Методическая статья

Спектроскопическая сверхразрешающая визуализация молекул ДНК с использованием внутреннего контраста

DOI:

10.3791/69917

⸱

6 марта 2026 г.

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Northwestern University, 2Center for Physical Genomics and Engineering, Northwestern University, 3Department of Gastroenterology and Hepatology, Northwestern Memorial Hospital

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол обеспечивает детальные операции по подготовке образцов, сбору данных и анализу внутренних флуоресцентных спектров ДНК.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Сверхразрешающая визуализация произвела революцию в биологических исследованиях, раскрывая структурные детали на наноуровне. Большинство оптических методов с сверхразрешением основаны на флуоресцентной маркировке биомолекул, что позволяет специфическим меткам молекулярных видов, но может нарушать функции клеток, вводить неточности связывающих молекул и не обеспечивать стабильной высокой плотности маркировки, необходимой для хроматиновой визуализации на уровне отдельных молекул ДНК. Технология, позволяющая проводить геномную визуализацию без маркировки и на месте с нанометровым разрешением, существенно повлияет на биологию. Здесь мы представляем протокол, который использует внутреннюю флуоресценцию ДНК для проведения спектроскопической микроскопии локализации одной молекулы (sSMLM). Протокол подробно описывает подготовку образцов, сбор данных и спектральный анализ. Кратко: тонкий гель ДНК создаётся путём нанесения раствора полинуклеотида на стекло и его высыхания в течение нескольких часов. После образования геля образец снимается в присутствии буфера визуализации с помощью sSMLM. Записанный набор данных состоит из изображения нулевого порядка, предоставляющего пространственные локализации, и изображения первого порядка, кодирующего спектр излучения каждой локализации. Пространственные реконструкции генерируются из данных нулевого порядка, после чего соответствующие спектры извлекаются из сигнала первого порядка. Наконец, мы демонстрируем осуществимость этого подхода с использованием нескольких длин волн возбуждения и молекул ДНК с разной длиной, последовательностями и составом.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Методы сверхразрешающей флуоресцентной микроскопии — включая структурированную микроскопию освещения (SIM), стимулированную эмиссионную истощение микроскопии (STED) и методы одиночной молекулярной локализационной микроскопии (SMLM), такие как фотоактивированная локализационная микроскопия (PALM) и стохастическая оптическая реконструкционная микроскопия (STORM) — значительно вывели разрешение оптической микроскопии далеко за пределы дифракционногопредела 1,2,3,4,5,6,7, обеспечив беспрецедентный доступ к наномасштабной организациихроматина 8,9,10,11,12. Однако современные методы окрашивания для визуализации структур нуклеиновых кислот опираются на маркировку белков, ассоциированных с ДНК, а не на самой ДНК, или на использовании маломолекулярных красителей, которые могут нарушать нативную структуру хроматина и снижать жизнеспособность клетки13,14. Из-за этих ограничений разработка оптических методов сверхразрешения без меток в нативных, невозмущающих условиях крайне желательна. Представленный здесь протокол предназначен для синтетически очищенных одноцепочечных или двухцепочечных нуклеотидов ДНК, где внутренняя флуоресценция может быть надежно обнаружена; он не оптимизирован для визуализации ядерных молекул ДНК в фиксированных или живых клетках.

Поскольку нуклеиновые кислоты долгое время считались нефлуоресцентными из-за их чрезвычайно низкой квантовой выходности (порядка 10−4 при ультрафиолетовом возбуждении) и ультрабыстрого распада флуоресценции прикомнатной температуре 15, исследования внутренней флуоресценции ДНК (в основном срока жизни флуоресценции) были редкими до тех пор, пока не появилась фемтосекундная спектроскопия. Хорошо известно, что нуклеотиды слабо флуоресцентируют при ультрафиолетовом освещении, тогда как их поглощение в видимом диапазоне значительно слабее. Тем не менее, недавно было обнаружено, что существует видимая флуоресценция немодифицированных нуклеиновых кислот в физиологическизначимых концентрациях 16. Это явление, вероятно, было упущено из виду, поскольку большинство фотохимических исследований нуклеотидов проводились в разбавленных растворах (10-100 мкм)17,18,19,20, тогда как в ядрах и хромосомах концентрация ДНК может достигать 0,1–1М 21,22,23. Что ещё важнее, стохастическое флуоресцентное переключение было зафиксировано при видимомосвещении16, что заложило основу для использования немодифицированных нуклеиновых кислот в качестве эндогенных контрастных агентов для микроскопии с сверхразрешением на основе локализации.

