Методическая статья

Оценка метаболической активности целых регенерирующих желудочков данио-религии ex vivo с помощью внеклеточного анализа потока

538 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/70459

⸱

17 апреля 2026 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Physiology, Anatomy and Genetics, University of Oxford, 2Institute of Developmental and Regenerative Medicine, University of Oxford, 3King Faisal Specialist Hospital & Research Centre, 4Department of Chemistry, University of Oxford

В этой статье

Краткое содержание

В этой статье мы описываем подробный протокол количественной оценки скорости потребления кислорода и скорости внеклеточного закисления желудочков взрослой зебро-рерио, чтобы охарактеризовать их окислительную и гликолитическую метаболическую способность.

Аннотация

Способность данио-религии регенерировать сердце во взрослом возрасте частично объясняется метаболическими адаптациями. Хотя выдвигается гипотеза, что сердце рыбы в значительной степени зависит от гликолиза, недавние исследования выявили более сложный метаболический профиль, в котором окислительный метаболизм становится важной частью редифференциации кардиомиоцитов и успешной поздней регенерации сердца. В 2025 году мы применили высокопроизводительный метод для оценки метаболического профиля целых желудочков данио-рерио , ex vivo, используя анализ Seahorse (внеклеточный анализ потока). Этот метод позволяет быстро и в реальном времени оценивать базальную и максимальную скорость потребления кислорода (OCR) и скорость внеклеточного закисления (ECAR) с помощью стресс-теста XF Mito на анализаторе Seahorse XFe24. В этой статье мы описываем подробный протокол проведения анализа внеклеточного потока целых желудочков данио-рерио. Возможность количественно оценивать OCR и ECAR в живых целых сердцах ex vivo даст возможность выяснить сердечный метаболизм в критические моменты развития процесса, прогрессирования заболевания и регенерации.

Введение

В отличие от человека, данио-рерио (Danio rerio) сохраняют способность восстанавливать утраченную сердечную ткань на протяжении всей взрослойжизни 1. При повреждении сердца кардиомиоциты в зоне границы раны дедифференцируются и возвращаются в клеточныйцикл 2,3, чтобы восстановить число кардиомиоцитов4 и заселить рану. В последнее время было признано значение редифференциации кардиомиоцитов в регенеративномпроцессе 5. Оба этих процесса строго регулируются метаболическими изменениями в сердце данио, при этом гликолиз способствуетпролиферации 6,7, а окислительное фосфорилирование (OXPHOS) способствует редифференциации8. Хотя фармакологические и генетические методы манипуляции метаболизмом широко распространены в областирегенерации 6,7, валидация метаболических эффектов этих возмущений остаётся сложной из-за небольшого размера сердца данио-рерио, что требует сложной, индивидуальной установки для кануляции 9,10,11 или объединения нескольких сердец для масс-спектрометрии12 или ЯМР-спектроскопии8. 13.

Чтобы обойти эти ограничения, мы недавно описали использование анализатора Seahorse XFe24 для высокопроизводительного метаболического профилирования желудочков целых желудочков данио-рерио ex vivo8. Анализ внеклеточного потока предназначен для измерения скорости потребления кислорода (OCR) и скорости внеклеточного закисления (ECAR) клеток, островков поджелудочной железы и сфероидов. Это достигается с помощью твердотельных датчиков, которые фиксируют изменения концентрации кислорода и протонов (pH) в среде, возникающие в результате использования респираторной цепи переноса электронов кислорода и выработки лактата, зависящего от гликолиза (рисунок 1A)14.

Анализ внеклеточного потока может проводиться на 96-ядровой пластине (XFe96 и XF Pro), 8-ядровых минипластинах или различных версиях 24-ячественных пластин (XFe24). Хотя пластины с 96 лунками обеспечивают большую пропускную способность, рабочее расстояние между датчиком и дном скважины недостаточно для размещения целого желудочка данио-рерио. Кроме того, в формате пластин с 96 лунками нет возможности закрепить желудочек на дне скважины, чтобы предотвратить его плавание в среде и мешать работе датчиков. С другой стороны, микропластина захвата островков XFe24 изначально была разработана для метаболической характеристики первичных островков поджелудочной железы и, как следствие, позволяет откладывать ткань на дне колодца, которая затем закрепляется сеткой (сеткой). Из-за небольшого размера сердца данио-рерио нам удалось адаптировать микропластину для захвата островков для использования желудочков данио, которые остаются закреплёнными под сеткой на время анализа.

Для оценки дыхательной ёмкости митохондрий мы использовали стресс-тест Мито, в котором использовались четыре ингибитора цепи транспорта электронов и синтазы аденозинтрифосфата (АТФ) (рисунок 1A). Во-первых, получаются исходные измерения OCR (рисунок 1B, пурпурный). Затем вводится олигомицин — комплексный ингибитор V. Олигомицин ингибирует активность АТФ-синтазы, что приводит к снижению OCR, что связано с выработкой АТФ (рисунок 1B, зелёный). Оставшееся потребление кислорода обусловлено несвязанным дыханием и не-митохондриальным потреблением кислорода (рисунок 1B, оранжевый и серый соответственно)15. После олигомицина вводится FCCP, который рассеивает градиент протона через мембрану митохондрий (рисунок 1A). В попытке восстановить градиент протона митохондрии увеличивают потребление кислорода до максимальной ёмкости (рисунок 1B, синий). Наконец, используется смесь ротенона и антимицина A, которая ингибирует комплексы I и III соответственно (рисунок 1A). Это сочетание препаратов приводит к полному прекращению активности цепи транспорта электронов в респираторных путях митохондрий из-за отсутствия потока электронов от комплексов I и III ккомплексу IV 15. Это позволяет измерять потребление кислорода в не-митохондриальных областях (см. рисунок 1B, серый).

В целом, используя микропластину захвата островков с тестом Mito Stress, мы смогли быстро и воспроизводимо оценить окислительную и гликолитическую метаболическую способность желудочков целых желудочков данио-рерио ex vivo. Ниже мы описываем подробный протокол этой процедуры. Наконец, мы показываем выживаемость неповреждённых изолированных желудочков дикого типа ex vivo в внеклеточном анализаторе потока и подтверждаем тест Mito Stress на 14 днях через 14 дней трансгенных желудочков данио-рерио(dpci) 8.

