In vitro Функциональный анализ регуляторных Т-клеток: фокус на пролиферации и дифференцировке

Краткое содержание

Этот протокол предусматривает in vitro стратегию совместной культуры для изучения влияния регуляторных Т-клеток на пролиферацию и дифференцировку эффекторных Т-клеток.

Аннотация

Регуляторные Т-клетки (Treg) играют ключевую роль в поддержании иммунного гомеостаза. Нарушения функции клеток Treg связаны с различными заболеваниями, включая аутоиммунные заболевания, отторжение трансплантаций органов, инфекции и рак. Манипуляция клетками Treg рассматривается как потенциальная терапевтическая стратегия для лечения воспалительных заболеваний, включая аутоиммунные заболевания, отторжение трансплантацией твердых органов, болезни трансплантаты против хозяина и аллергические заболевания. Классические тесты подавления клеток Treg in vitro в основном оценивают тормозящее действие клеток Treg на пролиферацию эффекторных T (Teff) клеток. Однако, помимо пролиферации, дифференцировка Т-клеток важна для выполнения Т-клеток иммунных функций. Таким образом, этот протокол предоставляет модифицированный тест подавления клеток Treg in vitro для изучения влияния клеток Treg на пролиферацию и дифференцировку клеток Teff. В этом протоколе сначала вводится подготовка клеток Treg и наивных Т-клеток мышей, затем стратегия совместного выращивания для изучения регуляторных эффектов клеток Treg на пролиферацию и дифференцировку клеток Teff, включая клетки Th1 и Th17, а также стратегия окрашивания для проточной цитометрии после совместной культуры. Этот in vitro функциональный анализ Treg-клеток может быть использован для изучения влияния Treg-клеток на пролиферацию и поляризацию Т-клеток.

Введение

^CD4+CD25⁺Foxp3⁺ регуляторные T (Treg) клетки являются важными медиаторами иммунного гомеостаза¹. Клетки Treg активно подавляют чрезмерные иммунные реакции и поддерживают толерантность к самоиммунитету, тем самым предотвращая повреждение нормальных тканей и органов со стороны^{иммунных реакций 2}. Манипуляция клетками Treg рассматривается как потенциальная терапевтическая стратегия для лечения воспалительных заболеваний, таких как аутоиммунные заболевания, отторжение трансплантации твердых органов, болезнь трансплантата против хозяина и аллергические^{заболевания 3,4,5}. В то же время ингибирование функции клеток Treg считается эффективной стратегией активации противоопухолевого^{иммунитета 6,7}. Клинические исследования изучали адсекционную регуляторную терапию Т-клеточными клетками или низкодозовое лечение IL-2 при аутоиммунных заболеваниях, трансплантации твердых органов и болезни трансплантата против^{хозяина 8,9,10}. Кроме того, исследования модифицированных Treg-клеток, включая клетки химерного антигенного рецептора (CAR)-Treg и T-клеточные рецепторы (TCR)-Treg, также привлекают всё больше^{внимания 11,12}.

На сегодняшний день терапия Treg-клетками не была широко распространена в рутинной клинической терапии. Для поддержки клинического применения терапии Treg клеточной терапии важно систематические исследования и оценку её функций. Распространённой стратегией оценки функций регуляторных Т-клеток in vitro является in vitro тест на подавление^{Treg 13}, который позволяет обнаружить супрессивную функцию Treg клеток на пролиферации эффекторных T (Teff) клеток. Однако стандартный тест подавления Treg in vitro не оценивает дифференцировку клеток Теффа. Если одновременно оценивать пролиферацию и дифференцировку эффекторных Т-клеток, можно получить дополнительную информацию о функции регуляторных Т-клеток.

Здесь представлен модифицированный тест подавления клеток Treg in vitro , называемый «функциональный анализ клеток Treg in vitro » (рисунок 1). Этот протокол предусматривает стратегию in vitro ко-культуры для изучения влияния клеток Treg на пролиферацию и дифференцировку клеток Teff.

Протокол

Все эксперименты на мышях были одобрены Комитетом по этике животных в Западнокитайской больнице, Сычуаньский университет (Одобрение No 20250814006, 20211212A). Все мыши, использованные в этом эксперименте, имели генетический фон C57BL/6.