Фотохимические характеристики нуклеотидных мономеров и одноцепочечных молекул ДНК с простыми последовательностями при физиологических концентрациях под возбуждением видимого света былиизучены 24. Также было показано, что эти молекулы ДНК обладают стохастическими флуоресцентными свойствами переключения, что хорошо соответствует теории истощения основного состояния (GSD)6,7, изучая флуоресцентное восстановление нуклеотидов при различных условиях обеднения. Кроме того, поскольку нуклеотиды обладают относительно высокой квантовой выходностью и низкой вероятностью межсистемного пересечения, количество фотонов и длительность мигания при эмиссии отдельных молекул сопоставимы с популярными экзогенными красителями в STORM (например, Alexa Fluor 647), обладающими уникальнымиспектрами 25,26 и делающими ДНК идеальным контрастным агентом для высокоразрешающей визуализации. Кроме того, реализация алгоритма спектральной регрессии, описанного в предыдущем разделе, позволяет выполнять сверхразрешённую визуализацию полинуклеотидов и линейных одноцепочечных волокон ДНК ниже десятинанометров 27.

Чтобы охватить полный спектр собственной флуоресценции ДНК, мы использовали призму двойного клина (DWP) для спектрального обнаружения, которая позволяет одновременно проводить высокопроизводительный одномолекулярный спектроскопический анализ и визуализацию с минимальными потерями передачи и ошибкой фронтаволны 28,29,30, а также открытое программное обеспечение для спектроскопического SMLM-анализа (RainbowSTORM) для автоматической обработки данных 31,32. Опираясь на эту возможность, мы разработали многолазерную платформу SMLM, интегрированную со спектроскопической детектировкой и специализированным спектральным анализовым конвейером. Представленный здесь протокол включает подготовку образцов, сбор и анализ данных, обеспечивая воспроизводимый рабочий процесс для использования внутренней флуоресценции ДНК в микроскопии локализации одной молекулы. Помимо проведения доказательств концепции исследований визуализации одноцепочечных олигонуклеотидов и двухцепочечных молекул ДНК с внутренним контрастом, этот подход заложил основу для более широких применений в ДНК-визуализации в нативных, свободных от меток условиях, таких как предсказание последовательностей на основе внутренней флуоресценции ДНК в сочетании с вычислительными методами.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Подготовка образцов ДНК-геля (рисунок 1A)

  1. Растворить образец ДНК (либо олигонуклеотидный, либо двухцепочечный) в деионизированной воде без нуклеазы до конечной концентрации 100 мМ и хранить запасной раствор при -4 °C.
  2. Приготовьте аликвоты по 5 мкл, чтобы минимизировать повторяющиеся циклы замораживания и оттаивания. Если используете замороженные аликвоты, разморозьте их при комнатной температуре 5-15 минут, в зависимости от объёма.
  3. Аккуратно очистите стеклянное стекло лабораторной салфеткой. Пипетте 5 мкл раствора молекулы ДНК объёмом 100 мм на свежеочищенное стекло и дайте ему испариться в течение 1-3 часа, образуя гель из ДНК.
  4. Для безопасности включите этот шаг в вытяжке с дымом. Подготовьте буфер для визуализации согласно Таблице материалов. И буфер β-меркаптоэтанола, и буфер DABCO были валидированы для поддержки стохастического фотопереключения молекул ДНК.
  5. Для безопасности включите этот шаг в вытяжке с дымом. Добавьте 5 мкл буфера для визуализации в ДНК-гель и нанесите сверху накрывающий слой непосредственно перед снимком. Внутри покрытого образца могут быть пузырьки. Используйте пинцет, чтобы удалить пузырьки внутри покрытого образца,

2. Калибровка системы sSMLM и сбор данных (рисунок 1B)

  1. Подготовьте изготовленный массив нанодыр с диаметром отверстия 100 нм и расстоянием 4 мкм, расположенный в 8 строк x 5 столбцов, для следующей калибровки спектроскопической системыSMLM 33.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Альтернативно, для спектральной калибровки33 также может использоваться диаграмма разрешения ВВС США (USAF) 1951 года (R3L1S4N).
    1. Создайте массив нанодыр посредством последовательного металлического распыления и фрезера с фокусированным ионным пучком (FIB). Сначала нанесите алюминиевую плёнку толщиной 150 нм на покрытие боросиликатного стекла размером 22 x 22 мм с использованием постоянного тока при 75 Вт при потоком аргона 20 стандартных кубических сантиметров в минуту (SCCM) при 3 мТорр.
    2. Нанесите схему массива 5 x 8 наноотверсий в алюминиевый слой с использованием фрезера FIB, работающего при напряжении ускорения 30 кВ.
  2. Включите спектроскопическую систему SMLM (рисунок 2), вставьте узкополосные фильтры (532 нм, 580 нм, 633 нм, 680 нм и 750 нм) прямо перед камерой и используйте белый источник света (например, микроскопическую лампу) для освещения калибровочного образца.
  3. Соберите по 10 кадров с каждым фильтром. Установите время экспозиции для 532 нм, 580 нм, 633 нм и 680 нм на 200 мс и на 2000 мс для 750 нм из-за низкой интенсивности лампы и низкой эффективности камеры в ближнем инфракрасном диапазоне (рисунок 3).
  4. Загрузите образец ДНК-геля на микроскоп, убедитесь, что сторона cover slip обращена к объективу, и откройте программное обеспечение камеры для сбора данных.
  5. Определите подходящее z-положение с помощью автоматической системы отслеживания фокуса, чтобы ясно заметно стохастическое мигание. Этот шаг критически важен и требует терпения, так как образцы ДНК-геля отсутствуют явных морфологических признаков, таких как клеточные структуры, что затрудняет навигацию к правильному сигналу.
  6. Убедитесь, что объектив не касается края крышки, так как это может привести к утечке буфера в погружное масло и мешать отслеживанию.
  7. Получить 10 000–30 000 кадров с типичной мощностью освещения 5 кВт/см² и временем экспозиции 30 мс. Регулируйте количество кадров, мощность освещения и время экспозиции по мере необходимости. После приобретения программа по умолчанию сохраняет данные в формате nd2.
  8. После завершения эксперимента утилизируйте стеклянный стекло в одобренный контейнер для отходов острых предметов (например, в разбитое стекло или контейнер для утилизации острых предметов) и выбросьте все оставшиеся буферы в специальный контейнер для химических жидких отходов в соответствии с институциональными нормами безопасности.