Протокол

Все процедуры, описанные ниже, связанные с животными, были выполнены в соответствии с пересмотренным Законом о животных (научные процедуры) 1986 года в Великобритании и Директивой 2010/63/ЕС в Европе и утверждены Центральным комитетом по уходу за животными и этическому обзору Оксфордского университета.

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол был выполнен с использованием анализатора Seahorse XFe24 и среды Seahorse DMEM без использования фенол-красного и бикарбоната.

1. Криотравма сердца у данио-рерио-рерио (по желанию)

  1. Получите соответствующее этическое одобрение от местного учреждения и национальных органов перед началом эксперимента.
  2. Проведите криотравму сердец данио, как было описановыше 16,17,18.

2. Увлажнение сенсорного картриджа

  1. Откройте внеклеточный анализ потока и загрузите 24-колодцевую утилитарную пластину (рисунок 2A), вливая 500 мкл калибровочного раствора в каждую скважину.
  2. Закройте вспомогательную пластину с помощью сенсорного картриджа и гидроусилителя (рисунок 2A).
  3. Инкубировать картридж и универсальную пластину в увлажнённом инкубаторе при 37 °C ночью (18–72 часа). Держите крышку на сенсорном картридже на протяжении всей инкубации.

3. Подготовка лекарственных растворов и материалов

  1. Изготовьте стандартные растворы препаратов: растворите олигомицин в диметилсульфоксиде (DMSO) до концентрации 10 мМ, карбонилцианид 4-(трифторметокси)фенилгидразон (FCCP) в DMSO до концентрации 5 мМ, ротенон в DMSO до концентрации 10 мМ, а антимицин А в этаноле до концентрации 10 мМ и храните при -20 °C, если не использовать немедленно.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется готовить свежие растворы олигомицина, ротенона и антимицина каждые 2–3 месяца, а затем использовать раствор FCCP каждый раз перед проведением анализа.
  2. Подготовьте рабочую концентрацию препаратов (500 мкм олигомицина, 300 мкм FCCP, 450 мкм ротенона/антимицина A смеси) разбавляя стандартный раствор в среде DMEM. Убедитесь, что конечный объём рабочих концентраций составляет 1,5 мл для олигомицина, 1,65 мл для FCCP и 1,8 мл для ротенона/антимицина А, что позволяет загрузить 30 портов (24 порта на ингибитор на картридж плюс 6 дополнительных портов на препарат для коррекции ошибок пипетирования).
    ПРИМЕЧАНИЕ: В ротеноне/антимицине А появятся осадки, но после хорошего смешивания это будет минимизировано. Обратите внимание, что концентрации, указанные в статье 3.2, в 10 раз превышают конечную концентрацию препаратов при введении в скважины.
  3. Подготовьте среду DMEM (pH 7,4) с содержанием 10 мМ глюкозы, 1 мМ пирувата и 2 мМ глутамина, и храните при -20 °C до использования.

4. Включение анализатора внеклеточного потока

  1. Включите анализатор с боковой кнопки на ночь перед анализом, чтобы обеспечить уравновесение температуры с окружающей средой.
  2. Включите компьютер и откройте программу Wave.
  3. Выберите стресс-тест Mito в программном обеспечении.
  4. Выключите обогреватель в левом нижнем углу программного обеспечения, чтобы температура анализатора опустилась ниже 37 °C и достигла 28–29 °C, чтобы приблизиться к стандартной температуре содержанияданио-рерио. 19.
  5. Задайте стратегию инъекции на странице определений групп (во вкладке стратегий инъекций ), добавив соединения, которые будут отложены в каждом порте из каталога соединений. Для стресс-теста Mito добавьте олигомицин в порту A, FCCP в порту B и ротенон/антимицин в порту C. Есть возможность добавить ещё один препарат в порт D, который не используется в данном протоколе.
  6. Удалять все остальные заранее разработанные стратегии, которые есть во вкладке стратегий инъекций , после того как экспериментальная стратегия будет определена. Укажите экспериментальные группы (например, дикий тип и мутант) на стороне страницы Группы и укажите стратегию инъекции, которую они получат (та, что определена на шаге 4.5). Убедитесь, что стратегии инъекций совпадают между группами и соответствуют разработанной стратегии инъекций.
  7. На странице карты пластин укажите положение каждого образца на 24-луночной плите, кликнув на каждую группу, а затем по скважинам, в которых будут эти образцы.
    1. Обратите внимание, что четыре из этих скважин не подходят для осадки образцов (рисунок 2B) и служат заготовками, которые будут использоваться для коррекции фона. Убедитесь, что образцы в каждой группе равномерно распределены по плите, чтобы сбалансировать потенциальное позиционное смещение в измерениях или условиях окружающей среды.
  8. На странице протокола удалите вкладку Control или Experiment , если не используется дополнительный ингибитор, кроме указанных выше, и убедитесь, что порты программного обеспечения совпадают с положением лекарств на картридже.
  9. Программное обеспечение автоматически устанавливает 3 цикла смешивания, ожидания и измерения в каждом состоянии. Изменить количество циклов до 10 базовых (необработанных), 3 измерения олигомицина, 7 FCCP и 9 измерений ротенона/антимицина А, чтобы обеспечить стабильные следы и чтобы ингибиторы действовали на 3D-ткань. Убедитесь, что каждый цикл состоит из 3 минут перемешивания, 2 минут ожидания и 3 минут измерения.

