В этом видеоролике показано, как использовать два нервных стимуляторов, альдикарб и pentylenetetrazole (PTZ), в дополнительных способов изучения синаптической функции в нематода C. Элеганс. Этот дополнительный подход может также использоваться, чтобы пролить свет на эволюционно консервативных механизмов для модуляции нейронной синхронии и имеет значение для лечения эпилепсии и эпилептические припадки.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Парадигмы для Фармакологические Характеристика C. Элеганс Synaptic Мутанты передачи
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Нематода Caenorhabditis elegans стала удобной моделью для изучения нейротрансмиссии. C. elegans уникальна среди животных моделей тем, что анатомия и связность ее нервной системы были определены на основе электронных микрофотографий и уточнены с помощью фармакологических анализов. В данном видео мы описываем, как два взаимодополняющих нейростимулятора — ингибитор ацетилхолинэстеразы, называемый алдикарбом, и антагонист рецепторов гамма-аминомасляной кислоты (GABA), называемый пентилентетразолом (PTZ), — могут быть использованы для специфической характеристики сигналинга в нервно-мышечных соединениях (NMJs) C. elegans и углубления нашего понимания антагонистических нейронных цепей.
Из 302 нейронов C. elegans девятнадцать ГАМК-ергических моторных нейронов D-типа иннервируют мышцы телостной стенки (BWMs), в то время как четыре ГАМК-ергических нейрона, называемые RMEs, иннервируют мышцы головы. Напротив, тридцать девять моторных нейронов экспрессируют возбуждающий нейромедиатор, ацетилхолин (ACh), и противодействуют ГАМК-передаче в BWMs для координации локомоции. Антагонистический характер ГАМК-ергических и холинергических моторных нейронов в НМС телостной стенки был первоначально определен с помощью лазерной абляции и позже подтвержден воздействием алдикарба. Острое воздействие алдикарба приводит к параличу дикого типа червей, зависящему от времени или дозы. Однако потеря возбуждающей ACh-передачи обеспечивает устойчивость к алдикарбу, так как в НМС червей накапливается меньше ACh, что приводит к меньшей стимуляции BWMs. Устойчивость к алдикарбу может наблюдаться у мутантов со специфическим нарушением функции ACh или общей синаптической функции. В соответствии с антагонизмом передачи ГАМК и ACh, потеря ГАМК-передачи или нарушение отрицательной регуляции высвобождения ACh вызывает гиперчувствительность к алдикарбу. Хотя воздействие алдикарба привело к выделению многочисленных гомологов генов нейротрансмиссии у червей, одного воздействия алдикарба недостаточно для эффективного определения доминирующей роли генов и путей в конкретных моторных нейронах C. elegans. Для этой цели мы внедрили дополнительный экспериментальный подход с использованием PTZ.
Мутанты нейротрансмиссии демонстрируют выраженные фенотипы в ответ на PTZ, которые отличаются от паралича, вызванного алдикарбом. Черви дикого типа, а также мутанты со специфической неспособностью высвобождать или принимать ACh, не проявляют явной чувствительности к PTZ. Однако ГАМК-мутанты, равно как и мутанты с общим нарушением синаптической функции, демонстрируют передние конвульсии, зависящие от времени воздействия или дозы. Мутанты, которые не способны негативно регулировать общий выброс нейромедиаторов и, следовательно, секретируют избыточное количество ACh на BWM, подвергаются параличу при воздействии PTZ. Фенотипы различных классов мутантов, вызванные PTZ, указывают на то, что комплексный подход с использованием парадигм воздействия алдикарба и PTZ на C. elegans может ускорить наше понимание механизмов нейротрансмиссии. Кроме того, видео, демонстрирующие проведение фармакологических анализов, должны помочь в установлении единых методов исследований C. elegans.
Протокол
Альдикарб выдержки Paradigm
- В первый день, чтобы по крайней мере тридцати молодых взрослой стадии червей каждого генотипа и каждой репликации будут доступны для альдикарб пробы на второй день. Лучше всего, если экспериментатор выбирает пятьдесят и более L4 червей стадии в свежем пластин NGM (лучше без нистатин), которые содержат Е. палочка (желательно OP50) в качестве источника пищи, и выращивают их в течение 12-24 часов при последовательной и разрешительной температуре (20 ° С до 22 ° C лучше, хотя 25 ° C в порядке).