3. Анализ калибровочных и спектроскопических данных (рисунок 1C)

  1. Загрузите полученный необработанный стек образца ДНК в FIJI (Windows 64-bit), используя плагин Bio-Formats.
  2. Вычтите минимальную проекцию из стека, чтобы получить фоновый набор данных, и сохраните его для спектрального анализа. Для загруженного RAW-стека выберите Image > Stacks > Z Project и минимальную интенсивность в типе проекции. Затем выберите калькулятор процесса > изображение , чтобы вычесть минимальную проекцию из raw стека и сохранить его в формате TIFF.
  3. Выполните идентификацию локализации на стеке исходных изображений нулевого порядка с помощью плагина ThunderSTORM (версия 1.3). Используйте соответствующие параметры (например, порог = 1.2 x std (Волна.F1), сигма = 1.5, радиус посадки = 3) для восстановления изображения нулевого порядка и извлечения координат эмиссионных событий (единицы: нм). Для обрезанного raw стека изображения нулёвого порядка выберите Plugin > ThunderSTORM > Run analysis.
  4. Используйте FIJI и открытое программное обеспечение RainbowSTORM (ссылка на GitHub в32, версия MATLAB новее 2020b) для обработки калибровочных данных и получения связи между горизонтальными и вертикальными сдвигами и длинамиволн 31,32.
    1. Выполните идентификацию локализации на калибровочных изображениях 5 длин волн с помощью плагина ThunderSTORM. Используйте соответствующие параметры (например, порог = 5 x std (Волна.F1), сигма = 1.5, радиус посадки = 3) для реконструкции локализаций нанодыр на нулевом порядке и соответствующих спектральных локализаций на первом порядке.
    2. Отрегулируйте порог (например, в диапазоне 5-10 x std (Wave.F1)) до 80 локализаций для каждого калибровочного изображения.
    3. Запустите RainbowSTORM и нажмите Spectral Calibration > Просмотрите и загрузите CSV-файлы для каждой длины волны калибровки (532 нм, 580 нм, 633 нм, 680 нм, 750 нм) с предыдущего шага. Нажмите Сохранить файл калибровки.
  5. Преобразуйте координаты на основе нанометров в пиксельные координаты и сопоставьте их с соответствующим спектральным окном на основе горизонтальных и вертикальных сдвигов от нулевой к первой степени, определённых в калибровке (рисунок 4), чтобы измерить полный спектр внутренней флуоресценции ДНК.
    1. Используйте индивидуальные скриптыPython 34 (версия 3.11.7), чтобы извлечь данные полного спектра с помощью следующих шагов.
    2. Установите правильные пути файлов для стека изображений, вычитаемого фоном (.tiff) из шага 3.2, файла локализации CSV (.csv), полученного из шага 3.3, и файла калибровки из шага 3.4 (.mat).
    3. Используйте 900-950 пикселей в качестве горизонтального смещения для данных 488 нм, полученных с помощью 3D DWP, что соответствует спектральному окну 484-588 нм, немного шире, чем диапазон фильтров 500-550 нм, чтобы обеспечить покрытие.
    4. Используйте 925-984 пикселя в качестве горизонтального смещения для данных 532 нм, полученных с помощью 3D DWP, что соответствует спектральному окну 525-750 нм, снова выбранному для расширения диапазона фильтров 590-650 нм.
    5. Используйте 23 пикселя в качестве вертикального смещения как для данных 488 нм, так и для 532 нм с 3D DWP.
      Вышеуказанные значения были получены на основе спектральной калибровочной кривой, полученной с помощью RainbowSTORM. Скрипты на Python для измерения полного спектра можно найти в34-й части.
  6. Линеаризуйте нелинейный спектр для последующего анализа (сравнения, классификации и т.д.) с помощью полиномиального подгонки3-го порядка (рисунок 3).

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Весь процесс — от подготовки образца до сбора и анализа данных — для одного стека изображений образца ДНК занимает примерно 120 минут, если образование геля ДНК занимает 1 час (см. рисунок 1). Совокупное время оттаивания, образования геля и спектральной калибровки фиксируется примерно на 90 минутах, независимо от количества изображений или образцов в эксперименте. Для максимизации эффективности мы рекомендуем собирать несколько стеков изображений на нескольких образцах за одну сессию.

