Использование растворённой ЯМР для характеристики биомолекулярных конденсатов в бифазных условиях

Краткое содержание

Здесь мы представляем протоколы для ЯМР-методологий, REstricted DIFfusion INvisible speciE (REDIFINE) и CONdensate DEtectioN с помощью SEmi-твёрдого магнитоносного переноса (CONDENSE-MT), которые позволяют без маркировки количественно характеризуть биомолекулярные конденсаты в бифазных условиях, раскрывая молекулярное распределение, динамику обмена, гидратацию конденсата и структуру капель без осадкения или маркировки.

Аннотация

Биомолекулярные конденсаты, образованные в результате разделения жидкой и жидкой фазы (LLPS), организуют внутриклеточную среду и регулируют различные биохимические процессы. Несмотря на их важность, исследование состава конденсата, динамики обмена и внутренней организации остаётся сложным, особенно без внешних меток. Спектроскопия ядерного магнитного резонанса (ЯМР) может предоставить уникальное окно без меток в эти мезомасштабные сборки, фиксируя как молекулярное движение, так и гетерогенность окружающей среды. Две взаимодополняющие ЯМР-методологии позволяют всесторонне охарактеризовать конденсаты непосредственно в их бифазном состоянии. Для конденсатов, достаточно динамичных, чтобы их можно было наблюдать с помощью ЯМР, метод диффузионного обмена — REstricted DIffusion of INvisible speciE, сокращённо REDIFINE, использует контраст диффузии с химическим обменом для количественной оценки доли молекул, разделённых между конденсированной и разбавленной фазами, определения размера капель и проницаемости интерфейса, а также извлечения молекулярных обменных курсов через фазовую границу. Для более жёстких конденсатов, невидимых по ЯМР, метод полутвердой намагниченности-переноса с обнаружением воды, CONdensate DEtectioN с помощью переноса намагниченности SEmi, или сокращённо CONDENSE-MT, использует релаксационный контраст и обмен протонами между конденсированными биомолекулами и растворителем разбавленной фазы для мониторинга конденсатов на протонах воды, обеспечивая доступ к относительному распределению, скоростям переворачивания молекул, динамике гидратации и содержанию связанной воды. Вместе эти подходы предоставляют многомерный, количественный взгляд на структуру и динамику конденсата в почти естественных бифазных условиях без флуоресцентных или детектирующих меток. Их интеграция расширяет набор ЯМР-инструментов для изучения биомолекулярного фазового разделения и закладывает основу для связи физико-химических свойств конденсата с их биологической функцией и патологическими нарушениями.

Введение

Клетки достигают своей исключительной пространственной и временной организации, разделяя биохимические^{реакции 1,2,3}. Помимо мембранно-связанных органелл, многие важнейшие клеточные процессы происходят в безмембранных компартментах, образованных в результате жидко-жидкого фазового разделения (LLPS) белков и^{нуклеиновых кислот 4}. Эти динамические сборки, часто называемые биомолекулярными конденсатами, включают ядро, гранулы стресса, ядерные пятнышки и обрабатывающие тела, которые играют важную роль, например, в метаболизме РНК, регуляции транскрипции или передаче^{сигналов 5,6}. Их способность образовать, растворять и обмениваться компонентами в ответ на сигналы окружающей среды обеспечивает клеткам универсальный механизм организации биохимической активности без зависимости от липидных мембран.

Большая часть биомолекулярных конденсатов образуется из белков, связывающих РНК (РБП), которые содержат внутренне неупорядоченные области (ИДР) и домены, связывающие РНК (РНК)^7,8. Эти белки могут разделяться по фазам как по отдельности, так и в комплексе с РНК, что приводит к образованию конденсатов с различными материальными свойствами и биологическими функциями. Например, нуклеокапсидный белок SARS-CoV-2 (N) образует РНК-зависимые биомолекулярные^{конденсаты 9}, участвующие в упаковке и сборке вирусного генома, в то время как белок полипиримидинового связывающего тракт 1 (PTBP1) образует ядерные конденсаты, способствующие заглушанию^{генов 10}. Кроме того, белки, такие как FUS и DDX4, подвергаются LLP, обусловленным их неупорядочёнными участками, влияя на метаболизм РНК и формирование стрессовых^{гранул 11,12}. Дисрегуляция этих процессов связана с нейродегенеративными заболеваниями, такими как боковой амиотрофический склероз (БАС) и фронтотемпоральная деменция, где аномрантные фазовые переходы могут привести к агрегации и потере функции¹³.

