, 0,5, 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 24, 30, 36, 48, 72 часа) возьмите образцы объёмом 1 мл и немедленно замените их равным объёмом свежей, предварительно нагретой среды для поддержания условий погружения.
  7. Количественно определите концентрацию препарата в образцах с помощью UPLC. Рассчитайте совокупное высвобождение препарата и создайте кривые высвобождения.
  8. Оценка устойчивости наночастиц в PBS
  9. Смешайте CHI-SQ-PEG-FA NP с PBS (pH 7,4) в соотношении 1:20 (v/v). Инкубировать смесь в встряхивателе постоянной температуры при 37 ± 0,5 °C и 100 об/мин. Возьмите образцы на 1, 3, 6, 12, 18, 24, 30, 36, 42, 48, 72, 96 ч, чтобы измерить гидродинамический диаметр и потенциал Зета.
  10. Анализ клеточной пролиферации методом MTS
  11. Клетки рака поджелудочной железы PSN-1 были культивированы в полной среде RPMI-1640. Клетки в логарифмической фазе роста были собраны с помощью расщепления с содержанием 0,25% трипсина при 37 °C и ресуспендированы до плотности 4-6 x 104 клетки/мл в полной среде. Суспензия была засеяна в пластины с 96 лунками при 100 мкл на скважину и предварительно культивировалась в течение 2 часов в инкубаторе с температурой 37 °C и 5%CO2 для полной адгезии клеток.
  12. Аспирируйте оригинальную культурную среду. Создайте контрольную группу (пустую культурную среду) и несколько градиентов концентрации групп чидамидов (0,2, 2, 8, 10, 20, 80 pM), с тремя реплицированными скважиной на группу. Добавьте 100 мкл заготовки или медикаментосодержащей среды в каждую яму, затем переносите клеточную пластину в инкубатор для продолжения культуры. Обработайте экспериментальные группы 100 мкл свежей среды с разными концентрациями (0,2, 2, 8, 10, 20, 80 пМ) SQ-PEG, свободных CHI, CHI-SQ-PEG НП или CHI-SQ-PEG-FA НП, в то время как контрольная группа получает равный объём пустой среды. После дополнительной инкубации в течение 96 часов удалите материал с препаратом из каждой колодцы.
  13. Добавьте в каждую скважину 20 мкл рабочего раствора MTS, затем инкубировать в течение 4 часов. Встряхните пластину на 96 лунок в течение 15 секунд для обеспечения однородности и немедленно измерите поглощение (значение A) каждой ямы на длине волны 490 нм с помощью считывателя микропластин. Вычислите коэффициент пролиферации клеток, вычитая значение OD пустой группы от OD обработанной лекарственно обработанной группы, деля результат на разницу между OD в группе пустой среды и OD пустой группы, а затем умножьте на 100.
  14. Установление модели сфероидов опухолей с со-культивированием in vitro
  15. Смешайте клетки PSN-1 в логарифмической фазе роста с клетками HPSC в соотношении 2:7 и посейте их в пластины с ультранизкой прикреплённостью с 96 лунками и плотностью 5 000 ячеек на колодцу. После образования сфероидов опухолей обрабатывайте сфероиды различными нано-формулами (CHI-SQ-PEG/C6 NP с меткой Coumarin 6 и CHI-SQ-PEG-FA/C6 NP) или DMSO (в качестве контрольной группы) и совместно инкубировать их в течение 48, 96 и 144 часов для оценки эффективности препарата.
  16. После инкубации добавляйте в каждую яме равный объём реагента для анализа жизнеспособности клеток. Поставьте пластину на орбитальный шейкер и встряхните 15 минут, чтобы обеспечить полный лизис, затем инкубировать при комнатной температуре в темноте в течение 30 минут.
  17. Перенесите лизат клетки на чёрную пластину с 96 лунками. Измерьте сигнал хемилюминесценции на длине волны 562 нм с помощью многофункционального считывателя микропластин для количественной оценки жизнеспособности клетки.