- На второй день, сделайте 100 мМ исходный раствор альдикарб с 70% этанола (этанол) и 30% DDH 2 O. Распространение соответствующее количество альдикарб на NGM минус нистатин пластин с определенными объемами для достижения желаемого концентрации альдикарб. Мы последовательно использовать 0,5 мМ альдикарб при посеве 37,5 мкл 100 мМ альдикарб на 7,5 мл NGM пластин. Разрешить альдикарб пластин высохнуть в течение примерно 30-60 минут при комнатной температуре. Это не обязательно, чтобы взломать крышками. Кроме того, альдикарб могут быть добавлены к НГО и хранили при 4 ° С в течение одной недели.
- После сушки пластины соответствуют объемам Е. палочка (желательно OP50) на центре каждой пластины альдикарб и сухой в течение еще 30-60 минут при комнатной температуре. Мы последовательно пластины 25 мкл OP50, что создает достаточный размер пищи газон держать червей сконцентрированы в небольшом месте без переполненности тюрем.
- Когда пища газона сухая, можно приступить альдикарб анализов. Из-за субъективного характера анализы алдикарб, настоятельно рекомендуется, что эксперименты проводить "вслепую". Коллега первичной экспериментатор может повторно маркировать оригинальных пластин с червями, чтобы быть проанализированы. Кроме того, коллеги могли передать червей от первоначального пластины зашифрованные пластин альдикарб непосредственно перед началом таймера. Если экспериментатор предполагает опробование конкретного штамма червей с характерным фенотипом, таких как uncoordination, то должно быть управление с аналогичными фенотип уменьшения систематической ошибки. Кроме того, это лучше, если экспериментатор анализов штамма дикого типа, а также устойчивый штамм и сверхчувствительным напряжения, параллельно, чтобы помочь стандартизировать экспериментов. Экспериментатор должен стремиться, чтобы проанализировать соответствует количество червей для каждой репликации. Мы постоянно анализируем тридцать червей одного генотипа для каждой репликации. Мы также осуществляем по крайней мере три повторяет для каждого эксперимента. Опытный экспериментатор должен иметь возможность анализировать не менее шести штаммов одновременно.
- Подсчитайте количество парализована червей подталкивая в согласованном порядке каждого червя с платиновой проволоки. Мы последовательно подтолкнуть наших червей в два раза по голове и два раза на хвост каждые 30 минут в общей сложности три часа. Прекращение глотки насосные также может быть использован для определения паралич, но только если экспериментатор использует последовательное определение паралич на все анализы. Кроме того, стоит отметить, что некоторые черви, особенно те, которые устойчивы к алдикарб, может попытаться ползти от пластины. В этом случае экспериментатор может распространиться последовательной количество пальмитиновая кислота, физический барьер для передвижения червей, около альдикарб пластин. Выкладываем 25 мкл 10 мг пальмитиновая кислота / мл этанола.
PTZ выдержки Paradigm
- В первый день, чтобы по крайней мере тридцати молодых взрослой стадии червей каждого генотипа и каждого повторить будет доступен для тестов PTZ на второй день. Лучше всего, если экспериментатор выбирает пятьдесят и более L4 червей стадии в свежем пластин NGM (лучше без нистатин), которые содержат Е. палочка (желательно OP50) в качестве источника пищи, и выращивают их в течение 12-24 часов при последовательной и разрешительной температуре (20 ° С до 22 ° C лучше, хотя 25 ° C в порядке).