Конденсация не ограничивается белками и комплексами белок–РНК. Одна только РНК может подвергаться LLP, особенно в контексте повторных последовательностей расширения, связанных с несколькими нейродегенеративными^{заболеваниями 14,15}. Тринуклеотидные и гексануклеотидные повторные расширения, такие как CAG при болезни Хантингтона или CUG при миотонической дистрофии, могут образовывать капельнообразные конденсаты как in vitro, так и в^{клетках 14}. Понимание физических основ конденсации РНК, а также её отличия от конденсатов, управляемых белками и белками и РНК, имеет решающее значение для разъяснения молекулярных механизмов, лежащих в основе заболеваний повторного расширения.

Несмотря на биологическую значимость, количественная и безметочная характеристика биомолекулярных конденсатов остаётся серьёзной^{задачей 16}. Традиционные методы флуоресцентной микроскопии и спектроскопии опираются на внешние метки, которые могут нарушать структуру, динамику или фазовое поведение^{биомолекулы 17,18}. Кроме того, некоторые конденсаты невидимы по ЯМР из-за ограниченного молекулярного движения и широких линий, что ограничивает информацию, доступную традиционными методами ЯМР. Следовательно, существует острая необходимость в экспериментальных стратегиях, которые могли бы исследовать конденсаты непосредственно в их бифазном, родном состоянии, без маркировки. Учитывая важную роль границы фазы капель в процессах обмена и созревании конденсата, не менее важно стабилизировать биомолекулярные капли в данном объёме образца, тем самым предотвращая оседание плотной фазы. Это легко достигается с помощью гидрогелей агарозы, имитирующих цитоскелеты.

Недавние разработки в методологиях на основе ЯМР предоставляют такое решение. Подход REDIFINE (REstricted DIffusion of INvisible speciE)¹⁹ сочетает диффузионную ЯМР с химическим обменным анализом для количественной оценки молекулярного распределения, кинетики обмена и размера капель в белковых и белок-РНК-конденсатах. Дополнительно, метод CONDENSE-MT (CONdensate DEtectioN by SEmi-твёрдый магнитный перенос)²⁰ обнаруживает ЯМР-невидимые конденсаты посредством переноса водяной намагниченности, позволяя количественно оценивать количество конденсированного вещества при заданных условиях и дополнительно раскрывая динамику гидратации и молекулярные скорости переворачивания внутри конденсата. Вместе эти методы позволяют проводить неинвазивные исследования различных типов конденсатов, только белковых, белок-РНК и только РНК конденсатов при равновесных бифазных условиях. Расширяя набор инструментов ЯМР, они открывают дверь к систематическому количественному исследованию структуры конденсата, динамики и их связи с биологической функцией и заболеваниями.

Протокол

1. Подготовка образца

1. Выбор буфера: используйте проверенные буферы, в которых биомолекулы наиболее стабильны.
   ПРИМЕЧАНИЕ: ЯМР-сигналы обычно сильнее при более низком pH. В качестве технического требования добавьте 5% D_2Oв качестве полевой блокировки ко всем ЯМР-образцам (финальная v/v).
2. Стабилизировать бифазный образец с использованием агарозного гидрогеля, имитирующего цитоскелет, в качестве среды. Взвесьте агарозный порошок, чтобы приготовить бульон агарозы 1,5% (с в/в) в том же буфере. Используйте обычную агарозу как более дешёвую альтернативу биомолекулярным конденсатам, образованным внутренне неупорядочёнными белками (IDP) и РНК, способными выдерживать более высокие температуры. Используйте агарозу с низким уровнем плавления при приготовлении деликатных конденсатов с белками, содержащими сложенные^{домены 19}.
3. Приготовление агарозного бульона: нагрейте суспензию примерно до 80 °C в течение 10 минут и полностью растворите агарозу путём смешивания или вихря.
   ВНИМАНИЕ: Расплавленная агароза горячая и может гореть; Держать их в термостойких перчатках.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Храните расплавленную агарозу в тепле (например, 55 °C для обычной агарозы и 37 °C для агарозы с низким уровнем таяния) в водяной бане, чтобы она оставалась жидкой перед смешиванием с биологическим образцом.
   Расплавленную агарозу можно поддерживать в тепле несколько десятков минут^19,21.
4. Подготовьте финальный бифазный образец:
   1. Для подготовки бифазного образца, стабилизированного агарозным гидрогелем, смешивают белковые (и/или РНК) запасы с соответствующим тёплым агарозным буфером в микроцентрифуге объёмом 1,5 мл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Конечная концентрация белка/РНК обычно составляет 50-500 мкм, чтобы быть подходящим для обнаружения ЯМР.
   2. Немедленно переведите смесь в 3-мм ЯМР-трубку с помощью длинной стеклянной пипетки. Дайте агарозе затвердеть вскоре после переноса.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Без агарозы двуфазные образцы со временем осадки затрудняют сбор и анализ ЯМР-данных, поскольку образец физически меняется в рамках эксперимента.
5. Проведите визуальный осмотр: Осмотрите образец визуально. Если происходит фазовое разделение, образец сразу становится мутным и остаётся таким. Это указывает на успешную стабилизацию бифазного образца в агарозе.
6. При планировании запуска CONDENSE-MT подготовьте дополнительный эталонный образец агарозы, выполняя те же шаги, просто не добавляя биомолекулы. Вместо этого добавьте буфер, чтобы получить тот же объём сэмпла. Подготовьте этот образец только после подготовки образца конденсата и измерения всех данных, чтобы гарантировать, что эталонный образец агарозы не инкубируется дольше.