Репрезентативные изображения в реальном времени, полученные после DWP, показаны на рисунках 1B и 3A, где флуоресцентные сигналы делятся на нулевый порядок (слева, содержащий пространственную информацию) и первый порядок (справа, содержащий спектральную информацию). На рисунке 1B изображения были получены с использованием конфигурации 2D DWP, в которой расстояние между изображениями нуля и первого порядка относительно невелико. В отличие от этого, на рисунке 3A показаны данные, собранные с помощью 3D DWP, где два дифракционных порядка более широко разделены из-за инженерной разницы оптических путей, необходимой для бипланной 3D-визуализации. Все данные, представленные на рисунках 1C, 3 и 4 , были собраны с использованием конфигурации 3D DWP. Выбор между двумерной и 3D-визуализацией зависит от экспериментальной цели: для внутренних флуоресцентных спектральных измерений синтезированных образцов ДНК обычно предпочтительнее 2D DWP, поскольку эти образцы не имеют соответствующих трёхмерных структурных особенностей, хотя конфигурация 3D DWP также может использоваться при необходимости осевой информации.

Вместе эти репрезентативные результаты демонстрируют основную способность платформы визуализации на базе DWP одновременно определять пространственные локализации и спектры излучения отдельных молекул ДНК в реальном времени. Правильная производительность системы определяется чётким и стабильным разделением между пространственным изображением нулёвого порядка и спектрально рассеянным изображением первого порядка, при этом каждая локализация одной молекулы в нулевом порядке соответствует отдельному спектральному следу первого порядка. Количественный спектральный анализ проводится путём идентификации изолированных одиночных молекулярных событий на изображении нулевого порядка, измерения относительного смещения пикселей соответствующего сигнала первого порядка и преобразования этого смещения в длину волны с помощью калиброванной функции отображения. Поскольку связь между смещением пикселя и длиной волны излучения нелинейна, для точной реконструкции линейных эмиссионных спектров из исходных данных применяется полиномиальное подгонение третьего порядка28. Полученные одномолекулярные спектры могут быть дополнительно интегрированы в вычислительные аналитические конвейеры, включая машинное обучение или модели глубокого обучения, чтобы позволить спектральную классификацию и вывод состава последовательностей или молекулярной структуры ДНК на основе внутренних флуоресцентных сигнатур при различных условиях освещения и фотофизических состояниях.

Все данные, показанные в этом протоколе, были собраны с использованием буфера визуализации на основе β-меркаптоэтанола35. В принципе, любой буфер визуализации, усиливающий поведение фотокоммутации флуорофоров, должен быть совместим с этим подходом, например, с буфером визуализациина основе DABCO 36. Тестируемые молекулы ДНК включают 20-основанные одноцепочечные A, G, C, T; 40-базовая одножилонная цепь переменного тока (A 1C1, A5C5, A10C10, A20C20); одножилочный гуанин 5, 8, 12, 16 оснований; 20-базовые двухцепочечные GC и AT (см. таблицу материалов для подробной информации). Выбор конструкций ДНК с 20 и 40 основаниями основан на наблюдении, что цепь из 40 оснований принимает компактную конформацию с эффективным размером менее 40 x 3,4 = 13,6 нм, что опускает её ниже предела разрешения реконструированного изображения SMLM. Длины волн возбуждения (488 нм и 532 нм) не были уникально оптимизированы для конкретных последовательностей, а были выбраны для демонстрации того, что собственная флуоресценция ДНК может быть надёжно обнаружена в различных составах оснований и конформационных состояниях с использованием любой из длин волны. Мы протестировали буфер визуализации, как показано на дополнительном рисунке 1 , и обнаружили, что почти не обнаружено стохастических сигналов мигания, исключая компоненты буфера и обработку стеклянной поверхности. Только гель ДНК + буфер визуализации показал значительное количество морганий. Стеклянные стекли и накладки были чистыми и аккуратно обработанными, а образец геля формировался в закрытой среде. Поэтому обнаруженные сигналы маловероятно, что исходят от примесей или автофлуоресценции субстрата. Мы также измерили сигнал от сушащего геля и раствора ДНК, и обнаружили, что существенных различий нет, поэтому фотохимические артефакты во время сушки не являются основным источником сигналов. Продукты фотодеградации обычно обладают широкими спектрами и не обладают мигающими свойствами, которые никогда не наблюдались в нашем исследовании. Количественные пределы обнаружения, отражённые минимальным количеством фотонов локализаций, составляют 30–50 [фотонное счёт]. Это значение остаётся прежним для образцов ДНК и меченых систем, таких как AF647-маркированный H3K9me3 в фиксированных клетках. Средняя точность локализации внутри флуоресценции ДНК составляет около 15–25 нм, тогда как у AF647 — около 10–15 нм.

