Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Бронхоскопическая цитология и метагеномное секвенирование для различия лечения рака и инфекционных повреждений лёгких

224 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/70725

⸱

26 мая 2026 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Respiratory Medicine, Center for Pathogen Biology and Infectious Diseases, The First Hospital of Jilin University, 2Pulmonary and Critical Care Medicine Department, First Hospital of Jilin University, 3Department of Thoracic Surgery, The First Hospital of Jilin University

В этой статье

Краткое содержание

Здесь мы представляем протокол оценки бронхоальвеолярной лаважной жидкости (BALF) с помощью интегрированного бронхоскопического сбора, цитологического анализа и метагеномного секвенирования следующего поколения (mNGS). Этот комплексный рабочий процесс точно отличает повреждения лёгких, связанные с лечением рака, от лёгочных инфекций, облегчая точные и своевременные клинические решения.

Аннотация

Пациенты с повреждением лёгких, связанными с лечением рака (CTLI), часто проявляют неспецифические респираторные симптомы и радиологические изменения, которые близко имитируют инфекционную пневмонию или прогрессирование опухоли, что представляет собой серьёзную сложность для окончательного диагноза. Традиционные диагностические процессы, в основном оцениваемые с помощью биомаркеров и стандартных микробных культур, обычно не могут поставить чёткий диагноз и занимают слишком много времени. Здесь мы представляем комплексный протокол диагностики CTLI путём сочетания цитологического анализа бронхоальвеолярной лаважной жидкости (BALF) с метагеномным секвенированием следующего поколения (mNGS). Процедурный рабочий процесс состоит из трёх основных этапов. Сначала проводится стандартизированная бронхоскопия для получения высококачественных образцов BALF. Во-вторых, проведение цитологического анализа полученных образцов BALF даёт снимок микросреды лёгких. Это позволяет выявлять воспалительные признаки и проводить скрининг на злокачественные клетки для исключения прогрессирования опухоли. Наконец, mNGS используется для выявления или исключения активных инфекционных этиологий. Эта передовая геномная техника обеспечивает быстрое, высокочувствительное и беспристрастное обнаружение патогенов, успешно преодолевая ограничения традиционных культур. Репрезентативные результаты с использованием этого метода показывают, что он может эффективно отличать иммунно-связанный пневмонит от активных легочных инфекций или прогрессирования опухоли. По сравнению с традиционными методами диагностики, этот протокол обладает преимуществом быстрого и точного различия CTLI от инфекционных этиологий и скрытых злокачественных опухолей. В конечном итоге этот стандартизированный рабочий процесс проясняет клинические диагнозы, направляет критически важные решения по лечению и улучшает результаты лечения пациентов.

Введение

Достижения в противоопухолевых методах, таких как ингибиторы иммунных контрольных точек и таргетные терапии, значительно повысили выживаемость пациентов, но также увеличили частоту неинфекционных лёгочных токсичностей, известных как повреждения лёгких, связанные с лечением рака (CTLI)1,2,3,4,5,6,7 . Примечательно, что пневмонит ингибитора контрольных пунктов (CIP) стал смертельной иммунной побочной реакцией, с общей частотой заболеваемости от 2 до 19%, а смертностью достигает 35%8,9,10. Диагностика CTLI представляет собой серьёзную клиническую задачу, поскольку её неспецифические респираторные симптомы и радиологические проявления — такие как непрозрачность измельчённого стекла, консолидация или ретикулярная непрозрачность — тесно имитируют симптомы инфекционной пневмонии или прогрессированияопухоли 11,12,13,14.

В настоящее время диагноз CTLI должен быть поставлен путём аккуратного исключения другихэтиологий 15. Традиционные диагностические процессы сильно опираются на биомаркеры крови и стандартные микробные культуры, которые занимают много времени и часто не дают окончательногодиагноза 16,17,18,19,20,21,22,23. Хотя хирургическая биопсия легких даёт чёткие гистопатологические доказательства, её инвазивность делает её неподходящей для тяжело больных онкологических пациентов. Следовательно, существует критическая необходимость в эффективном, минимально инвазивном диагностическом подходе. В клинической практике описанный здесь протокол следует применять к пациентам с раком, которые ранее проходили или сейчас получают противоопухолевые препараты (например, иммунотерапия или таргетная терапия) и испытывающие новые респираторные симптомы и изменения в визуализации лёгких. Особенно рекомендуется при клиническом подозрении на КТЛИ, стандартных неинвазивных тестов не дают чёткого диагноза, и пациент не переносит инвазивные хирургические обследования.

Бронхоскопия в сочетании с бронхоальвеолярной промывкой (BAL) служит минимально инвазивной «жидкой биопсией» нижних дыхательныхпутей 24. Интегрируя цитологический анализ жидкости BAL (BALF) с метагеномным секвенированием следующего поколения (mNGS), этот подход значительно улучшает существующие диагностические процессы. Во-первых, цитология BALF даёт прямое представление о микроокружении лёгких; он может выявлять характерные воспалительныепризнаки 25, такие как лимфоцитоз и инвертированное соотношение CD4/CD8 при CIP, одновременно проводя скрининг на злокачественные клетки для исключения прогрессированияопухоли 26,27,28,29,30. Во-вторых, mNGS обеспечивает быстрое, высокочувствительное и беспристрастное обнаружение патогенов, преодолевая низкие показатели обнаружения и задержки традиционных культур, особенно для придирчивых бактерий или атипичныхпатогенов 31,32,33,34,35. Совместное использование этих методов показало значительное улучшение обнаружения смешанных инфекций и точное лечение, значительно снижая смертностьпациентов 4,5.