2. Запись экспериментов с REDIFINE

1. Зафиксируйте, подведите, подбирайте и настройте 1H-канал как обычно. Калибруйте длину импульса под углом 90° на ¹H с помощью вашей общей процедуры.
2. Запишите 1D-спектр, подавленный водой. В идеале наблюдается сильный биомолекулярный сигнал (дополнительный рисунок 1A).
   1. Если сигнал отсутствует или наблюдается очень мало, предположим, что сконденсированный белок/РНК не наблюдаем по ЯМР, и что распределение в конденсированную фазу высокое. В этом случае не переходите к REDIFINE, так как эта методология опирается на наблюдаемый биомолекулярный сигнал.
   2. В этой ситуации, в принципе, эксперименты CONDENSE-MT должны работать очень хорошо, поэтому сразу перейдите к шагу 4 (Запись экспериментов CONDENSE-MT).
3. Загрузите традиционный эксперимент по диффузионно-упорядоченной спектроскопии (DOSY), который основан на традиционной двумерной процедуре 2D Stimulated-Echo с использованием биполярных градиентов (последовательность импульсов Брукера: stebpgp1s19). Обратитесь к руководствам пользователя Bruker DOSY и Diffusion для получения дополнительной информации.
4. Установите P0, P1 и P27 на калиброванную длину импульса 90°. В качестве основного правила NS — 32 сканирования, DS — 16, TD1 — 16, а TD2 и SW2 отрегулируют время приобретения AQ 80-100 мс. Установите d1 на 1,5 с.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Градиенты должны быть правильно откалиброваны.
5. Оптимизируйте задержку Watergate d19 как обычно в зависимости от вашего магнитного поля, чтобы получить максимальное возбуждение в ароматических (около 7 ppm) или алифатических (около 1 ppm). Установите d20 на 75 мс. Выбор p30 зависит от размера белка/РНК. Для белков >20 кДа используйте 5 мс; Для мелких белков используйте правило 3,5 мс.
6. Запишите эксперимент DOSY с помощью команды: 'xau dosy 2 95 16 l y y', которая распределяет силу градиента диффузии от 2 до 95 % за 16 шагов линейно.
   1. В идеале следует наблюдать начальное затухание сигнала, исходящего из разбавленной фазы, в то время как затухание конденсированного фазового сигнала должно выравниваться (рисунок 1A и дополнительный рисунок 1B).
7. Чтобы продолжить сбор данных для полного набора REDIFINE, создайте 9 новых stebpgp1s19, скопировав параметры из исходного, который вы только что запустили. В каждом последующем эксперименте изменяйте задержку диффузии d20 в переменных шагах, чтобы охватить диапазон от 100 до 1000 мс (то есть 100, 150, 200, 250, 300, 400, 500, 700, 1000 мс).
8. Запускайте каждый из этих экспериментов командой 'xau dosy 2 95 16 l y n'. Последняя «n» гарантирует, что усиление приёмника сохраняется на протяжении всех 10 экспериментов.

