Методическая статья

Упрощённый и надёжный протокол для изоляции и долгосрочного расширения первичных эпителиальных клеток человеческого эндометрия

DOI:

10.3791/70429

⸱

10 апреля 2026 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1The International Education College of Zhejiang Chinese Medical University, 2The First Clinical Medical College of Zhejiang Chinese Medical University, 3Department of Breast Surgery, The First Affiliated Hospital of Zhejiang Chinese Medical University (Zhejiang Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine), 4Quzhou TCM Hospital at the Junction of Four Provinces Affiliated to Zhejiang Chinese Medical University, 5Bozhou District Hospital of Traditional Chinese Medicine, 6The Affiliated Traditional Chinese Medicine Hospital of Shihezi University

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Первичная культура человеческих эндометриальных эпителиальных клеток (HEEC) технически сложна. Этот протокол сочетает переваривание смешанных ферментов с ингибитором ROCK (Y-27632) для улучшения выживания и расширения клеток при сохранении эпителиальной идентичности, обеспечивая надёжную платформу для исследований эндометрия и регенеративных приложений.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Исследования заболеваний эндометрия, включая гиперплазия эндометрия, ассоциированного с тамоксифеном, были ограничены отсутствием устойчивых эпителиальных моделей in vitro . Традиционные методы изоляции эпителиальных клеток человеческого эндометрия (HEEC) часто неэффективны, технически требовательны и плохо масштабируемы. Здесь описан упрощённый протокол без питания, который интегрирует смешанное ферментное расщепление, лизис эритроцитов и устойчивое лечение ингибитором ROCK (Y-27632) для эффективной изоляции и расширения первичных HEEC. Включение Y-27632 имеет решающее значение для смягчения диссоциационного апоптоза и улучшения клеточной адгезии на ранних стадиях. Этот подход поддерживает последовательное пассажирование при сохранении эпителиальной идентичности как минимум на 3 проходах, при этом морфология сохраняется после 10 проходов. Характеристика с помощью вестерн-блота и иммунофлуоресценции подтверждает высокую экспрессию цитокератина 18 и E-кадгерина, с постепенным снижением количества виментин-положительных стромальных загрязнителей при селективных условиях культуры. Учитывая ключевые технические ограничения, этот метод обеспечивает надёжный, масштабируемый источник эпителиальных клеток для механистических исследований, моделирования заболеваний, скрининга лекарств и регенеративных приложений в эндометриальных исследованиях. Стандартизированный рабочий процесс предлагает альтернативу сложным системам совместной культуры, обеспечивая более широкий доступ к высококачественным моделям первичных клеток.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Надёжные модели in vitro необходимы для продвижения изучения заболеваний эндометрия, особенно тех, связанных с тамоксифеном (TAM)1. Хотя TAM широко используется как эндокринная терапия при раке молочной железы, его частичная эстрогено-агонистическая активность в эндометрии значительно увеличивает частоту гиперплазии эндометрия, полипов и, в некоторых случаях, злокачественнойтрансформации 2. В настоящее время клиническое лечение патологии эндометрия, ассоциированного с тамоксифеном, в основном основано на терапии прогестероном или хирургическом вмешательстве, оба из которых имеют значительные ограничения. Лечение прогестероном часто связано с побочными эффектами, такими как прорывное кровотечение и набор веса, тогда как хирургические методы могут привести к необратимому повреждению эндометрия и снижениюфертильности 3. Эти ограничения подчёркивают необходимость надёжных эпителиальных моделей, способных поддерживать механистические исследования и способствовать разработке улучшенных терапевтических стратегий. Однако прогресс в этой области в первую очередь ограничен техническими трудностями при получении высококачественных и расширяемых человеческих эндометриальных эпителиальных клеток (HEEC).