Несмотря на этот клинический потенциал, в настоящее время не существует стандартизированного протокола для комплексного сбора и анализа BALF в контексте CTLI. Здесь мы представляем стандартизированный протокол получения и обработки BALF с помощью бронхоскопии, явно сочетающий цитологическую оценку с mNGS. Методологическая новизна этого рабочего процесса заключается в его двухсторонней диагностической возможности: он использует цитологию для картирования иммунной микросреды и исключения злокачественных опухолей, наряду с mNGS для окончательного исключения активных инфекций. По сравнению с традиционными диагностическими методами, этот интегрированный протокол обладает явным преимуществом быстрого и точного различия CTLI от инфекционных этиологий и прогрессирования скрытых опухолей. В конечном итоге этот стандартизированный рабочий процесс ускоряет диагностические сроки и направляет своевременные, целенаправленные клинические вмешательства (рисунок 1).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Этот протокол соответствует принципам Хельсинкской декларации и был утверждён институциональным ревизионным советом нашей больницы. До начала процедуры все участники получили информированное согласие.

1. Подготовка до процедуры

  1. Оценка пациента (в течение 1 недели после бронхоскопии)
    1. Получите свежие лабораторные анализы, включая полный анализ крови и профиль свертываемости, чтобы обеспечить безопасность инвазивной процедуры (Дополнительный файл 1).
    2. Проведите 12-проводную электрокардиограмму.
    3. Оцените жизненно важные показатели и обеспечьте устойчивость гемодинамики.
    4. Измерьте насыщение кислородом пациента в состоянии покоя в воздухе комнаты для оценки функции лёгких.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если уровень SpO₂ низкий или у пациента есть нарушение дыхания, рассмотрите анализ газов артериальной крови на исходный PaO₂/PaCO₂.
    5. Проведите скрининг на все противопоказания.
    6. Инструктуйте пациента голодать не менее 6 часов и избегать питья в течение 2 часов до процедуры, чтобы снизить риск аспирации.
    7. Проведите отсосывание и очищение полости рта и носа непосредственно перед процедурой, чтобы минимизировать загрязнение верхних дыхательных путей.
  2. Подготовка оборудования и личного состава
    1. Подготовьте все необходимые бронхоскопические аппараты и оборудование для мониторинга. Выберите подходящий размер бронхоскопа, исходя из анатомии дыхательных путей пациента. Проверьте функцию всасывания бронхоскопа.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Обеспечьте немедленное наличие аварийного оборудования для экстренной реанимации, включая дополнительные устройства для подачи кислорода и аппарат для всасывания, для управления возможными осложнениями дыхательных путей. Любой сертифицированный бронхоскопист со стандартной подготовкой может выполнить эту процедуру самостоятельно без специализированных сертификатов.
    2. Прогрейте стерильный физиологический физиологический раствор (0,9% NaCl), предназначенный для промывания, до 37 °C.
    3. Набрать 100–150 мл тёплого стерильного физиологического раствора в несколько шприцев по 20 мл для быстрого введения.
  3. Установка позиционирования и мониторинга пациентов
    1. Положите пациента на стол для бронхоскопии.
    2. Установите оборудование для постоянного мониторинга пациента перед началом процедуры.
      1. Применение электрокардиограммы (ЭКГ) ведёт непосредственно в грудную клетку пациента для непрерывного мониторинга сердечной активности.
      2. Подключите зонд пульсоксиметра к пальцу пациента, чтобы непрерывно контролировать насыщение кислородом крови и пульс.
      3. Прикрепите неинвазивный манжет для измерения давления на верхнюю часть руки пациента, чтобы постоянно фиксировать венозное давление.
  4. Установка устройства для поддержки кислорода и отлучение после процедуры
    1. Подготовьте и настройте подходящее устройство кислородной поддержки на основе исходного дыхательного состояния пациента. Завершите эту конфигурацию перед началом бронхоскопии.
    2. Установка носовой канюли с высоким потоком (HFNC)
      1. Выберите систему HFNC для пациентов сSpO 2 ≥ 90% на воздухе в комнате и без гиперкапнии. Подключите канюлю к пациенту и установите начальный расход газа ≥60 л/мин сFiO-2 1,0. Постоянно титруйтеFiO2 во время процедуры, чтобы поддерживать уровеньSpO2 ≥ 90%.
    3. Стратегия перехода для пациентов с неинвазивной вентиляцией (NIV)
      1. Снимите маску NIV и переведите пациента в систему HFNC непосредственно перед установкой бронхоскопа. Установите расход газа HFNC на ≥60 л/мин сFiO2 1.0. Проводите активное всасывание дыхательных путей в период без маски для удаления выделений и оптимизации их проходности.
      2. Внимательно следите за пациентом на предмет десатурации во время временного перехода от NIV к HFNC. Если уровень SpO₂ опускается ниже 90% и остаётся резистентным к отсасыванию и максимальным настройкам HFNC, процедуру бронхоскопии немедленно прекратите. Немедленно повторно надевайте маску NIV для восстановления положительного давления или переключитесь на инвазивную эндотрахеальную интубацию, если респираторное состояние пациента ухудшается.
    4. Установка инвазивной машинестроения вентиляции (IMV)
      1. Установите приливный объём на 6–8 мл/кг прогнозируемой массы тела, FiO₂ до 1,0, положительное давление в конце выдоха (PEEP) на 5–8 смH₂O, а частоту дыхания на 12–16 вдохов в минуту. Введите бронхоскоп непосредственно через установленную эндотрахеальную трубку.
    5. Поддерживайте непрерывный мониторинг жизненных показателей после завершения бронхоальвеолярной промывания (BAL). Титруйте дополнительный кислород для поддержанияSpO2 в диапазоне 92%–96% (или 88–92% для пациентов с хронической гиперкапнией).
    6. Перед снижением кислородной поддержки убедитесь, что пациент соответствует всем следующим критериям: полное выход из седации, восстановление защитных рефлексов дыхательных путей, гемодинамическая стабильность и отсутствие активного кровотечения или тяжёлого бронхоспазма.
    7. Для отлучения от HFNC сначала снижайте концентрацию, затем расход. Уменьшайте FiO₂ с шагом от 5% до 10%, пока не достигнете ≤40%. Затем снижайте расход с шагом от 5% до 10%. Полностью прекращайте HFNC, когда пациент сохраняет целевую SpO₂ с FiO₂ ≤ 35% и расходом ≤ 20 л/мин.
    8. Для отлучения от груди с помощью NIV убедитесь, что гипоксемия улучшилась и жизненно важные показатели стабилизированы, затем приступите к одному из двух методов:
      1. Уменьшите IPAP на 2–3 смH₂O за корректировку, уменьшите PEEP до 4–5 смH₂O, а FiO₂ — до ≤40%.
      2. Для периодического отлучения пациента переходите на HFNC, чтобы облегчить и постепенно продлить продолжительность спонтанного дыхания. Немедленно возобновить полную поддержку NIV, если у пациента наблюдается тахипноэ (>30 вдохов/мин), тахикардия (>140 ударов в мин), усталость дыхательных мышц, изменение психического состояния или SpO₂ < 90%.
    9. Для отлучения от ИМВ проводите испытание спонтанного дыхания или тест на утечку манжеты. Экстубация следует проводить только после успешного прохождения испытания, проявления достаточной силы спонтанного кашля и минимального выделения дыхательных путей.
  5. Седация и анестезия
    1. Введите 15 мл 2% лидокаина в слизистую слизистую и рохотку, разделив на 2–5 доз.
    2. Введите 10 мл 2% лидокаина в разделённых дозах через рабочий канал бронхоскопа. Применяйте эти дозы шаг за шагом, продвигая бронхоскоп в дыхательные пути, чтобы покрыть слизистую трахею, карину и бронхиальное дерево.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Абсолютная максимальная безопасная доза местного лидокаина неизвестна. Токсичность обычно возникает, когда концентрация сыворотки превышает 5 мкг/мл, но субъективные побочные эффекты могут проявиться при более низких концентрациях. Тщательно отслеживайте общий объём введённого наркоза.
    3. Вводите системную седацию в зависимости от предпочтений пациента, степени тревожности и ожидаемой переносимости процедуры для обеспечения достаточной анестезии, максимального комфорта пациента и уменьшения кашля. Вводить мидазолам 2–2,5 мг медленно внутривенно или снижать дозу до 0,5–1 мг для слабых или пожилыхпациентов 36.
    4. Мониторинг SpO₂, ЭКГ и неинвазивное артериальное давление (NIBP) постоянновнедряется 37.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Системная седация значительно увеличивает риск рефрактерной гипоксемии, коллапса дыхательных путей и экстренной интубации трахеи. Внимательно следите за пациентом на протяжении всей процедуры.

