В этом видеоролике показано, как поддержать рост человеческих эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) в фидер бесклеточных условиях и как непрерывно прохождения ЭСК в питатель бесклеточных условиях. Подтверждение чЭСК плюрипотентности, выращенные в питатель бесклеточных условиях с помощью иммунофлуоресценции микроскопии также продемонстрирована. Часть 3 из 3.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
С MEFs к Матригель 3: пассажи из ЭСК Матригель на Матригель
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
В этом видеоролике показано, как поддержать рост человеческих эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) в фидер бесклеточных условиях и как непрерывно прохождения ЭСК в питатель бесклеточных условиях. Подтверждение чЭСК плюрипотентности, выращенные в питатель бесклеточных условиях с помощью иммунофлуоресценции микроскопии также продемонстрирована.
Протокол
Разделение ЭСК из Матригель к Матригель
Обычно сливной 6-луночный планшет из ЭСК на Матригель можно разделить 1:3 до 1:5 до другого Матригель табличка со скважин становится вырожденным снова через 4-5 дней после расщепления.
- CM и Матригель пластин приготовленного, как описано выше, до расщепления.
- В день расщепления, мыть каждую лунку для расщепления с 1 х PBS, pH7.4, добавьте 1 мл 1mg/ml Dispase (разбавленный 5mg/ml маточного раствора с DMEM/F12 средств массовой информации) в каждую лунку и инкубировать при температуре 37 ° C в течение 3 мин.
- Промыть каждую лунку три раза с 1 х PBS, pH7.4, добавьте 1 мл ES ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Эта серия 3 видео демонстрирует, как выращивать человеческие эмбриональные стволовые клетки (ЭСК) на мышиных эмбриональных фибробластов (MEF) фидерных клеток (видео 1), как прохождение их Матригель подачи бесклеточной пластин (видео 2), и как поддерживать ЭСК путем пассажей в Матригель подачи бесклеточных условиях (видео 3). Многочисленные предыдущие исследования показали, что поддержание жизнеспособных, недифференцированные ЭСК требует культуры на инактивированной фидерные клетки MEF. Однако для многих экспериментов, чистая населения ЭСК б.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Благодарности
Человека эмбриональных стволовых клеток исследований в лаборатории Teitell поддерживаются Калифорнийского института регенеративной медицины (CIRM) семена грант RS1-00313. Мы благодарим членов Широкий Центр регенеративной медицины и исследований стволовых клеток в Лос-Анджелесе, особенно доктор Amander Кларк, д-р Джером Зак, и члены UCLA Broad Institute стволовых клеток Основные фонда за поддержку наших исследований.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии | |
|---|---|---|---|---|
| Заменитель сыворотки Knockout (KSR) | Реагент | GIBCO, by Life Technologies | 10828-028 | |
| DMEM/F12 | Реагент | GIBCO, by Life Technologies | 11330-057 | |
| Незаменимые аминокислоты | Реагент | GIBCO, by Life Technologies | 11140-050 | |
| GlutaMax | Реагент | GIBCO, by Life Technologies | 35050-061 | |
| DMEM | Реагент | GIBCO, by Life Technologies | 11995-065 | |
| FBS | Реагент | Clontech Laboratories | 631107 | |
| L-глутамин | Реагент | GIBCO, by Life Technologies | 25030-081 | |
| BME | Реагент | Fisher Scientific | BP176-100 | |
| bFGF | Реагент | R&D Systems | 233-FB-025 | |
| Коллагеназа IV | Реагент | GIBCO, by Life Technologies | 17104-019 | |
| Диспаза | Реагент | Stem Cell Technologies | 17105-041 | |
| Пенициллин / Стрептомицин | Реагент | GIBCO, by Life Technologies | 15140-122 | |
| Желатин | Реагент | Chemicon International | ES-006-B | |
| Matrigel | Реагент | BD Biosciences | 354277 | |
| Антитела к Oct-4 | Реагент | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | SC-9081 | |
| Конъюгат анти-h/mSSEA-4 с фико–эритрином, мышиный IgG3 | Реагент | R&D Systems | FAB1435P | |
| FITC-конъюгированные антикроличьи IgG | Реагент | Jackson ImmunoResearch | 715-095-152 |
Ссылки
- Thomson, J. amesA., Itskovitz-Eldor, J. oseph, Shapiro, S. anderS., Waknitz, M. ichelleA., Swiergiel, J. enniferJ., Marshall, V. ivienneS., Jones, J. effreyM. Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts . Science. 282, 1145-1147 (1998).
- Xu, C. hunhui, Inokuma, M. argaretS., Denham, J. errod, Golds, K. athaleen, Kundu, P. ratima, Gold, J. osephD., Carpenter, M. elissaK.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
