Парадигмы для Фармакологические Характеристика C. Элеганс Synaptic Мутанты передачи

Краткое содержание

В этом видеоролике показано, как использовать два нервных стимуляторов, альдикарб и pentylenetetrazole (PTZ), в дополнительных способов изучения синаптической функции в нематода C. Элеганс. Этот дополнительный подход может также использоваться, чтобы пролить свет на эволюционно консервативных механизмов для модуляции нейронной синхронии и имеет значение для лечения эпилепсии и эпилептические припадки.

Аннотация

Нематода, Caenorhabditis elegans, стала целесообразной моделью для изучения нейротрансмиссии. C. elegans уникален среди животных моделей, так как анатомия и связность его нервной системы были определены по электронным микрофотографиям и уточнены с помощью фармакологических анализов. В этом видео мы описываем, как два взаимодополняющих нейростимулятора, ингибитор ацетилхолинэстеразы, называемый алдикарбом, и антагонист рецепторов гамма-аминомасляной кислоты (ГАМК), называемый пентилентретразолом (PTZ), могут быть использованы для специфической характеристики передачи сигналов в нервно-мышечных переходах C. elegans (NMJ) и облегчения нашего понимания антагонистических нейронных цепей.

Из 302 нейронов C. elegans, девятнадцать моторных нейронов ГАМКергического D-типа иннервируют мышцы стенки тела (BWM), в то время как четыре ГАМКергических нейрона, называемые RME, иннервируют мышцы головы. И наоборот, тридцать девять моторных нейронов экспрессируют возбуждающий нейромедиатор, ацетилхолин (ACh), и препятствуют передаче ГАМК в BWM для координации локомоции. Антагонистическая природа ГАМКергических и холинергических моторных нейронов в NMJ стенки тела была первоначально определена с помощью лазерной абляции, а затем подкреплена воздействием алдикарба. Острое воздействие алдикарба приводит к временному или дозозависимому параличу у червей дикого типа. Тем не менее, потеря возбуждающей передачи АЧ придает устойчивость к алдикарбу, так как меньшее количество АЧ накапливается в NMJ червей, что приводит к меньшей стимуляции BWM. Устойчивость к алдикарбу может наблюдаться у мутантов, специфичных для АЧ или мутантов с общей синаптической функцией. В соответствии с антагонистической передачей ГАМК и АЧ, потеря передачи ГАМК или неспособность отрицательно регулировать высвобождение АЧК приводит к гиперчувствительности к алдикарбу. Несмотря на то, что воздействие алдикарба привело к выделению многочисленных гомологов генов нейротрансмиссии, воздействие алдикарба само по себе не может эффективно определить преобладающую роль генов и путей в конкретных моторных нейронах C. elegans. Для этого мы внедрили дополнительный экспериментальный подход, в котором используется PTZ.

Нейротрансмиссионные мутанты демонстрируют явные фенотипы, отличные от алдикарб-индуцированного паралича, в ответ на PTZ. Черви дикого типа, а также мутанты со специфическими неспособностями к высвобождению или получению АЧ не проявляют явной чувствительности к ПТЗ. Тем не менее, мутанты ГАМК, а также мутанты с общей синаптической функцией, демонстрируют передние конвульсии в зависимости от времени или дозы. Мутанты, которые не могут негативно регулировать общее высвобождение нейротрансмиттеров и, таким образом, выделяют чрезмерное количество ACh на BWM, становятся парализованными на PTZ. Индуцированные PTZ фенотипы дискретных мутантных классов указывают на то, что комплементарный подход с парадигмами воздействия алдикарба и PTZ у C. elegans может ускорить наше понимание нейротрансмиссии. Кроме того, видеоролики, демонстрирующие проведение фармакологических анализов, должны установить согласованные методы исследования C. elegans.

Протокол

Альдикарб выдержки Paradigm

1. В первый день, чтобы по крайней мере тридцати молодых взрослой стадии червей каждого генотипа и каждой репликации будут доступны для альдикарб пробы на второй день. Лучше всего, если экспериментатор выбирает пятьдесят и более L4 червей стадии в свежем пластин NGM (лучше без нистатин), которые содержат Е. палочка (желательно OP50) в качестве источника пищи, и выращивают их в течение 12-24 часов при последовательной и разрешительной температуре (20 ° С до 22 ° C лучше, хотя 25 ° C в порядке).
   
   
2. На второй день, сделайте 100 мМ исходный раствор альдикарб с 70% этанола (этанол) и 30% DDH ₂ O. Распространение соответствующее количество альдикарб на NGM минус нистатин пластин с определенными объемами для достижения желаемого концентрации альдикарб. Мы последовательно использовать 0,5 мМ альдикарб при посеве 37,5 мкл 100 мМ альдикарб на 7,5 мл NGM пластин. Разрешить альдикарб пластин высохнуть в течение примерно 30-60 минут при комнатной температуре. Это не обязательно, чтобы взломать крышками. Кроме того, альдикарб могут быть добавлены к НГО и хранили при 4 ° С в течение одной недели.
    