3. Обработка наборов данных REDIFINE и визуализация результатов

1. Обрабатывайте каждый эксперимент (всего 10) следующим образом:
   1. Установить qsine SSB 2 как оконную функцию, извлечь^5-й срез с помощью qsin; fp, фазировать 1D и сохранить параметры фазирования в 2D-набор данных.
   2. Затем обработайте 2D с помощью xf2, выполните коррекцию базовой линии abs2 и извлеките эти 16 срезов с помощью split2D (дальнейшие входы в всплывающем окне: r – 16 – 11). Это позволит извлечь 16 спектров, полученных с помощью разных градиентных напряжённостей, и сохранить их в 1D-обработанных экспериментах с 11 по 26 в одном наборе данных.
   3. Повторите то же самое для оставшихся 9 экспериментов. Иногда крайне важно проверить хотя бы первые 4-5 срезов, чтобы убедиться, что фазирование и коррекция базовой линии правильны. При необходимости корректируйте их вручную — хорошая фазировка и исходная линия являются необходимыми условиями для правильной количественной оценки (рисунок 1B).
2. Используйте предоставленный код Matlab LLPS_REDIFINE_fit для анализа (дополнительный рисунок 2A). В коде корректируйте в зависимости от экспериментов следующее: 'Delta' (диффузия умножена на d20), 'P.d' (общая длительность градиента 2*p30), exp(1,:) до exp(10,:) в зависимости от # проведённых экспериментов. Затем настройте P.G в соответствии с силой градиента зонда (доступно в папке экспериментов TopSpin в файле «difflist»).
3. Регулируйте «папку» и «путь» в зависимости от вашего местоположения данных. Запускай код до 40-й строки. Это даст вам 1D-срез — отсюда выберите области интеграции; Они должны включать ароматические или алифатические вещества и выбирать область максимально узкой, не учитывая различные молекулярные группы, такие как амиды.
4. Введите границы интегрирования в точки переменных «лево» и «право» соответственно (дополнительный рисунок 2A). Это делается для интеграции данных для количественного анализа (рисунок 1C). Выберите название матрицы исходя из вашей выборки, даты запуска и некоторых экспериментальных особенностей.
5. Запусти весь код. В 'fit0' можно выбрать начальные параметры, которые функция оптимизации будет использовать для начала минимизации. Начните с значений по умолчанию, а если сходимость не достигнута, измените второе значение fit0 (популяция в конденсированной фазе) шагами 0.1 с 0.1 до 1.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Иногда набор данных имеет несколько локальных минимумов, и для начала сходимости к более глобальному минимуму необходимо значительно изменять начальные параметры.
6. Когда достигается удовлетворительная подгонка, значения пригонки записываются внутри рисунка (рисунок 1D и дополнительный рисунок 2B) и доступны в переменной 'fiting'. Далее постройте эти параметры как статистический график для лучшей визуализации.

4. Запись экспериментов CONDENSE-MT

ПРИМЕЧАНИЕ: Цель эксперимента — косвенно обнаружить конденсаты по их наблюдению за водным сигналом растворителя с помощью протонного^{обмена 20}. В эксперименте CONDENSE-MT получается и анализируется профиль отпечатков пальцев (рисунок 2A⁾²⁰.

1. Запишите свой любимый 1D-спектр, подавленный водой. Если сигнал наблюдается очень мало, весьма вероятно, что эксперимент CONDENSE-MT будет работать очень хорошо.
2. Количественный анализ CONDENSE-MT требует предварительного определения скорости воды R1. Определите скорость R₁ с помощью восстановления инверсии T₁ . Скопируйте предоставленную последовательность импульсов, набор параметров Bruker и список vd в соответствующие папки. Загрузите параметры «T1_inversion_recovery» и настройте мощности и частоты для вашего ЯМР-спектрометра (согласно «edprosol»).
   1. Откалибруйте импульс 1H 90° (p1), установите NS на 2, DS на 0, d1 на 20 с, SW на 10 ppm, TD2 на 16k, а TD1 на 24 (от длины вашего скорректированного списка vd). Включить слабый градиент вдоль Z (GPZ0 = 0,1 %), чтобы избежать эффектов демпфирования радиации.
3. Для эксперимента CONDENSE-MT,
   1. Скопируйте предоставленный набор параметров Bruker, последовательность и список частот в папки, специфичные для Bruker, загрузите набор параметров "CONDENSE-MT" и настройте частоты и мощности в зависимости от вашего спектрометра.
   2. Установите P1 на калиброванную длину импульса 90° и P4 на 1 мкс для импульса возбуждения, чтобы избежать демпфирования радиации. Установите NS на 2, DS на 16, d1 на 4 с, SW2 на 20 ppm, TD2 на 8k, TD1 на длину списка частот (обычно 46). Установите SPNAM10 на Squa100.1000, а его длительность — p10 до 5 секунд.
   3. Найдите мощность SP10, чтобы получить облучение 100 Гц (команда 'pulse 100 Hz' рассчитает мощность в ваттах и дБ). Отрегулируйте мощность импульса облучения SP10 соответственно и проведите этот псевдодвухмерный эксперимент с помощью команды 'zg'.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эксперимент будет использовать предоставленный список частот, охватывающий смещения облучения от резонанса с водой до очень дальнего дисзонанса (100000 Гц), чтобы обнаружить водяной сигнал при различных смещениях облучения (рисунок 2B). График водяных интегралов (обеспечивает правильное фазирование спектров; Рисунок 2C) относительно смещения облучения даёт профиль CONDENSE-MT, показанный на рисунке 2A.
4. Создайте 7 новых экспериментов и в каждом последовательном увеличивайте только мощность облучения, чтобы охватить диапазон от 170 Гц до 1000 Гц (то есть 170, 250, 330, 500, 650, 780, 1 000 Гц). В каждом эксперименте используйте команду из предыдущей точки. Для каждой степени насыщения будет получен весь список смещений (рисунок 2D).
   ПРИМЕЧАНИЕ: КОНДЕНСАЦИЯ-МТ требует эталонных данных, полученных на образце только агарозы (среде без биомолекулярных конденсатов). Обеспечьте одинаковый временной интервал между подготовкой образца и сбором данных, а также получите один и тот же набор из 8 экспериментов на эталонной образце агарозы. Это делается для того, чтобы и эталонный образец агарозы, и бифазный образец инкубировали одинаковое время.