5. Калибровка анализатора

  1. Снимите картридж и утилитную пластину из увлажнённого инкубатора (см. шаги 2.1–2.3).
  2. Снимите гидро-усилитель и крышку (рисунок 2A) из картриджа и положите сенсорный картридж на утилитарную пластину с калибром.
  3. Аккуратно вводите ингибиторы в соответствующие порты, касаясь боковой стенки порта кончиком пипетки, обеспечивая плавный поток жидкости: 50 мкл олигомицина в порту A, 55 мкл FCCP в порту B и 60 мкл ротенона/антимицина А в порту C (рисунок 2C).
    1. Обратите внимание, что жидкость удерживается на месте только поверхностным натяжением в отверстии порта, поэтому с этого этапа избегайте резкого пипетирования или заклеивания картриджа. Убедитесь, что жидкость не попадает в порт датчика (рисунок 2C), так как это повредит анализатор.
  4. Нажмите « Запустить, запустить », назовите запуск и сохраните его на компьютере. В этот момент откроется лоток анализатора, чтобы разместить картридж и утилитарную пластину.
  5. Разместите картридж с лекарствами и утилитарную пластину с калибром на лоток анализатора согласно карте пластины на лотке (поле A1 в левом верхнем углу) и убедитесь, что всё правильно подгоняется. Снимите усилитель гидранта и крышку (рисунок 2A) с пластины перед загрузкой на лоток. Если этого не сделать, анализатор повредится.
  6. Когда вы готовы, попросите программу начать анализ, нажав «запустить анализ». В этот момент анализатор принимает загруженный лоток и запускает калибровку.
  7. Начните процедуру изоляции сердца (см. шаги 6.1–6.12). Калибровка длится примерно 40 минут, но пластину можно удерживать в анализаторе столько, сколько потребуется, чтобы изолировать сердца и поместить их в микропластину для захвата островков (рисунок 2B,D).

6. Выделение сердец рыбы и загрузка их на 24-колодцевую пластину Islet

  1. Откройте микропластину для захвата островков и загрузите 24-ядровую пластину 500 мкл DMEM (10 мМ глюкозы, 1 мМ пирувата, 2 мМ глутамина) при комнатной температуре.
  2. Поместите все решётки в чашку Петри диаметром 35 мм с медиа DMEM при комнатной температуре, убедитесь, что они полностью погружены и не содержат крупных пузырьков.
  3. Приготовьте дополнительную чашку Петри диаметром 35 мм, содержащую DMEM (10 мМ глюкозы, 1 мМ пирувата, 2 мМ глутамина) при комнатной температуре. Это служит для промывания сердец при сборе и вскрытия желудочка от предсердий и булбуса артериального отверстия.
  4. Отстреляйте одну рыбу на 5 г/л MS-222 и проверьте отсутствие рефлексов.
  5. Поместите рыбу на губку, закреплённую на чашке Петри диаметром 92 мм, откройте сердечную полость и вскрытие сердца, как описановыше 16,20.
  6. Промывайте сердца в чашке Петри диаметром 35 мм, содержащей DMEM (10 мМ глюкозы, 1 мМ пирувата, 2 мМ глутамина) при комнатной температуре.
  7. Удалите предсердие и бульбус артериозу с помощью щипцов из чашки Петри диаметром 35 мм.
  8. Аккуратно встряхните и сжайте желудочек, чтобы кровь стекла из его просвета. Не повреждайте стенку желудочков при мытье сердца.
  9. Переместите сердце в назначенную яме на микропластине захвата островка и дайте ему опуститься в центр соответствующей ямы согласно карте пластин. Поддерживайте пластину при комнатной температуре. Включите все желудочки в анализ, даже если они перестают биться заметно.
  10. Повторите процесс для всех доступных рыб. При сравнении метаболической активности разных экспериментальных групп мы рекомендуем выделить по одному сердцу для каждой группы, а не все сердца из одной группы, прежде чем перейти к следующему. Хотя сердца могут выживать в анализаторе не менее 180 минут (рисунок 3A), мы предлагаем изоляцию происходить по одному сердцу на группу в качестве лучшей практики для обеспечения равномерного распределения времени в медиа между группами.
  11. После того как все сердца выделены (примерно 60 минут для пластины из 20 сердец), положите их на дно микропластинчатых колодцей островка (рисунок 2B) и разместите в центре с помощью тонких щипцов (рисунок 2D, E).
  12. Используйте щипцы, чтобы покрыть их сеткой (примерно 20 минут) (рисунок 2D). Убедитесь, что сетка расположена в правильной ориентации (сетка обращена вниз к сердцу) и не содержит крупных пузырьков, так как это может мешать измерениям (рисунок 2E).
    1. Когда сетка на месте, используйте щипцы, чтобы прижать её к краям, пока не раздаётся лёгкий щелчок. Убедитесь, что не повредите сердце щипцами через сетку.

7. Загрузка образцов на анализатор и получение измерений

  1. После того как сердца будут заключены в микропластину захвата островка, проверьте в программном обеспечении, что все скважины были успешно откалиброваны, что отмечено зелёными галочками на экране компьютера. Теперь выпустите универсальную пластину, нажав на открытый лоток.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В этот момент патрон не будет выброшен, и появится только утилитическая пластина с калибром.
  2. Замените утилитарную пластину на микропластину островка, содержащую образцы на лотке анализатора. Убедитесь, что микропластина островка расположена правильно (A1 в левом верхнем углу) и что крышка снята. Если не снять крышку, анализатор повредится.
  3. После размещения пластины островка инструктировать программное обеспечение начать эксперимент, нажав пластину нагрузочной ячейки. В течение примерно первых 10 минут датчики выполняют этап уравновешения, после чего начинаются измерения.
  4. После завершения эксперимента (примерно через 4 часа) нажмите на картридж для выброса , чтобы открыть лоток и выбросить микропластину и картридж островка.
  5. Снимите микропластину островка и картридж, и нажмите готово , чтобы лоток закрылся. На этом этапе нажмите просмотр результатов , чтобы увидеть собранные данные.
  6. Сохраните измерения, экспортируйте их с компьютера анализатора и загрузите на аналитический интерфейс для дальнейшего анализа и обработки. Это приводит к удалению островочной пластины и картриджа из анализатора.
  7. Снимите пластину и картридж из анализатора и закройте картридж крышкой.
  8. Заморозьте островчатую пластину на сухом льде или вынимите сердца из колодцев (см. шаг 8.2) и храните при -20 °C, если выделение белка для нормализации (шаг 8) не выполнено немедленно.
  9. После сохранения данных отключите программное обеспечение, анализатор и компьютер.
  10. Загрузите данные на аналитический интерфейс и визуализируйте их, выбрав график OCR из опции стандартных просмотров . На интерфейсе просмотрите данные как уровень или скорость OCR и ECAR, корректируя фон по пустым скважинам, и выберите скважины для визуализации, кликнув на карту пластин, чтобы они появились или исчезли.