3. После сушки пластины соответствуют объемам Е. палочка (желательно OP50) на центре каждой пластины альдикарб и сухой в течение еще ​​30-60 минут при комнатной температуре. Мы последовательно пластины 25 мкл OP50, что создает достаточный размер пищи газон держать червей сконцентрированы в небольшом месте без переполненности тюрем.
    
4. Когда пища газона сухая, можно приступить альдикарб анализов. Из-за субъективного характера анализы алдикарб, настоятельно рекомендуется, что эксперименты проводить "вслепую". Коллега первичной экспериментатор может повторно маркировать оригинальных пластин с червями, чтобы быть проанализированы. Кроме того, коллеги могли передать червей от первоначального пластины зашифрованные пластин альдикарб непосредственно перед началом таймера. Если экспериментатор предполагает опробование конкретного штамма червей с характерным фенотипом, таких как uncoordination, то должно быть управление с аналогичными фенотип уменьшения систематической ошибки. Кроме того, это лучше, если экспериментатор анализов штамма дикого типа, а также устойчивый штамм и сверхчувствительным напряжения, параллельно, чтобы помочь стандартизировать экспериментов. Экспериментатор должен стремиться, чтобы проанализировать соответствует количество червей для каждой репликации. Мы постоянно анализируем тридцать червей одного генотипа для каждой репликации. Мы также осуществляем по крайней мере три повторяет для каждого эксперимента. Опытный экспериментатор должен иметь возможность анализировать не менее шести штаммов одновременно.
    
5. Подсчитайте количество парализована червей подталкивая в согласованном порядке каждого червя с платиновой проволоки. Мы последовательно подтолкнуть наших червей в два раза по голове и два раза на хвост каждые 30 минут в общей сложности три часа. Прекращение глотки насосные также может быть использован для определения паралич, но только если экспериментатор использует последовательное определение паралич на все анализы. Кроме того, стоит отметить, что некоторые черви, особенно те, которые устойчивы к алдикарб, может попытаться ползти от пластины. В этом случае экспериментатор может распространиться последовательной количество пальмитиновая кислота, физический барьер для передвижения червей, около альдикарб пластин. Выкладываем 25 мкл 10 мг пальмитиновая кислота / мл этанола.

PTZ выдержки Paradigm

1. В первый день, чтобы по крайней мере тридцати молодых взрослой стадии червей каждого генотипа и каждого повторить будет доступен для тестов PTZ на второй день. Лучше всего, если экспериментатор выбирает пятьдесят и более L4 червей стадии в свежем пластин NGM (лучше без нистатин), которые содержат Е. палочка (желательно OP50) в качестве источника пищи, и выращивают их в течение 12-24 часов при последовательной и разрешительной температуре (20 ° С до 22 ° C лучше, хотя 25 ° C в порядке).
   
   
2. На второй день, сделайте 0,5 г PTZ / мл DDH ₂ O исходного раствора PTZ. Распространение соответствующее количество PTZ на NGM минус нистатин пластин с определенными объемами для достижения желаемого концентрации PTZ. Потому что мы предпочитаем доза-реакция анализы для PTZ, мы пластины различного количества PTZ на 7,5 мл NGM пластин. Например, можно пластины 37,5 мкл исходного раствора PTZ на 7,5 пластины NGM мл, чтобы сделать 5 мг PTZ / мл раствора. Разрешить PTZ пластин высохнуть в течение примерно 60-120 минут при комнатной температуре. Это не обязательно, чтобы взломать крышками. Кроме того, PTZ могут быть добавлены непосредственно в НГО, но она должна быть немедленно использованы для анализов после затвердевания. Стабильность PTZ значительно меньше, чем у альдикарб. Таким образом, тесты со взрослыми пластин PTZ являются менее надежными. PTZ следует хранить при температуре -20 ° С в сушильном шкафу с сушильного агента перед использованием. Мы предпочитаем отказаться от PTZ примерно через два месяца после открытия, чтобы обеспечить стабильность.
   
   
3. После сушки пластины соответствуют объемам Е. палочка (желательно OP50)на центре каждой пластины PTZ и сухой в течение еще 30-60 минут при комнатной температуре. Мы последовательно пластины 25 мкл OP50, что создает достаточный размер пищи газон держать червей сконцентрированы в небольшом месте без переполненности тюрем.
    
4. Когда пища газона сухая, можно продолжить анализы PTZ. Хотя PTZ анализы менее субъективным, чем анализы алдикарб, он по-прежнему настоятельно рекомендуется проводить эксперименты «вслепую». Коллега первичной экспериментатор может повторно маркировать оригинальных пластин с червями, чтобы быть проанализированы. Кроме того, коллеги могли передать червей от первоначального пластины зашифрованные пластин PTZ непосредственно перед началом таймера. Если экспериментатор предполагает опробование конкретного штамма червей с характерным фенотипом, таких как uncoordination, то должно быть управление с аналогичными фенотип уменьшения систематической ошибки. Кроме того, это лучше, если экспериментатор анализов штамма дикого типа, а также штаммов с передним или полным тело конвульсии, параллельно, чтобы помочь стандартизировать экспериментов. Экспериментатор должен стремиться, чтобы проанализировать соответствует количество червей для каждой репликации. Мы постоянно анализируем тридцать червей одного генотипа для каждой репликации. Мы также осуществляем по крайней мере три повторяет для каждого эксперимента. Опытный экспериментатор должен иметь возможность анализировать не менее трех штаммов одновременно. Тем не менее, частота и интенсивность PTZ-индуцированные судороги обычно пик 15-30 минут воздействия, а затем затухают, как черви стали парализованными или, в некоторых случаях, акклиматизироваться к препарату.
   