В 2D-сценарии реконструированное изображение SMLM имеет размер пикселя 22 нм. Точность локализаций стохастических излучений составляет среднее ~20 нм, что описывает доверительный интервал, где локализована одна молекула. Однако образцы, проверяемые на внутреннюю флуоресценцию, не имеют биологической структуры, поэтому их разрешение невозможно интерпретировать. Когерентная рамановская рассеяющая микроскопия имеет разрешение 250–300нм 37, а УФ-двухфотонная микроскопия — 300 нм38. Соотношение сигнал/шум в когерентной рамановской рассеяющей визуализации составляет 10 - 10039, тогда как для УФ-2-фотонной микроскопии40,41 оно составляет 2 - 20 (часто выражается как отклонение сигнала к обоим стандартам, SSDR). SNR для внутренней флуоресценции ДНК с использованием sSMLM составляет около 5 из-за низкого количества фотонов и ограничений, связанных с шумом, обнаружением камеры.

figure-results-1
Рисунок 1: Рабочий процесс с предполагаемой длительностью. (A) Подготовка образца включает размораживание бульона, подготовку ДНК-геля и добавление буфера для визуализации. Общее время варьируется от 1 до 3 часов в зависимости от образца и среды. (B) Каждое получение требует калибровочного процесса с использованием специально разработанного образца нанодырочного массива. Общее время калибровки составит около 20 минут, а время сбора данных для одного стека изображений — около 10 минут, включая поиск по образцам (10 000 кадров и время экспозиции 50 мс). (C) Конвейер анализа включает предобработку FIJI и спектральный анализ в Python. Предобработка в FIJI занимает около 10 минут, при этом спектральный анализ проходит быстро с установленными кодами. Представленные спектры были собраны из 16-базового гуанина. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

figure-results-2
Рисунок 2: Оптическая схема . Четыре лазерные линии (405 нм, 488 нм, 532 нм, 647 нм) направляются к инвертированному микроскопу с помощью лазерного выравнивания, что делает систему стабильной и простой в эксплуатации. DWP размещается прямо перед камерой sCMOS, что позволяет спектроскопически обнаруживать одномолекулы. При калибровке для DWP между камерой и DWP вставляется колесо фильтра. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

figure-results-3
Рисунок 3: Спектральная калибровка. Используемые калибровочные длины волн включают 532 нм, 580 нм, 633 нм, 680 нм и 750 нм. Последовательно размещая узкополосные фильтры с этими центральными длинами волн после DWP и перед камерой, можно измерять соответствующие горизонтальные и вертикальные сдвиги разных длин волн, что позволяет отображать калибровочную кривую между положением пикселя и длиной волны. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

figure-results-4
Рисунок 4: Спектры выбранных двухцепочечных и одноцепочечных молекул ДНК при возбуждении 532 нм и 488 нм соответственно. (A - B) Нелинейные и линейные спектры GC_alter, которые относятся к типу двуцепочечной молекулы ДНК, обе цепочки которых имеют 20-основание 5'-GCGCGCGCGCGCCGCC-3'. Выделенный зелёный спектр показывает среднюю кривую. (C - D) Нелинейные и линейные спектры A10C10, что относится к типу одноцепочечной молекулы ДНК с длиной 40 оснований и повторяющимся содержанием 10 аденина и 10 цитозина (5'- AAAAAAAAACCCCCCCCCCCAAAAAAAAAAAACCCCCCCCCCCCCCCCCC-3'). Выделенный синий спектр показывает среднюю кривую. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Дополнительный рисунок 1: Контрольные эксперименты по внутренней флуоресценции ДНК. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы впервые представляем протокол для захвата полного спектра внутренней флуоресценции ДНК как с одноцепочечных, так и от двухцепочечных молекул ДНК, охватывающий весь рабочий процесс от подготовки образцов до сбора данных и вычислительного анализа. Этот протокол позволяет безметочно сверхразрешающую визуализацию молекул ДНК, используя внутреннюю флуоресценцию, а не экзогенные зонды. В принципе, этот подход можно распространить на фиксированные клетки и, возможно, на живые клетки, поскольку он избегает химической маркировки и амплификации на основе антител. Хроматин внутри ядра включает ДНК, РНК и различные виды белков, что является гораздо более сложной системой, чем ДНК-гель. В настоящее время, из-за низкого количества фотонов из молекул ДНК, стохастические излучения из ядра в фиксированных/живых клетках вызывают трудности. Но для изолированных хромосом, или ядра, сигнал флуоресценции ДНК былзарегистрирован 16,24,27. Однако в нынешнем виде протокол ограничен in vitro средами с использованием синтезированных образцов ДНК. Для сравнения, маркировка ядерной ДНК или хроматина с помощью иммунокрашивки обычно включает длительные многоступенчатые процедуры — включая закалку, блокировку и инкубацию первичных и вторичных антител — которые могут занимать порядка нескольких часов (часто ~5 часов на цель)12,42, внося как экспериментальную сложность, так и потенциальные нарушения нативной структуры хроматина. Устраняя экзогенные метки, внутренняя флуоресцентная визуализация не только значительно сокращает время подготовки образца, но и предотвращает структурные возмущения и ошибки связи, связанные с громоздкими флуоресцентными зондами и антителами, что позволяет более точно локализовать ДНК в наномасштабе.