1. Подготовка растворов

1. Подготовьте буфер для сортировки клеток, активируемых флуоресценцией (FACS): 1× PBS, содержащий 0,5% бычий сывороточный альбумин (BSA).
2. Подготовьте буфер для магнитно-активированной сортировки клеток (MACS): 1× PBS содержит 0,5% BSA и 2 мМ эттилендиаминовой тетрауксусной кислоты (EDTA).
3. Подготовьте клеточную культурную среду: среду RPMI 1640 с 10% плодовой бычьей сывороткой (FBS), 1 мМ пирувата натрия, 2 мМ L-глутамина, 10 мМ HEPES, 55 мкм β-меркаптоэтанола, 100 Ед/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина.

2. Подготовка мышиных лимфоцитов C57BL/6

1. Возьмите селезёнку и периферические лимфатические узлы (LN) мыши C57BL/6 возрастом 6–8 недель (самца или самки) в стерильных условиях и поместите их в центрифугную трубку объемом 50 мл с 5 мл буфера FACS.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Вскрытие селезёнки и ЛН должно проводиться согласно стандартным процедурам.
2. Поставьте сито для клеток 70 мкм на трубку центрифугы объемом 50 мл, затем селезенка и LN на сито и используйте поршень шприца на 5 мл для аккуратного измельчения ткани в течение 1 минуты. Во время шлифовки промывайте сито 3 раза буфером FACS. Обязательно полностью измельчите всю ткань и промывайте клетки в центрифугной трубке. После измельчения снимите сито.
3. Центрифуга при 4 °C, 350 × г в течение 7 минут.
4. Удалите супернатант, снова суспензируйте клеточную гранулу в 3 мл буфера лизиса эритроцитов и оставьте суспензию при комнатной температуре на 3–5 минут.
5. Немедленно добавьте буфер FACS к центрифугной трубке объёмом 15–20 мл для завершения лизиса и центрифугуйте при температуре 4 °C 350 × г в течение 7 минут.
6. Удалите супернатант, добавьте 10 мл буфера FACS и аккуратно суспензуйте клеточную гранулу.
7. Возьмите 10 мкл клеточной суспензии и используйте трипан-синий окрашивание для подсчета всего живых лимфоцитов.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Эти клетки — это лимфоциты CD45.2⁺ .

3. Подготовка мышиных лимфоцитов CD45.1

1. Возьмите селезёнку и LN мыши CD45.1 возрастом 6–8 недель (самца или самки) в стерильных условиях и поместите их в центрифугную трубку объемом 50 мл с 5 мл буфера FACS.
2. Подготовьте лимфоциты мыши CD45.1, следуя тем же шагам, что описаны выше.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Эти клетки — это лимфоциты CD45.1⁺ .

4. Подготовка наивных Т-клеток CD45.2⁺CD4⁺CD62L⁺

ПРИМЕЧАНИЕ: Весь процесс использует CD4⁺CD62L⁺ T Cell Isolation Kit для MACS. Буфер MACS предварительно охлаждается при 4 °C, а при всех условиях центрифугирования — 4 °C, 350 × г в течение 7 минут.