5. Обработка наборов данных CONDENSE-MT и визуализация результатов

1. Обрабатывайте каждый эксперимент CONDENSE-MT (всего 8, дополнительный рисунок 3A) следующим образом.
   1. Установить qsine SSB 2 в качестве оконной функции, извлечь^46-й срез с помощью qsin; fp, фазировать пик воды в 1D, сохранить параметры фазирования в 2D-наборе данных, затем обработать 2D с xf2 и извлечь эти 46 срезов с помощью split2D (дальнейшие входы в окне всплывающего окна: r – 46 – 11).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это позволит извлечь 46 1D-спектров, полученных с помощью различных смещений облучения, и сохранить их как 1D-обработанные эксперименты с 11 по 56 в одном наборе данных (дополнительный рисунок 3A, показан для эксперимента CONDENSE-MT с частотой 1000 Гц).
   2. Повторите то же самое для оставшихся 7 экспериментов. Проверьте несколько срезов из каждого эксперимента, чтобы убедиться, что фазирование и исходная линия правильны (рисунок 2C). Если нужно, корректируйте их вручную — хорошая фазировка и исходная линия являются необходимыми условиями для правильной количественной оценки!
2. Повторите те же шаги с данными, полученными с использованием эталонного образца агарозы, и для экспериментов по восстановлению инверсии, извлекая 24-й срез для фазирования и используя split2D (r – 24 – 11).
3. Подгонка полученных данных с использованием предоставленного кода Matlab. Следуйте конкретным инструкциям в сценарии.
4. Сначала проведите фитинговый анализ для эталонного образца агарозы, чтобы получить фоновые параметры при отсутствии конденсатов. Код read_CONDENSE_MT_data сначала считывает обработанные данные ЯМР и интегрирует резонансный сигнал воды в 1D-срезы, генерируемые командой split2D (дополнительный рисунок 3B).
5. Устанавливайте границы интеграции индивидуально; в Matlab будет нанесён эталонный одномерный спектр для оценки границ интеграции (дополнительный рисунок 3C). Код дополнительно нормализует данные и подгонит нормированные интегралы воды в зависимости от смещения и мощности облучения к модели^{CONDENSE-MT 20}. read_CONDENSE_MT_data хранит нормализованные интегралы в переменной integral_water_real_all, которая затем используется для последующего подгонки.
6. Определите скорость релаксации R₁ воды в присутствии агарозы или конденсатов перед подгонкой данных CONDENSE-MT.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Установка эксперимента по восстановлению инверсии воды может быть выполнена в первой части скрипта CONDENSE-MT_full Matlab (или CONDENSE_MT_referenceMTpool скрипта в случае эталонных данных агарозы). Имя файла и путь эксперимента, а также идентификатор эксперимента можно ввести для запуска скрипта Inversion_Recovery Matlab (дополнительный рисунок 4A, раздел 1). При необходимости количество одномерных срезов и границы интеграции могут быть изменены в этом скрипте; последнее зависит от параметров обработки, используемых в TopSpin. В этом разделе будет определена скорость воды R1 и хранение её в переменной P.R1w , которая необходима для последующего подбора данных CONDENSE-MT.
7. Для агарозных данных используйте нормализованные интегралы, простые для подгонки, используя скрипт CONDENSE_MT_referenceMTpool (который вызывает функцию function_1MT .
8. Для количественной оценки конденсата используйте подогнанные параметры агарозы как вход для глобальной подгонки данных, полученных на конденсированном образце (Дополнительный рисунок 4A). Это зафиксирует физические свойства агарозной сетки как постоянные значения к подгонке, что позволит количественно оценить дополнительный эффект конденсата, встроенного в агарозную сетку (рисунок 2E).
9. Квантификация конденсата выполняется с помощью скрипта CONDENSE-MT_full , который вызывает функцию function_2MT Matlab. Начальные параметры для вычислительной оптимизации приведены через fit0 (дополнительный рисунок 4B). Неопределённость параметра подгонки будет вычисляться с помощью матрицы Якобиана, из которой будет выведена матрица дисперсии-ковариации (дополнительный рисунок 4B).
10. Оценить качество подгонки по отклонению подгонки, аналогичному остаточному отклонению прогноза модели по экспериментальным данным. Для дальнейшего контроля качества составьте подгонку вместе с экспериментальными данными (дополнительный рисунок 4C).