Фундаментальные исследования в этой области были представлены Arnold и др. (2001), которые выделили популяции стромальных и эпителиальных клеток посредством расщепления коллагеназы и последовательной фильтрации сито, достигнув чистоты более 98%, подтвержденнойиммунокрашиванием 4. Несмотря на успех, метод основывался на переваривании одним ферментом, требовал длительной обработки и применял поэтапную фильтрацию для удаления стромальных и эритроцитарных загрязнителей, что делало рабочий процесс трудоёмким и трудным для стандартизации. Позже Yokomizo и др. (2002) установили первичную систему культуры HEEC из образцов гистерэктомии с использованием трёхмерной кокультуры со стромовыми питающимиклетками 5. Хотя микросреда на основе питателей частично поддерживала рост эпителия, система позволяла лишь ограниченное проходжение, обычно не более пяти проходов, что ограничивало её полезность для приложений, требующих крупномасштабного, стабильного расширенияэпителия 5.

Для преодоления этих ограничений был разработан упрощённый и высоковоспроизводимый протокол изоляции HEEC и долгосрочной культуры. Опираясь на предыдущие исследования, показавшие, что ингибитор ROCK Y-27632 значительно повышает эффективность первичной культуры для кератиноцитов человека, десневых эпителиальных клеток и клеток эпителия молочной железы, тот же принцип был применён к эндометриальнойткани 6,7,8. Этот подход включает три ключевые функции: смешанное переваривание ферментов для эффективной диссоциации тканей, важный этап эритроцитного лизиса для снижения раннего загрязнения и облегчения прикрепления эпителия, а также постоянное приём Y-27632 для подавления апоптоза, поддержки спайки и увеличения пролиферативной способности. Используя эту стратегию, HEEC можно расширять по нескольким проходам при сохранении морфологии эпителия и высокой экспрессии CK18 и E-cadherin 9,10. Примечательно, что последовательная передача не менее трёх поколений не приводила к обнаруживаемому фенотипическому дрейфу, что демонстрирует стабильность и масштабируемость культурной системы.

Этот метод напрямую решает давние технические проблемы в первичной культуре HEEC, включая высокие потребности в тканевых вводах, сложные рабочие процессы, низкую воспроизводимость и ограниченный потенциал расширения. Сохраняя эпителиальную идентичность и функциональные характеристики на протяжении всего перехода, протокол предоставляет надежную платформу для исследований регенерации эндометрия, патофизиологии, высокопроизводительного скрининга лекарств и взаимодействия между клетками и биоматериалом. Интегрируя обработку тканей с последовательным расширением, этот стандартизированный рабочий процесс решает давний узкий горлышко в репродуктивной биологии и поддерживает будущие применения в тканевой инженерии, регенеративной медицине и персонализированной терапии.

Этот протокол требует свежих образцов тканей, желательно обработанных в течение 24 часов после сбора. Характеристики выхода и роста клетки могут варьироваться в зависимости от источника ткани, например, от эндометриальных полипов против нормального эндометрия. Распространёнными причинами отказа являются неполное переваривание тканей, чрезмерное загрязнение эритроцитами или недостаточное приём добавок Y-27632. Хотя система поддерживает расширение по нескольким проходам, может потребоваться дополнительная оптимизация для поддержания фенотипической стабильности во время длительной культуры.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Свежие образцы эндометриальной ткани были получены из образцов полипов матки, хирургически удаленных у пациентов Первой аффилированной больницы Китайского медицинского университета Чжэцзяна. Все процедуры проводились в соответствии с рекомендациями, утверждёнными Комитетом по медицинской этике Первой аффилированной больницы Чжэцзянского китайского медицинского университета (Протокол No 2025-KLS-569-01; утвержден 14 сентября 2025 года). Обработка первичных человеческих образцов проводилась в биологическом шкафе II класса с использованием соответствующих средств индивидуальной защиты, включая лабораторные халаты, перчатки и средства защиты глаз. Все ферментативные реагенты эксплуатировались в соответствии с институциональными нормами безопасности и рекомендациями по безопасности материалов (MSDS).