8. Выделение белков и количественная оценка для нормализации

  1. Подготовьте буфер для радиоиммунопреципитационного анализа (RIPA), содержащий ингибиторы протеазы, растворив одну таблетку ингибитора протеазы в 10 мл буфера RIPA и тщательно перемешав.
  2. Если это ещё не сделано (шаг 7.8), используя инструмент вставки экрана захвата островков (рисунок 2F), уберите сетки с пластины островка, чтобы освободить сердца. Аккуратно убирайте сердца, так как они могут застрять на сетке. Если это так, используйте щипцы, чтобы освободить их. Если сетку нельзя удалить с помощью инструмента для вставки экрана, переместите пластину под стереоскоп и с помощью ножниц микродиссекции аккуратно разрежьте сетку, чтобы освободить сердце.
  3. Поместите каждый желудочек в трубку объёмом 1,5 мл, содержащую 200 мкл буфера RIPA, обогащённого ингибитором протеаз, на льду.
  4. Гомогенизируйте сердце с помощью гомогенизатора с одноразовыми пестиками на льду.
  5. Подготовьте стандарты, разбавляя предоставленный бычий сывороточный альбумин (BSA) в буфере RIPA в следующих концентрациях: 2000 мкг/мл, 1500 мкг/мл, 1000 мкг/мл, 750 мкг/мл, 500 мкг/мл, 250 мкг/мл, 125 мкг/мл, 25 мкг/мл, 0 мкг/мл.
  6. Подготовьте рабочее решение Pierce BCA (50:1, реагент A: реагент B, согласно инструкции производителя). Рассчитайте объём рабочего реагента, необходимого по следующей формуле:
    (количество стандартов + количество образцов) × 2 × 200 мкл
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот объём позволяет использовать 200 мкл рабочего раствора на образец и стандарт, а также позволяет собирать дублирующие измерения на каждый образец и стандарт.
  7. В пластине на 96 лунок добавьте по 25 мкл каждого стандарта и каждый образец в каждой скважине в дубликатах.
  8. Добавьте 200 мкл рабочего раствора на каждую скважину.
  9. Инкубировать тарелку при 37 °C в течение 30 минут.
  10. Дайте пластине остыть до комнатной температуры 10 минут и запечатайте её герметиком для пластин. Убедитесь, что в скважинах нет пузырьков, так как это может заблокировать считыватель пластин. Если образуется ограниченное количество пузырьков, используйте кончик или тонкие щипцы, чтобы лопнуть их.
  11. Измерьте поглощение при 562 нм с помощью считывателя пластин.
  12. Сгенерируйте стандартную кривую на основе поглощения стандартов и вычислите концентрацию белка в образцах.
  13. Фиксируйте концентрацию белка на вкладке нормализации (рисунок 2G) аналитического интерфейса для каждой скважины.

9. Анализ данных

  1. После нормализации по содержанию белка экспортируйте данные из аналитического интерфейса в файлы Excel или Prism для дальнейшего анализа с помощью облачной кнопки в правом верхнем углу графика.
  2. Используя нормализованные данные, вычислите исходные OCR и ECAR как среднее значения исходных измерений, исключая первые три получения, так как сигнал может быть нестабильным при первых измерениях.
  3. Используя нормализованные данные, чтобы определить максимальный OCR и ECAR, рассчитайте средние измерения трёх основных приобретений обработки FCCP.

Результаты

Этот протокол позволяет количественно оценивать OCR и ECAR целых желудочков данио-рерио. Мы подтвердили выживаемость желудочков в условиях ex vivo путём инкубации неповреждённых желудочков дикого типа KCL в анализаторе при отсутствии лекарственного лечения (рисунок 3A). Данные показывают, что желудочки имеют стабильный OCR и ECAR, которые значительно повышены по сравнению с исходными измерениями пустых скважин как минимум на 180 минут (рисунок 3A). Эти данные свидетельствуют о том, что желудочки демонстрируют нормальную дыхательную функцию и выживаемость в условиях ex vivo .

Мы провели несколько измерений OCR с использованием различных концентраций лекарств и составов сред, чтобы определить оптимальную дозировку для желудочков (рисунок 3B). Мы наблюдали небольшое увеличение изменения складок OCR (FCCP/базального) при использовании комбинаций [олигомицин] 10 мкм, [FCCP] 8 мкм и [ротенона/антимицин] 25 мкм, а также немного большего увеличения [олигомицина] 50 мкм, [FCCP] 30 мкм и [ротенона/антимицина] 45 мкм (рисунок 3B). В результате мы перешли к последним концентрациям для наших экспериментов. Поскольку желудочек представляет собой трёхмерную структуру, возможно, что препараты сильно воздействуют на внешние клетки ткани, не достигая клеток на световой стороне желудочка. Для решения этой проблемы мы провели этап проницаемости, при котором обработали сердца сапонином 0,5% в течение 30 минут перед инкубацией в DMEM (10 мМ галактозы, 1 мМ пирувата, 4 мМ глутамина). Это привело к устойчивому снижению OCR и отсутствию ожидаемого увеличения OCR после инъекции FCCP (рисунок 3C), что свидетельствует о метаболической неэффективности сердца. В результате мы не проникали желудочки для наших экспериментов.