Результаты

Протокол LLPS REDIFINE, описанный здесь, был применён к N-терминальному домену FUS (NTD). Фаза FUS NTD легко отделяется в условиях окружающей среды при микромолярных^{концентрациях 19,21}. Этот образец был подготовлен при концентрации 200 мкм в буфере HEPES 30 мМ с содержанием 200 мМ Кл при pH 7,5, с 0,5% обычной агарозы. При фазовом разделении сигналы FUS NTD остаются видимыми в конденсированной фазе (рисунок 1A,B). Это делает его идеальным кандидатом для изучения LLPS REDIFINE. А именно, большинство белков, склонных к LLPS, содержат длинные внутренне неупорядоченные области, которые обычно могут наблюдаться в конденсированной фазе; однако в более структурированных белках это не так.

Подгонка REDIFINE (рисунок 1D и рисунок 3A,B) выявила несколько уникальных параметров для этого образца FUS NTD. В частности, он определял коэффициенты диффузии в разбавленной и конденсированной фазах (D_dil и_{D cond}), популяцию белка в конденсированной фазе (ν_cond), средний размер капли R и межфазную проницаемость p. Размер и проницаемость капель определяют межфазный обменный курс от конденсированной к разбавленной фазе_{k cd}=3p/R, что позволяет получить информацию о динамике^{обмена 19}.

Эти результаты можно визуализировать по-разному (рисунок 3B). Используя паучий график, можно было сравнивать результаты в разных условиях или образцах. С другой стороны, параметры REDIFINE в модели можно нарисовать для наиболее эффективной визуализации. Обратите внимание, что REDIFINE предоставляет все эти результаты без маркировки всего за пару часов, используя только один образец.

Поскольку ЯМР-сигнал FUS NTD остаётся обнаруживаемым в конденсированной фазе (рисунок 3C), CONDENSE-MT, скорее всего, не будет применим из-за отсутствия релаксационного контраста. Мы зафиксировали набор данных CONDENSE-MT по FUS NTD, и действительно, различий в профиле MT между эталонным агарозным и бифазным образцом FUS NTD не наблюдается (рисунок 3C). Это делает методологию CONDENSE-MT неприменимой к данному конкретному образцу FUS NTD.

Однако CONDENSE-MT обеспечивает динамическую характеристику конденсатов РНК с повторным расширением (рисунок 3C,D⁾²⁰. Обратите внимание, что CONDENSE-MT может предоставлять несколько параметров, уникально характеризующих РНК в конденсированной фазе (рисунок 3D), несмотря на то, что его сигнал ненаблюдаем в обычном ЯМР (рисунок 3C). Полученные параметры включают кинетику протонного обмена между конденсатом и накоплённой водой (_{k конденсат, H2O} и k_{H2O, конденсат}), скорость релаксации T₂ для конденсата (T_{2, конденсат}), отражающая степень динамической остановки биомолекул при конденсации, и кажущаяся скорость R₂ в объеме воды (_{R 2, вода}). Этот последний параметр представляет собой линейную комбинацию скорости переворачивания объёмной воды, разбавленной воды и медленно переворачивающейся конденсированной воды. Более высокие значения_R2 указывают на более высокую концентрацию воды в конденсате, что повышает кажущуюся общую скорость воды R₂ ^{до 20} (рисунок 2E и рисунок 3D).