  18. Исследование клеточного поглощения наночастиц
  19. Подготовьте целевые наночастицы (CHI-SQ-PEG-FA/C6 NP) и нецеленаправленные наночастицы (CHI-SQ-PEG/C6 NP), включающие кумарин-6 (C6) в качестве флуоресцентного зонда. Регулярно культивируют клетки PSN-1 в логарифмической фазе роста в течение 24 часов, чтобы получить монослой. Растворите кумарин 6 в этаноле для получения настоящего раствора с концентрацией 200 мкг/мл. Смешайте 10 мкл раствора с SQ-CHI и SQ-PEG-FA (или SQ-PEG) в соотношении 1:0,7, затем капля впрыгните в деионизированную воду при перемешивании. Помешайте 5 минут, удалите этанол путём испарения и соникуйте 30 минут. Наконец, очистите с помощью ультрафильтрации (3 кДа, 12 000 об/мин, 20 минут), чтобы получить предметы.
  20. Рассматривайте клетки следующим образом: экспериментальные группы получают безсывороточную среду, содержащую свободные C6, CHI-SQ-PEG/C6 NP или CHI-SQ-PEG-FA/C6 NPs (с конечной концентрацией CHI 5 мкмоль/л и концентрацией C6 2,6 мкмоль/л), тогда как контрольная группа получает равный объём пустой среды.
  21. После инкубации в течение 4, 12 и 24 часов аспирируете содержащую препарат среду. Окрашивать ядра клеток с помощью 4',6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI)19.
  22. Проводить наблюдения под флуоресцентным микроскопом (40x, длина волны возбуждения Ex=360 нм, длина волны излучения Em=477 нм). Оценить клеточное поглощение наночастиц, измеряя флуоресцентную интенсивность кумарина-6.

4. Статистический анализ

  1. Проведите все эксперименты с минимум 3 репликами, чтобы получить данные, представленные в данном исследовании. Анализируйте статистику с помощью программного обеспечения GraphPad Prism. Представлять экспериментальные данные как среднее ± стандартную ошибку среднего значения (SD) и сравнивать группы с помощью теста Стьюдента, одностороннего ANOVA или теста Уилкоксона, где это уместно. Установите порог статистической значимости на уровне P < 0,05.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этом исследовании было успешно разработано и систематически оценено новую таргетную систему доставки нанопрепаратов — самособранные наночастицы на основе чидамидных скваленилированных препаратов (CHI-SQ-PEG-FA NPs; Рисунок 1). Мы синтезировали NP CHI-SQ-PEG-FA (рисунок 2) и систематически оценили влияние различных параметров, включая фазовое соотношение масла к воде (рисунок 3A), длительность пере...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В данном исследовании представлено практическое пошаговое руководство по реализации системы с низкой талией на основе самосборки наночастиц. Самособранные наночастицы, полученные в этом исследовании, имели регулярную сферическую форму, хорошую дисперсию, равномерный размер частиц, высокую нагрузку и эффективность инкапсуляции препаратов, а также продемонстрировали удовлетворительнуюстабильность 21. Для оценки проникновения наночастиц была использована 3D-модель ко...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не заявляют о конфликтах интересов.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана грантами Фонда естественных наук провинции Чжэцзян (LZ23H290001, LY19H280001); гранты Национального фонда естественных наук Китая (82474338 и 82274364); Программа сотрудничества в области сельскохозяйственной науки и технологий провинции Чжэцзян для трёх сельских районов и девяти сторон (2025SNJF075); а также проект исследований общественного благополучия Huzhou Science and Technology Grand (2021GZ261); а также Общий научно-исследовательский проект Департамента образования провинции Чжэцзян (Y202456442, 2025YKJ10).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0,25% трипсин-ЭДТАGibco (США)25200072