2. Процедура BAL

ПРИМЕЧАНИЕ: Выполняйте процедуру сбора BALF строго в соответствии со стандартными протоколами и клиническими рекомендациями.

  1. Выбор целевого сегмента лёгких (Рисунок 2)
    1. Ознакомьтесь с последним высокоразрешающим компьютерным томографическим сканированием грудной клетки (HRCT) пациента перед процедурой, чтобы определить точное анатомическое распределение заболевания лёгких.
    2. Выберите целевой сегмент лёгких для BAL на основе специфического распределения заболевания, выявленного на ЗГКТ.
    3. Направьте бронхоскоп для проведения промывания в наиболее поражённом рентгеновском сегменте или в сегменте, демонстрирующем наиболее быструю прогрессирующую диагностику локализованного или заметно асимметричного заболевания.
    4. Направьте бронхоскоп на промывку либо правой средней дошки, либо лингулы левой верхней доли при выявлении диффузных или симметричных заболеваний, так как эти анатомические участки обычно обеспечивают достаточный возврат жидкости.
  2. Прелаваж и сброс образца
    1. Введите 20–30 мл тёплого физиологического раствора через бронхоскоп в клиновидный сегмент. Ждите 20–30 секунд.
    2. Примените мягкое всасывание (отрицательное давление 50–100 мм рт. ст.), чтобы аспирировать жидкость обратно. Соберите этот первый аликвот в ловушку и выбросьте его, не отправляя на анализ, так как он может содержать слизь и бронхиальный мусор.
  3. Основная процедура промывания
    1. Подключите стерильный шприц с 0,9% нормального физиологического раствора прочно к рабочему каналу бронхоскопа.
    2. Введите 20 мл физиологического раствора через рабочий канал за 3–5 секунд. Немедленно сделайте паузу на 5–10 секунд после инъекции, позволяя жидкости полностью рассеяться и осесть в дистальных альвеолярных пространствах под действием силы тяжести.
    3. Примените мягкое всасивание, чтобы восстановить введённую жидкость в стерильную коллекционную ловушку. Поддерживайте всасывание давления ниже 100 мм рт. ст., чтобы избежать значительного коллапса дыхательных путей или повреждения слизистой слизистой дыхательных путей.
    4. Повторяйте инстилляцию, паузу и отсосывание строго до тех пор, пока общий объём инфузии не достигнет от 100 до 150 мл, чтобы убедиться, что образец нижних дыхательных путей адекватен и репрезентативен.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Постоянно следите за жизненными показателями пациента, насыщением кислородом и чувством комфорта на протяжении всей процедуры. Операция немедленно приостанавливается, если возникает сильный кашель или десатурация, и возобновляйте её только после стабилизации пациента.
  4. Техника извлечения жидкости
    1. Используйте низкое всасывание (≤100 мм рт.ст.), чтобы избежать коллапса дыхательных путей.
    2. Используйте технику «импульсного всасывания» вместо непрерывного всасывания: периодически перекрывайте и отпускайте трубку для смешивания воздуха, мобилизуя жидкость и предотвращая коллапс бронха у эндоскопа.
    3. Цель — извлечение не менее 40–60 мл BALF.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Прекращение промывания, если у пациента развиваются осложнения (например, бронхоспазм, непереносимая гипоксемия), даже если полный объём не восстановлен. Ограничивайте общее время процедуры инстилляции и аспирации BAL не менее 2–3 минут, чтобы минимизировать риск гипоксии.
  5. Уход после промывки
    1. Аккуратно вынимите бронхоскоп после завершения BAL.
    2. Всасывание оставшихся выделений из центральных дыхательных путей.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Продолжайте поддерживать HFNC или NIV, если она применяется, пока пациент не стабилизируется в процессе восстановления. Наблюдайте за пациентом на предмет постпроцедурных осложнений, таких как кровотечение или пневмоторакс.