1. Приобретение тканей

  1. Собирайте свежую эндометриальную ткань из хирургических образцов, полученных у взрослых женщин. Переместить ткань в стерильные трубки с 10 мл физиологического раствора, буферированного фосфатом (PBS), дополненным 3% пенициллином/стрептомицином (P/S).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Вся ткань должна быть обработана в течение 24 часов после хирургического забора.

2. Предобработка тканей

  1. Перемешайте ткань в растворе для мытья (Таблица 1) два последовательных промывания по 2 минуты каждая, чтобы удалить слизь и тромбы.
  2. Кратко прополосните ткань в 5 мл этанола 75% в течение 5 секунд для дезинфекции поверхности.
  3. Немедленно переложите ткань в 20 мл раствора для стирки и промывайте два раза по 5 минут каждая, чтобы удалить остатки этанола.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку этанол горючий, выполните этот шаг вдали от открытого огня и утилизируйте отходы, содержащие этанол, в соответствии с институциональными рекомендациями по химической безопасности.

3. Переваривание тканей и сбор клеток

  1. Измельчение тканей
    1. Измельчить эндометриальную ткань двумя стерильными лопастями, пока фрагменты (~2мм 3) не будут аспирированы через кончик пипетки объёмом 1 мл (около 10 минут).
    2. Переместите измельчённую ткань в центрифугную трубку на 50 мл.
  2. Ферментативное пищеварение
    1. Добавьте 10 мл раствора для пищеварения (Таблица 1) в трубку с фрагментами ткани.
    2. Инкубировать трубку в водяной бане при температуре 37 °C в течение 30 минут. Аккуратно встряхивайте трубку каждые 15 минут, чтобы облегчить пищеварение.
    3. Продолжайте инкубацию до тех пор, пока фрагменты ткани не будут заметно диссоциированы, а раствор не станет мутным из-за высвобождения клеток.
  3. Прекращение пищеварения
    1. Добавьте 10 мл нейтрализирующего раствора, чтобы прекратить ферментное переваривание.
    2. Тщательно перемешайте, примерно 15 раз вверх и вниз с помощью пипетки P1000, установленной на 800 мкл.
  4. Фильтрация и центрифугирование
    1. Фильтруйте переваренную суспензию через сетчатый фильтр диаметром 100 мкм.
    2. Центрифуга при 156 × г в течение 5 минут при 25 °C.
  5. Лизис эритроцитов (эритроцитов)
    1. Аккуратно вдыхайте супернатант, не нарушая гранулу.
    2. Суспензировать клеточную гранулу в 2 мл предварительно охлаждённого буфера лизиса эритроцитов.
    3. Инкубировать на льду (примерно при 4 °C) 3–5 минут с мягким перемешиванием.
  6. Прекращение лизиса
    1. Добавьте ≥10 мл PBS или полной среды, чтобы остановить реакцию лизиса.
    2. Центрифуга при 156 × г в течение 5 минут при 25 °C.

4. Инициация первичной культуры

  1. Промывка и центрифугирование
    1. Аккуратно вдыхайте супернатант, не нарушая гранулу.
    2. Суспензируйте гранулу в 20 мл нейтрализирующего раствора.
    3. Перемешивайте, пипетируя примерно 15 раз.
    4. Центрифуга при 156 × г в течение 5 минут при 25 °C.
  2. Ресуспензия и засев
    1. Аспирировать супернатант.
    2. Аккуратно повторно суспензируйте клеточную гранулу в 10 мл исходной культурной среды с 10 мкм Y-27632, медленно поднимая и опускаясь 8–10 раз с помощью пипетки объёмом 1 мл.
    3. Поместите суспензированную ячейку в 100-мм посевную чашу.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для оптимальной начальной плотности посева выберите сосуд для культуры согласно предполагаемому урожаю клеток. Если ожидаемый урожай составляет >1 × 106 ячеек, используйте тарелку диаметром 100 мм, а для меньших результатов — чашу диаметром 60 мм. Отрегулируйте средний объём соответственно (например, 10 мл для тарелки 100 мм; 4 мл для тарелки 60 мм).
  3. Условия культуры
    1. Инкубировать блюдо при 37 °C в увлажнённой атмосфере с содержанием 5%CO2.
    2. Заменяйте среду на свежую эпителиальную культурную среду без Y-27632 каждые 3 дня.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Следите за присоединением клеток и морфологией; Обновлять среду каждые 2 дня, когда клетки начинают размножаться.