1-Этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимид гидрохлорид (EDCI)Sigma-Aldrich (США)E6383
Криогенные флаконы объёмом 2 млКорнинг (США)430488
96-ядровые клеточные культивные пластиныКорнинг (США)3598
Абсолютный этанолКитайская национальная фармацевтическая группа (Sinopharm)100092680
ацетонКитайская национальная фармацевтическая группа (Sinopharm)32201-2.5L
АцетонитрилTedia (США)A998-4Класс HPLC
Ацетат аммонияКитайская национальная фармацевтическая группа (Sinopharm)10002861
Безводный сульфат натрияSigma-Aldrich (США)31481
Кабинет биологической безопасностиThermo Fisher Scientific, США1380, 1332, 1356
Колбы для клеточной культурыКорнинг (США)CLS430372
Инкубатор клеточной культурыThermo Fisher Scientific, СШАHERA51901126
Чидамид (CHI)Shenzhen Microcore Biotech Co., Ltd. (Китай)Чистота >95%
Многомодовый микропластинчатый считыватель Cytation 5BioTek, СШАCYT5MV
Термостатический магнитный нагревательный мешал DF-101SZhengzhou Kechuang Instrument Co., Ltd., Китай
ДихлорметанКитайская национальная фармацевтическая группа (Sinopharm)80047318
диметилсульфоксид (DMSO)Sigma-Aldrich (США)D2650
диоксанАладдин (Китай)D116156-5 мл
Среда DMEMGibco (США)12100046
Физиологический раствор с фосфатным буфером Дульбекко (DPBS)Gibco (США)14040141
этилацетатКитайская национальная фармацевтическая группа (Sinopharm)10009460
этиловый эфирКитайская национальная фармацевтическая группа (Sinopharm)
FA2004B электронный балансShanghai Tianmei Balance Instrument Co., Ltd., КитайFA2004B
Сыворотка плода быка (FBS)Gibco (США)10099141C
Фолат-поли(этиленгликоль)-амин (FA-PEG-NH2)Shanghai Pengshu Biological Technology Co., Ltd. (Китай)PS2-NFA-2000
Муравьиная кислотаАладдин (Китай)F112034Класс HPLC
Сублимированная сушилкаThermo Fisher Scientific, США
человеческий катепсин BSigma-Aldrich (США)SRP0289
Линии клеток рака поджелудочной железы человека (PSN-1, CFPAC-1)Американская коллекция типографической культуры (ATCC)CRL-3211, CRL-1918
Звёздчатые клетки поджелудочной железы человека (HPaStec, HPSC)Американская коллекция типографической культуры (ATCC)
Человеческий трипсинSigma-Aldrich (США)
соляная кислотаКитайская национальная фармацевтическая группа (Sinopharm)CFSR-10011008
Инвертированный микроскопОлимп, ЯпонияIX83
Модифицированный медиум Дульбекко Искова (IMDM)Gibco (США)12440053
IX 1000 вихревой микшер и nbsp;Hangzhou Ruicheng Instrument Co., Ltd., КитайIX 1000
МетанолКитайская национальная фармацевтическая группа (Sinopharm)M433287-10L
метанол и bbsp;Tedia (США)MS1922-001Класс HPLC
микроцентрифугные трубки (1,5/2,0 мл)Axygen (США)MCT-150-C
микропипетки (20, 100 и 1000 & Mu; L)Thermo Fisher Scientific, США4642050, 4642070, 4642090
Система очистки воды Mill-Q Миллипор, СШАZR0Q00800
  Набор для анализа МТС (3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-5-(3-карбоксиметоксифенил)-2-(4-сульфофенил)-2H-тетразолий)Promega (США)G3582
N,N-диметилформамид (DMF)Аладдин (Китай)
N-бромозсукцинимид (NBS)Sigma-Aldrich (США)B81255
N-гидроксисукцинимид (NHS)Sigma-Aldrich (США)56480
Optima Max ультрацентрифуга Бекман, США393490