Несмотря на отсутствие меток и концептуальную простоту, успешная реализация этого протокола требует внимательного внимания к ряду критически важных экспериментальных деталей. Например, при подготовке образца недостаточное время для образования ДНК-геля снижает количество обнаруживаемых локализаций по одной молекуле по сравнению с полностью сформированными гелями. Обычно гель формируется примерно за 1,5 часа. Если раствор не полностью высох, просто подождите ещё немного. Для накладного скольжения размером 22 x 22 мм достаточно 5 мкл буфера для изображения, тогда как больший объём буфера может вызвать утечку, что нарушает интерфейс погружения в масло объектива и негативно влияет на качество изображения. Если происходит протечка, её можно аккуратно удалить с помощью лабораторной салфетки. Во время фокусировки постепенно поднимайте цель с нижней позиции z. После того как объектив задействует погружное масло, используйте режим тонкой настройки для идентификации фокальной плоскости с частыми стохастическими эпизодами одномолекулярного излучения. Если крупные гелевые кластеры производят агрегированные сигналы с перекрывающимися спектрами первого порядка, выберите альтернативную область визуализации.

Несмотря на свои преимущества, у этого протокола есть несколько важных ограничений, которые следует учитывать при оценке его применимости и производительности. Во-первых, точная спектральная экстракция основана на достаточном пространственном расстоянии между отдельными событиями одной молекулы; высокая плотность локализации, например, возникающая при крупных кластерах ДНК-гелей или плотно упакованных макромолекулярных сборок, может привести к перекрывающимся спектральным следам первого порядка, которые усложняют или исключают надежную реконструкцию спектра. Во-вторых, метод чувствителен к оптическому выравниванию и стабильности фокуса, поскольку небольшие смещения призмы с двойным клином или отклонения от оптимальной фокальной плоскости могут привести к систематическим ошибкам в калибровке длины волны и снизить отношение сигнал/шум. В-третьих, в настоящее время протокол не реализует спектральное смешивание, что ограничивает его использование в образцах с высокой молекулярной плотностью или множественными спектрально перекрывающимися видами. В совокупности эти факторы определяют практический режим работы метода и должны тщательно учитываться при расширении протокола на более сложные или перенасыщенные биологические системы.

В этом протоколе RainbowSTORM используется только для спектральной калибровки, хотя программное обеспечение также предоставляет мощные инструменты для калибровки 2D/3D, анализа данных sSMLM и реконструкции изображений. Такие инструменты анализа хорошо подходят для связывания информации о пространственной локализации со спектральными показами в спектроскопической сверхразрешающей визуализации и могут быть использованы в будущих расширениях этого протокола. Наконец, этот протокол потенциально возможен для других типов биологическихмакромолекул 43, 44, 45, таких как РНК, тубулин и др. Обнаруженный спектр может быть дополнительно введён в вычислительные модели, такие как модели глубокогообучения 46, для классификации, таким образом предсказывая структуру последовательностей или молекуляр по внутренним спектрам при различном освещении и фотофизических свойствах. Это исследование также открывает путь к молекулярно-специфической хроматиновой визуализации, которая предотвращает внешнее метирование или денатуризацию нативных структур.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Это исследование было поддержано грантами R02CA225002, U54CA261694, R01CA289294 и U54CA268084 от Национальных институтов здравоохранения и грантом CBET-2430743 от Национального научного фонда. Мы благодарим лабораторию профессора Хао Ф. Чжана в Северо-Западном университете за их двойное клиновидное призматическое устройство как ключевую часть спектроскопической системы SMLM.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Эмиссионный фильтр 488 нм для визуализацииChroma Technology Corp.ET525/50M
Полосный фильтр 532 нм для калибровкиТорлабыFL532-3
Эмиссионный фильтр с частотой 532 нм для визуализацииChroma Technology Corp.ET620/60M
Полосный фильтр 580 нм для калибровкиТорлабыFB580-10
Полосный фильтр 633 нм для калибровкиТорлабыFL632.8-3
Полосный фильтр 680 нм для калибровкиТорлабыFB680-10
Полосный фильтр 750 нм для калибровкиТорлабыFB750-10
Бета-меркаптоэтанол SigmaM6250
Буфер визуализации BMENANA7 μ L GLOX, 7 и MU; L бета-меркаптоэтанол и 690 μ L-глюкозный буфер
Каталаза из печени крупного рогатого скотаSigmaC100
DABCO (1,4-ди-азобицикло-(2.2.2.)-октан)SigmaD27802
Буфер визуализации DABCONANA65 мМ DABCO+30 мМ сульфита натрия + 30 мМ DTT 1 M  в ДНК — деионизированная вода, свободная от РНК. Сульфит натрия следует растворять в PBS 10 и более раз; до 1 М до создания буфера изображения.
ДНК-деплекс для спектроскопического SMLMIDTNAПары с 20 основаниями, двойные GC_alter, GC_conti, AT_alter и AT_conti.
Например, GC_alter имеет обе нити длиной 5' - GCGCGCCGCGCCGCGCGCGC- 3'; GC_conti имеет одну прядь длиной 5 футов - ГГГГГГГГГГГГГГГГ - 3' а другой — 5 футов - CCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCC - 3'
Все образцы выполнены в стандарте HPLC.
ДНК олигонуклеотид/двухцепочечная ДНКIDTNA
ДНК-олиго для спектроскопического SMLMIDTNA20-основания A, G, C, T; 40-базовая одножилонная цепь переменного тока (A1C1, A5C5, A10C10, A20C20);   одноцепочечный гуанин с 5, 8, 12, 16 основами.
Например, A10C10 является
5'- AAAAAAAAAAACCCCCCC
CCCCCAAAAAAAAAAAA
AACCCCCCCCCCCC - 3'
Все образцы выполнены в стандарте HPLC.
Дистиллированная вода без ДНКаз/РНазыИнвитроген10977015
DTT (DL-дитиотрейтол)Sigma43816
GLOXNANA14 мг глюкозооксидазы, 50 и мю; L каталаза (17 мг/мл) + 200 мг/мл; L буфер A, который составляет 10 мМ Трис (pH 8,0) и 50 мМ NaCl. 
Глюкозный буферNANA50 мМ Трис (pH 8,0), 50 мМ NaCl и 10% глюкозы. 
глюкозооксидазаSigmaG7141
Глюкоза, порошокТермо Фишер15023021
PBS (10 раз)Термо ФишерJ62036. K3
PBS (1 раз)Gibco10010023
Хлорид натрияТермо Фишер424290010
Сульфит натрия SigmaS0505
Tris (1M) pH 8.0ИнвитрогенAM9856