5. Передача клеток

  1. Подготовка к трипсинизации
    1. Когда культуры достигают слияния 80%–90%, убирайте 100-мм антенну из инкубатора.
    2. Выбросьте использованную среду.
    3. Промывайте клетки дважды 2 мл PBS.
    4. Аккуратно аспирируйте и удалите оставшиеся PBS.
  2. Трипсинизация
    1. Добавьте 2 мл трипсина 0,05% в блюдо.
    2. Аккуратно покрутите, чтобы обеспечить равномерное покрытие клеточного слоя.
    3. Инкубировать при 37 °C в течение 7 минут.
    4. Осмотрите клетки под микроскопом (40x объектив) для подтверждения отслоения.
  3. Нейтрализация и сбор
    1. Добавьте 8 мл нейтрализирующего раствора, чтобы остановить переваривание трипсина.
    2. Перенесите подвеску ячейки в центрифугную трубку объёмом 15 мл.
    3. Пипетт примерно 15 раз для получения одноклеточной суспензии.
    4. Центрифуга при 156 × г в течение 5 минут при 25 °C.
  4. Повторная подвеска и повторный посев
    1. Аспирируйте супернатант, не нарушая гранулу.
    2. Аккуратно суспензируйте гранулу клетки в 10 мл эпителиальной клеточной среды, проводя пипету вверх и вниз примерно 10 раз с помощью пипетки объемом 1 мл.
    3. Семя 1 × 106 клеток в 10 мл эпителиальной клеточной среды в новую 100-мм антенну.
    4. На следующий день отрегулируйте плотность посева для создания изолированных, хорошо распространённых отдельных клеток или небольших скоплений, избегая перенаселённости.
  5. Техническое обслуживание после перехода
    1. Инкубировать в стандартных условиях культуры (37 °C, 5%CO2).
    2. Регулярно наблюдайте за культурой и меняйте эпителиальную клеточную среду каждые 2 дня.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки обычно готовы к последующим применению после первого или второго прохода, когда получается здоровый, прилипший монослой с ≥80% слияния.
      ВНИМАНИЕ: Все материалы, контактировавшие с первичными человеческими клетками, рассматривались как потенциальная биологическая опасность. Перед утилизацией или дальнейшей обработкой эти материалы дезинфицировались с использованием 10% отбеливателя в соответствии с институциональными рекомендациями по биобезопасности.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Успешное создание первичной системы культуры HEEC было подтверждено с помощью морфологических, пролиферативных и молекулярных оценок, как показано на рисунке 1. Сочетая смешанное ферментное пищеварение, лизис эритроцитов и ингибитор ROCK, этот протокол позволил эффективно выделить и стабильно расширять эпителиальные клетки из ткани эндометрия человека.