Кроме того, здесь представлены нормализованные следы из нашего оригинальногоэксперимента 8. Используя естественное разнообразие регенеративного потенциала семи штаммов диких данио-рерио, мы выявили, что MDH1ab, цитозольная малатдегидрогеназа 1Ab, оказывает положительное влияние на регенерацию через редифференциацию кардиомиоцитов. Для подтверждения этого результата мы получили трансгенных данио-реришей, гиперэкспрессирующих mdh1ab кардиомиоцитно-специфическим образом (mdh1ab c OE), а также контролировали рыбу, переэкспрессирующую зелёный флуоресцентный белок (GFP cOE). Мы провели криотравмы желудочков, собрали их при 14 dpci и изучили их метаболизм с помощью стресс-теста Мито (рисунок 3D). Лечение олигомицином не изменило значительный эффект OCR, хотя наблюдалось небольшое увеличение ECAR. Введение FCCP в среду привело к ожидаемому увеличению OCR и ECAR, при этом образцы mdh1ab cOE сохранили наивысшую максимальную дыхательную ёмкость (см. рисунок 3D). Наконец, ротенон/антимицин привели к полной остановке метаболизма в обеих группах. В целом этот метод позволил выявить значительные различия в метаболической способности желудочек, сверхэкспрессирующих mdh1ab, а также между семью различными дикими штаммамиданио-рерио. 8.

figure-results-1
Рисунок 1: Метаболизм глюкозы во время стресс-теста Мито. (A) Схематическое представление метаболизма глюкозы. Глюкоза поступает в клетку через транспортеры GLUT и превращается в пируват с помощью гликолиза. Лактатдегидрогеназа (ЛДГ) превращает пируват в лактат, и полученные протоны выделяются из клетки. Пируват превращается в ацетил-КоА и входит в митохондрии и цикл ТКА, чтобы питать цепь переноса электронов в внутренней митохондриальной мембране. Ингибиторы комплексов I, III и V, а также разъединитель FCCP отмечены красным цветом. Электроны, передающиеся через цепь переноса электронов дыхания, обозначаются синими стрелками, которые в конечном итоге приводят к превращению кислорода и протонов в воду. (B) Схема результатов стресс-теста Мито. Базальное дыхание отмечено в мадженте. При введении олигомицина OCR снижается, что позволяет рассчитывать дыхание, связанное с АТФ (зелёный), а также утечку протона (оранжевый). FCCP увеличивает OCR до максимальной дыхательной ёмкости клеток (синий). Инъекции ротенона и антимицина А приводят к прекращению митохондриального дыхания и допускают только немитохондриальное дыхание (серый режим). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

figure-results-2
Рисунок 2: Компоновка сенсорного картриджа и микропластин захвата островков. (A) Изображение комплекса крышки-сенсора, картриджа-гидроусилителя-утилитарных пластин (сверху) и инвертированного сенсорного картриджа (снизу). Чешуйка: 1 см. (B) Изображение микропластины для захвата островка, загруженной желудочками данио-рерио. Красные круги обозначают пустые ямы без желудочков и служат фоновым коррекцией во время анализа. Масштаб: 1 см. (C) Схематическое изображение расположения портов в сенсорном картридже XFe24. Порт A содержит олигомицин, B — FCCP, а C — смесь ротенона и антимицина. Порт D можно оставить пустым или добавить дополнительный препарат. S обозначает сенсорный порт, который не должен содержать жидкость, чтобы не повредить анализатор. (D) Репрезентативное изображение желудочка данио-рериша на дне колодца, окружённого сеткой (слева) и без сетки (справа). Шкаля: 5 мм. (E) Схематическое сечение микропластины захвата островка, содержащая желудочек, сетку (жёлтый) и картридж сенсора (зелёный). P обозначает порты, а S — датчик. Волнистая линия символизирует медиум. (F) Инструмент для вставки экрана островка. Scalebar: 1 см. (G) Иконка вкладки нормализации на интерфейсе аналитики. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

figure-results-3
Рисунок 3: Репрезентативные OCR и ECAR измерения желудочков данио-рерио. (A) Репрезентативные следы OCR и ECAR неповреждённых желудочков дикой данио-религии (штамм KCL), которые не были обработаны ингибиторами, использованными в анализе (n = 2, красная линия). Следы, полученные от пустых скважин, не содержащих биологического материала, представлены серым цветом (n = 4); OCR, двусторонние повторяющиеся измерения ANOVA, временной коэффициент P = 0,0200, время × взаимодействие скважины P = 0,0196, коэффициент скважины P < 0,0001, фактор группы P < 0,0001; Двусторонние повторяющиеся меры ECAR ANOVA, временной фактор P = 0,1323, время × взаимодействие скважины P = 0,0216, коэффициент скважины P = 0,0009, групповой фактор P<0,0001; данные представлены как среднее ± изменение OCR (B) по различным концентрациям и используемым средам. Односторонний ANOVA (P = 0,0032) с тестом множественных сравнений Тьюки. [O] 5 мкм, [F] 4 мкм, [RA] 2 мкм, n = 6; [O] 10 мкм, [F] 8 мкм, [RA] 25 мкм, n = 8; [O] 25 мкм, [F] 16 мкм, [RA] 45 мкм, n = 8; [O] 50 мкм, [F] 30 мкм, [RA] 45 мкм, n = 8; [O] 100 мкм, [F] 60 мкм, [RA] 90 мкм, n = 8. O, олигомицин; F, FCCP; РА, ротенон/антимицин. (C) следы сапонинопроницаемых желудочков (красные, n = 4) по сравнению с необработанными желудочками (серый, n = 4); двусторонние повторяющиеся измерения ANOVA, временной коэффициент P < 0,0001, время × взаимодействие образца P < 0,0001, фактор лечения P < 0,0001, фактор выборки P = 0,824; данные представлены как среднее ± SEM.OCR max желудочек, обработанных сапонином, по сравнению с необработанными желудочками; T-тест непарного ученика (P = 0.0850). (D) Репрезентативные следы OCR и ECAR из mdh1ab cOE (красный, n = 8) и GFP cOE (серый, n = 8) 14dpci желудочки. OCR, двусторонние повторяющиеся измерения ANOVA, временной коэффициент P < 0,0001, время × взаимодействие выборки P < 0,0001, генотипный фактор P < 0,0001, фактор выборки P = 0,1098; ECAR, двусторонние повторяющиеся измерения ANOVA временной фактор P < 0,0001, время × взаимодействие выборки P = 0,7507, коэффициент выборки P = 0,2154, генотип P < 0,0001. Данные адаптированы из Lekkos et al., 20258 и представлены в виде среднего ± SEM. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Обсуждение