- На второй день, сделайте 0,5 г PTZ / мл DDH 2 O исходного раствора PTZ. Распространение соответствующее количество PTZ на NGM минус нистатин пластин с определенными объемами для достижения желаемого концентрации PTZ. Потому что мы предпочитаем доза-реакция анализы для PTZ, мы пластины различного количества PTZ на 7,5 мл NGM пластин. Например, можно пластины 37,5 мкл исходного раствора PTZ на 7,5 пластины NGM мл, чтобы сделать 5 мг PTZ / мл раствора. Разрешить PTZ пластин высохнуть в течение примерно 60-120 минут при комнатной температуре. Это не обязательно, чтобы взломать крышками. Кроме того, PTZ могут быть добавлены непосредственно в НГО, но она должна быть немедленно использованы для анализов после затвердевания. Стабильность PTZ значительно меньше, чем у альдикарб. Таким образом, тесты со взрослыми пластин PTZ являются менее надежными. PTZ следует хранить при температуре -20 ° С в сушильном шкафу с сушильного агента перед использованием. Мы предпочитаем отказаться от PTZ примерно через два месяца после открытия, чтобы обеспечить стабильность.
- После сушки пластины соответствуют объемам Е. палочка (желательно OP50)на центре каждой пластины PTZ и сухой в течение еще 30-60 минут при комнатной температуре. Мы последовательно пластины 25 мкл OP50, что создает достаточный размер пищи газон держать червей сконцентрированы в небольшом месте без переполненности тюрем.
- Когда пища газона сухая, можно продолжить анализы PTZ. Хотя PTZ анализы менее субъективным, чем анализы алдикарб, он по-прежнему настоятельно рекомендуется проводить эксперименты «вслепую». Коллега первичной экспериментатор может повторно маркировать оригинальных пластин с червями, чтобы быть проанализированы. Кроме того, коллеги могли передать червей от первоначального пластины зашифрованные пластин PTZ непосредственно перед началом таймера. Если экспериментатор предполагает опробование конкретного штамма червей с характерным фенотипом, таких как uncoordination, то должно быть управление с аналогичными фенотип уменьшения систематической ошибки. Кроме того, это лучше, если экспериментатор анализов штамма дикого типа, а также штаммов с передним или полным тело конвульсии, параллельно, чтобы помочь стандартизировать экспериментов. Экспериментатор должен стремиться, чтобы проанализировать соответствует количество червей для каждой репликации. Мы постоянно анализируем тридцать червей одного генотипа для каждой репликации. Мы также осуществляем по крайней мере три повторяет для каждого эксперимента. Опытный экспериментатор должен иметь возможность анализировать не менее трех штаммов одновременно. Тем не менее, частота и интенсивность PTZ-индуцированные судороги обычно пик 15-30 минут воздействия, а затем затухают, как черви стали парализованными или, в некоторых случаях, акклиматизироваться к препарату.
- Посчитайте количество "эпилептического типа" конвульсиях червей каждые 30 минут в общей сложности один час. Лучше всего, чтобы оценка количества червей с передней судороги, которые мы называем "голова качается", отдельно от количества червей с полным тело конвульсии, полный паралич тела, которую мы называем "тоник", или сочетание передняя судороги с BWM паралич, который мы называем "тонико-клонические". Большинство червей одного генотипа проявляют лишь один вид судорог. Тем не менее, тонико-клонические черви зачастую становятся полностью тоник, поэтому следует продолжать анализ последних 30 минут, даже если все черви уже выставлены судороги. Кроме того, стоит отметить, что некоторые черви могут попытаться ползти от пластины. В этом случае экспериментатор может распространиться последовательной количество пальмитиновая кислота вокруг пластин PTZ. Выкладываем 25 мкл 10 мг пальмитиновая кислота / мл этанола.