Морфологические наблюдения продемонстрировали важную роль Y-27632 в ранней куль...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Создание надёжной in vitro модели эпителиальных клеток человеческого эндометрия (HEECs) крайне важно для изучения биологии и патологииэндометрия. Хотя было разработано несколько методов изоляции HEEC, большинство из них остаются ограниченными технической сложностью, низкой эффективностью и ограниченным потенциаломрасширения 4,5. Многие протоколы также опираются на фидерные слои, которые добавляют ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют, что нет конфликтов интересов в отношении публикации этой статьи.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана Программой науки и технологий Цюйчжоу (No2024ZD046), Фондом сотрудничества в области науки и технологий провинции Гуйчжоу ZK (2025) General 023, Программой науки и технологий Бинтуани (No 2024ZD059; No2026YD026).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Dispase SolarbioCAS:42613-33-2Для изоляции HEEC
Коллагеназный тип IMerckSKU:SCR103Для изоляции HEEC
100 & micro; Фильтр MMESHSolarbio431752Для фильтрации HEEC
Rabbit Anti CK18AbcamAB133263Для иммунофлуоресцентного окрашивания для проверки маркера дифференцировки HEEC
Rabbit anti CDH1AbcamAB40772Для иммунофлуоресцентного окрашивания для проверки маркера дифференцировки HEEC
rabbit anti VIMAbcamab16700Для иммунофлуоресцентного окрашивания для проверки маркера дифференцировки HEEC
4% параформальдегидsolarbioP0099Для иммунофлуоресцентного окрашивания для проверки маркера дифференцировки HEEC
CO2-инкубаторThermo Scientific42820906Для инкубации клеток
ЦентрифугаЭппендорф5404HN133048Центрифуга ячейки
100-мм контейнер для клеточной культурыКорнинг430167Для клеточной культуры
Центрифуга на 50 млКорнинг430829Для центрифугирования ячейки
Микроцентрифугальные пробирки объемом 1,5 млNEST081722CK01Для переваривания клеток
Ячейковая ситаSolarbio431752Клеточная фильтрация
Раствор с фосфатным буферомТеконо20201033Раствор для мытья
DMEMGibco8122622Компонент нейтрализационной среды
Пенициллин/стрептомицинThermo Scientific15140-122Антибиотики
Сыворотка плода для быкаGibco2556132PКомпонент нейтрализационной среды
0,05% трипсинBasalmediaK431010Для HEECs  диссоциация
Y-27632SolarbioIY0040Ингибитор ROCK
Буфер лизиса эритроцитовSolarbioR1010Лизис эритроцитов
1% Triton X-100 Thermo ScientificHFH10Мембранная проницаемость
IgG против ОслаThermo ScientificA32790TRВторичные антитела
DAPIThermo Scientific62248ДНК-окрашивание
1 x PBSTSolarbioP1031Промывочный буфер
Специализированная среда для начальных HEECiCelliCell-f004-002hДля культуры HEEC
Инвертированный конфокальный микроскопZeiss LSM880Используется для получения иммунофлуоресцентных изображений; оснащённый 40x
Клеточная линия MRC-5iCelliCell-h146 Линию человеческой эндометриальной аденокарциномы; Профиль STR.
Клеточная линия ИсикавыiCelliCell-h113 Линию человеческой эндометриальной аденокарциномы; Профиль STR.