1. Соберите суспензию клеток с мышей C57BL/6, центрифугите и выбросьте супернатант, добавьте 400 мкл буфера MACS и 100 мкл коктейля биотина и антитела CD4⁺ T клеток на каждые 1 ×^{10 8} начальных целых клеток. Аккуратно перемешайте и инкубуйте при 4 °C в течение 5 минут в темноте.
2. Добавьте 300 мкл буфера MACS и 200 мкл антибиотиновых микрошариков в пробирку центрифуга, начиная с шага 4,1 на 1 × 10⁸ начальных целевых клеток. Аккуратно перемешайте и инкубуйте при 4 °C в течение 10 минут в темноте.
3. Добавьте 10 мл буфера MACS, центрифугу и сбросьте супернатант. Повторно подвесьте клеточную гранулу в 2 мл буфера MACS.
4. Поместите колонку LS на соответствующий магнитный сепаратор сортировки MACS. Используйте 3 мл буфера MACS, чтобы промыть колонку. Дождитесь, пока буфер в колонке полностью не сливается, прежде чем переходить к следующему этапу.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Максимальная грузоподъемность ячеек колонки LS составляет 2 × 10⁹ ячеек, включая как положительные, так и отрицательные ячейки, а максимальное количество положительных ячеек, которые она может захватить — 1 × 10⁸. Обычно для одной мыши нужен только один столбец LS.
5. Загрузите подвеску ячейки с шага 4.3 на колонку LS. Когда суспензия ячейки полностью попадёт в колонку, используйте 3 мл буфера MACS для промывки колонки. Соберите всю проточную жидкость в новую центрифугную трубку на 15 мл.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Это общее количество ^CD4+CD25^– Т-клеток.
6. Центрифугуйте общие ^CD4+CD25^– Т-клетки, полученные на шаге 4.5, отбросьте супернатант и получите клеточную гранулу.
7. Добавьте 800 мкл буфера MACS и 200 мкл микрошариков CD62L в клеточную гранулу на 1 × 10⁸ начальных целевых клеток. Аккуратно перемешайте и инкубуйте при 4 °C в течение 10 минут в темноте.
8. Добавьте 10 мл буфера MACS в трубку центрифуги, центрифугуйте и сбросьте супернатант, а затем снова суспензируйте ячеточную гранулу в 500 мкл буфера MACS.
9. Разместите столбец MS на соответствующий магнитный сепаратор сортировки MACS и используйте буфер MACS объемом 1 мл, чтобы промыть колонку.
10. Загрузите подвеску ячейки на колонку MS. Когда подвеска полностью попадёт в колонну, используйте 1 мл буфера MACS для промывки колонны 2 раза.
11. Снимите колонку MS из магнитного сепаратора и поставьте её на новую 15-мл-центрифугную трубку. Добавьте 1 мл буфера MACS в колонку и немедленно нажимайте на поршень, чтобы элюировать клетки, маркированные магнитными шариками.
12. Посчитайте клетки, центрифугуйте и уберите супернатант, снова подвесьте клетки в соответствующем объёме культурной среды и держите трубку на льду.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эти клетки — CD45.2⁺CD4⁺CD62L⁺ наивные Т-клетки. Обычно примерно 8 × 10⁶ к 1 × 10^{7 CD4+}CD25^–CD62L⁺ можно очистить из одной мыши; включение периферических лимфатических узлов может увеличить урожай.
13. Определите чистоту изолированных клеток: возьмите 5 × 10⁴ изолированных ^CD4+CD62L⁺ Т-клеток и ресуспензируйте их в 50 мкл раствора антител в центрифугной пробирке на 1,5 мл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте раствор антител, добавив антитела CD4 PerCP-Cy5.5 против мышей, антитела CD62L FITC и антитела CD25 PE в буфер FACS в соотношении 1:100.
14. После 20-минутной инкубации при 4 °C в темноте добавьте 1 мл буфера FACS для промывки клеток. Центрифугуйте клетки, удалите супернатант и снова суспензуйте гранулу в 200 мкл буфера FACS.
15. Определить чистоту образцов с помощью проточной цитометрии.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для подробностей анализа потокового цитометра обратитесь к руководству пользователя прибора или ранее указанному^{протоколу 14}. Чистота наивных Т-клеток CD4⁺CD25^–CD62L⁺ должна превышать 95% в изолированном образце Т-клеток (см. рисунок 2).

5. Подготовка клеток CD45.1⁺CD4⁺CD25⁺ и клеток, обогащённых антигеном, не CD4⁺

ПРИМЕЧАНИЕ: Весь процесс использует CD4⁺CD25⁺ Regulatory T Cell Isolation Kit для MACS, а инструкции в наборе оптимизированы для одновременного получения клеток, обогащённых антиген-презентирующими (APC), неCD4⁺ клеток, и клеток, обогащённых CD4⁺CD25⁺ . Буфер MACS предварительно охлаждается при 4 °C, а при всех условиях центрифугации — 4 °C, 350 × г в течение 7 минут.