3. Обработка образцов и контроль качества

  1. Измерение, транспорт и первичная оценка BALF
    1. Запишите объём возвращённой жидкости по сравнению с объёмом, введённым сразу во время процедуры.
    2. Вычислите процент восстановления по следующей формуле:
      Процент восстановления = (восстановленный объём / введённый объём) × 100%
      ПРИМЕЧАНИЕ: Восстановление ≥30% обычно считается хорошим образцом BALF.
    3. Немедленно положите собранный BALF на лёд. Быстро доставьте BALF в лабораторию.
      ВНИМАНИЕ: Образцы BALF человека потенциально могут быть инфекционными. Обращайтесь со всеми образцами с соблюдением соответствующих стандартных мер предосторожности.
    4. Наблюдайте и фиксируйте макроскопический цвет и мутность образца BALF перед обработкой.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Прозрачная или бледно-жёлтая жидкость без видимой мутности типична для неинфекционных состояний. Мутный или молочный вид связан с альвеолярным протеинозом лёгочных (PAP)38. Гнойная жидкость указывает на потенциальную бактериальную инфекцию. Жидкость с оттенком крови указывает на возможное кровотечение или диффузное альвеолярноекровотечение 39.
  2. Оценка жизнеспособности клеток
    1. Разведите BALF до концентрации примерно 1 ×10 6 клеток/мл с помощью стерильного физиологического физиологического раствора.
    2. Смешайте разбавленный BALF с Trypan blue в соотношении объёма 1:1, чтобы получить реакционную смесь с концентрацией 20 мкл.
      ВНИМАНИЕ: Трипан-синий — токсичное вещество и подозреваемый канцероген.
    3. Инкубировать реакционную смесь в течение 3 минут при комнатной температуре (примерно 25 °C).
    4. Поместите смесь на гемоцитометр. Осмотрите клетки под микроскопом с низкой мощностью.
    5. Посчитайте минимум 200 клеток, чтобы систематически определить жизнеспособность клетки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Жизнеспособные клетки остаются неокрашенными, прозрачными и морфологически целыми, тогда как нежизнеспособные клетки поглощают синий краситель. Начальная жизнеспособность клеток составляет >90%–95%, чтобы обеспечить надёжные подсчёты цитологии ниже по потоку.
  3. Распределение Аликвот
    1. Разделите BALF на специальные трубки для различных анализов во время операции промывания.
    2. Обозначите трубу 1 как «отброшенную» для первого возвращенного аликвота.
    3. Выделить трубку 2 для микробиологии и выделить 10–20 мл BALF для анализа патогена (например, mNGS).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Проводите одновременно проведение обычных бактериальных окрашиваний/посева, грибкового окрашивания/посева, мазка кислотно-быстрых бацилл (AFB) и ПЦР одновременно в клинической практике.
    4. Выделите трубку 3 для цитологии и зарезервируйте не менее 10 мл для общего и дифференциального количества клеток.
    5. Назначить трубку 4 как необязательный резерв и сохранить оставшуюся жидкость (при 4 °C в краткосрочном режиме или при -80 °C в долгосрочной перспективе) для дополнительных испытаний.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Заморозьте образец mNGS при -80 °C, если тестирование не может начаться сразу. Обрабатывайте цитологические образцы свежими; если ожидается задержка, образец поместить в холодильник при 4 °C до 24 часов для сохранения морфологии клетки.