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gompel, A. Progesterone, progestins and the endometrium in perimenopause and in menopausal hormone therapy. Climacteric. 21 (4), 321-325 (2018).
  2. Prat, A., et al. Clinical implications of the intrinsic molecular subtypes of breast cancer. Breast. 24 (Suppl 2), S26-S35 (2015).
  3. Chen, J., Cao, D. Fertility-sparing re-treatment for endometrial cancer and atypical endometrial hyperplasia patients with progestin-resistance: A retrospective analysis of 61 cases. World J Surg Oncol. 22 (1), 169(2024).
  4. Arnold, J. T., Kaufman, D. G., Seppälä, M., Lessey, B. A. Endometrial stromal cells regulate epithelial cell growth in vitro: A new co-culture model. Hum Reprod. 16 (5), 836-845 (2001).
  5. Yokomizo, R., et al. Endometrial regeneration with endometrial epithelium: Homologous orchestration with endometrial stroma as a feeder. Stem Cell Res Ther. 12 (1), 130(2021).
  6. Liu, Z., et al. A simplified and efficient method to isolate primary human keratinocytes from adult skin tissue. J Vis Exp. (138), e57784(2018).
  7. Xie, Z., et al. Isolation and culture of primary human gingival epithelial cells using Y-27632. J Vis Exp. (177), e62978(2021).
  8. Qian, L., et al. Isolation and culture of primary human mammary epithelial cells. J Vis Exp. (207), e66638(2024).
  9. Moll, R., et al. Cytokeratins of normal epithelia and some neoplasms of the female genital tract. Lab Invest. 49 (5), 599-610 (1983).
  10. Shimoyama, Y., et al. Cadherin cell-adhesion molecules in human epithelial tissues and carcinomas. Cancer Res. 49 (8), 2128-2133 (1989).
  11. Fitzgerald, H. C., Schust, D. J., Spencer, T. E. In vitro models of the human endometrium: Evolution and application for women's health. Biol Reprod. 104 (2), 282-293 (2021).
  12. Riaz, M. A., et al. Long-term maintenance of viable human endometrial epithelial cells to analyze estrogen and progestin effects. Cells. 13 (10), 811(2024).
  13. Wen, J., Zu, T., Zhou, Q., Leng, X., Wu, X. Y-27632 simplifies the isolation procedure of human primary epidermal cells by selectively blocking focal adhesion of dermal cells. J Tissue Eng Regen Med. 12 (2), e1251-e1255 (2018).
  14. Zhu, Y., et al. Therapeutic effect of Y-27632 on tumorigenesis and cisplatin-induced peripheral sensory loss through rhoa-nf-κb. Mol Cancer Res. 17 (9), 1910-1919 (2019).
  15. Brosens, I., Brosens, J. J., Benagiano, G. The eutopic endometrium in endometriosis: Are the changes of clinical significance. Reprod Biomed Online. 24 (5), 496-502 (2012).
  16. Najar, M., et al. Proliferative and phenotypical characteristics of human adipose tissue-derived stem cells: Comparison of ficoll gradient centrifugation and red blood cell lysis buffer treatment purification methods. Cytotherapy. 16 (9), 1220-1228 (2014).
  17. Tam, W. L., Weinberg, R. A. The epigenetics of epithelial-mesenchymal plasticity in cancer. Nat Med. 19 (11), 1438-1449 (2013).
  18. Loh, C. Y., et al. The e-cadherin and n-cadherin switch in epithelial-to-mesenchymal transition: Signaling, therapeutic implications, and challenges. Cells. 8 (10), 1118(2019).
  19. Rubio, S., Cazares, O., Macias, H., Hinck, L. Generation of mosaic mammary organoids by differential trypsinization. J Vis Exp. (157), e60742(2020).
  20. Chen, S. Y., Hayashida, Y., Chen, M. Y., Xie, H. T., Tseng, S. C. A new isolation method of human limbal progenitor cells by maintaining close association with their niche cells. Tissue Eng Part C Methods. 17 (5), 537-548 (2011).
  21. Li, X., et al. Prolonged treatment with Y-27632 promotes the senescence of primary human dermal fibroblasts by increasing the expression of IGFBP-5 and transforming them into a caf-like phenotype. Aging. 12 (16), 16621-16646 (2020).
  22. Hu, R., Hilakivi-Clarke, L., Clarke, R. Molecular mechanisms of tamoxifen-associated endometrial cancer (review). Oncol Lett. 9 (4), 1495-1501 (2015).
  23. Wu, X., et al. Conditional reprogramming: Next generation cell culture. Acta Pharm Sin B. 10 (8), 1360-1381 (2020).
  24. Turco, M. Y., et al. hormone-responsive organoid cultures of human endometrium in a chemically defined medium. Nat Cell Biol. 19 (5), 568-577 (2017).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Endometrial Epithelial CellsCell IsolationPrimary Cell ExpansionFeeder Free CultureMixed Enzyme DigestionROCK InhibitorErythrocyte LysisSerial PassagingWestern BlotImmunofluorescence

Похожие статьи