1. Собрать суспензию клеток с мышей CD45.1, провести центрифугу и выбросить супернатант, добавить 400 мкл предварительно охлаждённого буфера MACS и 100 мкл коктейля CD4⁺CD25⁺ Regulatory T Cell Biotin-Antibody в трубку на 1 ×¹⁰ 8 начальных целых клеток. Аккуратно перемешайте и инкубуйте при 4 °C в течение 10 минут в темноте.
2. Без промывки непосредственно добавьте 380 мкл предварительно охлаждённого буфера MACS, 200 мкл антибиотиновых микрошариков и 20 мкл антитела CD25-PE на 1 × 10⁸ начальных цельных клеток в пробирку центрифуги с шага 5.1. Аккуратно перемешайте и инкубуйте при 4 °C в течение 15 минут в темноте.
3. Добавьте 10 мл буфера MACS в трубку центрифуга, центрифугу и сбросьте супернатант, затем снова суспензуйте гранулу клетки в 500 мкл буфера MACS на 1 × 10⁸ начальных ячейок.
4. Поместите LD-колонку на соответствующий магнитный разделитель сортировки MACS и промите колонку 2 мл буфера MACS. Дождитесь, пока буфер в колонке полностью не сливается, прежде чем переходить к следующему этапу.
5. Медленно загрузите подвеску ячеек с шага 5.3 на LD-колонку. Когда суспензия ячейки полностью попадёт в колонку, промыйте колонку 2 мл буфером MACS. Соберите всю проточную жидкость в новую центрифугную трубку на 15 мл.
6. Снимите LD-колонку из магнитного сепаратора и поставьте её на новую 15-мл-центрифугную трубку. Добавьте 3 мл буфера MACS в колонку LD, немедленно сильно нажмите на поршень, чтобы изгнать клетки, маркированные микрошариками, не CD4⁺ . Посчитайте клетки, центрифугайте, ресуспензируйте клетки в соответствующем объёме среды для достижения концентрации 1 × 10⁷ клеток/мл и держите трубку в состоянии льда.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Эти клетки без ^CD4+ в основном состоят из АПК, таких как макрофаги, дендритные клетки и В-клетки. В этом протоколе эти клетки используются как обогащённая APC не-CD4⁺ фракция.
7. Центрифугуйте все ^CD4+ Т-клетки, собранные на шаге 5.5, отбросьте супернатант и получите клеточную гранулу.
8. Добавьте 900 мкл буфера MACS и 100 мкл анти-ПЭ-микрошариков в клеточную гранулу на 1 × 10⁸ начальных целевых клеток. Аккуратно перемешайте и инкубуйте при 4 °C в течение 15 минут в темноте.
9. Поместите столбец MS на соответствующий магнитный разделитель сортировки MACS и промыйте колонку 500 мкл предварительно охлаждённого буфера MACS. Дождитесь, пока буфер в колонке полностью не сливается, прежде чем переходить к следующему этапу.
10. Медленно загрузите подвеску элемента с шага 5.8 на колонку MS. Когда подвеска ячейки полностью попадёт в колонку, промыйте колонку 2 раза буфером MACS объемом 1 мл. Соберите проточную жидкость в новую центрифугную трубку на 15 мл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки в проточной жидкости в данный момент — это ^CD4+CD25^– Т-клетки.
11. Отсоедините колонку MS от магнитного сепаратора и разместите её поверх новой центрифугной трубки объемом 15 мл. Добавьте 1 мл буфера MACS в колонку, затем немедленно нажмите на поршень, чтобы восстановить магнитные шарики CD4⁺CD25⁺ с обогащением Treg.
12. После подсчёта ячеек центрифугуйте суспензию и удалите супернатант. Суспензируйте гранулу в достаточном сохранившем столе для получения конечной концентрации 2 ×^{10 6} клеток/мл и держите трубку во льду.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эти клетки являются CD45.1^+CD4+CD25⁺ обогащёнными Трегами. Обычно примерно 8 × 10⁵ к 1 × 10^{6 клеток} CD4⁺CD25⁺ можно очистить из одной мыши; включение периферических лимфатических узлов может увеличить урожай.
13. Определить чистоту изолированных клеток CD4⁺CD25⁺ Treg: взять 5 × 10⁴ изолированных клеток ^CD4+CD25⁺ Treg и 5 ×^{10 4} изолированных клеток с обогащенным APC не CD4⁺ соответственно и ресуспензировать их в 50 мкл раствора антител.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте раствор для антител, добавив антитела CD4 PerCP-Cy5.5 против мышей и антитела CD25 PE в буфер FACS в соотношении 1:100. Используйте то же антитело CD25 PE, чтобы подтвердить, что клетки CD4⁺CD25⁺ адекватно маркированы и что в не-CD4+ фракции нет Т-клеток ^CD4+CD25⁺. Для более строгой идентификации клеток Treg также можно провести внутриклеточное окрашивание антителами Foxp3 PB против мышей.
14. После 20-минутной инкубации при 4 °C в темноте добавьте 2 мл буфера FACS для промывки клеток. Центрифугуйте клетки, удалите супернатант и снова суспензуйте гранулу в 200 мкл буфера FACS.
15. Определить чистоту образцов с помощью проточной цитометрии.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Частота клеток CD4⁺CD25⁺ должна быть ≥ 95%, чтобы обеспечить чистоту популяции клеток, обогащённых Treg, соответствующим экспериментальным требованиям (рисунок 2). Клетки, не содержащие ^CD4+ , используемые в качестве фракции, обогащённой APC, должны содержать не более 5% ^CD4+ Т-клеток (рисунок 2).

