В этом видеоролике показано, как поддержать рост человеческих эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) в фидер бесклеточных условиях и как непрерывно прохождения ЭСК в питатель бесклеточных условиях. Подтверждение чЭСК плюрипотентности, выращенные в питатель бесклеточных условиях с помощью иммунофлуоресценции микроскопии также продемонстрирована. Часть 3 из 3.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
С MEFs к Матригель 3: пассажи из ЭСК Матригель на Матригель
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
В этом видеоролике показано, как поддержать рост человеческих эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) в фидер бесклеточных условиях и как непрерывно прохождения ЭСК в питатель бесклеточных условиях. Подтверждение чЭСК плюрипотентности, выращенные в питатель бесклеточных условиях с помощью иммунофлуоресценции микроскопии также продемонстрирована.
Протокол
Разделение ЭСК из Матригель к Матригель
Обычно сливной 6-луночный планшет из ЭСК на Матригель можно разделить 1:3 до 1:5 до другого Матригель табличка со скважин становится вырожденным снова через 4-5 дней после расщепления.
- CM и Матригель пластин приготовленного, как описано выше, до расщепления.
- В день расщепления, мыть каждую лунку для расщепления с 1 х PBS, pH7.4, добавьте 1 мл 1mg/ml Dispase (разбавленный 5mg/ml маточного раствора с DMEM/F12 средств массовой информации) в каждую лунку и инкубировать при температуре 37 ° C в течение 3 мин.
- Промыть каждую лунку три раза с 1 х PBS, pH7.4, добавьте 1 мл ES СМИ без bFGF, с помощью мобильного скребок, чтобы очистить колонии со дна колодца, собирать приостановлено ЭСК в 50 мл трубки сокола, и гранул путем центрифугирования на 200 г в течение 5 мин при комнатной температуре.
- Для повторного пластины ЭСК на пластинах Матригель, первой стирки Матригель пластин с DMEM/F12 и добавить 2,5 мл СМ дополнена 10ng/ml bFGF на лунку. Ресуспендируют чЭСК пеллет в соответствующий объем СМ дополнена 10ng/ml bFGF, пипетка клеточной суспензии вверх и вниз три раза. (ПРИМЕЧАНИЕ: При ЭСК для расщепления происходят из Матригель пластин, сгустки очень легко сломать, поэтому три раунда пипетирования достаточно и больше пипетки может чрезмерно нарушить колоний и сделать отдельные клетки.) Алиготе 0,5 мл чЭСК сгустки суспензии в а из 6-луночный планшет Матригель для достижения 3 мл на лунку, как конечного объема. Место пластины в 37 ° С инкубатор.
Обнаружение маркеров плюрипотентности помощью иммунофлуоресценции микроскопии
Иммунофлуоресценции микроскопии для изучения экспрессии маркеров плюрипотентности чЭСК Oct-4 и SSEA-4 во время культивирования.
- Аспирируйте средств массовой информации из одной ямы и промыть 1 х PBS, рН 7,4. Добавить 2 мл 3,7% формальдегид и зафиксировать в течение 10 мин.
- Промыть 1xPBS, рН 7,4, добавляют 2 мл метанола к колодцу и место при температуре -20 ° С в течение 2 мин.
- Промыть 1xPBS, рН 7,4, а блок с 1 мл 0,2% бычьего serume альбумина (БСА) в течение 5 мин.
- Добавить 1 мл Oct-4 или anti-h/mSSEA-4 антител (1:200 разведения в 0,2% BSA), и инкубировать при комнатной температуре в течение 1 ч или при температуре 4 ° С в течение ночи. (ПРИМЕЧАНИЕ: для SSEA-4 окрашивания, перейти к пункту 6)
- Промыть трижды 1xPBS, рН 7,4, добавляют FITC-сопряженных кролика IgG (1:500 разведения в 0,2% BSA), и инкубировать при комнатной температуре в течение 1 часа.
- Промыть 3 раза 1xPBS, рН 7,4, и поместить каплю решение для монтажа (может содержать DAPI если ядерная визуализация желанию) в центре хорошо. Положите покровное на вершине клетки, печать с лаком для ногтей, а также оценить с помощью иммунофлуоресценции микроскопии.
Человека эмбриональных стволовых клеток поступлений
ES СМИ (средств массовой информации эмбриональных стволовых клеток):
DMEM/F12 - 400 мл
Нокаут сыворотки Replacer - 100мл
Номера для незаменимых аминокислот - 5 мл
200 мМ GlutaMax / BME раствор - 5 мл
Пенициллин / стрептомицин - 5 мл
Хорошо перемешайте и храните окончательный медиа-культуры чЭСК в 500 мл бутылки при температуре 4 ° C. Хорошо для не более двух недель.
MEF Культура СМИ:
DMEM - 1000 мл
FBS - 100 мл
Номера для незаменимых аминокислот - 10 мл
Глютамин - 10мл
Penicllin / стрептомицин - 10 мл
Хорошо перемешайте и храните окончательный медиа-культуры MEF при 4 ° C.