Раствор пенициллина/стрептомицинаGibco (США)15140-122
Периодическая кислотаSigma-Aldrich (США)P7875
Petroleum EtherКитайская национальная фармацевтическая группа (Sinopharm)
Феназинметосульфат (ПМС)Sigma-Aldrich (США)3180806
Фосфатно-буферный физиологический раствор (PBS)Gibco (США)70011069
Поли(этиленгликоль)-амин (PEG-NH2)Shanghai Pengshu Biological Technology Co., Ltd. (Китай)PG2-AM-20k
Средний RPMI-1640Gibco (США)31800022
Силикагель-порошокSigma-Aldrich (США)53698300 mesh
Бикарбонат натрияSigma-Aldrich (США)401676
хлорид натрияКитайская национальная фармацевтическая группа (Sinopharm)10019318
Дихромат натрия дигидрат дигидратаSigma-Aldrich (США)1.93689
СкваленыSigma-Aldrich (США)Y0002131
стерильные центрифугные трубки (15 и 50 мл)Корнинг (США)430791, 430828
серная кислотаКитайская национальная фармацевтическая группа (Sinopharm)10021618
ТетрагидрофуранКитайская национальная фармацевтическая группа (Sinopharm)34865-4X4LАналитическая оценка
ультрафильтрационные центробежные трубки (срез молекулярной массы: 3,5 кДа)Бекман, США344088

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wang, Y., et al. Role of the microbiome in occurrence, development and treatment of pancreatic cancer. Mol Cancer. 18, 173(2019).
  2. Chen, K., et al. Single-cell RNA-seq reveals dynamic change in tumor microenvironment during pancreatic ductal adenocarcinoma malignant progression. EBioMedicine. 66, 103315(2021).
  3. Mascharak, S., et al. Desmoplastic stromal signatures predict patient outcomes in pancreatic ductal adenocarcinoma. Cell Rep Med. 4 (11), 101248(2023).
  4. Fu, Y., et al. Unbiasedly decoding the tumor microenvironment with single-cell multiomics analysis in pancreatic cancer. Mol Cancer. 23 (1), 140(2024).
  5. Helms, E., Onate, M. K., Sherman, M. H. Fibroblast heterogeneity in the pancreatic tumor microenvironment. Cancer Discov. 10, 648-656 (2020).
  6. Navarro Chica, C. E., et al. Design and characterization of squalene-Gusperimus nanoparticles for modulation of innate immunity. Int J Pharm. 590, 119893(2020).
  7. Rodríguez-Nogales, C., et al. Squalenoylgemcitabine/edelfosine nanoassemblies: anticancer activity in pediatric cancer cells and pharmacokinetic profile in mice. Int J Pharm. 582, 119345(2020).
  8. Emamzadeh, M., et al. Dual controlled delivery of squalenoyl-gemcitabine and paclitaxel using thermo-responsive polymeric micelles for pancreatic cancer. J Mater Chem B. 6, 2230-2239 (2018).
  9. Bulanadi, J. C., et al. Biomimetic gemcitabinelipid prodrug nanoparticles for pancreatic cancer. Chemplus chem. 85, 1283-1291 (2020).
  10. Yang, H., et al. High-level 5-methyltetrahydrofolate bioproduction in bacillus subtilis by combining modular engineering and transcriptomics-guided global metabolic regulation. J Agric Food Chem. 70 (19), 5849-5859 (2022).
  11. De Santis, M. C., et al. Signaling pathways regulating redox balance in cancer metabolism. Front Oncol. 8, 126(2018).
  12. Rushing, B. R., et al. Exploratory metabolomics underscores the folate enzyme ALDH1L1 as a regulator of glycine and methylation reactions. Molecules. 27 (23), 8394(2022).
  13. Matsumura, Y., Maeda, H. A new concept for macromolecular therapeutics in cancer chemotherapy: mechanism of tumoritropic accumulation of proteins and the antitumor agent smancs. Cancer Res. 46 (12 Pt 1), 6387-6392 (1986).