6. Маркировка наивных ^CD4+ Т-клеток красителем пролиферации клеток

ПРИМЕЧАНИЕ: Все условия центрифуга: 4 °C, 350 × г в течение 7 минут. Буфер PBS предварительно уравновешивают до комнатной температуры перед использованием. Процесс маркировки проводится под лёгкой защитой, чтобы избежать закалки красителем.

1. Возьмите наивную суспензию CD4⁺ Т-клеток, центрифуга, отбросьте супернатант и получите клеточную гранулу.
2. Разбавить краситель пролиферации клеток eFluor 450 в PBS для получения концентрации 20 мкм при комнатной температуре.
3. Добавьте 0,5 мл PBS на 1 × 10⁷ клеток. Держите трубку наклонённой примерно под углом 45° и аккуратно подвешивайте клетки, поднимая и опуская 50 раз.
4. Быстро добавьте равный объём раствора красителя для пролиферации клеток в суспензию, чтобы конечная концентрация красителя для пролиферации составила 10 мкм. Держите трубку наклонённой примерно под углом 45° и смешивайте клетки, пипетируя вверх и вниз 50 раз, чтобы обеспечить полный контакт между клетками и красителем пролиферации.
5. Сразу же обмотайте трубку центрифугой алюминиевой фольгой, чтобы избежать освещения. Инкубировать при комнатной температуре в течение 20 минут. Аккуратно вихрьте клетки каждые 5 минут, чтобы предотвратить их скопление.
6. Добавьте 10 мл предварительно охлаждённой среды для культуры клеток в трубку центрифуги, аккуратно прокрутите вихрь для прекращения окрашивания, затем центрифугайте и сбросьте супернатант.
7. Добавьте 5 мл предварительно охлаждённой среды для культуры клетки в клеточную гранулу, центрифугу и сбросьте супернатант для промывки клеток.
8. Снова добавьте 5 мл предварительно охлаждённой среды для культуры клеток в клеточную гранулу и снова суспензуйте клетки.
9. Посчитайте клетки, центрифугите и отстраните супернатант, снова суспензуйте клетки в соответствующем объёме культурной среды для достижения концентрации 2 × 10⁶ клеток/мл и держате трубку во льду.

