$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Высокое разрешение Открытый Родные Electophoresis гель (hrCNE) для митохондриальной комплекс В-гель Анализы активность
Человека эмбриональные стволовые клетки (ЭСК) были сохранены на монослой ˠ-облученных или митомицин С обработанных мышиных эмбриональных фибробластов (MEFs), затем перешел на рост на Матригель течение 5 дней в МЭФ-кондиционированной среды с использованием стандартных условиях. Для удаления загрязняющих MEFs, ЭСК были повторно высевают на Матригель и выросли в МЭФ-кондиционированной среды для дополнительных 3 дня. Иммунофлуоресценции микроскопии для маркеров плюрипотентности Oct-4 и SSEA-4 была использована для подтверждения отсутствия чЭСК дифференциации.
- Вымойте клеток с теплой 1x PBS, рН 7,4, после чего трипсинизации (1 мл 1 раз трипсина на лунку в 6-луночный планшет) в течение 5 мин.
- Добавить равный объем свежей ингибитора трипсина (1mg/ml в 1x PBS, рН 7,4). Урожай клеток и центрифуге при 200 г, 5 мин, при комнатной температуре.
- Удалите супернатант и гранулированный ресуспендирования клеток в 0,8 - 1.7ml (исходя из размера осадок клеток) ледяной митохондрий буфера изоляция (83 мм сахароза; 6,6 мм имидазола / HCl, рН 7,0) с свежеприготовленный коктейль ингибиторов протеаз 1 '. Инкубировать на льду в течение 10 мин.
- Dounce клеток с гомогенизатор (~ 40 - 50 ударов). Пятно аликвоту dounced клеток с трипанового синего для проверки полноты гомогенизации использованием светового микроскопа.
- Центрифуга на 20000 г в течение 10 мин при 4 ° С до получения сырого митохондриальной гранул, которая также содержит ядер и более крупные фрагменты клетки. Декантировать и отбросить супернатант и весят осажденный сырой митохондриальные гранулы. Гранулы могут храниться при температуре -80 ° C следующий момент замораживания в жидком азоте, если это точки остановки.
ПРИМЕЧАНИЕ: центрифугирования Дифференциальная или другой градиент основе процедур может быть использован для выделения и сбора чистой фракции митохондрий мембраны. См. ссылку. 4 для деталей. Этот альтернативный подход даст митохондриальной сложной деятельности на мг белка митохондрий вместо сложной деятельности на мг веса ячейки или числом. Концентрация митохондриальных белков необходимо будет определена после очистки, чтобы сделать такое сравнение. Кроме того, различные буфера изоляции могут потребоваться для этого подхода. Для солюбилизации чистой фракции митохондрий мембраны, см. примечание следующий шаг 6 ниже.
- Растворения сырой митохондриальной гранул на льду вортексе с ледяной буфера солюбилизации (50 мМ NaCl, 50 мМ имидазола / HCl рН 7,0, 1 мМ EDTA, 2 мМ 6-aminohexanoic кислоты). 6-aminohexanoic кислота может быть заменена 1x коктейль ингибиторов протеазы. Используйте 35μl солюбилизации буфер на 20 мг веса гранул. Добавить 20 мкл 10% вес / дигитонин в 20 мг гранул веса и смешать, щелкая трубки. Инкубируйте в течение 5-10 мин на льду. Додецилсульфата-BD-maltoside или тритона Х-100 может быть заменен на дигитонин для растворения белков. Выбор моющего средства и его количество может влиять на формирование supercomplexes или мультимерные формы митохондриальных комплексов. Для получения дополнительной информации см. задания 1.
ПРИМЕЧАНИЕ: количество моющего средства, необходимые для растворения чистого митохондриальной фракции мембран соответствует моющего средства / белок веса в пределах от 2-6 г / г. Оптимальное соотношение для растворения митохондриальных мембран 2,5 г / г для додецилсульфата-BD-maltoside, 3 г / г для тритона Х-100, и 6 г / г для дигитонин.
- Центрифуга солюбилизированного гранул на 100 000 г в течение 15 мин при 4 ° C. Сбор ясно супернатант.
- Добавить загрузки буфера для окончательного 5% вес / объем глицерина и 0,01% вес / пунцовый S (использование 50% вес / объем глицерина, 0,1% м / о загрузке пунцовый S буферный запас раствора).
- Нагрузка гель скважин с объемом, который содержит 20-40мг сырой митохондриальные гранулы на одну полосу движения. Используйте гель акриламида градиент (4 -13%) с 3,5% укладки гелем.