4. Лабораторная обработка BALF

  1. Общее количество ячеек
    1. Переверните трубку, аккуратно перемешайте BALF и снова подвесьте клетки.
    2. Разведите BALF соответствующим объемом стерильного физиологического раствора, если образец содержит макроскопические слизистые пробки и мусор.
    3. Перед фильтрацией тщательно смочите стерильную медицинскую марлю стерильным физиологическим раствором. Профильтруйте разбавленный образец через два слоя предварительно увлажнённой стерильной медицинской марли.
    4. Соберите фильтрат в стерильную сборную трубку. Посчитайте общее количество ядреных клеток с помощью гематологического анализатора.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Низкое загрязнение эпителиальных клеток (<5% клеток) и минимальная доля эритроцитов (<10%) указывают на наличие высококачественного альвеолярного образца.
  2. Дифференциальное количество клеток
    1. Перенесите 1 мл хорошо смешанного образца BALF в микротрубку объемом 1,5 мл. Центрифугуйте микротрубку при 211 × г в течение 5 минут, чтобы сконцентрировать клетки.
    2. Удалять супернатант, оставляя ровно 50–100 мкл жидкости в микротрубке. Тщательно подвесьте клеточную гранулу в оставшейся супернатанте.
    3. Пипетка 10–20 мкл подвешенной ячейки на поверхность чистого стеклянного затвора, рядом с матовым краем.
    4. Держите второй чистый стеклянный затвор под углом 30–45° к первому. Продвигайте вторую затворку вперёд, используя лёгкую технику клиновидного размазива, чтобы создать тонкий, равномерный клеточный размаз.
    5. Повторите шаги 4.2.3–4.2.4, чтобы подготовить 2–3 одинаковых слайда.
    6. Дайте размазанным слайдам полностью высохнуть на воздухе при комнатной температуре.
    7. Окрашивайте слайды методом Райта-Гемсы.
    8. Осмотрите окрашенные стекла под световым микроскопом с помощью мощного масляного погружного объектива (увеличение 1000×).
    9. Определите и классифицируйте как минимум 400 клеток для определения дифференциального количества клеток.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Сохраняйте любые образцы BALF с высоким клиническим подозрением на злокачественность при 4 °C и отправляйте их в центральную патологоанатомическую лабораторию для стандартизированной цитоцентрифуги в течение 2 часов после сбора образца.
  3. Конвейер mNGS
    1. Инактивируйте образец бронхоальвеолярной жидкости для лаважа (BALF), инкубировав его при 65 °C в течение 30 минут.
    2. Перенесите 0,5 мл инактивированного образца BALF в микроцентрифугную пробирку объемом 1,5 мл с 1 г стеклянных шариков толщиной 0,5 мм.
    3. Закрепите микроцентрифугную трубку на горизонтальной платформе вихревого миксера. Перемешивайте смесь при 2800–3200 об/мин в течение 30 минут, чтобы облегчить механическое разрушение микробной клеточной стенки и последующее высвобождение ДНК.
    4. Кратковременно центрифугуйте трубку, чтобы оседать шарики, и аккуратно перенесите 0,3 мл супернатанта в новую микроцентрифугную трубку на 1,5 мл.
    5. Извлекайте полные нуклеиновые кислоты из супернатанта с помощью микрообъёмного набора для экстракции ДНК, строго следуя инструкциям производителя.
    6. Измерьте концентрацию извлеченной ДНК с помощью флюорометра.
    7. [ТОЧКА ПАУЗЫ] Храните экстракцию ДНК при -20 °C для краткосрочного использования или при -80 °C для длительного хранения, если подготовка библиотеки не проводится немедленно.
    8. Постройте библиотеки метагеномики из извлеченной ДНК с помощью комплекта для подготовки библиотеки с ультранизким входом.
    9. Проверьте собранные библиотеки для обеспечения подходящих размеров фрагментов и достаточной концентрации.
    10. Секвенируйте квалифицированные библиотеки на высокопроизводительной платформе секвенирования.
  4. Анализ данных секвенирования
    1. Устранить низкокачественные чтения и последовательности адаптеров из сырых данных секвенирования с помощью программного обеспечения для обработки последовательностей.
    2. Discard считывает с длиной меньше 35 базовых пар (bp), с низкой сложностью и с рейтингом качества Phred (Q) ниже 20.
    3. Выровнять высококачественные считывания с человеческим эталонным геномом (версия hg38) с помощью алгоритма выравнивания Бэрроуз-Уилера для идентификации последовательностей человеческой ДНК.
    4. Отбросьте выровненные человеческие последовательности хозяев, чтобы изолировать данные секвенирования, не связанные с хозяином.
    5. Проверьте оставшиеся не-хозяиновые секвенирующие считывания в базе данных классификационных справочников для получения микробной информации на уровне вида. Создать базу данных на основе опубликованных микробных геномных баз данных, таких как база данных референсных последовательностей в Национальном центре биотехнологической информации (NCBI). Убедитесь, что в нем содержатся полные данные о патогенах (например, 25 863 патогена, включая 12 142 бактерии, 2 680 грибов, 10 061 вирус, 654 паразита, 206 микобактерии и 120 микоплазмы/хламидиоз).
    6. Устанавливайте отрицательные (контроль без шаблона, NTC) и положительные контроли, обрабатывая их с помощью идентичных процедур извлечения, подготовки библиотеки и биоинформатического анализа.
    7. Изучите строго картированное число считывания (SMRN) и геномное покрытие для диагностики.
      ПРИМЕЧАНИЕ: SMRN обозначает количество последовательностей, которые точно совпадают с микроорганизмом на уровне вида.
    8. Классифицируйте результат mNGS бактериального, грибочного, микоплазменного или хламидиозного как положительный, если микроорганизм не обнаружен в NTC И его геномное покрытие входит в топ-10 среди микробов одного рода, ИЛИ если отношение SMRN_sample к SMRN_NTC > 10 (когда SMRN_NTC ≠ 0).
    9. Подтвердить, что SMRN_sample соответствует следующим минимальным порогам положительного результата: ≥3 для бактерий, грибов, микоплазм и хламидиев; ≥100 для паразитов; и ≥1 для Mycobacterium tuberculosis.
    10. Классифицировать результат вирусного mNGS как положительный, если вирус не обнаружен в NTC, ИЛИ если соотношение SMRN_sample к SMRN_NTC равно >5 (когда SMRN_NTC ≠ 0).
    11. Подтвердите, что SMRN_sample вирусов — ≥1.
    12. Составьте список кандидатов на патогены вместе с их количеством прочитанных или относительной численностью.
    13. Фиксируйте любые гены резистентности на антибиотики или факторы вирулентности, выявленные в биоинформатическом конвейере.
    14. Определите значительный удар, объединив количество чтений, статистическое сравнение с контрольными группами и клиническую значимость.
    15. Оцените, может ли каждый выявленный патоген объяснить клиническую ситуацию.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Следуя вышеуказанному стандартизированному протоколу, клиницисты могут воспроизводимо получать высококачественные образцы BALF и использовать как клеточный и геномный анализ, чтобы отличить CTLI от его имитаторов. Ниже мы представляем репрезентативный результат нашего случая, чтобы проиллюстрировать типичные выводы. 68-летняя женщина с плохо дифференцированным раком лёгких IV стадии (первичная опухоль правой плевральной области) на иммунотерапии пембролизумабом представлена для иллюстрац...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

В современную эпоху терапии рака травмы органов, связанных с лечением, такие как вызванные ингибиторами иммунных контрольных пунктов (ICI), остаются серьёзной клинической проблемой, которая может ограничить прогрессирование лечения или даже быть опаснойдля жизни 3,4. Среди иммунно-связанных побочных явлений (irAE), вызванных ICI, пневмонит привлек значительное внимание как основная причина летальныхисходов 10

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих интересов.