Здесь мы подробно описываем протокол анализа OCR и ECAR желудочков ex vivo данио-рерио с использованием анализатора Seahorse XFe24 и стресс-теста Mito. Метаболизм кардиомиоцитов играет важную роль в регенерациисердца 21,22,23,24. Однако подтверждение метаболического фенотипа регенерирующего сердца данио-религии оказалось сложным и часто отсутствует впубликациях 6,7. Из-за небольшого размера сердца данио-рерио, такие методы, как ЯМР-спектроскопия или масс-спектрометрия, требуют объединения нескольких желудочков для получения адекватногосигнала 8,12,13. В отличие от этого, описанный здесь метод позволяет получать OCR и ECAR измерения из нескольких отдельных желудочков, тем самым увеличивая статистическую мощность.

Классические методы метаболического профилирования, такие как метаболомика, дают снимок метаболического профиля ткани в момент её сбора. С помощью стресс-теста Mito мы смогли собрать данные в реальном времени в реальном времени о том, как желудочки адаптируются к различным метаболическим проблемам, включая их максимальную дыхательную ёмкость, что не видно при использовании других методов. Для достижения живого фенотипирования желудочков данио-рерио была предпринята перфузия сердцаданио 9,10,11. Для достижения кануляции требуется сложное индивидуальное оборудование и высококвалифицированные техники, оставаясь при этом низкопроизводительным методом. Анализатор предлагает более простую альтернативу с использованием коммерчески доступного оборудования для высокопроизводительного (20 желудочек одновременно) фенотипирования желудочков. Насколько нам известно, не было прямого сравнения метода, описанного в этой статье, с другими методами живой оксиметрии, такими как электрод типа Кларка.

Важно, что описываемый нами метод адаптируется в зависимости от исследовательского вопроса. Ранее этот анализ использовался для характеристики целых эмбрионовданио-рерио. 25,26. В дополнение к описанному здесь стресс-тесту Mito, тест Mito Fuel Flex был оптимизирован для оценки использования метаболического топлива человеческими сердечнымисрезами 27. Кроме того, тест Cell Energy Phenotype был адаптирован для характеристики гликолитической способности регенерирующих сердец Astyanax mexicanus 28. Мы ожидаем, что этот протокол будет использован для других трёхмерных структур, таких как кардиорганоиды, и будет полезен для проверки генетических нарушений метаболических путей в неповреждённых сердцах данио-рерио.

Мы признаём, что у этой техники есть определённые ограничения. Что касается технических задач, после изоляции сердца обрабатывались в DMEM-среде при комнатной температуре и не поддерживали при 28 °C, что является оптимальной температурой дляданио-рерио-19. Понижение температуры воды до 18 °C может существенно повлиять на функцию сердца данио-рерио, 29,30. Однако мы не ожидаем, что краткосрочное воздействие комнатной температуры окажет значительное влияние на физиологию изолированных желудочков, поскольку желудочки быстро возвращаются к анализатору при температуре 28 °C. В наших руках большинство желудочков перестали заметно биться при рассечении предсердия, что указывает на отсутствие стимула кардиостимулятора как на этиологию несокращения. Кроме того, в период изоляции среда не была насыщена кислородом, что может привести к лёгкой гипоксии, которая восстанавливается до нормального уровня кислорода после смешивания в анализаторе перед первым измерением.

Дополнительный практический аспект температуры сердец связан с выключением нагревателя в анализаторе, что приводит к снижению температуры с 37 °C до 28–29 °C. Анализатор не позволяет снизить мощность нагревателя до желаемой температуры. Тем не менее, при работе анализатора температура внутри лотка на 6–7 °C выше комнатной. Этот температурный диапазон совпадает с оптимальной температурой содержанияданио-рерио 19.

Этот анализ проводится на крупных желудочках данио-рерио. Следовательно, невозможно отличить вклад отдельных типов клеток в изменения, наблюдаемые в OCR и ECAR. Это может оказаться важным при изучении метаболических частот в ранние регенеративные периоды, когда высокий приток иммунныхклеток 31 может скрывать изменения OCR кардиомиоцитов. Кроме того, остаточная кровь, оставшаяся в просвете желудочка, может влиять на метаболические показатели. Позволяя сердцам кровоточить в присутствиигепарина-7 , это может дополнительно снизить влияние свертываемости кровяных клеток в сердце. Кроме того, чтобы усилить диффузию ингибиторов, используемых во внутренние клетки желудочка, мы попробовали этап проницаемости с использованием сапонина. Проницаемость сапонина приводила к устойчивому снижению OCR на протяжении всего анализа, что приводило желудочки к дыхательной недостаточности. Эти ограничения можно было избежать с помощью выделения, культуры и анализа изолированных кардиомиоцитов, хотя такой подход требует длительного поселенияклеток 32 , что может быть неоптимальным для регенеративных условий.

Повреждённая ткань может влиять на используемый метод нормализации. В этом исследовании мы нормализуем OCR по мкг белка/мл с помощью анализа BCA. Хотя анализ BCA не реагирует сильно с белками коллагена из-за их состава, богатого гидроксипролином и пролином, которые плохо обнаруживаются с помощью копера, наличие других компонентов раны, свободных от клеток, может влиять на нормализацию. В будущих исследованиях можно рассматривать использование полнойДНК-33 как точного отражения живых клеток в желудочке.

Кроме того, нам не удалось воспроизвести ожидаемое снижение OCR, вызванное ингибитором комплексаV15, зависящим от олигомицина. Хотя некоторые исследования показывают снижение OCR при лечении олигомицином изолированныхкардиомиоцитов 32,34,35, данные здесь напоминают отсутствие ответа, описанного в недавнем исследовании изолированных кардиомиоцитов взрослых мышей 36. Поскольку используемая нами концентрация олигомицина значительно выше, чем описанная в вышеупомянутых исследованиях, неясно, повлияло ли повышение конечной концентрации до более 50 мкм.