200 мМ Glutamax / BME Решение:
Glutamax - 100мл
β-меркаптоэтанол (Stock решение в 14.3M) - 140 μ1
Смешайте два решения хорошо, а затем часть аликвоту 10 мл. Держите аликвоты при -20 ° C.
bFGF Решение (конечная концентрация складе: 10 мкг / мл):
bFGF (FGF2) - 50 мкг
0,1% BSA в 1xPBS, рН 7,4 - 5 мл
Растворите 50 мкг bFGF в 5 мл 0,1% БСА, чтобы сделать 10 мкг / мл состава. Алиготе в 500 мкл порции. Хранить при температуре -80 ° C.
Коллагеназы IV Решение (1mg/ml):
Коллагеназы IV - 50 мг
DMEM/F12 СМИ - 50 мл
Добавить порошок коллагеназы IV в 50 мл трубки сокола. В капот, смешать в 50 мл стерильного DMEM/F12 СМИ. Vortex решение для <1 мин. чтобы убедиться, что порошок не растворится. В капот, проходят через 0,22 мкм фильтр в новые стерильные 50 мл трубки сокола. Это решение хорошо для не более 2 недель хранили при 4 ° C.
Dispase Решение (1mg/ml):
Dispase 5mg/ml - 2 мл
DMEM/F12 СМИ - 8 мл
Алиготе коммерческих Dispase 5mg/ml решение и хранить при температуре -20 ° C. Развести dispase к 1mg/ml использованием DMEM/F12. Это решение может храниться в течение 1 недели при температуре 4 ° C.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Эта серия 3 видео демонстрирует, как выращивать человеческие эмбриональные стволовые клетки (ЭСК) на мышиных эмбриональных фибробластов (MEF) фидерных клеток (видео 1), как прохождение их Матригель подачи бесклеточной пластин (видео 2), и как поддерживать ЭСК путем пассажей в Матригель подачи бесклеточных условиях (видео 3). Многочисленные предыдущие исследования показали, что поддержание жизнеспособных, недифференцированные ЭСК требует культуры на инактивированной фидерные клетки MEF. Однако для многих экспериментов, чистая населения ЭСК б...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Благодарности
Человека эмбриональных стволовых клеток исследований в лаборатории Teitell поддерживаются Калифорнийского института регенеративной медицины (CIRM) семена грант RS1-00313. Мы благодарим членов Широкий Центр регенеративной медицины и исследований стволовых клеток в Лос-Анджелесе, особенно доктор Amander Кларк, д-р Джером Зак, и члены UCLA Broad Institute стволовых клеток Основные фонда за поддержку наших исследований.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии | |
|---|---|---|---|---|
| Заменитель сыворотки Knockout (KSR) | Реагент | GIBCO, by Life Technologies | 10828-028 | |
| DMEM/F12 | Реагент | GIBCO, by Life Technologies | 11330-057 | |
| Незаменимые аминокислоты | Реагент | GIBCO, by Life Technologies | 11140-050 | |
| GlutaMax | Реагент | GIBCO, by Life Technologies | 35050-061 | |
| DMEM | Реагент | GIBCO, by Life Technologies | 11995-065 | |
| FBS | Реагент | Clontech Laboratories | 631107 | |
| L-глутамин | Реагент | GIBCO, by Life Technologies | 25030-081 | |
| BME | Реагент | Fisher Scientific | BP176-100 | |
| bFGF | Реагент | R&D Systems | 233-FB-025 | |
| Коллагеназа IV | Реагент | GIBCO, by Life Technologies | 17104-019 | |
| Диспаза | Реагент | Stem Cell Technologies | 17105-041 | |
| Пенициллин / Стрептомицин | Реагент | GIBCO, by Life Technologies | 15140-122 | |
| Желатин | Реагент | Chemicon International | ES-006-B | |
| Matrigel | Реагент | BD Biosciences | 354277 | |
| Антитела к Oct-4 | Реагент | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | SC-9081 | |
| Конъюгат анти-h/mSSEA-4 с фико–эритрином, мышиный IgG3 | Реагент | R&D Systems | FAB1435P | |
| FITC-конъюгированные антикроличьи IgG | Реагент | Jackson ImmunoResearch | 715-095-152 |
Ссылки
- Thomson, J. amesA., Itskovitz-Eldor, J. oseph, Shapiro, S. anderS., Waknitz, M. ichelleA., Swiergiel, J. enniferJ., Marshall, V. ivienneS., Jones, J. effreyM. Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts . Science. 282, 1145-1147 (1998).
- Xu, C. hunhui, Inokuma, M. argaretS., Denham, J. errod, Golds, K. athaleen, Kundu, P. ratima, Gold, J. osephD., Carpenter, M. elissaK. Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells Nature Biotechnology 19. Nature Biotechnology. 19, 971-974 (2001).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