Декларация о помощи ИИ:
Авторы заявляют о применении технологий с помощью искусственного интеллекта при подготовке этой рукописи. В частности, Gemini от Google использовался исключительно для доработки английского языка, исправления грамматических ошибок и обеспечения соответствия структурного форматирования стандартам журнала. Инструмент ИИ не использовался для генерации, анализа или интерпретации научных результатов. Все авторы тщательно изучили сгенерированный текст, внесли необходимые правки и взяли на себя полную ответственность за научную точность и целостность финальной рукописи.

Благодарности

Эта работа была поддержана проектом по улучшению потенциала в области здравоохранения провинции Цзилинь (грант No 2023JC007).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
2% лидокаин<сильный>Хунань КелунН/ДМестный анестетик для слизистой слизистой дыхательных путей.
Стеклянные бусины толщиной 0,5 ммSigmaН/ДИспользуется для механического разрушения клеточных стенок микроорганизмов.
Электронный бронхоскоп BF-260ОлимпН/ДБронхоскоп используется для получения альвеолярной жидкости для промывания.
Трассировка Бэрроуз-УилерОткрытый исходный код0.7.17 (RRID:SCR_010910)Алгоритм отображения последовательностей в геном человека.
Прибор для увлажнённой кислородной терапии с высоким потокомBMC MedicalН/ДОбеспечить определённый поток, нагретый и увлажнённый дыхательный газ для пациентов со спонтанным дыханием.
Вихревой миксерScientific   ПромышленностьН/ДНаучные отрасли
МидазоламЦзянсу ЭньхуаН/ДСистемное седативное средство для комфорта пациента.
Платформа Nextseq 550IlluminaН/ДГенная последовательность для секвенирования генома в BALF
Комплект библиотеки QIAseq для ультранизкого входаТяньгэньН/ДНабор для построения метагеномной библиотеки
Кубит 4.0Термо Фишер СайентификН/ДИнструмент для обнаружения содержания нуклеиновых кислот BALF
TIANamp Micro DNA Kit DP316ТяньгэньН/ДНабор для экстракции ДНК для извлечения полных нуклеиновых кислот из BALF
Трипан-синийBiosharpН/ДКраситель, используемый для оценки жизнеспособности клеток.
  Водяная баняДжоанН/ДИспользуется для инактивации образца BALF при температуре 65°C.
Пятно Райта-ГимсыЮаньмуН/ДИспользуется для дифференциального окрашивания клеток.
Гематологический анализатор XN-9000SysmexSN-13699Гематологический анализатор для подсчёта всех нуклеированных клеток из образца BALF