Наконец, хотя потребление кислорода в основном зависит от дыхания, внеклеточное закисление обусловлено не исключительно лактатом, образующимся гликолизом, но и превращением углекислого газа в угольную кислоту. Сообщалось, что в глюкозосодержащих миобластах треть внеклеточного закисления происходит из-за углекислого газа в исходныхусловиях 37. Поэтому мы рекомендуем проявлять осторожность при интерпретации измерений ECAR, полученных анализатором Seahorse, если коррекция доли дыхательной кислотности небыла проведена 38.

Раскрытие информации

Авторы не заявляют о конфликте интересов.

Благодарности

Мы благодарны Нику Хау (Agilent Technologies) и Томасу Николу (Оксфордский университет) за их поддержку и критическое обсуждение при разработке этого метода. Мы хотели бы выразить признательность персоналу нашего ветеринарного центра уровня 1 (Университет Оксфорда, отдел биомедицинских услуг) и Института развивающей и регенеративной медицины (Оксфордский университет) за содержание и перенос данио-религии. Эта работа была поддержана Медицинским исследовательским советом (MR/W006731/1 к KL), Специализированной больницей и исследовательским центром короля Фейсала (постдокторская стипендия RA), Фондом стратегической поддержки Wellcome (204826/Z/16/Z для JSOM), Британским фондом сердца IBSRF (FS//17/58/33072 до LCH), Европейским исследовательским советом (ERC) в рамках программы исследований и инноваций Европейского союза Horizon 2020 (715895, CAVEHEART, ERC-2016-STG до MTMM), гранты проекта Британского фонда сердца (PG/15/111/31939 и PG/23/11189 до MTMM), MTMM признает поддержку от Центра исследований BHF Оксфордского университета, Оксфордского университета (RE/24/130024) и Центра регенеративной медицины BHF (RM/13/3/30159).

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
1,5 мл трубок Эппендорфа СтарлабS1615-5550
96-колодцевая пластина ThermoFisherAB-0800
Антимицин АChemCruz sc-202467A
Среда DMEMAgilent1035755-100
DMSOSigma-Aldrich D2650-100mL
Сухой лёд 
ЭтанолSupelco1.00983.2500
Набор для анализа внеклеточного потока;Agilent103518-100В упаковке входят утилитарные пластины, гидроусилитель, сенсорный картридж, крышка (в комплекте с островочными пластинами)
FCCPSigma-Aldrich C2920
ГлюкозаAgilent103577-100
ГлутаминAgilent103579-100
Инкубатор
Микропластина захвата островковAgilent101122-100В наборе входит 25 сеток
Инструмент для захвата экрана островковAgilent101135-100
Микродиссекционные щипцыideal-tek3131760Размер 5-S (потребуется 2x, чтобы изолировать желудочек от бульбусного артериоса и предсердия)
Микродиссекционные ножницыFST15009-08
MS-222Sigma-Aldrich E10521
ОлигомицинMP 151786
Гомогенизатор Пестика Mottor VWR431-0100
ПестлыVWR431-0094
Чашка Петри 35 ммGreiner Bio-One627102
Чашка Петри 92ммШтарштедт82.1473
Пирс BCA Assay KitThermo Scientific23227
Мини-таблетки с ингибиторами протеазы Пирса и фосфатазы, без ЭДТАThermo ScientificA32961
ПируватAgilent103578-100
Буфер лизиса RIPAСанта-КрусSC-364162
РотенонеMP 02150154-CF
Интерфаза Seahorse Analytics AgilentAgilenthttps://www.agilent.com/en/product/cell-analysis/real-time-cell-metabolic-analysis/xf-software/agilent-seahorse-analytics-787485
Анализатор Seahorse XFe24Agilenthttps://www.agilent.com/en/product/cell-analysis/real-time-cell-metabolic-analysis/xf-analyzers/seahorse-xfe24-analyzer-740878
ГерметикThermo ScientificAB-0558
SPECTROstar NanoMG LABTECH GmbH601-0298
ГубкаСделайте разрез достаточно длинный и глубокий, чтобы рыба подошла с вентральной стороны вверх
Wave (версия 2.6.1.56)Agilenthttps://www.agilent.com/en/products/cell-analysis/software-download-for-wave-desktop
XF calibrant Agilent100840-000