  14. Zheng, H. Expression and significance of molecular imaging marker folate receptor α in pancreatic cancer. J Shandong Uni Health Sci. 48 (3), 83-85 (2010).
  15. Zhang, N., et al. Chidamide combined with paclitaxel effectively reverses the expression of histone deacetylase in lung cancer. Anticancer Drugs. 31, 702-708 (2020).
  16. He, M., et al. Chidamide Inhibits Aerobic Metabolism to Induce Pancreatic Cancer Cell Growth Arrest by Promoting Mcl-1 Degradation. PLoS ONE. 11 (11), e0166896(2017).
  17. Chen, Q. B., et al. Extraction and Structural Characterization of Squalene from Siraitia grosvenorii Seeds. Guangxi Zhiwu. 26 (6), 687-689 (2006).
  18. Xu, M. Y., et al. Application Study of Nano Laser Particle Size Analyzer in Silica Sol Particle Size Testing. Diamond Abrasives Eng. 35 (02), 55-58 (2015).
  19. Shen, Z., et al. Study on the binding characteristics of 4',6-diamidino-2-phenylindole to DNA. Acta Biophysica Sinica. (03), 352-356 (1991).
  20. Mahajan, R. R., et al. Oral Administration of Neratinib Maleate-Loaded Lipid-Polymer Hybrid Nanoparticles: Optimization, Physical Characterization, and In Vivo Evaluation. Pharmaceutics. 17 (2), 221(2025).
  21. Ouyang, P., Lu, Y. Research progress on dispersion stability of nanoparticles in lubricating oil. Appl Chem Ind. 51 (6), 1843-1847 (2022).
  22. Xiao, S., et al. Development and application of folic acid-conjugated starch nanoparticles as a tumor-targeting drug delivery carrier. Chin Sci Bull. 51 (10), 1151-1155 (2006).
  23. Song, Y., Shi, W., Chen, W. Fluorescent carbon nanodots conjugated with folic acid for distinguishing folate-receptor-positive cancer cells from normal cells. J Mater Chem. 22 (25), 12568-12573 (2012).
  24. Tie, Y., et al. Targeting folate receptor β positive tumor-associated macrophages in lung cancer with a folate-modified liposomal complex. Signal Transduct Target Ther. 5, 6(2020).
  25. Li, C., et al. Small molecule nanodrug assembled of dual-anticancer drug conjugate for synergetic cancer metastasis therapy. Bioconjug Chem. 29, 3495-3502 (2018).
  26. Dormont, F., et al. Squalene-based multidrug nanoparticles for improved mitigation of uncontrolled inflammation in rodents. Sci Adv. 6, eaaz5466(2020).
  27. Jiang, W., et al. Intravenous delivery of enzalutamide based on high drug loading multifunctional graphene oxide nanoparticles for castration-resistant prostate cancer therapy. J Nanobiotechnol. 18, 50(2020).
  28. Yong, T. Y. Exocytosis of porous silicon nanoparticles and their application in deep tumor penetration and cancer stem cell therapy. [Doctoral dissertation]. , Huazhong Univ Sci Technol. (2017).
  29. Bulanadi, J. C., et al. Biomimetic gemcitabine lipid prodrug nanoparticles for pancreatic cancer. ChemPlusChem. 85, 1283-1291 (2020).
  30. Zhang, W., et al. Prodrug-like acetylmannosamine modified liposomes loaded with arsenic trioxide for the treatment of orthotopic glioma in mice. J Pharm Sci. 109, 2861-2873 (2020).
  31. Fan, X. X., et al. ROS-responsive berberine polymeric micelles effectively suppressed the inflammation of rheumatoid arthritis by targeting mitochondria. Nano-Micro Lett. 12, 76(2020).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Enzyme Responsive NanoparticlesSqualene Chidamide ProdrugPancreatic CancerExtracellular MatrixDrug PenetrationFolate Modified NanoparticlesControlled Drug ReleaseCellular UptakeTumor TargetingProdrug Synthesis

Related Articles