Ссылки

  1. Li, Z., et al. Effects and potential mechanisms of the ultra-high dose rate radiotherapy on lung injury: a review. Radiat Oncol. 20 (1), 161(2025).
  2. Kormish, J., et al. Temporal and spatial patterns of inflammation and tissue injury in patients with postoperative respiratory failure after lung resection surgery: a nested case-control study. Int J Mol Sci. 24 (12), 10051(2023).
  3. Xie, X., et al. Fatal toxic effects related to EGFR tyrosine kinase inhibitors based on 53 cohorts with 9,569 participants. J Thorac Dis. 12 (8), 4057-4069 (2020).
  4. Hazama, K., et al. Disproportionality analysis of adverse events in advanced lung cancer treated with atezolizumab plus platinum-based combination chemotherapy. J Pharm Health Care Sci. , (2025).
  5. Iwasa, E., et al. Interstitial lung disease as an adverse drug reaction in Japan: exploration of regulatory actions as a basis for high reporting. Drug Saf. 43 (11), 1121-1131 (2020).
  6. Imran, S., et al. Immune checkpoint inhibitor-related pneumonitis: acute lung injury with rapid progression and organising pneumonia with less severe clinical disease. Histopathology. 81 (6), 724-731 (2022).
  7. Zou, T., et al. A real-world disproportionality analysis of the US Food and Drug Administration adverse event reporting system events for durvalumab. BMC Pharmacol Toxicol. 25 (1), 97(2024).
  8. Naidoo, J., et al. Pneumonitis in patients treated with anti-programmed death-1/programmed death ligand 1 therapy. J Clin Oncol. 35 (7), 709-717 (2017).
  9. Suresh, K., et al. Pneumonitis in non-small cell lung cancer patients receiving immune checkpoint immunotherapy: incidence and risk factors. J Thorac Oncol. 13 (12), 1930-1939 (2018).
  10. Wang, D. Y., et al. Fatal toxic effects associated with immune checkpoint inhibitors: a systematic review and meta-analysis. JAMA Oncol. 4 (12), 1721-1728 (2018).
  11. Hou, Z., et al. Pirfenidone for grade 2 and grade 3 radiation-induced lung injury: a multicentre, open-label, randomised, phase 2 trial. Lancet Oncol. 26 (12), 1552-1562 (2025).
  12. Huang, A., et al. Radiographic features and prognosis of early- and late-onset non-small cell lung cancer immune checkpoint inhibitor-related pneumonitis. BMC Cancer. 21 (1), 634(2021).
  13. Shroff, G. S., et al. Drug-induced lung disease in the oncology patient: from cytotoxic agents to immunotherapy. Clin Chest Med. 45 (2), 325-337 (2024).
  14. Kuhlman, J. E. The role of chest computed tomography in the diagnosis of drug-related reactions. J Thorac Imaging. 6 (1), 52-61 (1991).
  15. Nissen, A., et al. Advances in noninvasive imaging for detecting radiation-induced lung injury (RILI). Int J Radiat Biol. , 1-13 (2025).
  16. Gosangi, B., et al. Imaging features of toxicities associated with immune checkpoint inhibitors. Eur J Radiol Open. 9, 100434(2022).
  17. Teng, P., et al. Severe community-acquired pneumonia with disseminated infection caused by highly virulent Pseudomonas aeruginosa: successful treatment of a case. J Inflamm Res. 18, 12817-12824 (2025).
  18. Wang, C. C., et al. Acute fibrinous and organizing pneumonia presents as right lung upper lobe cavitary lesion: case report and literature review. Medicine (Baltimore). 104 (39), e44915(2025).
  19. Li, Q., et al. Psittacosis chlamydia pneumonia complicated with organizing pneumonia: a case report and literature review. Front Med (Lausanne). 12, 1670456(2025).
  20. Lin, X., et al. Expert consensus on cancer treatment-related lung injury. J Thorac Dis. 17 (4), 1844-1875 (2025).
  21. Zhang, Y., Shen, W. X., Li, P., Chen, M. B., Zhou, L. N. Serum interleukin levels predict occurrence of acute radiation pneumonitis and overall survival in thoracic tumours. Clin Invest Med. 48 (1), 29-38 (2025).
  22. Loy-Caraos, G., et al. PNA-FISH-based chromosome aberration frequency and serum IL-6 as predictive biomarkers for radiation therapy-induced pneumonitis in lung cancer patients. Radiat Res. 204 (2), 127-142 (2025).
  23. Zhang, X., et al. Integrated omics characterization reveals reduced cancer indicators and elevated inflammatory factors after thermal ablation in non-small cell lung cancer patients. Respir Res. 25 (1), 309(2024).
  24. Luo, T., et al. Preclinical models of immune checkpoint inhibitors-related interstitial pneumonia for anti-PD1 tumor immunotherapy. Immunobiology. 230 (2), 152884(2025).
  25. Xiao, L., et al. Early prediction of radiation pneumonitis in patients with lung cancer treated with immunotherapy through monitoring of plasma chemokines. Int J Radiat Oncol Biol Phys. 122 (5), 1238-1247 (2025).
  26. Lin, X., et al. Comprehensive analysis of the immune microenvironment in checkpoint inhibitor pneumonitis. Front Immunol. 12, 818492(2021).
  27. Suresh, K., et al. The alveolar immune cell landscape is dysregulated in checkpoint inhibitor pneumonitis. J Clin Invest. 129 (10), 4305-4315 (2019).
  28. Strippoli, S., et al. Cellular analysis of bronchoalveolar lavage fluid to narrow differential diagnosis of checkpoint inhibitor-related pneumonitis in metastatic melanoma. J Transl Med. 18 (1), 473(2020).
  29. Johkoh, T., et al. Chest CT diagnosis and clinical management of drug-related pneumonitis in patients receiving molecular targeting agents and immune checkpoint inhibitors: a position paper from the Fleischner Society. Chest. 159 (3), 1107-1125 (2021).
  30. Davidson, K. R., Ha, D. M., Schwarz, M. I., Chan, E. D. Bronchoalveolar lavage as a diagnostic procedure: a review of known cellular and molecular findings in various lung diseases. J Thorac Dis. 12 (9), 4991-5019 (2020).
  31. Ungvári, T., et al. The possible role of some laboratory parameters in predicting radiation-induced lung injury after breast cancer treatment. Orv Hetil. 166 (29), 1153-1159 (2025).
  32. Park, S. H., et al. Predictive factors for severe radiation-induced lung injury in patients with lung cancer and coexisting interstitial lung disease. Radiother Oncol. 192, 110053(2024).
  33. Lin, X., et al. Peripheral blood biomarkers for early diagnosis, severity, and prognosis of checkpoint inhibitor-related pneumonitis in patients with lung cancer. Front Oncol. 11, 698832(2021).
  34. Arora, S., Walker, S. M., Cummings, K. W., Hammer, M. M. Pneumonia in immunocompromised patients. Radiographics. 45 (12), e250021(2025).
  35. Domagala-Kulawik, J. The relevance of bronchoalveolar lavage fluid analysis for lung cancer patients. Expert Rev Respir Med. 14 (3), 329-337 (2020).
  36. Du Rand, I. A., et al. British Thoracic Society guideline for diagnostic flexible bronchoscopy in adults: accredited by NICE. Thorax. 68, Suppl 1. i1-i44 (2013).
  37. Wahidi, M. M., et al. American College of Chest Physicians consensus statement on the use of topical anesthesia, analgesia, and sedation during flexible bronchoscopy in adult patients. Chest. 140 (5), 1342-1350 (2011).
  38. Jouneau, S., Ménard, C., Lederlin, M. Pulmonary alveolar proteinosis. Respirology. 25 (8), 816-826 (2020).