Ссылки

  1. Poss, K. D., Wilson, L. G., Keating, M. T. Heart regeneration in zebrafish. Science (1979). 298 (5601), 2188-2190 (2002).
  2. Jopling, C., et al. Zebrafish heart regeneration occurs by cardiomyocyte dedifferentiation and proliferation. Nature. 464 (7288), 606-609 (2010).
  3. Kikuchi, K., et al. Primary contribution to zebrafish heart regeneration by gata4+ cardiomyocytes. Nature. 464 (7288), 601-605 (2010).
  4. Bertozzi, A., et al. Is zebrafish heart regeneration "complete"? Lineage-restricted cardiomyocytes proliferate to pre-injury numbers but some fail to differentiate in fibrotic hearts. Dev Biol. 471, 106-118 (2021).
  5. Nguyen, P. D., et al. Interplay between calcium and sarcomeres directs cardiomyocyte maturation during regeneration. Science (1979). 380 (6646), 758-764 (2023).
  6. Fukuda, R., et al. Stimulation of glycolysis promotes cardiomyocyte proliferation after injury in adult zebrafish. EMBO Rep. 21 (8), e49752(2020).
  7. Honkoop, H., et al. Single-cell analysis uncovers that metabolic reprogramming by ErbB2 signaling is essential for cardiomyocyte proliferation in the regenerating heart. Elife. 8, e50163(2019).
  8. Lekkos, K., et al. Oxidative phosphorylation is required for cardiomyocyte redifferentiation and long-term fish heart regeneration. Nat Cardiovasc Res. 4 (10), 1363-1380 (2025).
  9. Zhang, H., et al. A Langendorff-like system to quantify cardiac pump function in adult zebrafish. Dis Model Mech. 11 (9), dmm034819(2018).
  10. Zhang, P. C., Llach, A., Sheng, X. Y., Hove-Madsen, L., Tibbits, G. F. Calcium handling in zebrafish ventricular myocytes. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 300, 56-66 (2011).
  11. Lin, E., et al. Construction and use of a zebrafish heart voltage and calcium optical mapping system, with integrated electrocardiogram and programmable electrical stimulation. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 308, R755-R768 (2015).
  12. Miklas, J. W., et al. Amino acid primed mTOR activity is essential for heart regeneration. iScience. 25 (1), 103574(2022).
  13. García-Poyatos, C., et al. Cox7a1 controls skeletal muscle physiology and heart regeneration through complex IV dimerization. Dev Cell. 59 (14), 1824-1841.e10 (2024).
  14. How Agilent Seahorse XF Analyzers Work. , Agilent. https://www.agilent.com/en/products/cell-analysis/how-seahorse -xf-analyzers-work?srsltid=AfmBOopkIZodH4uZO 5puXTOp1U5gdkky661L6TKluz5XgBWGqujHEzww (2026).
  15. Yoo, I., Ahn, I., Lee, J., Lee, N. Extracellular flux assay (Seahorse assay): Diverse applications in metabolic research across biological disciplines. Mol Cells. 47 (8), 100095(2024).
  16. Chablais, F., Jaźwińska, A. Induction of myocardial infarction in adult zebrafish using cryoinjury. J Vis Exp. (62), e3666(2012).
  17. González-Rosa, J. M., Mercader, N. Cryoinjury as a myocardial infarction model for the study of cardiac regeneration in the zebrafish. Nat Protoc. 7 (4), 782-788 (2012).
  18. Schnabel, K., Wu, C. C., Kurth, T., Weidinger, G. Regeneration of cryoinjury induced necrotic heart lesions in zebrafish is associated with epicardial activation and cardiomyocyte proliferation. PLoS One. 6 (4), e18503(2011).
  19. Aleström, P., et al. Zebrafish: Housing and husbandry recommendations. Lab Anim. 54 (3), 213-224 (2019).
  20. Singleman, C., Holtzman, N. G. Heart dissection in larval, juvenile and adult zebrafish, Danio rerio. J Vis Exp. (55), e3165(2011).
  21. Duan, X., Liu, X., Zhan, Z. Metabolic regulation of cardiac regeneration. Front Cardiovasc Med. 9, 933060(2022).
  22. Yu, F., Cong, S., Yap, E. P., Hausenloy, D. J., Ramachandra, C. J. Unravelling the interplay between cardiac metabolism and heart regeneration. Int J Mol Sci. 24 (12), 10300(2023).
  23. Cook, M., Lal, S., Hume, R. D. Transcriptional, proteomic and metabolic drivers of cardiac regeneration. Heart. 111 (18), 851-858 (2025).
  24. Chen, X., et al. Metabolic reprogramming: A byproduct or a driver of cardiomyocyte proliferation. Circulation. 149 (20), 1598-1610 (2024).
  25. Bond, S. T., McEwen, K. A., Yoganantharajah, P., Gibert, Y. Live metabolic profile analysis of zebrafish embryos using a seahorse XF 24 extracellular flux analyzer. Methods Mol Biol. 1797, 393-401 (2018).
  26. Gibert, Y., McGee, S. L., Ward, A. C. Metabolic profile analysis of zebrafish embryos. J Vis Exp. (71), e4300(2013).
  27. Trampel, K. A., et al. Seahorse metabolic analysis for human and mouse cardiac organotypic slices. bioRxiv. , (2025).
  28. Ruggiero, G., et al. A balanced circadian glycolytic rhythm drives cardiomyocyte cell cycle progression during fish heart regeneration. bioRxiv. , (2025).
  29. Lee, L., et al. Functional assessment of cardiac responses of adult zebrafish (Danio rerio) to acute and chronic temperature change using high-resolution echocardiography. PLoS One. 11 (1), e0145163(2016).
  30. Shaftoe, J. B., Geddes-McAlister, J., Gillis, T. E. Integrated cellular response of the zebrafish (Danio rerio) heart to temperature change. J Exp Biol. 227 (20), jeb247522(2024).
  31. Ryan, R., Moyse, B. R., Richardson, R. J. Zebrafish cardiac regeneration—looking beyond cardiomyocytes to a complex microenvironment. Histochem Cell Biol. 154 (5), 533-548 (2020).
  32. Angelini, A., Pi, X., Xie, L. Evaluation of long-chain fatty acid respiration in neonatal mouse cardiomyocytes using SeaHorse instrument. STAR Protoc. 3 (2), 101392(2022).
  33. Ludikhuize, M. C., Meerlo, M., Burgering, B. M. T., Rodríguez Colman, M. J. Protocol to profile the bioenergetics of organoids using Seahorse. STAR Protoc. 2 (1), 100386(2021).
  34. Neary, M. T., et al. Hypoxia signaling controls postnatal changes in cardiac mitochondrial morphology and function. J Mol Cell Cardiol. 74 (100), 340-352 (2014).
  35. Cheng, Y. Y., et al. Metabolic changes associated with cardiomyocyte dedifferentiation enable adult mammalian cardiac regeneration. Circulation. 146 (25), 1950-1967 (2022).
  36. Li, X., et al. Inhibition of fatty acid oxidation enables heart regeneration in adult mice. Nature. 622 (7983), 619-626 (2023).
  37. Mookerjee, S. A., Goncalves, R. L. S., Gerencser, A. A., Nicholls, D. G., Brand, M. D. The contributions of respiration and glycolysis to extracellular acid production. Biochim Biophys Acta. 1847 (2), 171-181 (2015).
  38. Mookerjee, S. A., Brand, M. D. Measurement and analysis of extracellular acid production to determine glycolytic rate. J Vis Exp. (106), e53464(2015).

Перепечатки и разрешения

Теги

Seahorse
Оценка метаболической активности целых регенерирующих желудочков данио-религии ex vivo с помощью внеклеточного анализа потока
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.