Поведенческие реакции Выбранный C. Элеганс Synaptic Мутанты передачи в альдикарб и PTZ
| Мутант Имя | Роль Synaptic | Поведение без наркотиков | Поведенческий ответ на альдикарб (по сравнению с диким типом N2) | Поведенческий ответ на PTZ |
|---|---|---|---|---|
| Том-1 (ok188) | тормозит синаптическую передачу | несогласованный | увеличенной скоростью паралича | неотличимы от дикого типа |
| UNC-43 (n498n1186) | комплекс | несогласованный | увеличенной скоростью паралича | все тело конвульсии |
| UNC-25 (e156) | ГАМК способствует передаче | несогласованный | увеличенной скоростью паралича | передняя судороги, все тело паралич |
| СНБ-1 (md247) | способствует синаптической передачи | несогласованный | сниженной ставке паралич | передняя судороги |
| UNC-4 (E120) | способствует передаче АЧ | несогласованный | сниженной ставке паралич | неотличимы от дикого типа |
Два нейронных стимуляторов, ингибиторов ацетилхолинэстеразы, называемый алдикарб, и антагонист рецепторов ГАМК, называемый pentylenetetrazole (PTZ), могут быть использованы на основе взаимодополняемости, чтобы охарактеризовать C. Элеганс синаптической передачи мутантов. Превышение возбуждающие ацетилхолина (АХ) накапливается в теле червя стену нервно-мышечного соединения (NMJs) от вредных мутаций в негативных регуляторов АЧ передачи (например, том-1 и UNC-43) или положительный регуляторы тормозных ГАМК-передачи (например, UNC-25). С другой стороны, возбуждающие уровни ацетилхолина на червя NMJs уменьшаются на вредных мутаций в положительной регуляторы общей синаптической передачи (например, SNB-1) или АЧ-специфических генов передачи (например, UNC-4). По сравнению с диким типом червей N2, червей мутантов с повышенной передачи возбуждающих АЧ на NMJs обладают повышенной скорости альдикарб вызванного параличом, в то время как черви мутанта с пониженной передаче возбуждающих АЧ демонстрируют снижение темпов альдикарб вызванного параличом. Хотя PTZ нарушает нейронные синхронность в Элеганс C. мышцах стенки тела, а не в отличие от алдикарб, PTZ также противодействует тормозных ГАМК в мышцах C. Элеганс голову. В результате, альдикарб чувствительность не может точно предсказать PTZ чувствительности. Мутант червей с конкретными дефектами в отрицательной или положительной RegulЭйшен передачи АЧ неотличимы от дикого типа N2 червей в присутствии PTZ, в то время как мутант червей с дефектами в положительной регуляции общего синаптической передачи или конкретных дефектов в тормозной ГАМК выставку передачи надежной PTZ-индуцированной передней судороги. Более того, UNC-43 с потерей функции мутантов отображения всего тела судороги в присутствии PTZ и, вероятно, имеют дополнительные нарушения синаптической передачи, которые способствуют их уникальных ответов препарата.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Действующие протоколы по альдикарб экспозиции с C. Элеганс не позволяют экспериментаторам различать мутанты с конкретными дефицита ацетилхолина передачи и мутанты с обобщенными дефицит в синаптической передаче, так как оба класса мутантов выставку сопротивление альдикарб. Кроме того, алдикарб не может быть использована для определения того, мутанты имеют специфические дефициты ГАМК передачи или обобщенных неудачи негативно регулируют АЧ передачи, так как оба класса мутантов выставку повышенная чувствительность к альдикарб. Результа...
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Благодарности
Мы хотим отметить дух сотрудничества всех членов Колдуэлл Lab. Василий О'Коннор ученый награду от марте Dimes и КАРЬЕРА награду от Национального научного фонда в GAC, а также Бакалавриат Научные исследования грантовой программы из Медицинского института Говарда Хьюза в университете штата Алабама, финансировали нейронную возбудимость и эпилепсии исследований в Лаборатории Колдуэлл.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии | |
|---|---|---|---|---|
| Альдикарб | Реагент | Supelco, Sigma-Aldrich | PS734 | Доступен для покупки в Sigma |
| Пентилентетразол | Реагент | Sigma-Aldrich | P6500 |
Ссылки
- Mahoney, T. R., Luo, S., Nonet, M. L. Analysis of synaptic transmission in Caenorhabditis elegans using an aldicarb-sensitivity assay. Nat. Protoc. 1, 1772-1777 (2006).
- Williams, S. N., Locke, C. J., Braden, A. L., Caldwell, K. A., Caldwell, G. A. Epileptic-like convulsions associated with LIS-1 in the cytoskeletal control of neurotransmitter signaling in Caenorhabditis elegans. Hum. Mol. Genet.. 13, 2043-2059 (2004).
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