7. Создание in vitro функционального анализа клеток Treg

1. Рассчитать количество образцов, необходимых для культуры клеток, подготовить соответствующее количество среды с антителами CD3 против мышей с содержанием 2,5 мкг/мл или указанными индукционными цитокином, и аккуратно провёл вихрь подготовленных CD45.2⁺CD4⁺CD62L⁺ наивных Т-клеток, CD45.1^+CD4+CD25⁺ обогащённых Treg клетки и необогащённые ^АПК4+ клетки.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте CD45.2⁺CD4⁺CD62L⁺ наивные Т-клетки в качестве ответчиков T (Tresp). В этом примере эксперимента изучается влияние Treg-клеток на дифференцировку и пролиферацию клеток Th1 и Th17. Таким образом, для клеточной культуры существует всего четыре образца: клетки Tresp, культивируемые при условиях индукции Th1 или Th17, при отсутствии или наличии клеток, обогащённых Treg.
2. Добавьте 100 мкл CD45.2⁺CD4⁺ наивных Т-клеток (2 × 10⁵ клеток на колодцу) в пластину с 48 ячелинами.
3. Добавьте 100 мкл CD45.1⁺ обогащённых APC неCD4⁺ клеток (1 × 10⁶ клеток на колодцу) в пластину с 48 ячеями.
4. Добавьте 100 мкл CD45.1⁺CD4⁺CD25⁺ обогащённых Treg (2 × 10⁵ клеток на скважину) в экспериментальные скважины и 100 мкл клеточной культурной среды в контрольные скважины. Соотношение клетки:тресп, обогащённые Трегом, в экспериментальных образцах составляет 1:1.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Соотношение ячеек Treg и Tresp может быть зададено по необходимости, либо можно спроектировать панель с несколькими коэффициентами. Количество клеток Tresp фиксируется в совместной культуре, тогда как количество клеток Treg может изменяться по мере необходимости. Обычно соотношения Treg к Tresp в экспериментальных образцах включают 1:1, 1:2, 1:4, 1:8, 1:16 и 0:1. Кроме того, каждое экспериментальное условие можно подготовить в трёх экземплярах для минимизации случайной экспериментальной ошибки. Здесь, для ясности, основываясь на предыдущем опыте^{исследований 15,16}, приводится соотношение 1:1 в качестве примера.
5. Добавьте 100 мкл среды клеточной культуры, содержащего 2,5 мкг/мл антитела CD3 против мышей в каждую яму.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Конечная концентрация антитела CD3 к мышам составляет 0,5 мкг/мл. Помимо экспериментальных образцов, установите пустой контрольный образец без антитела CD3 против мышей. В этом образце добавьте 100 мкл среды для культуры Т-клеток без антитела CD3 против мышей, чтобы определить интенсивность флуоресценции непролиферированных Т-клеток или интенсивность пика 0. Это позволяет точно калибровать распределение пролиферации.
6. Добавьте 100 мкл среды клеточной культуры с указанными цитокинами в каждую яму, чтобы итоговый объём каждой ямы составил 500 мкл.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В этом эксперименте рекомбинантный мышь IL-12 p70 при конечной концентрации 10 нг/мл используется для индуцирования клеток Th1, а рекомбинантный человеческий TGF-β1 при конечной концентрации 2 нг/мл и рекомбинантный мышь IL-6 при 50 нг/мл применяются для индуцирования клеток Th17.
7. Добавьте PBS в оставшиеся пустые скважины (500 мкл/скважину), чтобы поддерживать влажность пластины и уменьшать влияние краёв.
8. Инкубировать пластину с 48 лунками в инкубаторе с 5%_CO2 при 37 °C в течение 3 дней.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В этой системе совместной культуры растворимое антитело CD3 к мышиным препаратам обеспечивает сигнал первичного Т-клеточного рецептора (TCR) для активации Т-клеток, а обогащённые APC неCD4⁺ клетки обеспечивают костимуляторные сигналы для полной активации Т-клеток. TCR и костимуляторные сигналы также могут быть вызваны пластинчатыми антителами к CD3 у мышей и растворимыми антителами к CD28 у мышей. Исследователи могут выбрать метод стимуляции по мере необходимости.

8. Функциональный анализ Treg клеток in vitro

ПРИМЕЧАНИЕ: Все условия центрифуга: 4 °C, 350 × г в течение 7 минут.