   
5. Посчитайте количество "эпилептического типа" конвульсиях червей каждые 30 минут в общей сложности один час. Лучше всего, чтобы оценка количества червей с передней судороги, которые мы называем "голова качается", отдельно от количества червей с полным тело конвульсии, полный паралич тела, которую мы называем "тоник", или сочетание передняя судороги с BWM паралич, который мы называем "тонико-клонические". Большинство червей одного генотипа проявляют лишь один вид судорог. Тем не менее, тонико-клонические черви зачастую становятся полностью тоник, поэтому следует продолжать анализ последних 30 минут, даже если все черви уже выставлены судороги. Кроме того, стоит отметить, что некоторые черви могут попытаться ползти от пластины. В этом случае экспериментатор может распространиться последовательной количество пальмитиновая кислота вокруг пластин PTZ. Выкладываем 25 мкл 10 мг пальмитиновая кислота / мл этанола.

Поведенческие реакции Выбранный C. Элеганс Synaptic Мутанты передачи в альдикарб и PTZ

Мутант Имя	Роль Synaptic	Поведение без наркотиков	Поведенческий ответ на альдикарб (по сравнению с диким типом N2)	Поведенческий ответ на PTZ
Том-1 (ok188)	тормозит синаптическую передачу	несогласованный	увеличенной скоростью паралича	неотличимы от дикого типа
UNC-43 (n498n1186)	комплекс	несогласованный	увеличенной скоростью паралича	все тело конвульсии
UNC-25 (e156)	ГАМК способствует передаче	несогласованный	увеличенной скоростью паралича	передняя судороги, все тело паралич
СНБ-1 (md247)	способствует синаптической передачи	несогласованный	сниженной ставке паралич	передняя судороги
UNC-4 (E120)	способствует передаче АЧ	несогласованный	сниженной ставке паралич	неотличимы от дикого типа

Два нейронных стимуляторов, ингибиторов ацетилхолинэстеразы, называемый алдикарб, и антагонист рецепторов ГАМК, называемый pentylenetetrazole (PTZ), могут быть использованы на основе взаимодополняемости, чтобы охарактеризовать C. Элеганс синаптической передачи мутантов. Превышение возбуждающие ацетилхолина (АХ) накапливается в теле червя стену нервно-мышечного соединения (NMJs) от вредных мутаций в негативных регуляторов АЧ передачи (например, том-1 и UNC-43) или положительный регуляторы тормозных ГАМК-передачи (например, UNC-25). С другой стороны, возбуждающие уровни ацетилхолина на червя NMJs уменьшаются на вредных мутаций в положительной регуляторы общей синаптической передачи (например, SNB-1) или АЧ-специфических генов передачи (например, UNC-4). По сравнению с диким типом червей N2, червей мутантов с повышенной передачи возбуждающих АЧ на NMJs обладают повышенной скорости альдикарб вызванного параличом, в то время как черви мутанта с пониженной передаче возбуждающих АЧ демонстрируют снижение темпов альдикарб вызванного параличом. Хотя PTZ нарушает нейронные синхронность в Элеганс C. мышцах стенки тела, а не в отличие от алдикарб, PTZ также противодействует тормозных ГАМК в мышцах C. Элеганс голову. В результате, альдикарб чувствительность не может точно предсказать PTZ чувствительности. Мутант червей с конкретными дефектами в отрицательной или положительной RegulЭйшен передачи АЧ неотличимы от дикого типа N2 червей в присутствии PTZ, в то время как мутант червей с дефектами в положительной регуляции общего синаптической передачи или конкретных дефектов в тормозной ГАМК выставку передачи надежной PTZ-индуцированной передней судороги. Более того, UNC-43 с потерей функции мутантов отображения всего тела судороги в присутствии PTZ и, вероятно, имеют дополнительные нарушения синаптической передачи, которые способствуют их уникальных ответов препарата.

Обсуждение

Действующие протоколы по альдикарб экспозиции с C. Элеганс не позволяют экспериментаторам различать мутанты с конкретными дефицита ацетилхолина передачи и мутанты с обобщенными дефицит в синаптической передаче, так как оба класса мутантов выставку сопротивление альдикарб. Кроме того, алдикарб не может быть использована для определения того, мутанты имеют специфические дефициты ГАМК передачи или обобщенных неудачи негативно регулируют АЧ передачи, так как оба класса мутантов выставку повышенная чувствительность к альдикарб. Результа...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Алдикарб	Реагент	Супелко, Сигма-Олдрич	PS734	Можно приобрести из Сигма
Пентилентетразол	Реактив	Сигма-Олдрич	P6500