ДОСТУПНОСТЬ ДАННЫХ И КОДА

Исходные данные и коды обработки LLPS REDIFINE доступны в репозитории Zenodo: https://doi.org/10.5281/zenodo.15228787 . Исходные данные и коды обработки CONDENSE-MT были переведены в репозиторий Zenodo https://doi.org/10.5281/zenodo.15789697. Для обработки требуется MATLAB. Они также приведены в этой статье (Дополнительные файлы кодирования).

Рисунок 1: Рабочий процесс REDIFINE. (A) Измерения диффузии дают сложные кривые распада диффузии в конденсированных образцах. Полученный распад содержит деконволютированные параметры, описывающие коэффициенты диффузии видов в конденсированной и разбавленной фазах, их популяции, размер капель и межфазный обменный курс. (B) Для декодирования этих изолированных параметров необходимо записать псевдо-3D-набор данных, изменяя не только силу градиента, но и задержки диффузии. Для количественной оценки крайне важно, чтобы каждый срез из этих измерений был правильно фазирован и скорректирован на исходную линию. (C) После проверки качества измеренных и обработанных данных эти одномерные срезы подаются в код MATLAB для анализа и окончательного построения графиков. (D) Данные затем подгоняются нелинейным решателем программирования. Параметры подгонки и результатов иллюстрируются для бифазного образца FUS NTD. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 2: Рабочий процесс CONDENSE-MT (A) Уникальный профиль CONDENSE-MT, наблюдаемый на резонансе воды, иллюстрирующий расширение за счёт наличия конденсированных биомолекул и воды. (B) Вода наблюдается при каждом смещении облучения. (C) Для количественной оценки крайне важно, чтобы все спектры были правильно фазированы. (D) После получения резонанса воды при различных смещениях облучения эксперимент повторяется при различных мощностях облучения. Это даст набор данных относительного водного сигнала, зависящего как от смещения облучения, так и от мощности облучения (E). Данные затем подгоняются нелинейным решателем программирования. Подгонка и результирующие параметры иллюстрированы для бифазного образца РНК 31xCAG. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 3: Представление результатов REDIFINE и CONDENSE MT. (A) Представление параметров REDIFINE в виде паучьего графика для сравнительного анализа по образцам или условиям. (B) Схематическая модель, иллюстрирующая параметры, полученные из REDIFINE, включая коэффициенты диффузии, радиус капель, разбиение и межфазный обменный курс. (C) Сравнение профилей CONDENSE-MT, полученных для эталонного агарозного и бифазного FUS NTD в агарозе при облучении 500 Гц.
(D) Анализ CONDENSE-MT конденсатов РНК с повторным расширением 31xCAG, показывающий экстракцию параметров и визуализацию эффектов намагниченности, связанных с конденсатом. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Дополнительный рисунок 1: Настройка REDIFINE. (A) Домен FUS N-конца остаётся наблюдаемым при приготовлении бифазного конденсированного образца. Наблюдается сильный амид/амино- и ароматический протонный сигнал. (B) Затухание сигнала, наблюдаемое в диффузионном эксперименте DOSY, иллюстрирует более быстрый распад популяции белков в разбавленной фазе и более медленный распад белка в конденсированной. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительный рисунок 2: обработка REDIFINE. (A) Код Matlab, используемый для подгонки REDIFINE, с выделенными параметрами, где требуется конкретный вход. Вставка иллюстрирует, как выбирается область интеграции. (B) Минимизация функции подгонки и последующие результаты. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительный рисунок 3: Настройка CONDENSE-MT . (A) Обзор ЯМР-экспериментов, необходимых для анализа CONDENSE-MT, включая эксперимент по инверсии воды и восстановлению воды (expno. 5) и эксперименты CONDENSE-MT с разными мощностями облучения (expno 11-18). (B), (C) Обзор скрипта Matlab для чтения и интеграции одномерных спектров воды для наборов данных CONDENSE-MT. Эксперименты CONDENSE-MT приведены как основные – основные8. Границы интеграции вводятся в виде water_left и water_right. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительный рисунок 4: обработка CONDENSE-MT . (A) Первый раздел скрипта фитинга CONDENSE-MT, включающий фитинг для восстановления инверсии воды (раздел 1) и ввод ранее определённых параметров агарозного фона. (B) Определение подгонки и неопределённости параметров наборов данных CONDENSE-MT. Начальные параметры посадки можно задать в рамках fit0. (C) Построение графика результата фитинга CONDENSE-MT. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительные файлы кодирования: скрипты MATLAB для анализа REDIFINE и CONDENSE-MT. Коды Bruker Topspin для создания эксперимента CONDENSE-MT и скриптов MATLAB, используемых для обработки и подборки наборов данных диффузии REDIFINE и наборов данных намагниченности CONDENSE-MT, включая интеграцию данных, анализ релаксации и глобальные процедуры подгонки моделей. Для запуска скриптов требуется MATLAB. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Обсуждение