ПРИМЕЧАНИЕ: подготовка гель-электрофореза и условия:
Для геля, использовать акриламид / бис-акриламида (АА / bisAA) 3 смесь следующим образом: 48 г акриламида и 1,5 г bisacrylamide (49,5% T, 3% C. Если Т является общей концентрации АА и bisAA и С Процент сшивателя (bisAA) в общих мономера).
Гель буфера (3 '): 1,5 6-aminohexanoic кислоты; 75 мм имидазола, рН 7,0
| Градиент геля: | 4% | 13% | Укладка геля: | 3,5% |
| AA / bisAA 3 смеси | 2 мл | 6,5 мл | | 0,6 мл |
| Гель буфера 3 ' | 8,3 мл | 8,3 мл | | 2,7 мл |
| Глицерин | | 5 г | | |
| H 2 O | 14,7 мл | 5 мл | | 4,7 мл |
| Общий объем | 25 мл | 25 мл | | 8 мл |
| 10% APS | 139 мкл | 125 мкл | | 67 мкл |
| TEMED | 14 мкл | 12,5 мкл | | 6,7 мкл |
Анодный буфер: 25 мМ имидазола / HCl, рН 7,0
Катод буфера: 50 мМ Tricine, 7,5 мм имидазола / HCl, 0,02% вес / додецил-BD-maltoside, 0,05% вес / дезоксихолата, рН 7,0
Залейте и запустите гелей в холодном помещении (4-7 ° С). Начальное напряжение 100В используется. Когда образец вступил концентрирующий гель, повышении напряжения до 500В с ограничением тока до 15 мА (по 0,15 '14' 14 см, гели). Электрофорез прекращается через 3-4 ч при резком линии красителя красный пунцовый S подходит гель фронт. Кроме того, гель можно работать на ночь с постоянным напряжением в 70-100В.
- В-гель анализов деятельности. Время инкубации для каждого анализа зависит от эффективности белка солюбилизации и количество материала загружены на лунку. Комплексы I, IV и V обычно дают более сильные сигналы, чем комплексов II и III.
Комплекс I (CI)
Инкубируйте геля с CI буфер (5 мМ Трис-HCl, рН 7,4; 0.1mg/ml NADH; 2.5mg/ml НБТ) при комнатной температуре в течение нескольких часов.
CI буфер: Добавить на 100 мл 5 мМ Трис-HCl, рН 7,4:
0,01 г NADH
0,25 НБТ
Fix гель в 50% метанола и 10% уксусной кислоты в течение 15-45 мин. Фиксированной гель сохраняется в 10% уксусной кислоты.
Комплекс II (CII)
Инкубируйте геля с CII буфер (20 мМ сукцината натрия; 0,2 methasulfate феназина; 2.5mg/ml НБТ; 5 мМ Трис-HCl рН 7,4) при комнатной температуре в течение нескольких часов.
CII буфер: Добавить на 100 мл 5 мМ Трис-HCl, рН 7,4:
200 мкл 1М сукцинат натрия
80μl феназина methasulfate (250 мм PMS растворяется в ДМСО)
0,25 НБТ
Fix гель, как описано для Комплекс I
Комплекс III (CIII)
Инкубируйте геля с CIII буфер (50 мМ фосфат натрия, рН 7,2, 0,05% 3,3 '-диаминобензидина tetrahydrochloride (DAB)) при комнатной температуре в течение нескольких часов.
CIII буфер: Добавить 100 мл 50 мМ натрий-фосфат, рН 7,2:
50 мг диаминобензидина tetrahydrochloride
Fix гель, как описано для Комплекс I
Комплекс IV (CIV)
Инкубируйте геля с ЦИВ буфер (50 мМ фосфат натрия, рН 7,2, 0,05% 3,3 '-диаминобензидина tetrahydrochloride (DAB), 50 мкм лошади сердце цитохром с) при комнатной температуре в течение нескольких часов.
CIV буфер: Добавить 100 мл 50 мМ натрий-фосфат, рН 7,2:
50 мг диаминобензидина tetrahydrochloride
0,1 г лошадь сердце цитохром с
Fix гель, как описано для Комплекс I
Комплекс V (CV)
Инкубируйте геля с CV буфера (35 мм Трис-основание, 270мм глицин, рН 8,3 при 25 ° С, 14мм MgSO 4, 0,2% мас. / Pb (NO 3) 2, 8 мм АТФ) при комнатной температуре в течение нескольких часов.
CV буфера: на 100 мл раствора добавить:
| Трис-основание | 0.424g |
| Глицин | 2.026g |
| MgSO 4 | 0.345g |
| Pb (NO 3) 2 | 0.29g |
Нет необходимости корректировки рН (должно быть 8,3) - не использовать кислоты или основания. Фильтр и добавить
Fix гель в 50% метанола в течение 30 мин и трансфер в воде.