1. Аккуратно пипетируйте культивированные клетки для повторной суспензии и перенесите суспензию в центрифугную трубку объемом 1,5 мл. Центрифугуйте клетки и удалите супернатант.
2. Добавьте в каждую трубку 500 мкл среды для клеточной культуры, содержащего 5 нг/мл PMA, 1 мкг/мл иономицина и разбавленный ингибитор транспорта белка GolgiPlug в соотношении 1:1 000, мягко создайте вихрь для повторной суспензии клеток и инкубируем их в инкубаторе с 5%_CO2 при 37 °C в течение 3 часов.
3. Центрифуга, удаление супернатаната, добавление 50 мкл PBS с одним тестом красителя Zombie Yellow и разбавленный антитело CD16/32 1:100 в каждый образец, вихрь и инкубация при комнатной температуре в темноте в течение 15 минут, чтобы маркировать мёртвые клетки и блокировать Fc-рецепторы.
4. Центрифуга, выбросьте супернатант, добавьте 50 мкл поверхностного коктейля антител, вихрьте и инкубируем при 4 °C в темноте в течение 20 минут.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Добавьте антитела против CD4 PerCP-Cy5.5, антитела к CD45.1 FITC и анти-CD45.2 APC-eFluor 780 в буфер FACS в соотношении 1:200, чтобы подготовить коктейль поверхностного антитела.
5. Добавьте 1 мл буфера FACS в каждую трубку центрифуга, центрифугу и сбросьте супернатант.
6. Добавьте 300 мкл раствора фиксации и проницаемости в каждую трубку центрифуга, вихрь и инкубировать при температуре 4 °C в темноте в течение 20 минут.
7. Добавьте 1 мл буфера 1× Permeabilization/Wash (Perm/Wash) в каждую трубку центрифуга, центрифугу и сбросьте супернатант; Затем повторите этот этап промывания один раз, чтобы полностью удалить остаточный фиксатор.
8. Добавьте 50 мкл коктейля с цитокиновыми антителами, вихрьте и инкубировать при 4 °C в темноте в течение 40 минут.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Добавьте антитела к IFN-γ PE и антитела к IL-17A PE-Cy7 в буфер Perm/Wash в соотношении 1:100, чтобы подготовить коктейль антитела к цитокинам.
9. Промыйте каждый образец с помощью 1 мл буфера Perm/Wash, центрифугуйте клетки и удалите супернатант. Подвесьте гранулу в 300 мкл буфера FACS.
10. Измерять пролиферацию и дифференцировку клеток Tresp с помощью потоковой цитометрии. Используйте следующую стратегию гейтинга (рисунок 3): во-первых, изолировать популяцию лимфоцитов среди всех клеток и исключить остатки и примеси; во-вторых, провести гейт для популяции одной клетки среди лимфоцитов на основе сигналов рассеяния; В-третьих, зарегистрировать живую популяцию клеток между отдельными клетками; в-четвёртых — отключить популяцию ^CD4+ Т-клеток среди живых клеток; в-пятых, открыли CD45.1⁺ популяцию клеток, обогащённых Трегом, и CD45.2⁺ Теффа среди CD4⁺ Т-клеток; шестое — клетки CD45.2^+CD4+IFN-γ⁺ Th1, CD45.2^+CD4+IL-17A⁺ Th17 и непролиферированные CD45.2⁺CD4⁺ Т-клетки среди CD45.2⁺ Т-клеток.
11. Проведите сбор данных потоковой цитометрии и проанализируйте данные потоковой цитометрии.
    1. Используйте культивированные Т-клетки, помеченные красителем для пролиферации клеток eFluor 450, в качестве однократного контроля цвета клеточной пролиферации. Подготовьте контрольный тест Zombie Yellow с одним окрашением с культивированными Т-клетками, которые не были помечены красителем для пролиферации клеток. Подготовьте остальные одноокрашенные элементы с компенсационными шариками для каждого используемого флуорофора.
    2. Используйте Т-клетки, маркированные красителем пролиферации клеток eFluor 450 и культивируемые без антитела к CD3 против мышей, чтобы определить ворота непролиферированных клеток.
    3. Используйте культивированные Т-клетки, помеченные красителем для пролиферации клеток и окрашенные красителем Zombie Yellow, антитела к поверхности клеток и изотипные контроли антитела IFN-γ PE и антитела IL-17A PE-Cy7 для мышей для определения ворот клеток IFN-γ^+CD4+ и IL-17A⁺CD4⁺ Т-клетки.

Результаты

В репрезентативном эксперименте наивные Т-клетки использовались в качестве клеток Tresp для изучения влияния клеток, обогащённых Treg, на пролиферацию и дифференцировку клеток Th1 и Th17. В этом эксперименте клетки Tresp активировались противомышиными клетками CD3 и APC, обогащёнными не CD4⁺ , а затем дифференцировались в клетки Th1 при индукции IL-12 p70 или в клетки Th17 при индукции TGF-β1 и IL-6. При этих двух индукционных условиях были изучены изменения в пролиферации и дифференцировке клеток Tresp после ...