Здесь мы представили подробные протоколы для ЯМР-характеристики бифазных биомолекулярных конденсатов без меток. Они включают две новые методологии — LLPS REDIFINE и дополняющий, но ортогональный эксперимент под названием CONDENSE-MT. Хотя LLPS REDIFINE обычно применим, он основан на биомолекулярном обнаружении и требует наблюдаемого сигнала при фазовом разделении для правильного анализа. Хотя это может ограничивать применимость REDIFINE, большинство конденсатов содержат белки с внутренне неупорядочёнными участками, которые обычно наблюдаются с помощью ЯМР. В частности, для белковых:РНК и только РНК-конденсатов сигнал биомолекул в конденсированной фазе расширяется за пределы обнаружения при разделении фаз. Если коэффициент разбиения в конденсированную фазу высок, обычный ЯМР почти не наблюдает сигнала. CONDENSE-MT обходит это ограничение обнаружения, будучи методом наблюдения за водой и основывающимся на значительном различии в релаксации между молекулярными видами в разбавленной и конденсированной фазах.

Правильная подготовка образца является ключом к успешному применению как REDIFINE, так и CONDENSE-MT. Поэтому важно убедиться, что агароза полностью расплавлена перед её переносом в смесь, чтобы избежать сильного образования пузырьков воздуха при переносе и обеспечить достаточное количество материала для надёжного заполнения ЯМР-трубки бифазными смесями, которые изначально прилипают к стеклянной стенке. Для CONDENSE-MT крайне важно воспроизводимо передавать заданный объём агарозы, так как агарозный фон будет измеряться отдельно. Если распределение биомолекул между конденсированной и разбавленной фазами сильно искажено, или если обмен между фазами очень медленный или быстрый, эффекты REDIFINE или CONDENSE-MT могут отсутствовать или быть слишком слабыми для достоверной количественной оценки. Это может напоминать ключевое ограничение этих методов. В таком случае повышение или снижение температуры может быть полезным, так как температура является мощным модулятором молекулярного распределения и химических обменных курсов. После получения наборов данных оптимальные результаты подгонки часто получаются итеративно, повторяя вычислительную оптимизацию с использованием параметров наилучшего соответствия из начальной или предыдущей подгонки в качестве входных значений.

Для систем, обладающих сильными эффектами REDIFINE и CONDENSE-MT, эти эксперименты могут дать без меток представление о молекулярном распределении, обменных курсах и молекулярной динамике, которые трудно достичь другими методами без меток. Кроме того, методы на основе ЯМР, как правило, неинвазивны, позволяют многократно анализировать образцы или хранить их длительное время, что позволяет отслеживать свойства конденсата со временем. Это особенно интересно в контексте созревания фибрилизации патологическими конденсатами, которую сложно изучать с помощью дополнительных методов на протяжении очень длительных периодов времени.

Учитывая, что мембранные клеточные органеллы обычно являются многокомпонентными сборками со сложной архитектурой, будущие применения этого метода включают обнаружение и характеристику всё более сложных многокомпонентных систем моделей конденсата, а также анализ конденсата в клеточном контексте с помощью внутриклеточной ЯМР. Однако для этого требуется адаптация REDIFINE или CONDENSE-MT к таким сложным системам, и ведутся усилия по достижению этой цели.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
700 МГц ЯМР-спектрометр Avance NEO	Bruker Biospin	https://www.bruker.com/en.html	Данные собраны с помощью ЯМР-спектрометра с частотой 700 МГц.
Топспин	Bruekr Biospin	https://www.bruker.com/en.html	Данные обрабатываются с помощью этого программного обеспечения.
Белок FUS NTD		Н/Д	Этот белок экспрессируется и очищается в нашей лаборатории
31xCAG РНК		Н/Д	РНК производится и очищается в нашей лаборатории
MATLAB	MathWorks	https://www.mathworks.com/products/matlab.html	Данные обрабатываются и визуализируются с помощью этого программного обеспечения.