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ellis, R. J., Minton, A. P. Join the crowd. Nature. 425 (6953), 27-28 (2003).
  2. Hell, S. W., Wichmann, J. Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated emission-depletion fluorescence microscopy. Opt Lett. 19 (11), 780(1994).
  3. Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nat Methods. 3 (10), 793-796 (2006).
  4. Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
  5. Gustafsson, M. G. L. Nonlinear structured-illumination microscopy: wide-field fluorescence imaging with theoretically unlimited resolution. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (37), 13081-13086 (2005).
  6. Hell, S. W., Kroug, M. Ground-state-depletion fluorescence microscopy: a concept for breaking the diffraction resolution limit. Appl Phys B. 60 (5), 495-497 (1995).
  7. Fölling, J., et al. Fluorescence nanoscopy by ground-state depletion and single-molecule return. Nat Methods. 5 (11), 943-945 (2008).
  8. Ricci, M., Manzo, C., García-Parajo, M. F., Lakadamyali, M., Cosma, M. Chromatin fibers are formed by heterogeneous groups of nucleosomes in vivo. Cell. 160 (6), 1145-1158 (2015).
  9. Bintu, B., et al. Super-resolution chromatin tracing reveals domains and cooperative interactions in single cells. Science. 362 (6413), eaau1783(2018).
  10. Matsuda, A., et al. Condensed mitotic chromosome structure at nanometer resolution using PALM and EGFP-histones. PLoS One. 5 (9), e12768(2010).
  11. Bohn, M., et al. Localization microscopy reveals expression-dependent parameters of chromatin nanostructure. Biophys J. 99 (5), 1358-1367 (2010).
  12. Acosta, N., et al. Three-color single-molecule localization microscopy in chromatin. Light Sci Appl. 14, 7(2025).
  13. Almassalha, L. M., et al. Label-free imaging of the native, living cellular nanoarchitecture using partial-wave spectroscopic microscopy. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (42), E6372-E6381 (2016).
  14. Beerman, T. A., et al. Effects of analogs of the DNA minor groove binder Hoechst 33258 on topoisomerase II and I mediated activities. Biochim Biophys Acta. 1131 (1), 53-61 (1992).
  15. Cadet, J., Anselmino, C., Douki, T., Voituriez, L. New trends in photobiology. J Photochem Photobiol B. 15 (4), 277-298 (1992).
  16. Dong, B., et al. Superresolution intrinsic fluorescence imaging of chromatin utilizing native, unmodified nucleic acids for contrast. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (35), 9716-9721 (2016).
  17. Vayá, I., Gustavsson, T., Miannay, F., Douki, T., Markovitsi, D. Fluorescence of natural DNA: from the femtosecond to the nanosecond time scales. J Am Chem Soc. 132 (34), 11834-11835 (2010).
  18. Anders, A. DNA fluorescence at room temperature excited by means of a dye laser. Chem Phys Lett. 81 (2), 270-272 (1981).
  19. Plessow, R., Brockhinke, A., Eimer, W., Kohse-Höinghaus, K. Intrinsic time- and wavelength-resolved fluorescence of oligonucleotides: a systematic investigation using a novel picosecond laser approach. J Phys Chem B. 104 (15), 3695-3704 (2000).
  20. Takaya, T., et al. UV excitation of single DNA and RNA strands produces high yields of exciplex states between two stacked bases. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (30), 10285-10290 (2008).
  21. Bancaud, A., et al. A fractal model for nuclear organization: current evidence and biological implications. Nucleic Acids Res. 40 (18), 8783-8792 (2012).
  22. Daban, J. R. High concentration of DNA in condensed chromatin. Biochem Cell Biol. 81 (3), 91-99 (2003).
  23. Bohrmann, B., et al. Concentration evaluation of chromatin in unstained resin-embedded sections by means of low-dose ratio-contrast imaging in STEM. Ultramicroscopy. 49 (1-4), 235-251 (1993).