Обсуждение

В этом исследовании результаты ко-культуры при индукции Th1 соответствуют предыдущим сообщениям о том, что клетки Treg могут подавлять пролиферацию и дифференцировку клеток Th1^17,18. Клетки, обогащённые трегами, также подавляли пролиферацию Tresp-клеток при индукции Th17. Однако при условиях поляризации Th17, используемых здесь, частота клеток IL-17A⁺ Tresp увеличивалась в присутствии клеток, обогащённых Treg, что отли...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
1.5 мл центрифужная пробирка	Thermo Fisher Scientific	3457IW	или эквивалент
12.5 μL фильтрованные наконечники для пипетки	Thermo Fisher Scientific	94420043	или эквивалент
1250 μL фильтрованные наконечники для пипетки	Thermo Fisher Scientific	94420813	или эквивалент
15 мл конические центрифужные пробирки	Thermo Fisher Scientific	339650	или эквивалент
200 μL фильтрованные наконечники для пипетки	Thermo Fisher Scientific	94420318	или эквивалент
48-лунковые пластинки	Corning Incorporated	3548	или эквивалент
5 мл поршень шприца	Shifeng Medical	SB2-061(A)	или эквивалент
50 мл конические центрифужные пробирки	Thermo Fisher Scientific	339652	или эквивалент
50 μL фильтрованные наконечники для пипетки	Thermo Fisher Scientific	94420258	или эквивалент
70 μм клеточный фильтр	Biosharp Life Sciences	BS-70-CS	или эквивалент
Анти-мышиное антитело к CD28	BioXcell	BE0015-1	или эквивалент
Анти-мышиное антитело к CD3	BioXcell	BE0001-1	или эквивалент
Анти-мышиное антитело к Foxp3 PB (FJK-16s)	Thermo Fisher Scientific	45-0042-82	или эквивалент
Анти-мышиное антитело к IFN-gamma PE (XMG1.2)	BioLegend	505808	или эквивалент
Анти-мышиное антитело к IL-17A PE-Cy7 (eBio17B7)	Thermo Fisher Scientific	25-7177-82	или эквивалент
Потокометр Beckman CytoFLEX S	Beckman Coulter	N/A	для сбора данных цитометрии потоков клеток-иммунологов
Белок сыворотки быка (BSA)	Sigma-Aldrich	B2064	или эквивалент
Мыши C57BL/6	Shanghai Model Organisms Center, Inc	SM-001	для выделения первичных лимфоцитов и подгрупп Т-клеток
Моноклональное антитело к CD25 (PC61.5), PE	Thermo Fisher Scientific	12-0251-83	или эквивалент
Набор для выделения регуляторных Т-клеток CD4+CD25+, мыши	Miltenyi Biotec	130-091-041	для сортировки клеток
Набор для выделения Т-клеток CD4+CD62L+, мыши	Miltenyi Biotec	130-106-643	для сортировки клеток
Мыши CD45.1	Shanghai Model Organisms Center, Inc	NM-KI-210226	для выделения первичных лимфоцитов и подгрупп Т-клеток
Моноклональное антитело к CD45.1 (A20), FITC	Thermo Fisher Scientific	11-0453-85	или эквивалент
Моноклональное антитело к CD45.2 (104), APC-eFluor 780	Thermo Fisher Scientific	47-0454-82	или эквивалент
Моноклональное антитело к CD62L (L-Selectin) (MEL-14), FITC	Thermo Fisher Scientific	11-0621-85	или эквивалент
Набор для фиксации/проникновения Cytofix/Cytoperm	BD Biosciences	554714	или эквивалент
eBioscience Краситель для определения пролиферации клеток eFluor 450	Thermo Fisher Scientific	65-0842-90	или эквивалент
Этилендиаминтетраацетатная кислота (ЭДТА)	Solarbio Life Sciences	E1170	или эквивалент
Фета́льная сыворотка быка	Thermo Fisher Scientific	A5669701	или эквивалент
FlowJo 10.6.2	BD Biosciences	N/A	программное обеспечение для анализа данных цитометрии потоков
Голги-Плаг Ингибитор транспорта белков	BD Biosciences	555029	или эквивалент
HEPES (1 М)	Thermo Fisher Scientific	15630080	или эквивалент
Гуманный TGF-бета1	PEPROTECH	100-21C	или эквивалент
Иономиицин кальция	Millipore Sigma	I3909	или эквивалент
Колонки LD	Miltenyi Biotec	130-042-901	для сортировки клеток
L-Глутамин (200 мМ)	Thermo Fisher Scientific	25030081	или эквивалент
Колонки LS	Miltenyi Biotec	130-042-401	для сортировки клеток
MACS MultiStand	Miltenyi Biotec	130-042-303	для сортировки клеток
Колонки MS	Miltenyi Biotec	130-042-201	для сортировки клеток
ОктоMACS сепараторы	Miltenyi Biotec	130-042-109	для сортировки клеток
PBS, pH 7.4	Thermo Fisher Scientific	10010049	или эквивалент
PE Rat IgG1, κ Isotype Ctrl Antibody	BioLegend	400408	или эквивалент
PE/Cyanine7 Rat IgG2a kappa Isotype Control Antibody	Thermo Fisher Scientific	25-4321-82	или эквивалент
Пенициллин-стрептомицин	Thermo Fisher Scientific	15140122	или эквивалент
PMA	Millipore Sigma	P8139	или эквивалент
Очищенное антитело к