  39. Maldonado, F., Parambil, J. G., Yi, E. S., Decker, P. A., Ryu, J. H. Haemosiderin-laden macrophages in the bronchoalveolar lavage fluid of patients with diffuse alveolar damage. Eur Respir J. 33 (6), 1361-1366 (2009).
  40. Olsen, H. H., Grunewald, J., Tornling, G., Sköld, C. M., Eklund, A. Bronchoalveolar lavage results are independent of season, age, gender and collection site. PLoS One. 7 (8), e43644(2012).
  41. Meyer, K. C., et al. An official American Thoracic Society clinical practice guideline: the clinical utility of bronchoalveolar lavage cellular analysis in interstitial lung disease. Am J Respir Crit Care Med. 185 (9), 1004-1014 (2012).
  42. Whitley, R. J., Roizman, B. Herpes simplex virus infections. Lancet. 357 (9267), 1513-1518 (2001).
  43. Li, H., et al. Prediction of primary biliary cholangitis among health check-up population with anti-mitochondrial M2 antibody positive. Clin Mol Hepatol. 31 (2), 474-488 (2025).
  44. Wakabayashi, S. I., et al. Emergence of anti-mitochondrial M2 antibody in patient with angioimmunoblastic T-cell lymphoma. Clin J Gastroenterol. 11 (4), 302-308 (2018).
  45. Madrid, F. F., et al. Autoantibodies in breast cancer sera are not epiphenomena and may participate in carcinogenesis. BMC Cancer. 15, 407(2015).
  46. Nisihara, R., et al. Anti-nuclear antibodies in patients with breast cancer. Clin Exp Immunol. 193 (2), 178-182 (2018).
  47. Mohammed, M. E., Abdelhafiz, K. Autoantibodies in the sera of breast cancer patients: antinuclear and anti-double stranded DNA antibodies as example. J Cancer Res Ther. 11 (2), 341-344 (2015).
  48. Khan, M. B., Kaur, A., Ali, A., Boris, A., Spitalewitz, S. Complete resolution of paraneoplastic membranous nephropathy following curative therapy of triple-negative breast cancer. Cureus. 13 (9), e18125(2021).
  49. Sun, X., et al. Immune-related adverse events associated with programmed cell death protein-1 and programmed cell death ligand 1 inhibitors for non-small cell lung cancer: a PRISMA systematic review and meta-analysis. BMC Cancer. 19 (1), 558(2019).
  50. Miao, Q., et al. Microbiological diagnostic performance of metagenomic next-generation sequencing when applied to clinical practice. Clin Infect Dis. 67, Suppl 2. S231-S240 (2018).
  51. Chen, J., et al. Metagenomic next-generation sequencing for concurrent diagnosis of infections and malignancies in patients with lung lesions: a single-center prospective study. Sci Rep. 15 (1), 33721(2025).
  52. Liang, W., et al. Diagnostic strategy of metagenomic next-generation sequencing for gram negative bacteria in respiratory infections. Ann Clin Microbiol Antimicrob. 23 (1), 10(2024).
  53. Hauser, S., et al. A metagenomics method for the quantitative detection of bacterial pathogens causing hospital-associated and ventilator-associated pneumonia. Microbiol Spectr. 11 (6), e0129423(2023).
  54. Li, H., et al. Detection of pulmonary infectious pathogens from lung biopsy tissues by metagenomic next-generation sequencing. Front Cell Infect Microbiol. 8, 205(2018).
  55. Liu, H., Zhang, Y., Yang, J., Liu, Y., Chen, J. Application of mNGS in the etiological analysis of lower respiratory tract infections and the prediction of drug resistance. Microbiol Spectr. 10 (1), e0250221(2022).
  56. Dickson, R. P., Erb-Downward, J. R., Martinez, F. J., Huffnagle, G. B. The microbiome and the respiratory tract. Annu Rev Physiol. 78, 481-504 (2016).
  57. Huang, M. Q., Zheng, T. T., Wang, X. R., Xiang, F. The clinical value of metagenomic next-generation sequencing in Pneumocystis jirovecii pneumonia. Infect Drug Resist. 17, 69-80 (2024).
  58. Li, Y., et al. Optimization of decision thresholds for Mycobacterium tuberculosis can effectively improve the performance of mNGS in tuberculosis diagnosis. Front Cell Infect Microbiol. 15, 1646194(2025).
  59. Mei, J., et al. Diagnostic role of mNGS in polymicrobial periprosthetic joint infection. J Clin Med. 12 (5), (2023).
  60. Wang, J., Han, Y., Feng, J. Metagenomic next-generation sequencing for mixed pulmonary infection diagnosis. BMC Pulm Med. 19 (1), 252(2019).
  61. Qiang, P., et al. A new era in lower respiratory tract infections management: synergy between mNGS and CMTs in patients with hematological disorders. Diagn Microbiol Infect Dis. 114 (2), 117158(2026).
  62. Duan, J., et al. Metagenomic analysis identifying a polymicrobial pulmonary infection in a non-HIV immunocompromised patient: a case report. BMC Pulm Med. 25 (1), 12(2025).
  63. Qin, Z., et al. Metagenomic next-generation sequencing contributes to the diagnosis of mixed pulmonary infection: a case report. Ann Clin Microbiol Antimicrob. 21 (1), 52(2022).
  64. Deng, Z., et al. BALF metagenomic next-generation sequencing analysis in hematological malignancy patients with suspected pulmonary infection: clinical significance of negative results. Front Med (Lausanne). 10, 1195629(2023).
  65. Zhang, P., et al. Metagenomic next-generation sequencing for the clinical diagnosis and prognosis of acute respiratory distress syndrome caused by severe pneumonia: a retrospective study. PeerJ. 8, e9623(2020).
  66. Chiu, C. Y., Miller, S. A. Clinical metagenomics. Nat Rev Genet. 20 (6), 341-355 (2019).
  67. Hasan, M. R., et al. Depletion of human DNA in spiked clinical specimens for improvement of sensitivity of pathogen detection by next-generation sequencing. J Clin Microbiol. 54 (4), 919-927 (2016).
  68. Miller, S., et al. Laboratory validation of a clinical metagenomic sequencing assay for pathogen detection in cerebrospinal fluid. Genome Res. 29 (5), 831-842 (2019).
  69. Zinter, M. S., et al. Pulmonary metagenomic sequencing suggests missed infections in immunocompromised children. Clin Infect Dis. 68 (11), 1847-1855 (2019).
  70. Rodino, K. G., Simner, P. J. Status check: next-generation sequencing for infectious-disease diagnostics. J Clin Invest. 134 (4), (2024).
  71. Simner, P. J., Miller, S., Carroll, K. C. Understanding the promises and hurdles of metagenomic next-generation sequencing as a diagnostic tool for infectious diseases. Clin Infect Dis. 66 (5), 778-788 (2018).
  72. Li, S., et al. One-step diagnosis of infection and lung cancer using metagenomic sequencing. Respir Res. 26 (1), 48(2025).
  73. Liu, B., et al. Onco-mNGS facilitates rapid and precise identification of the etiology of fever of unknown origin: a single-centre prospective study in North China. BMC Infect Dis. 24 (1), 1475(2024).
  74. Gu, W., et al. Detection of cryptogenic malignancies from metagenomic whole genome sequencing of body fluids. Genome Med. 13 (1), 98(2021).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Больше статей

Диагностика повреждения легкихповреждение легких при лечении ракабронхоальвеолярный лаважцитологический анализпрогрессирование опухолиобнаружение патогеновлегочные инфекции
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.