  24. Dong, B., et al. Stochastic fluorescence switching of nucleic acids under visible light illumination. Opt Express. 25 (7), 7929-7944 (2017).
  25. Gong, R., et al. DNA spectroscopic intrinsic-contrast photon-localization optical nanoscopy. Proc SPIE. 13326, 133260F(2025).
  26. Wang, G., et al. Label-free DNA spectroscopic photon-localization nanoscopy. Optica Biophotonic Congress. , (2025).
  27. Eshein, A., et al. Sub-10-nm imaging of nucleic acids using spectroscopic intrinsic-contrast photon-localization optical nanoscopy (SICLON). Opt Lett. 43 (23), 5817-5820 (2018).
  28. Song, K. H., et al. Monolithic dual-wedge prism-based spectroscopic single-molecule localization microscopy. Nanophotonics. 11 (8), 1527-1535 (2022).
  29. Song, K. H., Sun, C., Zhang, H. F. Design strategy for a dual-wedge prism imaging spectrometer in spectroscopic nanoscopy. Rev Sci Instrum. 94 (2), 023702(2023).
  30. Yeo, W. H., Sun, C., Zhang, H. F. Physically informed Monte Carlo simulation of dual-wedge prism-based spectroscopic single-molecule localization microscopy. J Biomed Opt. 29 (S1), S11501(2023).
  31. Davis, J. L., et al. RainbowSTORM: an open-source ImageJ plug-in for spectroscopic single-molecule localization microscopy (sSMLM) data analysis and image reconstruction. Bioinformatics. 36 (19), 4972-4974 (2020).
  32. Davis, J. L., et al. RainbowSTORM v2 (MATLAB app). , https://github.com/FOIL-NU/sSMLM-protocol (2020).
  33. Brenner, B., et al. Implementation and calibration of spectroscopic single-molecule localization microscopy. BMC Methods. 2 (1), 2(2025).
  34. sSMLM for DNA intrinsic fluorescence (Python scripts). , Backman Lab. https://github.com/BackmanLab/sSMLM-for-DNA-intrinsic-fluorescence (2025).
  35. N-STORM protocol. , Molecular Vista. Available from: https://www.mvi-inc.com/wp-content/uploads/N-STORM+Protocol.pdf (2014).
  36. Abdelsayed, V., Boukhatem, H., Olivier, N. An optimized buffer for repeatable multicolor STORM. ACS Photonics. 9 (12), 3926-3934 (2022).
  37. Zumbusch, A., Holtom, G. R., Xie, X. S. Three-dimensional vibrational imaging by coherent anti-Stokes Raman scattering. Phys Rev Lett. 82 (20), 4142(1999).
  38. Benninger, R. K. P., Piston, D. W. Two‐photon excitation microscopy for the study of living cells and tissues. Curr Protoc Cell Biol. 59 (1), 4-11 (2013).
  39. Zhang, C., Zhang, D., Cheng, J. X. Coherent Raman scattering microscopy in biology and medicine. Ann Rev Biomed Eng. 17 (1), 415-445 (2015).
  40. Song, J., et al. SNR enhanced high-speed two-photon microscopy using a pulse picker and time gating detection. Sci Rep. 13 (1), 14244(2023).
  41. Luu, P., Fraser, S. E., Schneider, F. More than double the fun with two-photon excitation microscopy. Comm Biol. 7 (1), 364(2024).
  42. Van de Linde, S., et al. Direct stochastic optical reconstruction microscopy with standard fluorescent probes. Nat Protoc. 6 (7), 991-1009 (2011).
  43. Wang, D., et al. Research progress on the luminescence of biomacromolecules. J Mater Sci Technol. 76, 60-75 (2021).
  44. Varejão, N., Reverter, D. Using intrinsic fluorescence to measure protein stability upon thermal and chemical denaturation. Methods Mol Biol. 2581, 229-241 (2023).
  45. Sindrewicz, P., et al. Intrinsic tryptophan fluorescence spectroscopy reliably determines galectin-ligand interactions. Sci Rep. 9 (1), 11851(2019).
  46. Ho, C. S., et al. Rapid identification of pathogenic bacteria using Raman spectroscopy and deep learning. Nat Commun. 10 (1), 4927(2019).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

ThunderSTORMRainbowSTORM

Похожие статьи